一种解脲支原体检测试剂盒配方及其使用方法

技术领域

本发明涉及解脲支原体检测技术领域，具体涉及一种解脲支原体检测试剂盒配方及其使用方法。

背景技术

解脲支原体属于支原体目支原体科，通常存在于人类泌尿生殖道。男性感染解脲支原体后可产生尿道炎症状，并可继发慢性前列腺炎；还可继续感染精道、精囊和睾丸，影响精子和精液的质量，引起男性不育。女性感染解脲支原体后会生殖道炎症，致使黏膜细胞坏死、输卵管中的纤毛失去运动功能，受精卵运动受到抑制；不仅如此，解脲支原体可直接吸附在精子的头部，破坏精子的活力，影响精子正常运动，影响精子与卵子的正常结合，患者难以正常受精；此外，解脲支原体感染还与精子膜有共同抗原，一旦感染就有可能导致免疫性不孕。解脲支原体不仅仅危害母体健康，而且危害胎儿生存，可导致早产、死胎、流产，或在分娩时感染新生儿，引起呼吸道感染。该细菌与人类乳头瘤病毒(HPV)高度相关。

目前市场上的解脲支原体检测试剂普遍检测较慢，且检测过程较为复杂，导致患者常常需要等待数日才能得出检测结果，同时检测准确率较差，容易发生误检和错检等情况，存在着严重的安全隐患；由此有必要设计一种解脲支原体检测试剂盒，以解决上述问题。

发明内容

本发明的目的是解决目前市场上的解脲支原体检测试剂由于普遍检测较慢，且检测过程较为复杂，从而导致患者常常需要等待数日才能得出检测结果，同时检测准确率较差，容易发生误检和错检等情况，存在着严重安全隐患的问题；本发明的解脲支原体检测试剂盒配方及其使用方法，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，且报告信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数，也实现了该解脲支原体检测试剂盒能够快速、准确、简便的检测解脲支原体。

为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种解脲支原体检测试剂盒配方，包括以下组分及各组分的重量为：

Polymerase：0.3-1.0µL；

逆转录酶：0.3-1.0µL；

PCR反应Buffer：15-40µL；

脲支原体反应溶液：3-10µL；

阳性对照溶液和阴性对照液：3-10µL。

前述的解脲支原体检测试剂盒配方，所述脲支原体反应溶液包括解脲支原体上游引物、解脲支原体下游引物、解脲支原体探针、内参上游引物、内参下游引物、内参探针，其中解脲支原体上游引物0.5-2µL、解脲支原体下游引物0.5-2µL、解脲支原体探针1-3µL、内参上游引物0.5-2µL、内参下游引物0.5-2µL、内参探针1-3µL。

前述的解脲支原体检测试剂盒配方，所述脲支原体反应溶液内部含有的溶质具体基因序列如下：

所述脲支原体上游引物序列为CCTGCCAACTGTGCACGAGT；

所述脲支原体下游引物序列为AATTCGCCGTAATCGGCCGAGTA；

所述脲支原体探针序列为GAGTCTGTGACGGATTGACTGAGCCA；

所述内参上游引物序列为TAAACGTGCCTGCGTAGAACGG；

所述内参下游引物序列为GAGATCTGTCTGAATGACATGGACGTC。

前述的解脲支原体检测试剂盒配方，所述PCR反应Buffer包括UNG酶、RNA酶抑制剂、dNTPs、氯化镁、DEPC水，其中UNG酶3-5µL、RNA酶抑制剂3-5µL、dNTPs2-3µL、氯化镁2-10µL、DEPC水5-20µL。

前述的解脲支原体检测试剂盒配方，所述阳性对照溶液包括重组脲支原体基因质粒、重组内参基因质粒、Buffer，其中重组脲支原体基因质粒、重组内参基因质粒、Buffer按比例1-3：1-3：2-5加入至阳性对照溶液中。

前述的解脲支原体检测试剂盒配方，所述阴性对照溶液为生理盐水。

前述的解脲支原体检测试剂盒配方，所述体积数是每人每次检测用的体积数，包括以下组分及各组分的体积数为：

Polymerase：0.5µL；

逆转录酶：0.5µL；

PCR反应Buffer：19µL，其中UNG酶3.5µL、RNA酶抑制剂3.5µL、dNTPs2.5µL、氯化镁3.5µL、DEPC水6µL；

脲支原体反应溶液：5µL，其中解脲支原体上游引物0.5µL、解脲支原体下游引物0.5µL、解脲支原体探针1.5µL、内参上游引物0.5µL、内参下游引物0.5µL、内参探针1.5µL；

阳性对照溶液和阴性对照液：5µL，其中阳性对照溶液中重组脲支原体基因质粒、重组内参基因质粒、Buffer重量比为2：2：3。

一种解脲支原体检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

步骤（A），取出试剂盒中各组分，并混合1-3min至均匀，随后放置在冰上暂存；

步骤（B），将25µL由Polymerase、逆转录酶、PCR反应Buffer配制成的溶液加入PCR管中；

步骤（C），将待测样本、阳性对照溶液和阴性对照液5µL加入配制好的溶液中，混合1-3min至均匀，短时离心3-10min，转速500-1000r/min；

步骤（D），将上述装有混合溶液的PCR管放入荧光定量PCR仪中进行扩增和荧光信号检测；

步骤（E），根据荧光定量PCR仪显示的强度结果进行判断。

前述的解脲支原体检测试剂盒使用方法，步骤（D），将上述装有混合溶液的PCR管放置入荧光定量PCR仪中进行扩增和荧光信号检测，荧光定量PCR扩增程序具体过程为：

（D1），逆转录，时间为20min，温度50℃，循环次数1T；

（D2），预变性，时间为10min，温度95℃，循环次数1T；

（D3），变性，时间为0.5min，温度95℃，循环次数44T；

（D4），退活/延伸/型号检测，时间为0.5min，温度60℃，循环次数44T。

前述的解脲支原体检测试剂盒使用方法，步骤（A），取出试剂盒中各组分，并混合1-3min至均匀，随后放置在冰上暂存，所述各组分的具体值为：Polymerase0.5µL；逆转录酶0.5µL；PCR反应Buffer19µL，其中UNG酶3.5µL、RNA酶抑制剂3.5µL、dNTPs2.5µL、氯化镁3.5µL、DEPC水6µL；脲支原体反应溶液5µL，其中解脲支原体上游引物0.5µL、解脲支原体下游引物0.5µL、解脲支原体探针1.5µL、内参上游引物0.5µL、内参下游引物0.5µL、内参探针1.5µL；阳性对照溶液和阴性对照液5µL，其中阳性对照溶液中重组脲支原体基因质粒、重组内参基因质粒、Buffer重量比为2：2：3。

本发明的有益效果是：

本发明的解脲支原体检测试剂盒配方及其使用方法，首先当探针完整的时候，5′端报告基团经仪器光源激发的荧光正好被近距离的3′端荧光基团淬灭，仪器检测不到5′端报告基团所激发的荧光信号，这样5’荧光基团的发射波长正好是3’ 荧光基团的吸收波长，因而能量被吸收传递到3’荧光基团而发出其它荧光，随着PCR的进行，Polymerase在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5′-3′外切酶活性，由于此活性是双链特异性的使得游离的单链探针不受影响，这样就会将切割探针，并释放5′端报告基团游离于反应体系中，而由于远离3′端荧光淬灭基团的屏蔽，使得5′端报告基团受激发所发射的荧光信号就可以被探头检测到，也就是说每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，有效的实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，且报告信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数，也有效的实现了该解脲支原体检测试剂盒能够快速、准确、简便的检测解脲支原体，具有广泛的应用前景。

具体实施方式

本发明的解脲支原体检测试剂盒配方，包括以下组分及各组分的体积数为：

Polymerase：0.3-1.0µL；

逆转录酶：0.3-1.0µL；

PCR反应Buffer：15-40µL；

脲支原体反应溶液：3-10µL；

阳性对照溶液和阴性对照液：3-10µL。

其中，体积数是每人每次检测用的体积数。

优选的，所述脲支原体反应溶液包括解脲支原体上游引物、解脲支原体下游引物、解脲支原体探针、内参上游引物、内参下游引物、内参探针，其中解脲支原体上游引物0.5-2µL、解脲支原体下游引物0.5-2µL、解脲支原体探针1-3µL、内参上游引物0.5-2µL、内参下游引物0.5-2µL、内参探针1-3µL。

优选的，所述脲支原体反应溶液内部含有的溶质具体基因序列如下：

所述脲支原体上游引物序列为CCTGCCAACTGTGCACGAGT；

所述脲支原体下游引物序列为AATTCGCCGTAATCGGCCGAGTA；

所述脲支原体探针序列为GAGTCTGTGACGGATTGACTGAGCCA；

所述内参上游引物序列为TAAACGTGCCTGCGTAGAACGG；

所述内参下游引物序列为GAGATCTGTCTGAATGACATGGACGTC。

优选的，所述PCR反应Buffer包括UNG酶、RNA酶抑制剂、dNTPs、氯化镁、DEPC水，其中UNG酶3-5µL、RNA酶抑制剂3-5µL、dNTPs2-3µL、氯化镁2-10µL、DEPC水5-20µL；所述阳性对照溶液包括重组脲支原体基因质粒、重组内参基因质粒、Buffer，其中重组脲支原体基因质粒、重组内参基因质粒、Buffer按比例1-3：1-3：2-5加入至阳性对照溶液中；所述阴性对照溶液为生理盐水；

本发明的解脲支原体检测试剂盒配方，一个实施例，包括以下组分及各组分的体积数为：

Polymerase：0.5µL；

逆转录酶：0.5µL；

PCR反应Buffer：19µL，其中UNG酶3.5µL、RNA酶抑制剂3.5µL、dNTPs2.5µL、氯化镁3.5µL、DEPC水6µL；

脲支原体反应溶液：5µL，其中解脲支原体上游引物0.5µL、解脲支原体下游引物0.5µL、解脲支原体探针1.5µL、内参上游引物0.5µL、内参下游引物0.5µL、内参探针1.5µL；

阳性对照溶液和阴性对照液：5µL，其中阳性对照溶液中重组脲支原体基因质粒、重组内参基因质粒、Buffer重量比为2：2：3。

该优选的实施例能够快速、准确、简便的检测解脲支原体。

本发明解脲支原体检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤，

步骤（A），取出试剂盒中各组分，并混合1-3min至均匀，随后放置在冰上暂存，

最优的各组分具体值为：Polymerase0.5µL；逆转录酶0.5µL；PCR反应Buffer19µL，其中UNG酶3.5µL、RNA酶抑制剂3.5µL、dNTPs2.5µL、氯化镁3.5µL、DEPC水6µL；脲支原体反应溶液5µL，其中解脲支原体上游引物0.5µL、解脲支原体下游引物0.5µL、解脲支原体探针1.5µL、内参上游引物0.5µL、内参下游引物0.5µL、内参探针1.5µL；阳性对照溶液和阴性对照液5µL，其中阳性对照溶液中重组脲支原体基因质粒、重组内参基因质粒、Buffer重量比为2：2：3；

步骤（B），将25µL由Polymerase、逆转录酶、PCR反应Buffer配制成的溶液加入PCR管中；

步骤（C），将待测样本、阳性对照溶液和阴性对照液5µL加入配制好的溶液中，混合1-3min至均匀，短时离心3-10min；

步骤（D），将上述装有混合溶液的PCR管放入荧光定量PCR仪中进行扩增和荧光信号检测；

荧光定量PCR扩增程序具体过程为：

（D1），逆转录，时间为20min，温度50℃，循环次数1T；

（D2），预变性，时间为10min，温度95℃，循环次数1T；

（D3），变性，时间为0.5min，温度95℃，循环次数44T；

（D4），退活/延伸/型号检测，时间为0.5min，温度60℃，循环次数44T；

步骤（E），根据荧光定量PCR仪显示的强度结果进行判断。

通过本发明上述使用方法的解脲支原体检测试剂盒，具体效果如下：

（1）荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，且报告信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数；（2）能够快速、准确、简便的检测解脲支原体。

综上所述，本发明的解脲支原体检测试剂盒配方及其使用方法，通过当探针完整的时候，5′端报告基团经仪器光源激发的荧光正好被近距离的3′端荧光基团淬灭，仪器检测不到5′端报告基团所激发的荧光信号，这样5’荧光基团的发射波长正好是3’ 荧光基团的吸收波长，因而能量被吸收传递到3’荧光基团而发出其它荧光，随着PCR的进行，Polymerase在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5′-3′外切酶活性，由于此活性是双链特异性的使得游离的单链探针不受影响，这样就会将切割探针，并释放5′端报告基团游离于反应体系中，而由于远离3′端荧光淬灭基团的屏蔽，使得5′端报告基团受激发所发射的荧光信号就可以被探头检测到，也就是说每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，有效的实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，且报告信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数，也有效的实现了该解脲支原体检测试剂盒能够快速、准确、简便的检测解脲支原体，具有广泛的应用前景。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。