一种粘质沙雷氏菌及其应用

技术领域

本发明涉及农业微生物技术领域，涉及一种粘质沙雷氏菌及其应用。

背景技术

云南省是中国小粒咖啡的主产区，国内最大的小粒咖啡种植基地和贸易出口集散地，种植区主要分布在11个地州(市)的42个县(市)及干热河谷地区。2016年云南小粒咖啡产量达15.84万吨，占全国的98.8％，种植面积达116973.33hm

近些年，微生物作为一种能够制备成高效、安全、无残留的生物农药的基础，在现代农业生产及科学研究中有着举足轻重的地位。而至今，利用微生物防治鞘翅目害虫尤其是防治咖啡灭字脊虎天牛的研究在国内外报道较少。

发明内容

本发明的目的是提供一种粘质沙雷氏菌及其应用，该粘质沙雷氏菌可以明显抑制咖啡灭字脊虎天牛幼虫，且效果好、成本低；以该菌或其代谢物作为活性成分制备生物制剂或者菌肥，对于咖啡灭字脊虎天牛的防控具有重要意义。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供了一株粘质沙雷氏菌Serratia marcescens，其保藏号为：CGMCCNo.21857，保藏时间为：2021年3月9日，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

本发明还提供了所述的粘质沙雷氏菌在制备防治咖啡灭字脊虎天牛生物制剂中的应用。

本发明还提供了所述的粘质沙雷氏菌在制备防治咖啡灭字脊虎天牛的菌肥中的应用。

本发明还提供一种所述的粘质沙雷氏菌的发酵液的制备方法，包括以下步骤：

将粘质沙雷氏菌接种于YSP液体培养基中，在20-28℃，pH值6-8条件培养12-16 h，获取种子液；

将所得种子液按照0.5％-2％接种量接种于YSP液体培养基中，在20-28℃，pH 值6-8条件培养38-84h，获取粘质沙雷氏菌发酵液。

优选的是，所述YSP液体培养基包括以下组分：酵母浸粉3-10g，蛋白胨8-15g，蔗糖15-25g，水1000mL。

本发明还提供一种由所述的制备方法获取的粘质沙雷氏菌发酵液。

本发明还提供了所述的粘质沙雷氏菌发酵液在制备防治咖啡灭字脊虎天牛生物制剂中的应用。

本发明还提供了所述的粘质沙雷氏菌发酵液在制备防治咖啡灭字脊虎天牛的菌肥中的应用。

本发明公开了以下技术效果：

本发明公开的粘质沙雷氏菌是从罹病咖啡灭字脊虎天牛幼虫中分离的，以粘质沙雷氏菌活体或其代谢产物为活性成分制备生物制剂，应用于防治咖啡灭字脊虎天牛，其抑制率可达76.67％；同时，还能作为制备生物菌肥的活性成分，既能防治咖啡灭字脊虎天牛，还能提高咖啡的产量和品质。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为不同培养基对粘质沙雷氏菌ND1-1生长的影响；

图2为不同碳源对粘质沙雷氏菌ND1-1生长速度的影响；

图3为不同氮源对粘质沙雷氏菌ND1-1生长的影响；

图4为pH对粘质沙雷氏菌ND1-1生长速度的影响；

图5为培养温度对粘质沙雷氏菌ND1-1生长速度的影响；

图6为接菌量对粘质沙雷氏菌ND1-1生长速度的影响；

图7为培养时间对粘质沙雷氏菌ND1-1生长速度的影响；

图8为粘质沙雷氏菌ND1-1系统发育进化树。

具体实施方式

现以实施例方式对本发明技术方案进行具体说明，但其不应该被认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1粘质沙雷氏菌的分离纯化以及鉴定

一、菌株的分离纯化

从罹病咖啡灭字脊虎天牛幼虫中分离，该咖啡灭字脊虎天牛幼虫采集于普洱市思茅区南岛河村咖啡种植基地，该种植基地从未使用过相关微生物农药。采用如下步骤进行分离纯化：

1、首先，将罹病咖啡灭字脊虎天牛幼虫体表以75％酒精漂洗3次，每次2分钟，再用无菌水漂洗3次后研磨。

2、灭菌：所用培养皿、离心管、试管，枪头等实验器材及无菌水均采用高压灭菌，0.1MPa，121℃，灭菌30分钟。

3、研磨：将罹病咖啡灭字脊虎天牛消毒后放入无菌离心管中，加入1mL无菌水，用研磨棒充分研磨。

4、梯度稀释：取研磨后的汁液1mL，放入盛有9mL无菌水的试管中，即为10

5、培养基的配置

分离用培养基：牛肉膏蛋白胨培养基(NA培养基)，包括：牛肉膏3g，蛋白胨 10g，NaCl 5g，琼脂18g，水1000mL，pH 7.0-7.2，121℃灭菌20min。

纯化用培养基：LB培养基，包括：蛋白胨10g；酵母提取物5g；氯化钠10g；琼脂15g；蒸馏水1000mL；pH 7.0，121℃灭菌20min。

倒平板，每个培养皿倒大约15mL的培养基，平放静置，待冷却备用。

6、涂平板：将稀释菌液10

7、培养：倒置平皿于28℃培养箱中培养3-5天。

8、菌的纯化：在无菌条件下用接种环将NA培养基上长出的单菌落挑取于LB培养基上划线培养；纯化3-4次可得纯化后的单菌落，命名为ND1-1。

二、菌株鉴定

(1)菌株的培养特征的鉴定

将上述分离的菌株涂布于LB固体培养基上，在24℃、pH值为7的条件下恒温培养72h，观察菌株的菌落特征。

结果发现：菌落直径为1-3mm，红色、圆形、表面凸起、湿润、有光泽，边缘波状菌体长杆状，2.22-2.86μm。

(2)生理生化指标的鉴定

根据常见的细菌系统鉴定手册(东秀珠等.常见细菌系统鉴定手册[M].北京：科学出版社，2001.)中沙雷氏细菌的鉴定方法对上述分离获取的菌株进行了生理生化鉴定试验。

鉴定结果显示：该菌为革兰氏阴性，菌淀粉水解试验阴性，油脂水解试验阴性，石蕊牛奶试验阳性；发酵葡萄糖既产酸又产气；吲哚试验阴性，甲基红试验阳性，伏- 普试验阳性，明胶试验阳性，硫化氢试验阳性。

(3)菌株的序列分析

挑取1个上述分离获取的菌株单菌落接种于YSP液体培养基，24℃，pH值为7 的条件下培养16h，取菌液，15000rpm离心15min，收集菌体。按照天根(北京)生物科技有限公司细菌DNA提取试剂盒的提取方法，提取上述菌体基因组DNA，并用通用的细菌特异性引物进行PCR扩增。将扩增产物进行电泳检测，在1500bp处出现特异性片段，测定该片段序列，结果表明测得上述所得菌株的16S rRNA序列(SEQ ID NO：1)为

GATGCGCGGCTACCATGCAGTCGAGCGGTAGCACAGGGGAGCTTGCTCCCTGGG TGACGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGA TAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGG GACCTTCGGGCCTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAATGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCA CACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATAT TGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTT CGGGTTGTAAAGCACTTTCAGCGAGGAGGAAGGTGGTGAACTTAATACGTTCATC AATTGACGTTACTCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGG TAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGG CGGTTTGTTAAGTCAGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTTGA AACTGGCAAGCTAGAGTCTCGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGA AATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACGAAG ACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTA GTCCACGCTGTAAACGATGTCGATTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAATCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACT CAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTG

再通过BLAST软件进行序列对比分析，并构建菌株进化树(见图8)。

通过上述培养特征、生理生化特性以及16S rDNA分析，鉴定本发明上述分离所得菌株为粘质沙雷氏菌Serratia marcescens。

实施例2粘质沙雷氏菌发酵培养条件的筛选

挑取1个粘质沙雷氏菌ND1-1单菌落接种于YSP液体培养基，24℃，pH值为7 的条件下培养16h，获得种子液。

将所得种子液接种于YSP培养基上，在温度24℃、pH值为7的条件下培养，获得的粘质沙雷氏菌ND1-1发酵液，用于以下各发酵培养条件的优化。

1、培养基优选

采用YSP、NYBD、NA、LB和CM五种培养基对菌株进行培养，观察粘质沙雷氏菌ND1-1的生长情况。其中，上述具体培养基组成如下：

YSP培养基：酵母浸粉5g，蛋白胨10g，蔗糖20g，水1000mL；121℃灭菌20 min。

NYBD培养基：酵母浸粉5g，牛肉膏8g，葡萄糖10g，水1000mL；121℃灭菌20min。

NA培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂18g，水1000mL，121℃灭菌20min。

LB培养基：蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂15g，蒸馏水1000 mL，121℃灭菌20min。

CM培养基：(NH

如图1可知，粘质沙雷氏菌ND1-1在YSP培养基上生长速度最快，OD值为2.7909，其次是NYBD培养基，OD值为2.7094。

2、不同碳源对菌株生长速度的影响

采用麦芽糖、乳糖、葡萄糖、蔗糖、淀粉等五种碳源对菌株进行培养，观察粘质沙雷氏菌ND1-1的生长情况。

如图2可知，粘质沙雷氏菌ND1-1的最适碳源为蔗糖，菌液OD值2.7909。

3、不同氮源对菌株生长的影响

采用氯化铵、酵母粉、硝酸铵、丝氨酸、蛋白胨五种氮源对菌株进行培养，观察粘质沙雷氏菌ND1-1的生长情况。

如图3可知，粘质沙雷氏菌ND1-1在酵母浸粉上的生长速度最快，OD值为2.8930。

4、pH对菌株生长速度的影响

菌株培养pH设置7个处理，分别为pH＝4、pH＝5、pH＝6、pH＝7、pH＝8、pH＝9、 pH＝10，观察不同pH值环境中粘质沙雷氏菌ND1-1的生长情况。

如图4可知，粘质沙雷氏菌ND1-1最适生长pH值是7。

5、温度对菌株生长的影响

菌株培养温度设置6个处理，分别为16℃、20℃、24℃、28℃、32℃、36℃、 40℃，观察不同温度下粘质沙雷氏菌ND1-1的生长情况。

如图5可知，粘质沙雷氏菌ND1-1在最适生长温度24℃

6、接种量对菌株生长的影响

采用0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、2.5％、3％接菌量分别接菌，观察不同接菌量下粘质沙雷氏菌ND1-1的生长情况。

如图6可知，接菌量为1％时，ND1-1细菌的生长速度最快。

7、培养时间对菌株生长的影响

菌株培养时间分别设置为2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、18h、20h、 22h、24h、36h、38h、48h、60h、72h、84h、96h以及108h，观察不同培养时间菌株的生长情况。

如图7所示，随着培养时间增加，粘质沙雷氏菌ND1-1生长量增大，在72h时生长速度达到最大值，继续延长时间摇床培养，细菌生长速度开始减慢，OD值下降。

根据上述条件的筛选和优化得出，本发明分离得到的粘质沙雷氏菌ND1-1最佳培养基为YSP培养基，其包括以下成分：酵母浸粉5g，蛋白胨10g，蔗糖20g，水1000 mL。

最佳发酵培养条件为：粘质沙雷氏菌菌液按照1％接菌量，接种于YSP培养基，在24℃、初始pH值为7的条件下，培养72h，获取粘质沙雷氏菌发酵液，此时的菌含量可达到1.5×10

实施例3测定粘质沙雷氏菌ND1-1发酵液对咖啡灭字脊虎天牛幼虫的杀虫作用

根据上述筛选的最佳发酵培养条件，获取粘质沙雷氏菌ND1-1发酵液，测定其对对咖啡灭字脊虎天牛幼虫的杀虫作用。具体测定方法为：选取10头大小一致、健康的咖啡灭字脊虎天牛幼虫浸泡于细菌发酵液浸泡3s，单独装入指形管，用脱脂棉封口，重复3次，对照则用灭菌水浸泡3s，每天定时观察记录。最后计算校正累计死亡率。

经室内毒力测试结果表明，粘质沙雷氏菌ND1-1对咖啡灭字脊虎天牛(Xylotrechus quadripes Chevrola)幼虫的校正累计死亡率达76.67％(见表1)。

表1 ND1-1对咖啡灭字脊虎天牛幼虫的毒力

实施例4粘质沙雷氏菌ND1-1制备菌肥

按照上述筛选的最佳发酵培养条件，将粘质沙雷氏菌ND1-1接种于YSP培养基进行培养获取粘质沙雷氏菌发酵液，然后将所得发酵液按照有机肥重量的3.5％加入有机肥中，并将有机肥和发酵液混合均匀后，制备得到粘质沙雷氏菌肥。该生物菌肥中活菌数＞0.58×10

实施例5菌肥在提高小粒咖啡产量方面的应用

选择云南省临沧市某小粒咖啡种植区5年生正常结果的小粒咖啡树进行实验，选择50棵树，随机均分为两组，A组和B组中每棵小粒咖啡树在根基部穴施等量的有机肥，B组施用实施例5制备的粘质沙雷氏菌肥，其他种植和管理条件完全相同。

收获小粒咖啡种子后，发现B组平均产量比A组平均产量提高20.35％；另外，在管理过程中还发现，施用本发明制备的粘质沙雷氏菌肥的B组小粒咖啡树明显的咖啡灭字脊虎天牛危害减少，极大的减少了防控咖啡灭字脊虎天牛危害的工作，还有利于提高小粒咖啡的产量和质量。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。