分析

技术领域

本发明涉及样品中分析物的检测方法。本发明还提供一种用于此类方法的微流体卡盒，以及一种专用于此类方法或卡盒的基质。

背景技术

出于各种原因，人们需要对血液等液体样品进行检测。此外，人们希望能够检测全血样品，而不是血浆样品。然而，血液中的红细胞等成分会干扰或降低检测效率。例如，由于血液本身会对光学检测造成干扰，因此基于对血液样品内的酶活性或分析物进行光学检测的检测较为困难。这一问题可通过将酶/分析物从血液样品的主体中去除的方式得以解决，但是这一做法并不总能奏效，尤其在检测方法依赖存在的血液样品时。此类情况例如尤其为必须在一段时间内测定血液样品中的酶的作用的情形。

此方面的一例为凝血酶原时间(PT)或国际标准化比值(INR)检测。PT或INR检测常用于检查个人的凝血状态。此类情形尤其为接受口服华法林或香豆素等抗凝血剂治疗的个人的情形，其中，个人凝血状态的正确控制具有至关重要的作用。

PT/INR值可通过多种方法测定，包括电化学类，机械类及光学类方法。一种此类检测手段为

包括Abbott i-STAT系统在内的其他系统采用设于检测卡盒本身之内的电化学或光学传感器，以避免血液产生的任何光学干扰。

US5059525描述了一种用于PT检测的系统，该系统采用含于载体材料上干燥的合适试剂的测试条。然而，为了检测到合适的颜色变化，该系统似乎必要将血浆与血液分离，否则红细胞可能会干扰或遮盖所述颜色变化。

另一光学方法使用基于罗丹明110的荧光性凝血酶底物，该底物置于具有横向相对的施加面和指示面的渗透膜中。其中，通过荧光动力学分析获得可转化为INR的凝血酶原时间(Zweig SE,et al,Biomed Instrum Technol.1996 May-Jun；30(3):245-56)。

发明内容

本公开内容基于发明人所实施的对光学检测类分析的开发研究，此类分析可在含有一条或多条微流体通道的微流体系统内实施，其中，样品(如全血)可沿微流体通道输送，并采用另行设于该微流体通道附近的光学检测器检测光学变化。此外，更加概括性地说，发明人旨在减小或消除样品中的一种或多种成分对光学检测造成干扰或模糊的可能性。

从最为宽泛的意义上说，本公开内容基于对微流体类系统/方法的开发，在该系统/方法中，通过确保位于另行设置的读取设备内的光学检测手段与供检测的合适分析物或其反应产物的非常接近，实现对微流体通道内的合适分析物或其反应产物的光学检测。如此，可以最大程度地减小可能存在于样品中的且可能干扰光学检测和/或以其他方式使光学检测模糊的成分(如细胞或颗粒物)导致的任何影响。

应该理解的是，除非另有说明，否则本文所述的任何特征(包括任何随附的权利要求和附图)可与以下任何方面以任何组合方式组合。

在第一方面，提供一种用于检测样品内的分析物的动力学分析方法，所述方法包括：

1)向微流体通道的检测区域提供样品，所述检测区域包括可透光部分以及固着于所述微流体通道的可透光部分的内腔面上的试剂，其中，所述试剂与多孔基质结合在一起，并且能够与分析物或其反应产物反应而形成试剂反应产物，所述试剂反应产物能够用处于所述微流体通道的可透光部分的腔外的光学检测器检测；

2)通过所述可透光部分，取得所述试剂反应产物的至少一个光学测量值；以及

根据所述试剂反应产物的至少一个光学测量值，检测任何分析物。

“反应产物”应适宜理解为表示涉及所述分析物或试剂的反应的产物。因此，本领域技术人员应从化学意义对“反应”加以理解。反应使所述分析物或试剂转化或发生变化而形成所述反应产物，从而使得该反应产物虽源自所述分析物或试剂，但与该分析物或试剂不同或由该分析物或试剂转化而来。因此，“反应产物”应理解为所述分析物或试剂因反应而产生的一种变化后的实物。在一些实施方式中，所述反应产物为所述分析物或试剂的一种改变后的形式。

所述试剂可通过与以附着，结合或其他方式固着于所述内腔面上的所述多孔基质结合在一起，从而以附着，结合或其他方式固着于所述内腔面上。

在本文中，“基质”应理解为指可将一种或多种成分(如所述试剂或其试剂反应产物)以保留，结合或其他方式容留于其内或其上的支持物。如此，可产生使所述试剂及其任何试剂反应产物以与所述光学检测器非常接近的方式固着的优点。所述分析所需的任何其他试剂也可容留于所述基质之内和/或之上。

对所述试剂反应产物的光学测量可在所述基质的内部，外围或外部进行。在一种实施方式中，可光学检测的信号产生于所述基质的内部和/或外围。

所述试剂反应产物宜进行光学检测。例如，一旦所述试剂反应产物生成，光学信号便会发生变化。因此，所述试剂反应产物可通过光学信号发生的变化而实现光学检测。所述光学信号的变化可例如为荧光强度或荧光寿命的变化。光学信号可仅在所述试剂反应产物自所述试剂形成时才发出。如此，可使得信号发生清晰的变化。

所述基质为多孔基质。所述试剂通常与形成多孔基质的材料相混合，以使得该试剂整体分散于所述多孔基质之内。在本文中，处于所述检测区域内的多孔基质可称为“供光学信号生成的多孔基质”。

本领域技术人员应该理解的是，“多孔”一词是指具有多孔网络，或具有渗透性。本发明人认为，所述多孔基质的多孔性质使得必要的分析物(例如酶)或其反应产物能够从所述样品进入至所述多孔基质之内和/或之上。这使得任何分析物或其反应产物能够与处于所述基质之内和/或之上的试剂发生接触和反应，从而在反应之后，其任何试剂反应产物均与所述光学检测器紧密接近。虽然不希望受到理论的束缚，但发明人设想，所述多孔基质可设置为总体上不允许样品中可能存在的有可能对光学检测造成干扰和/或遮挡的红细胞或其他颗粒物等体积较大的成分渗透。如此，所述多孔基质可起到过滤作用，并且可不允许可能对光学检测造成干扰和/或遮挡的成分进入。

应该理解的是，检测可在所述可透光部分的位置上或其邻近处进行，也就是说，光学检测器可与所述可透光部分邻近设置，以透过所述可透光部分，对光学信号进行检测。作为替代方案，所述光学检测器不必与所述可透光部分邻近，但任何光学信号均可发送至不与所述可透光部分邻近设置的光学检测器，以供其检测。例如，可将用于信号检测的光纤设置于所述可透光部分的邻近处，而且该光纤能够将经所述可透光部分检测到的光学信号发送给所述光学检测器。在一些实施方式中，所述光学信号可通过摄像头以及合适光学器件进行检测，该合适的光学器件设计为对光学信号的变化进行检测或能够实现光学信号的变化的检测。

在本发明背景中，“微流体”应理解为指能够容纳微流体体积(即数微升体积，如10μl以下体积)的通道。然而，应该理解的是，在一些实施方式中，“微流体”一词还旨在包括能够输送小于1μl的体积(即10nl～100nl或更大的纳米流体体积)的通道。

所述试剂反应产物能够在所述多孔基质内部和/或外周进行直接或间接光学检测。所述多孔基质的固着性质具有使得所述试剂或其试剂反应产物的直接或间接光学信号位置固定的优点。该光学信号位置固定的性质确保即使当所述样品中仅存在低量的所述分析物时，也能检测到该光学信号。

“所述多孔基质之内”应理解为指处于该多孔基质的内部和/或处于该多孔基质的表面上。总体上，对于液体样品和/或存在于该样品内的试剂/分析物，如溶解的试剂/分析物，所述基质可具有多孔性，但是对于可能存在于样品中的悬浮物，如细胞或其他悬浮物，该基质可不具有多孔性。因此，举例而言，当所述样品为全血样品时，血液中带有溶解或悬浮小分子和/或蛋白质的液体成分可能能够进入所述多孔基质，但是细胞和细胞物质(如细胞碎片和血小板)等较大血液成分可能因此类较大血液成分的体积较大而无法进入所述多孔基质。

为了生成所需的光学信号，可能需要一个以上的酶促步骤和/或反应步骤。例如，取决于待检测的分析物，可能会需要两个，三个或更多个步骤。

在两个或更多个步骤的设想情形中，必要试剂可存在于单个多孔基质(供光学变化/信号生成的多孔基质)中，或者必要试剂可存在于两个或更多个多孔基质中，或者必要试剂可至少部分存在于用于生成光学变化/信号的多孔基质的外部。如此，多个反应步骤可在单个多孔基质内进行，或者多于一种的多孔基质可设置不同的试剂，或者至少部分试剂可设置于用于生成光学变化/信号的多孔基质的外部，从而使得所述微流体通道的不同位置可发生不同反应。例如，在一种实施方式中，可提供两个多孔基质，第一多孔基质可包括用于生成分析物反应产物的必要试剂，第二多孔基质可包括能够因与所述分析物反应产物接触后形成的试剂反应产物而生成可检测光学变化/信号的必要试剂(即用于生成光学变化/信号的多孔基质)。因此，根据本发明，可以将待检测光学信号的生成所需的各反应彼此隔开或分离。这一点可有利于单个多孔基质内的试剂，成分或赋形剂可能会例如彼此干扰或以其他方式相互作用的情形。

当提供两个或更多个多孔基质时，或者当部分试剂与用于生成光学变化/信号的多孔基质分隔开时，可以设想到的是，至少用于生成光学变化/信号的多孔基质固着于所述检测区域的可透光部分的内腔面上。其他多孔基质或所述分开的试剂也可固着在所述检测区域的可透光部分的内腔面上。或者，其他多孔基质或所述分开的试剂可固着于所述微流体通道的非检测区域的部分上。如此，便于将某些反应与所述检测区域隔开，并因而可有助于减轻或防止对光学检测的干扰。

如上所述，在使用过程中，所述可透光部分旨在设置为与所述光学检测器或其光学检测部件非常接近，以确保检测的有效性和/或减少可能因样品中的成分(如全血样品中的红细胞)而发生的任何干扰。在一些实施方式中，所述通道的可透光部分设计为该通道的顶部(或“上部”)部分。应该理解的是，所述“顶部”或“上部”指的是使用时的可透光部分，本领域技术人员能够容易地理解和体会其涵义。所述可透光部分的位置应与所述光学检测器或其光学检测部件邻近或与其处于同一侧。当所述光学检测器或其光学检测部件朝向所述顶部时，该检测器或其部件宜指向下方。如此，可实现限制灰尘堆积于所述检测器或其部件上的优点，从而防止其对光学检测造成模糊作用。这一优点尤其适用于所述多孔基质固着于上部腔面的实施方式。相应地，在一些实施方式中，所述多孔基质固着于所述可透光部分的顶部内腔面。如此，该多孔基质保持力需克服其重力。虽然不希望受到理论的束缚，但本发明人认为，通过将所述多孔基质固着于所述可透光部分的顶部内腔面，可确保将样品中的可能以其他方式对检测造成干扰的成分(如红细胞)保持于所述多孔基质之外，从而减小或消除光学检测受到的干扰。然而，在其他实施方式中，所述多孔基质可固着于所述可透光部分的底部(或“下部”)内腔面上，在该情形中，所述光学检测器或其光学检测部件可设置于所述可透光部分的下方。在本质上，本发明旨在通过使样品不介于所述多孔基质与所述光学检测器或其光学检测部件之间，使得样品不会对所述多孔基质内的任何光学信号的生成造成干扰或其他方式的阻挠，从而对光学信号的检测造成干扰或其他方式的阻挠。

在包括其他多孔基质的实施方式中，所述其他多孔基质可固着在所述微流体通道的非检测区域的部分的内腔面上。该内腔面既可以为上部内腔面，也可以为下部内腔面。

本发明涉及动力学分析，有时也称终点分析。动力学分析为基于酶的分析，旨在通过反应过程中底物的消耗量或者产物的生成量而测定物质或分析物的量。然而，并不需要达到真正的终点，而且在许多情况下，反应速度率是确定的。

本发明例如适用于任何可对样品实施的终点或动力学分析。本领域技术人员应理解的是，终点分析包括在一段固定的时间后进行一次测量。因此，步骤2)可在一段固定的时间后执行一次。

所述一段时间可以为至少10秒，至少30秒，至少1分钟，至少1.5分钟，至少2分钟，至少3分钟或至少5或10分钟。所述一段时间可以为不多于10或5分钟，不多于3分钟，不多于2分钟，不多于1.5分钟或不多于1分钟。在一些实施方式中，所述一段时间大约为2分钟。

根据本发明实施方式，步骤2)可包括在一段时间内取得所述试剂反应产物的多个光学测量值，随后的步骤包括根据所述多个光学测量值，检测任何分析物。通过这种方式，所述一系列光学测量值可追随反应从底物变成产物的进展。其中，一般情况下，可存在光学信号(例如可检测到的吸光度，荧光强度等)的变化，并且可使用分光光度计或荧光计，以例如监测光学信号的变化，该变化可以为信号随时间的增大或减小。

一般情况下，此类分析可用于检测或确定样品中一种或多种分析物的量。当所述样品为血液或其他体液的样品时，所述分析物可例如包括可能存在于该样品中的酶，脂质，脂蛋白，细胞因子，激素或其他生物标志物，包括内毒素等。一般情况下，分析物可包括凝血因子和/或脂质等酶，所述脂质例如为胆固醇或脂蛋白(a)等其他脂蛋白。

发明人将所述分析总体设想为酶促分析或脂质/脂蛋白分析。在酶促分析中，所述分析物包括一种或多种酶。在脂质/脂蛋白分析中，所述分析物包括一种或多种脂质/脂蛋白。

所述试剂反应产物应理解为所述分析物或其分析物反应产物与所述试剂的反应产物。

所述试剂反应产物可以为所述分析物与试剂的直接反应产物。例如，在包括酶促分析的实施方式中，所述试剂反应产物可得自分析物，该分析物与所述试剂直接反应形成所述试剂反应产物。反应可包括接触，例如，所述分析物因酶的裂解作用而形成所述试剂反应产物，或者所述分析物包括将所述试剂裂解而形成所述试剂反应产物的酶。或者，反应可包括所述试剂对所述分析物的氧化或还原反应或者所述分析物对所述试剂的氧化或还原反应，或者由此类氧化或还原反应构成，以形成氧化或还原后的试剂反应产物。

在一些实施方式中，所述试剂反应产物为所述分析物与所述反应产物的前体之间的间接反应的产物。例如，所述分析物可与反应途径中的成分直接反应，以形成分析物反应产物。该分析物反应产物可随后与所述反应途径中的下游成分(在本发明背景中，该下游成分可理解为进一步的分析物反应产物)反应。其后，所述反应途径的所述分析物反应产物、进一步的分析物反应产物或进一步的下游成分可与试剂直接反应形成试剂反应产物，从而生成所述试剂反应产物。

根据本发明的分析可应用的一种领域为伤口护理/愈合。其中，可例如对基质金属蛋白酶等蛋白酶进行监测(见Lazaro,J.L.et al,J of Wound Care,Vol 25,No.5,May2016)。

用于检测的酶包括接触激活途径(内源性途径)和组织激活途径(外源性途径)的酶，以及可存在于血液中的蛋白酶或核酸酶等其他酶。在一种实施方式中，本发明涉及所述外源性或内源性途径中的一种或多种酶的检测，或者对此两途径的共同成分的检测。与此两途径相关的其他描述将涉及凝血酶活性的检测，并因而涉及PT值和/或INR值的测定。然而，这不应理解为构成限制，除此之外，还可容易地想到能够检测和/或测定所述外源性或内源性途径中的其他成分或者其他途径中的酶的影响的方法。

所述外源性或内源性途径中的其他成分包括，但不限于，因子X，因子Xa，因子II，纤维蛋白单体以及蛋白C。

在一些实施方式中，所述用于检测的分析物包括凝血酶。因此，所述方法可包括，根据所述试剂反应产物的至少一个光学测量值，检测任何凝血酶。

所检测的凝血酶可用于确定样品的凝血酶原时间(PT)或国际标准化比(INR)值。例如，所述多孔基质可包括凝血酶可裂解底物作为所述试剂，该底物能够在被凝血酶裂解时，生成荧光信号等可检测的光学信号。所述凝血酶可裂解底物可包括可被凝血酶识别和裂解的肽序列以及在所述肽裂解后能被检测到的关联荧光性分子，以下将对此进行进一步详细描述。一般情况下，凝血酶裂解产物保留于所述多孔基质内部，并且/或者残留于所述多孔基质的附近或外围。

用于检测的脂质和/或脂蛋白包括，但可不限于，脂蛋白(a)，乳糜微粒，极低密度脂蛋白(VLDL)，中间密度脂蛋白(IDL)，磷脂，胆固醇以及甘油三酸酯。本领域技术人员应该理解的是，胆固醇可包括低密度脂蛋白(LDL)胆固醇和高密度脂蛋白(HDL)胆固醇。胆固醇可包括游离胆固醇和/或胆固醇酯。

在一些实施方式中，用于检测的分析物包括胆固醇。

本领域技术人员应该理解的是，在胆固醇氧化酶存在的条件下，胆固醇可发生以下反应：

因此，所述样品可包括内源性胆固醇氧化酶，以及/或者可加入至该样品的外源性胆固醇氧化酶，或者所述多孔基质内存在的外源性胆固醇氧化酶。在一些实施方式中，所述胆固醇反应产物是用于检测的分析物。

胆固醇反应产物可包括过氧化氢。在一些实施方式中，过氧化氢将所述试剂氧化，从而形成试剂反应产物。

所述样品可以为生物样品。该生物样品可宜为从检测对象获得的任何合适的液体或组织样品。例如，该生物样品可包括尿液，唾液，全血，血浆，痰液，精液，粪便，鼻拭子，伤口拭子，泪液，阴道拭子，直肠拭子，宫颈涂片，组织活检标本以及尿道拭子当中的至少一种。该生物样品适宜为易于从检测对象获取且检测对象无需他人帮助或任何有创技术便可自行获取的样品，例如尿液，唾液，全血，痰液等。在一些实施方式中，该样品为全血或伤口拭子。在一种实施方式中，该样品为全血。

该方法可进一步包括预备步骤，该预备步骤包括：将样品引入微流体通道；然后将至少一部分样品输送到检测区域。样品可经入口引入，该入口可与所述微流体通道相连。样品可通过与所述入口接触而直接引入。或者，可先以浸棒，微量移液头，毛细管等样品收集装置收集该样品，然后通过将该样品收集装置与所述样品入口接触或插入该样品入口而使得所述样品可引入所述微流体通道。

在一些实施方式中，例如当进行核酸分析时，该方法可能需要在封闭系统内实施。因此，用于将所述样品引入所述微流体通道的样品收集装置可达到如下双重目的：引入所述样品；以及当该样品收集装置插入所述样品入口或者与该样品入口接触后，将该样品入口密封。

在另一方面，提供一种用于本文所述的方法的微流体通道，该微流体通道包括：

检测区域，所述检测区域用于接收提供至该微流体通道的样品的至少一部分，所述检测区域包括可透光部分和含试剂的多孔基质，所述试剂固着于所述微流体通道的可透光部分的内腔面上，其中，所述试剂能够与所述样品中的待检测分析物或其分析物反应产物反应，以生成可被光学检测的试剂反应产物。

所述微流体通道可由以下三层构成：顶层；底层；以及置于该顶层和底层之间的中间层。这些层相互叠加在一起，限定出所述微流体通道。其中，该微流体通道的侧壁可由所述中间层限定。在一些实施方式中，所述顶层包括所述通道的可透光部分。所述多孔基质可沉积于所述顶层的内腔面。在该顶层中，仅旨在与所述检测区域重叠的部分可透光。在一些实施方式中，所述顶层由可透光部分构成。在一些实施方式中，所述顶层由所述可透光部分构成，而供光学变化/信号生成的多孔基质沉积于该顶层的内腔面上。在一些实施方式中，供光学变化/信号生成的多孔基质沉积于所述底层的内腔面上。

在一些实施方式中，所述中间层的形式为与所述顶层和底层粘合的粘合层，从而构成层叠结构。关于合适的微流体通道及其在合适的微流体卡盒中的存在形式方面的更多细节，本领域技术人员可参见WO2018/002668，该文的全部内容援引于此。

通过将包括所述试剂的多孔基质固着于所述通道可透光部分的内腔面，可使所述试剂反应产物非常接近于关联读取设备内的光学检测器或其光学检测部件，从而促进所述试剂反应产物的检测，并且/或者提高检测灵敏度。所述样品内的其他成分可不进入并且/或者不保持于或以其他方式残留于固着在所述内腔面上的多孔基质内，从而减小或消除所述其他成分的干扰。因此，通过使所述试剂反应产物非常接近所述光学检测器或其光学检测部件，可以使得检测发生于各种成分较少能够干扰和影响光学检测的环境内。通过这种方式，所述试剂反应产物的光学检测可在所述光学检测装置和试剂反应产物之间的光路中一般无红细胞等成分的情形下进行。在现有技术中，如果试剂反应产物分散于整个微流体通道内，则光学检测装置与试剂反应产物之间的光路内有可能会存在各种成分(如全血中的红细胞及其他细胞物质)，从而导致干扰和/或灵敏度降低。

一般情况下，所述微流体通道可包括于卡盒中，但不限于卡盒。在一些实施方式中，设置多条微流体通道。所述卡盒内可设置两条，三条，四条，五条，六条，七条，八条，九条，十条或更多条微流体通道。

可选地，当存在上述入口时，该入口也包括于所述卡盒内。该卡盒可设计为插入关联的读取设备内。为了简洁起见，以下将以所述微流体通道包括于卡盒内的情形进行描述，但这并不解释为构成限制。

在另一方面，提供一种用于对样品进行第一方面的分析的微流体卡盒，所述微流体卡盒包括：

至少一条微流体通道，其中，每一/所述微流体通道包括检测区域，所述检测区域包括可透光部分和含试剂的多孔基质，所述多孔基质固着于所述可透光部分的内腔面上，所述试剂能够与所述样品内的待检测的分析物或反应产物反应，以生成可用于光学检测的试剂反应产物。

该系统可由三层构成，这些层彼此堆叠在一起，限定出每一/所述微流体通道。

可选地，每一/所述微流体通道进一步与处于每一/所述检测区域下游的可外部加压的充气腔室流体连接，其中，通过以处于所述腔室外部的加压装置对该腔室进行加压或减压，可将气体驱离或吸入该腔室，而这又进一步使得所述样品在所述/每一微流体通道内发生移动。关于含充气腔室的合适微流体卡盒及其工作原理方面的更多细节，本领域技术人员可参见WO2018/002668，该文的全部内容援引于此。

所述微流体卡盒通常进一步包括与每一/所述微流体通道连通的样品进口/入口。在一些实施方式中，所述样品进口的形式为可供样品置于其中的凹孔。在某些实施方式中，所述凹孔可在形状上总体为圆形，并且在尺寸上可使得一滴血液能够容易地容纳于其中。该凹孔的体积可以为至少1μl，但不大于30μl。该凹孔的体积可以为至少4μl，但不大于10μl。该凹孔可形成于所述卡盒的顶表面。吸入所述卡盒中且充入至没过所述检测区域的血液等样品的总体积一般可以为3～6μl，例如3.5～5μl。所述检测区域的总体积可以为0.75～1.25μl。因此，本发明的分析/方法具有能够分析极小体积样品的优点。

所述样品进口或入口可一般位于所述卡盒的顶表面，以使得样品易于施加以及引入卡盒，并易于输送至所述微流体通道内。因此，应该理解的是，在一种实施方式中，所述入口位于可供所述多孔基质附着的同一基板上。所述入口使得样品能够从所述卡盒的外部顶表面进入所述微流体通道的内腔中，而所述多孔基质附着于该微流体通道的内腔的内表面上。

在一种实施方式中，所述可透光部分设置于所述微流体卡盒的顶表面或顶面上。

为免存疑，本发明的微流体通道或卡盒无需在所述卡盒内存在或设置充液囊，无需所述腔室内具有活塞等运动部件，而且/或者无需具有将流体(液体或气体)从关联读取设备输送至所述卡盒的能力。在这一意义上，本发明的卡盒可视为自持装置。在施加样品之前，本发明的卡盒基本上或完全不含液体，并可视为处于干燥状态。在施加样品之前，所述卡盒内可以存在或本身存在的唯一流体为气体，一般为空气。有利的一点是，本发明的分析中需要的唯一液体为所述样品本身。

该卡盒的基本上或完全不含液体的性质不仅简化了该卡盒本身的制造，而且还改善了其保质期，并使得本发明的多个卡盒能够在室温下保存而在使用前几乎不发生化学或生物成分的变质。

在一些实施方式中，所述方法进一步包括将所述卡盒插入读取设备的步骤。将所述卡盒插入读取设备的该步骤一般可在将所述样品施加至所述卡盒/微流体通道之前进行。所述读取设备包括光学检测器或其光学检测部件。关于合适的读取设备方面的更多细节，本领域技术人员可参见WO2018/002668，该文的全部内容援引于此。

在一些实施方式中，所述方法包括至少两个预备步骤，包括：

a)将所述卡盒插入读取设备；以及

b)将所述样品引入每一/所述微流体通道。

所述样品可通过被动方式(如毛细管作用)，主动方式(例如以泵等施加动力)或此两方式的混合方式引入每一/所述微流体通道。例如，在一种实施方式中，所述样品先通过毛细管作用引入所述微流体通道，然后再在泵等施加的主动作用的控制下进一步移动。所述泵一般设置于所述卡盒外部，例如设置于关联读取设备内。

所述样品可通过主动充入机构提供至所述检测区域。在一些实施方式中，所述样品通过主动方式移动进入并且/或者通过所述检测区域和/或多孔基质。

一般情况下，所述卡盒可在样品施加之前设置在或插入所述读取设备内。

“透光”应理解为，具有确定波长的光能够透射穿过所述部分并经该部分接收，也就是说，该部分基本上对透射穿过该部分并经该部分接收的光的波长不具有淬灭或吸收作用。通过这种方式，来自光学检测器的光可透射通过所述部分，与所述分析物或分析物反应产物相遇，进而被其反射或吸收后重新发射，并可被所述光学检测器检测。在一些实施方式中，所述部分为透明部分。在一些实施方式中，所述部分为半透明部分。“确定波长”应理解为包括，但不一定限于，至少10nm且不大于1500nm的波长。一般情况下，来自所述光学检测装置且透射通过所述可透光部分且经该部分接收的光的波长可至少为300nm且不大于800nm。

所述多孔基质以及可选的与其分离的试剂/成分可通过结合在所述内腔面上而固着在该内腔面，该内腔面可例如为顶部内表面。所述结合可以为例如通过物理吸附，共价化学偶联，支架，非共价化学偶联(如生物素与亲和素之间)或任何此类方式的组合实现的直接或间接结合。在一种实施方式中，所述多孔基质以物理方式吸附，而不是通过任何共价键合或离子键合的方式结合。分析物反应产物的前体(即与分析物的反应中的成分)可固着在所述内腔面上，并且/或者作为所述多孔基质的一部分，并且/或者设置于该多孔基质内或设置于该多孔基质上。所述前体可能够与所述分析物相互作用，以生成分析物反应产物。举例而言，所述前体可能够与所述分析物结合和/或反应。因此，所述多孔基质可用作所述前体的支架。

供光学变化/信号生成的多孔基质宜具有粘性，并因而可承受流体/血液流动。任何额外基质也可具有粘性，但是在一些实施方式中，额外基质的粘性低于供光学变化/信号生成的多孔基质。如此，所述多孔基质以及关联的前体和/或试剂(如有)将与所述光学检测器保持对准或非常接近，以确保与所述样品接触后的最佳检测。

应该理解的是，供光学变化/信号生成的多孔基质部分透光，或可以部分透光。在包括一种或多种额外基质的实施方式中，所述额外基质也可至少部分透光。在一些实施方式中，所述多孔基质为透明基质。在一些实施方式中，所述多孔基质为半透明基质。如此，有助于对所述多孔基质之内和/或之上的光学信号进行检测。

所述多孔基质可包括至少一种载体分子，如聚合物。在一种实施方式中，所述载体分子一般不溶于水基溶液。所述至少一种载体分子可一般不溶于所述样品流体，或者至少在实施所述分析所需的时间内不溶于所述样品流体。在水基溶液内，所述载体分子可形成胶体。“胶体”应理解为指不溶解但能够悬浮/分散于整个溶剂内的载体分子。该溶剂可以为水。在一种实施方式中，所述载体分子通常不溶于血液。在一些实施方式中，所述载体分子包括有序结构制造者(Kosmotrope)。“有序结构制造者”应理解为，所述载体分子使得水分子以有利方式相互作用，也就是说，所述聚合物有助于水-水相互作用的稳定性和结构。

在一些实施方式中，所述至少一种载体分子包括至少一种碳水化合物。

所述至少一种碳水化合物可包括至少一种单糖，二糖或多糖。本领域技术人员应该理解的是，多糖为聚合物。

在一些实施方式中，所述至少一种载体分子包括至少一种糖。在本发明背景中，糖应理解为指单糖和二糖。

在一些实施方式中，所述至少一种载体分子包括至少一种二糖或多糖。

单糖例如包括，但不限于，葡萄糖，果糖，半乳糖，丙糖，丁糖，戊醣，己糖及庚糖。

二糖例如包括，但不限于，蔗糖，乳糖，麦芽糖，海藻糖，纤维二糖及壳二糖。

多糖例如包括，但不限于，直链淀粉，支链淀粉，纤维素，甲壳素，胼胝质，昆布多糖，金藻昆布多糖，木聚糖，阿糖基木聚糖，甘露聚糖，岩藻多糖及半乳甘露聚醣。

在具体实施方式中，所述至少一种载体分子包括至少一种二糖。

优选地，所述至少一种载体分子至少包括海藻糖。

在一些实施方式中，所述至少一种载体分子包括至少一种多糖。在一些实施方式中，所述至少一种聚合物包括纤维素或甲壳素。在其他实施方式中，所述至少一种聚合物包括至少一种纤维素衍生物。

在一些实施方式中，所述至少一种载体分子包括纤维素或至少一种纤维素衍生物。

在一些实施方式中，所述至少一种载体分子包括海藻糖和至少一种纤维素衍生物。

所述纤维素衍生物可选自羧甲基纤维素(CMC)，纤维素乙基磺酸酯(CES)，羟乙基纤维素(HEC)，羟丙基甲基纤维素(HPMC)，羟丙基纤维素(HPC)，微晶纤维素(MCC)，甲基纤维素及其盐(如钠盐，钾盐，钙盐)。

盐可优选钠盐。

所述纤维素衍生物可选自羧甲基纤维素(CMC)，羟乙基纤维素(HEC)，微晶纤维素(MCC)及其盐。

在一些实施方式中，所述纤维素衍生物选自羧甲基纤维素(CMC)，羟乙基纤维素，微晶纤维素及羧甲基纤维素钠。

所述纤维素衍生物可包括羧甲基纤维素和微晶纤维素，如纤维素衍生物AvicelRC-591。

所述纤维素衍生物可以为羧甲基纤维素(CMC)。

所述纤维素衍生物可以为羟乙基纤维素(HEC)。

在一些实施方式中，所述纤维素衍生物包括至少0.1，至少0.2，至少0.3，至少0.4，至少0.5，至少0.6，至少0.7，至少0.8，至少0.9，至少1.1，至少1.2，至少1.5，至少2或至少3个取代度。例如，在羧甲基纤维素情形中，所述取代度为纤维素链上甲氧基(羧甲基)取代的平均水平(即每个脱水葡萄糖单元中被甲氧基取代的羟基的平均数目)。因此，在羧甲基纤维素情形中，取代度为0.7应理解为指每10个脱水葡萄糖单元中平均有7个羧甲基，而取代度为3应理解为指脱水葡萄糖单元上的三个羟基全部被羧甲基取代。

在一些实施方式中，所述纤维素衍生物包括至少0.5且不大于2的取代度。在一些实施方式中，所述纤维素衍生物包括至少0.5且不大于1.2的取代度。在一些实施方式中，所述纤维素衍生物包括至少0.7且不大于1.2的取代度。

在具体实施方式中，所述纤维素衍生物包括CMC，并包括至少0.7且不大于1.2的取代度。

所述纤维素可以为结晶状态。

在一些实施方式中，所述至少一种载体分子包括聚乙二醇(PEG)。

所述多孔基质可包括至少两种，至少三种，至少四种，至少五种，至少六种，至少七种，至少八种，至少九种或至少十种载体分子。

在一些实施方式中，所述多孔基质包括不多于十种，不多于九种，不多于八种，不多于七种，不多于六种，不多于五种，不多于四种，不多于三种或不多于两种载体分子。

在具体实施方式中，所述多孔基质包括至少两种载体分子。在一些实施方式中，所述至少两种载体分子包括至少两种碳水化合物。所述至少两种载体分子可包括至少一种二糖和纤维素或纤维素衍生物。所述二糖可包括海藻糖。所述至少两种载体分子可包括至少一种碳水化合物和聚乙二醇。

在具体实施方式中，所述至少两种载体分子包括海藻糖和至少一种纤维素衍生物。所述纤维素衍生物可以为羧甲基纤维素(CMC)。

在一些实施方式中，所述至少两种载体分子至少包括纤维素和羧甲基纤维素钠。

在具体实施方式中，所述至少两种载体分子包括海藻糖和羧甲基纤维素。

在一些实施方式中，所述至少两种载体分子包括羟乙基纤维素(HEC)和海藻糖。

在其他实施方式中，所述至少两种载体分子包括纤维素和羧甲基纤维素钠。

在其他实施方式中，所述多孔基质包括至少三种载体分子。所述至少三种载体分子可包括至少三种碳水化合物。所述至少三种载体分子可包括至少一种二糖和纤维素。在一些实施方式中，所述至少三种载体分子包括至少一种二糖和至少一种纤维素衍生物。在一些实施方式中，所述至少三种载体分子包括至少一种二糖，纤维素和至少一种纤维素衍生物。在其他实施方式中，所述至少三种载体分子包括至少一种二糖，纤维素或纤维素衍生物以及PEG。

在一些实施方式中，所述至少三种载体分子至少包括纤维素，羧甲基纤维素钠以及海藻糖。

在一些实施方式中，所述至少三种载体分子包括羟乙基纤维素(HEC)，海藻糖以及PEG。

在一些实施方式中，所述至少三种载体分子包括纤维素，羧甲基纤维素钠以及海藻糖。

在其他实施方式中，所述至少三种载体分子包括纤维素，羧甲基纤维素钠以及HEC。

在一些实施方式中，所述多孔基质包括至少四种载体分子。所述至少四种载体分子可包括至少四种碳水化合物。所述至少四种载体分子可包括至少一种二糖，纤维素或纤维素衍生物以及PEG。在一些实施方式中，所述至少四种载体分子包括至少一种二糖，纤维素，至少一种纤维素衍生物以及PEG。

在其他实施方式中，所述至少一种载体分子包括羟乙基纤维素(HEC)。

所述多孔基质可最初以允许通过蒸发或其他方式干燥的液体形式提供。因此，本文中提及在所述多孔基质中的浓度时指分子/成分在液体形式的基质中的浓度(即在允许该基质通过蒸发或其他方式干燥前以及样品添加前的浓度)。

所述多孔基质的液体形式可包括至少50nl且不大于200nl的体积，优选至少100nl且不大于160nl的体积。应该理解的是，通过这种方式，所沉积的多孔基质即使在干燥前也仅占所述检测区域的总体积当中的相对较小的体积。例如，所述多孔基质在干燥前可包括的体积在所述检测区域的总体积中的占比小于40％，30％，或25％。

所述至少一种载体分子可以以在所述多孔基质中至少为0.05w/v％且不大于40w/v％的浓度提供。所述至少一种载体分子可通常以至少10w/v％且不大于15w/v％的浓度提供。

所述载体分子的浓度应理解为该载体分子在湿态时在所述多孔基质(即在样品添加前该基质是以允许通过蒸发或其他形式干燥的液体形式施加)中的最终浓度。因此，当所述载体分子包括多于一种载体分子时，所述最终浓度应理解为所有所述载体分子的最终浓度。

在具体实施方式中，所述至少一种载体分子至少包括海藻糖。海藻糖可以以至少5w/v％，至少6w/v％，至少8w/v％，至少10w/v％且不多于30w/v％或不多于40w/v％的浓度提供。

海藻糖的浓度应理解为指以液体形式施加时海藻糖在所述多孔基质内的最终浓度，而非指当载体分子包括海藻糖之外的载体分子时载体分子的最终浓度。

在一些实施方式中，海藻糖以大约10w/v％的浓度提供。

在具体实施方式中，所述至少一种载体分子至少包括羧甲基纤维素(CMC)。CMC可以以在所述多孔基质中至少0.05w/v％且不大于0.6w/v％的浓度提供。在一些实施方式中，CMC以在所述多孔基质中至少0.08w/v％且不大于0.4w/v％的浓度提供。

在具体实施方式中所述至少一种载体分子至少包括HEC。HEC以在所述多孔基质中至少0.1w/v％且不大于2w/v％的浓度提供。在一些实施方式中，HEC以在所述多孔基质中至少0.25w/v％且不大于1w/v％的浓度提供。

所述多孔基质可包括分子量为至少50000g/mol且不大于1300000g/mol的HEC。所述多孔基质通常可包括分子量为720000g/mol的HEC。

所述多孔基质可包括具有至少两种不同分子量的HEC。

所述多孔基质可进一步包括一种或多种成分。当所述样品为血液样品时，所述一种或多种成分可包括，但不限于，一种或多种组织因子，一种或多种凝血因子，一种或多种荧光团，抗纤维蛋白原，抗抗凝血酶III，胆固醇氧化酶，一种或多种去污剂以及一种或多种抗凝血抑制剂。所述一种或多种成分可包括一种或多种其他试剂。

在测定凝血酶原时间(PT)或国际标准化比(INR)值的分析中，所述一种或多种成分可包括，但不限于，一种或多种组织因子，一种或多种凝血因子，一种或多种荧光团，抗纤维蛋白原，抗抗凝血酶III，一种或多种去污剂和/或一种或多种抗凝血抑制剂。

在一种实施方式中，为了确定PT/INR，所述载体分子包括CMC和PEG。CMC的存在量可以为0.025～0.125wt％，如0.05～0.1wt％。PEG的存在量可以为0.5～4wt％，如0.75～3.5wt％。

此外，还可存在其他成分，如海藻糖(2～8wt％)，ReadiPlasTin(25～40wt％)，显色底物(如可由酶裂解的罗丹明，0.05～0.75wt％)，表面活性剂(如吐温，0.01～0.05wt％)以及/或者聚凝胺(0.1～0.2mg/ml)。

在测定胆固醇值的分析中，所述一种或多种成分可包括，但不限于，一种或多种荧光团，辣根过氧化物酶(HRP)，胆固醇氧化酶，胆固醇酯酶以及一种或多种去污剂。

在包括胆固醇氧化酶(无论是添加在样品中，或者是作为所述多孔基质的成分)的实施方式中，HRP可含于样品中或作为所述多孔基质的一种成分，以用作氧化还原介体。

所述一种或多种荧光团可包括RPE(R-藻红蛋白)和/或PERCP(多甲藻黄素-叶绿素-蛋白质复合物)。有利地，通过使所述多孔基质含有一种或多种荧光团，可有助于在样品施加前对所述多孔基质进行检测。

抗抗凝血酶III用于抑制ATIII(抗凝血酶III)。本领域技术人员应该理解的是，ATIII为一种针对凝血酶的自身抗体，可抑制凝血酶的活性。因此，通过在所述多孔基质中加入抗抗凝血酶III，可实现防止ATIII抑制凝血酶的优点。如此，可以增大基于凝血酶的分析中获得的信号。

组织因子也称为因子III，是一种外源性凝血途径的脂蛋白抑制剂。本领域技术人员应该理解的是，组织因子的市售产品有RecombiPlastin 2g(Werfen)或ReadiPlasTin。ReadiPlasTin为RecombiPlastin 2g去除钙后的一种浓缩液体形式。其他市售组织因子也应为本领域技术人员所知。

所述一种或多种凝血因子可包括钙，因子V/Va，因子X/Xa，凝血酶原，因子VIIa，因子IXa及因子XIa当中的一种或多种。因子V/Va为一种与因子Xa和钙形成凝血酶原酶复合物的辅因子。该复合物将凝血酶原裂解，从而将其转化为凝血酶这一活性形式。因子V/Va由凝血酶调控——其既可由正反馈回路中的凝血酶直接激活，也可经血栓调节蛋白-蛋白C复合物(与辅因子蛋白S)途径由凝血酶间接激活。其他凝血因子也应为本领域技术人员所知。

所述一种或多种凝血因子可选自钙，因子V/Va，因子X/Xa，凝血酶原，因子VIIa，因子IXa以及因子XIa。

所述多孔基质可包括浓度至少为0.1mM且不大于25mM的钙。应该理解的是，摩尔或毫摩尔浓度涉及以液体形式提供时的浓度，所述液体形式随后允许以蒸发或其他方式干燥。

所述多孔基质可包括浓度至少为0.1单位/ml且不大于120单位/ml，例如至少10单位/ml且不大于100单位/ml的因子V/Va。

所述多孔基质可包括浓度至少为0.1μg/ml且不大于20μg/ml的因子X/Xa。在一些实施方式中，所述多孔基质包括浓度至少为1μg/ml且不大于15μg/ml的因子X/Xa。

所述多孔基质可包括浓度至少为0.05mg/mL且不大于0.25mg/mL的凝血酶原。

所述多孔基质可包括浓度至少为0.1μg/ml且不大于50μg/ml的因子VIIa。

所述多孔基质可包括浓度至少为0.1μg/ml且不大于50μg/ml的因子IXa。

所述多孔基质可包括浓度至少为0.1μg/ml且不大于50μg/ml的因子XIa。

抗凝血抑制剂的一例为聚凝胺(海美溴铵，HMB)。所述抗凝血抑制剂可以在所述多孔基质中至少为0.05mg/mL且不大于0.5mg/ml的浓度提供。在具体实施方式中，所述抗凝血抑制剂以在所述多孔基质中为大约0.25mg/ml的浓度提供。

如上所述，应该理解的是，以单位/ml，μg/ml或mg/ml为单位的浓度涉及的是以液体形式提供时的浓度，所述液体形式随后允许以蒸发或其他方式干燥。所述多孔基质的液体形式可先施加为斑点，该斑点随后例如允许干燥。所述斑点在施加后可由机械或其他方式四散摊开，以使得所提供的多孔基质变得更薄且更加均匀。更薄且更为分散的斑点可促进光学信号的生成和/或检测。干燥后的斑点宜进行厚度控制，而且可具有基本均匀的厚度。干燥后的斑点的最大厚度可以为1～5μm，例如1～3μm。可以在所述检测区域内提供例如正方形或长方形形式的疏水性印制特征，并且多孔基质提供并铺开于由这些疏水性印制特征界定的区域内。通过这种方式，可使所述多孔基质位于所述检测区域中的确定区域内，从而确保所述多孔基质能够以可再现且均匀的方式沉积。

所述一种或多种去污剂可包括吐温-20。

所述试剂反应产物能够在所述多孔基质之内或之上被直接或间接地光学检测。“直接”可理解为，所述试剂反应产物能够发出光学信号，如荧光或比色信号。“间接”可理解为，所述试剂反应产物能够与另一试剂反应，而该试剂能够在与所述试剂反应产物反应时发出光学信号。一般情况下，所述试剂反应产物能够进行直接光学检测。

所述分析物可能够与该分析物的特异性试剂反应，以生成分析物反应产物，该分析物反应产物进一步能够与另一试剂反应，该另一试剂能够在与所述分析物反应产物相互作用时，作为所述试剂反应产物发出光学信号。举例而言，所述试剂和另一试剂既可存在于单个多孔基质，也可存在于相互分开的多孔基质内。

所述多孔基质可含有所述试剂和/或可选的另一试剂。含有所述试剂和可选另一试剂的多孔基质可在本发明的方法实施之前，以干态或湿态固着在所述可透光部分的内腔面上。理想地，所述试剂/另一试剂包括于处于干态的多孔基质内，并且在其与样品接触后变湿。“干态”应视为基本不含液体的状态。所述试剂和/或多孔基质可最初以允许通过蒸发或其他方式干燥的液体/浆液形式提供。就本发明而言，当所述试剂和/或多孔基质最初以随后进行干燥的液体形式提供时，“干燥”一词应理解为表示干燥操作后液体残余量小于最初量的10％，5％或1％。所述多孔基质以及，可选地，所述试剂可以以任何的pH提供。在涉及生物样品的实施方式中，所述多孔基质以及，可选地，所述试剂可以以至少7且不大于8.5的pH提供。在一些实施方式中，所述多孔基质以及，可选地，所述试剂可以以7±0.25的pH提供。

应该理解的是，“光学信号”可以为光度信号。所述光学信号可以为荧光信号或颜色信号。在优选实施方式中，所述光学信号包括荧光信号。

在一些实施方式中，所述试剂或另一试剂包括可裂解底物。相应地，当所述试剂/另一试剂与所述分析物/分析物反应产物反应时，该分析物/分析物反应产物可将所述底物裂解，从而导致光学信号的释放。在所述试剂包括前体(即上游途径的成分)的实施方式中，所述分析物可将来自前体的底物裂解，以释放出所述分析物反应产物。随后，该分析物反应产物可与所述试剂反应，以形成所述试剂反应产物。所述分析物反应产物可能够发出光学信号。所述底物可包括一种或多种酶可裂解的肽。在一些实施方式中，所述可裂解底物包括凝血酶可裂解底物，该底物可在由凝血酶裂解时生成可检测的光学信号。所述凝血酶可裂解底物可包括可被凝血酶识别和裂解的肽序列以及在该肽被裂解后能够供检测的关联荧光性分子。

在实施方式中，所述试剂/另一试剂能够被氧化。相应地，在一些实施方式中，所述试剂/另一试剂能够通过被分析物或分析物反应产物氧化而形成发出光学信号的试剂反应产物。在所述试剂/另一试剂包括前体的实施方式中，所述试剂/另一试剂可能够通过被所述分析物氧化而形成氧化的分析物反应产物。所述分析物或分析物反应产物可包括过氧化氢。例如，胆固醇氧化酶可作用于作为所述分析物的胆固醇上，以形成作为所述分析物反应产物的过氧化氢。过氧化氢能够通过氧化所述试剂而形成所述试剂反应产物，从而使得该试剂发出光学信号。所述试剂可包括辣根过氧化物酶。

光学信号的检测可包括对光学信号(如荧光信号)的发射状况的检测。在一些实施方式中，检测包括对光学信号变化的检测，所述变化例如为所述试剂所发出的光的波长，信号强度和/或信号寿命的变化。

本领域技术人员应该理解的是，荧光团为一种在被相应波长的光激发时重新发光的荧光化合物。相应地，在可以发出光学信号的情形中，所述分析物、分析物反应产物、试剂和/或试剂反应产物可包括荧光团。该荧光团可以以非活性状态(即非荧光性状态)提供。

底物从所述荧光团的释放可将该荧光团激活，以发出荧光，从而生成光学信号。或者，所述分析物可通过与所述试剂结合而将所述荧光团激活，以发出荧光。在一些实施方式中，所述荧光团通过被所述样品中的分析物或分析物反应产物氧化。对非活性荧光团的氧化能够激活该荧光团，从而发出荧光。

在所述试剂包括荧光团的实施方式中，所述荧光团可包括罗丹明，如罗丹明110。其中，有利的情形是，一种或多种肽可与罗丹明110的氨基偶联，以生成罗丹明110/肽偶联物。罗丹明110/肽偶联物存在各种市售产品，如Thermo Fisher Scientific的产品。当肽被裂解时，罗丹明发出可检测的荧光信号。裂解后的罗丹明110可在至少490nm且不大于510nm的波长下激发。在一些实施方式中，裂解后的罗丹明110在505nm的波长下激发。裂解后的罗丹明110可发出波长至少为521nm且不大于530nm的光。在一些实施方式中，裂解后的罗丹明110发出波长为525nm的光。其他合适的荧光团也应为本领域技术人员所知。例如，其他合适的荧光团可包括，但不限于，FAM(荧光素)。

在本发明的背景中，应该理解的是，“肽”一词是指包括连于链中的两个或更多个氨基酸的化合物。

在一些实施方式中，罗丹明110与纤维蛋白原的一个或多个肽偶联，以形成凝血酶可裂解底物。罗丹明110/纤维蛋白原肽偶联物存在市售产品，如Thermo FisherScientific的罗丹明110/双-(对甲苯磺酰基-L-甘氨酰基-L-脯氨酰基-L-精氨酸酰胺)，产品目录号为R22124。当接触凝血酶时，罗丹明110/双-(对甲苯磺酰基-L-甘氨酰基-L-脯氨酰基-L-精氨酸酰胺)的纤维蛋白原肽臂被凝血酶从罗丹明上裂解而下。这实现了将罗丹明从非荧光性的双酰胺形式转换为可荧光检测的形式的优点。在所述纤维蛋白原肽臂的裂解过程中，先裂解生成荧光性的单酰胺，然后生成荧光性的罗丹明110。

在所述试剂包括荧光团的实施方式中，所述荧光团可包括二氢罗丹明123。该物质可例如为Thermo Fisher Scientific等市售供应商的市售产品。二氢罗丹明123为一种非活性荧光团。当被氧化时，二氢罗丹明123形成荧光性形式的阳离子罗丹明123。阳离子罗丹明123可在至少490nm且不大于510nm的波长下被激发。在一些实施方式中，阳离子罗丹明123在488nm的波长下被激发。阳离子罗丹明123可发出波长至少为521nm且不大于540nm的光。在一些实施方式中，阳离子罗丹明123发出波长为530nm的光。

在一些实施方式中，所述试剂包括两种荧光团，例如由肽偶联在一起的CFP(青色荧光蛋白)和YFP(黄色荧光蛋白)。所述肽可包括酶可裂解肽。在该肽被裂解时，第一荧光团与第二荧光团解耦。随后，第一荧光团可将能量转移至第二荧光团。因此，在肽接头完好无损的情况下，当第一荧光团在激发波长下被激发时，将使得能量从第一荧光团转移至第二荧光团，从而使得第二荧光团在FRET(福斯特共振能量转移)过程中发出荧光信号。当肽接头被一种或多种成分裂解后，则无法发生FRET，且仅第一荧光团发光。

所述多孔基质可含浓度至少为0.05mM且不大于1mM的上述可裂解试剂，通常情况下，所述浓度至少为0.1mM且不大于0.3mM。

如上所述，应该理解的是，以mM为单位的浓度涉及以液体形式提供时的浓度，所述液体形式允许以蒸发或其他方式干燥。

在一些实施方式中，所述多孔基质含浓度至少为0.05mM且不大于1mM的所述分析物反应产物的前体。

所述分析物可以为任何所需的分析物。在一些实施方式中，所述分析物为全血中任何所需的分析物。例如，所述分析物可包括蛋白质，肽，抗体，核酸，微生物(如细菌，真菌及病毒)，毒素，药物，酶，代谢物，脂质，过氧化物，细胞部分，抗原等当中的一种或多种。

在一些实施方式中，所述分析物包括至少一种酶。在具体实施方式中，所述分析物至少包括凝血酶。

在一些实施方式中，所述分析物包括至少一种脂质。在具体实施方式中，所述分析物至少包括胆固醇。

在一些实施方式中，所述试剂/另一试剂的形式为颗粒，该颗粒包括能够结合、裂解和/或相互作用的部分，该部分可例如通过非共价化学键合(如生物素与亲和素之间)直接或间接结合至所述颗粒的表面。所述颗粒可以为乳胶颗粒。在一些实施方式中，所述能够结合、裂解和/或相互作用的部分包括罗丹明110/肽偶联物，所述颗粒包括乳胶颗粒。在其他实施方式中，所述能够结合、裂解和/或相互作用的部分包括二氢罗丹明123，所述颗粒包括乳胶颗粒。

其他实施方式还可包括通过物理吸附，共价化学偶联，非共价化学键合(如生物素与亲和素之间)或这些方式的任意组合结合至颗粒的表面。或者，所述试剂/另一试剂可以为游离形式，即不直接或间接与颗粒结合，例如游离的罗丹明110/肽偶联物或游离的二氢罗丹明123。

在一些实施方式中，所述试剂/另一试剂包括游离的罗丹明110/肽偶联物。

在一些实施方式中，所述试剂/另一试剂包括游离的二氢罗丹明123。

样品沿微流体通道的输送可包括通过毛细管作用将样品吸入微流体通道。为了可将样品在最初时通过毛细管作用引入，需要以样品取代可存在于微流体通道内的气体。这一点可通过阀等将气体从微流体通道排出至卡盒外部来实现。

作为替代或追加方案，样品可通过主动充入机构(如WO2018/002668所述)以主动方式吸入微流体通道。在此类实施方式中，所述微流体通道可与气室相连。相应地，在一些实施方式中，卡盒包括与微流体通道相连的充气腔室。因此，所述气室和微流体通道应理解为彼此流体连通。

样品可由主动充入机构以主动方式吸入和/或吸出所述检测区域。在一些实施方式中，样品可由主动充入机构以主动方式吸入和/或吸出所述微流体通道的含多孔基质的部分。

除非上下文另外指出，否则“流体连通”一词应理解为表示，包括气体或液体在内的流体能够在相关部件之间输送。

因此，所述分析可进一步包括对如WO2018/002668所述的充气腔室进行加压和/或减压，以控制样品沿所述/每一微流体通道的移动。

所述分析可进一步包括“止流”机构。该词应理解为定义了一种当样品触及所述检测区域和/或止流特征(如所述检测区域下游的疏水性印制特征)时阻止样品进一步流动的机构。有利地，这可以降低过量样品溢出所述通道的风险且确保所存在的任何分析物均固着在所述检测区域和多孔基质上而非流出该检测区域和/或多孔基质。关于一种尤其合适的机构，本领域技术人员可参见WO2018/002668的描述，该文的全部内容援引于此。概括性地说，可以提供一种压电弯曲元件，其设计为对每一/所述充气腔室进行加压/减压，从而精确地控制流入所述微流体通道和检测区域的样品。

样品既可在卡盒插入读取设备之前引入，也可在卡盒插入读取设备之后引入。在一些实施方式中，卡盒在样品施加之前插入读取设备，并通过向充气腔室施加作用力而驱除所述/每一腔室内的气体。如此，可有效地使卡盒针对的样品施加，做好相关准备。

应该理解的是，如WO2018/002668中所述，所述充气腔室的加压和/或减压可作为单个或多个步骤实施。所述充气腔室的加压可由施力构件实现。该施力构件可含于所述读取设备内。关于合适施力构件的示例及其在合适读取设备内的存在形式，本领域技术人员可参见WO2018/002668，该文的全部内容援引于此。除此之外，还可设想到其他合适的施力构件和/或读取设备。

每一腔室内的气体一般为空气，但是也可引入其他气体或气体混合物。例如，当沉积在每一/所述微流体通道内的任何试剂易于在空气中发生氧化或者因其他原因寿命期较短时，可在卡盒和关联通道及腔室内充入氮气等惰性气体。通常，提及气体之处指的是空气，但这不应理解为构成限制。

有利地，通过对进出所述/每一气室的气体的移动进行精细控制，可以精确控制样品沿每一通道在任一方向上的移动速率。此外，可选地，所述读取设备可利用沿微流体通道设置的电极等装置检测每一通道内样品的位置，所述装置与所述读取设备接触，并且可反馈每一/所述微流体通道内任何样品的位置，从而使得所述读取设备能够极为精细地确定样品的位置以及样品移动的速率，该样品移动是通过向所述充气(气体/空气)腔室施加作用力/压力而实现的。

在一种实施方式中，样品先通过毛细管作用引入所述微流体通道，直至达到第一止流特征，随后如上所述，由主动作用机制控制其在通道内的进一步移动。

因此，在另一方面，提供一种与样品一起使用的动力学分析方法，所述方法包括：

a)将卡盒插入读取设备，所述卡盒包括微流体通道，所述微流体通道包括：

检测区域，所述检测区域用于接收提供至该微流体通道的样品至少的一部分，所述检测区域包括可透光部分和含试剂的多孔基质，所述多孔基质固着于所述可透光部分的内腔面上，其中，所述试剂能够与所述样品中的分析物或其分析物反应产物反应，以形成试剂反应产物，而且任何所述试剂反应产物均能够被光学检测；

b)可选地，使用所述读取设备内的施力装置，将空气驱离所述微流体通道；

c)将所述样品引入所述微流体通道的第一端；

d)通过毛细管作用和/或主动作用，将所述样品沿所述微流体通道吸至所述检测区域；

e)允许所述样品内的分析物或分析物反应产物与所述试剂反应；

f)利用所述读取设备内的光学检测器，取得任何生成的试剂反应产物的至少一个光学测量值，所述光学检测器处于所述微流体通道的可透光部分的腔外；以及

g)根据所述试剂反应产物的所述至少一个光学测量值，检测任何分析物或分析物反应产物。

通过将包括所述试剂的多孔基质固着在所述可透光部分的内腔面，可在对流体的移动进行精确控制的同时，不影响所述多孔基质及任何关联成分、试剂和/或前体的位置或浓度。

所述检测区域可例如以印于该部分上的疏水性特征为界，该疏水性特征例如为疏水性油墨，碳或银的特征。通过这种方式，可防止所述多孔基质被摊出特征边界确定的沉积区域之外。在一些实施方式中，所述检测区域可以印于底层上的特征为界，所述特征用于限制样品进一步移动出所述检测区域之外。

为所述检测区域定界的印制特征还可包括电极。在一些实施方式中，在步骤1)中，当样品触及所述印制特征时，这些印制特征触发所述光学检测装置获取光学测量值，并因而启动步骤2)中的分析。如此，所实现的优点在于，使得所述分析的起始时间不受操作错误的影响。除此之外，还能对样品成功充满所述检测区域加以确认。

所述样品可以为生物样品。该生物样品例如全血在分析开始前得自检测对象。所述分析的检测对象可预先确定。或者，该检测对象可造访医生，护士或其他医疗专业人士等医疗提供方，而该医疗提供方可确定所述检测对象需要进行所述分析。

在具体实施方式中，所述检测对象正在接受或正在考虑接受抗凝治疗。该检测对象可表现凝血相关症状或患有凝血相关病症，如中风，深静脉血栓形成，肺栓塞或心肌梗死。

在具体实施方式中，所述检测对象正在服用或正在考虑服用他汀类药物。在一些实施方式中，所述检测对象具有高胆固醇家族史、吸烟、体重超重、患有糖尿病以及/或者患有高血压。所述检测对象可具有早期心血管疾病家族史。

所述患者或医疗提供方可选择用于实施所述分析的卡盒，并且可选地，可将所选择的卡盒插入读取设备。或者，所述医疗提供方或患者可将所述生物样品发送给外部服务提供者，以供其实施本发明的分析。

所述读取设备可对其本身进行适当配置，以能够实施所述分析，并根据所获得的光学测量值，检测和/或确定所述检测对象的样品中的特定分析物的水平。所述读取设备和卡盒可相互协作对样品进行分析，而且当该分析完成后，所述读取设备对样品中存在的分析物水平进行检测和/或确定。随后，所述读取设备可将分析结果提供给所述检测对象和/或医疗提供方。所述结果可例如通过显示在屏幕上的视觉结果提供，或者该结果可发送给移动电话/计算机等另一装置。该结果也可作为打印物呈现。

在一些实施方式中，所得结果可转换为标准化的值，从而使得提供的有用信息更为丰富。在此类情况下，可能需要对所述卡盒试剂和/或读取设备进行校准。相应地，在本发明的一些实施方式中，所述分析方法可以包括校准步骤，或者可以在进行分析前，实施校准步骤。其中，可通过相应的校准信息对所述读取设备进行重新编程，以使得特定分析的结果能够转换为标准化值。本领域已存在为人所知的校准步骤。关于适合于pT/INR分析的例示校准步骤，本领域技术人员可参见Poller et al.,Clinical Chemistry,56:10,1608-1617(2010)，该文的全部内容援引于此。

PT/INR分析的校准步骤一般包括对样品进行检测，例如对INR已通过认证的血浆样品进行检测，以得到ISI(国际敏感度指数)值。该ISI值表示凝血活酶在分析中的敏感度，并用于计算标准化的INR值。适合用于获取ISI的样品存在市售产品，例如INR校正试剂盒(Hart Biologicals，英国哈特尔浦)中的冻干人血浆。

因此，在一些实施方式中，所述分析包括另一步骤，该另一步骤包括确定样品中的分析物水平。该水平根据所获得的光学测量值确定。

当所述分析物包括凝血酶时，在一些实施方式中，所述另一步骤包括确定样品中的凝血酶水平。该水平可根据所获得的光学测量值确定。检测所得的凝血酶水平可转换为PT或INR值。

所述分析的结果可用于指导对检测对象的后续诊断和/或治疗。相应地，应该理解的是，所述分析可包括根据该分析所确定的分析物水平，选择或改变特定疗法的额外步骤。理想地，所述特定疗法包括抗凝血剂疗法或他汀类疗法。合适的凝血剂疗法或他汀类疗法已为本领域所知。

除了医疗提供方和/或患者之外，使用者还可以为执法人员或运动药检人员，而所述检测对象例如为接受不当药物使用检验的个人。

如上所述，在所述分析为动力学分析的实施方式中，在一段时间内取得所述分析物或其反应产物的多个光学测量值。所述多个光学测量值可包括至少两个，至少三个，至少五个，至少10个，至少50个，至少100个，至少500个或至少1000个光学测量。在一些实施方式中，所述多个光学测量值以持续不断的方式在一段时间内获取。

或者，也可以在一段时间内，每隔0.05秒，每隔0.1秒，每隔0.2秒，每隔0.3秒，每隔0.4秒，每隔0.5秒，每隔0.6秒，每隔0.7秒，每隔0.8秒，每隔0.9秒或每隔1秒取得一个光学测量值。在一些实施方式中，在一段时间内，每隔0.1秒取得一个光学测量值。

所述一段时间可以为至少10秒，至少30秒，至少1分钟，至少1.5分钟，至少2分钟，至少3分钟或至少5分钟。所述一段时间可不长于5分钟，不长于3分钟，不长于2分钟，不长于1.5分钟或不长于1分钟。在一些实施方式中，所述一段时间为2分钟。

由于所述多个光学测量值为随时间流逝获取的测量值，因此该动力学分析无需到达终点(即每过去一个固定的温育时间段后取一个测量值)。如此，可实现比现有技术的分析更为快速且更为准确的优点。

所述多个光学测量值可在达到阈值之前一直获取，而在达到阈值之后不再获取。

所述光学检测器可含于读取设备之内，或者与读取设备相连。在一些实施方式中，所述光学检测器包括分光计或荧光计。在一些实施方式中，所述光学检测器包括LED(发光二极管)。其他合适的检测器也应为本领域技术人员所知。对于荧光检测，所述读取设备内的分光计或荧光计对所述检测区域内的分析物或其反应产物发出的直接或间接荧光进行检测。如此，可实现所述卡盒中仅设计为面向所述读取设备内的分光计或荧光计或与该分光计或荧光计相连的光学检测部件(例如光纤)的可透光部分必需要可透光的优点。在荧光检测情形中，所述卡盒的可透光部分必须在涵盖激发波长和发射(检测)波长的波长范围内可透光。例如，所述卡盒的可透光部分必须在200～1200nm范围内可透光。

作为分光计或荧光计的替代方案，可由CCD或CMOS摄像头等本领域已知的合适摄像头进行光学检测。

所述微流体通道的深度可不大于200μm，不大于150μm，不大于100μm或不大于70μm。这一深度的设置优点在于，可确保所述样品和多孔基质之间非常接近。这一深度还可确保激发波长的光能够到达所述多孔基质，而发射波长的光能够到达所述光学检测装置。

所述光学测量可包括荧光测量。其他合适的光学测量也应为本领域技术人员所知。

在一些实施方式中，所述分析可包括加热和/或冷却步骤。这一步骤可以为独立于所述分析的上述步骤之外的步骤，或者为上述步骤的追加步骤。例如，在所述分析的步骤1)之前，可以对所述微流体通道进行加热。这一加热作用可一直维持于一个或多个后续步骤中，或者也可以在步骤1)开始时停止。与此相反，也可在本分析的任意步骤内，对所述微流体通道进行加热或冷却。加热或冷却作用可由所述关联读取设备提供。应该理解的是，所述分析的温度取决于待检测的成分/所发生的反应。因此，本领域技术人员应该能够意识到每一分析/分析步骤的最佳温度。

所述分析可包括加热步骤，以对所述通道进行加热且将其温度保持于至少20℃且不大于95℃。在一些实施方式中，所述分析可包括加热步骤，以对所述通道进行加热且将其温度保持于至少20℃且不大于65℃。所述加热步骤可对所述通道进行加热且将其温度保持于至少30℃且不大于40℃。在一些实施方式中，该加热步骤可对所述通道进行加热且将其温度保持于至少35℃且不大于37℃。

在用于测定凝血酶原时间(PT)或国际标准化比(INR)值的分析中，该分析可包括加热步骤，以对所述通道进行加热且将其温度保持于约30℃～40℃，如36℃。

附图说明

以下，将参考以下附图，以举例方式进一步描述本发明。附图中：

图1(图1A和图1B)为凝血途径(或凝血级联)以及该途径中有潜力供本发明的动力学分析测量的目标分析物的示意图；

图2所示为可用于本发明的一种实施方式中的含罗丹明110的凝血酶可裂解试剂；

图3为根据本发明的实施方式的分析的示意图；

图4为根据本发明的实施方式的另一分析的示意图；

图5A所示为根据本发明的实施方式的微流体卡盒，图5B为分析过程中可透光部分的信号生成状况照片，图5C所示为根据多孔基质相对于光学检测器放置于的位置获得的不同信号强度，图5D所示为在使用沉积于内腔面上时便摊开的多孔基质的情况下不同时间点上的信号生成情况，图5E所示为厚薄两种多孔基质的信号生成情况比较；

图6所示为血液进入图5A所示卡盒且充入该卡盒的一部分的情形；

图7为根据本发明的实施方式的卡盒内的微流体结构图；

图8为根据本发明的实施方式的卡盒内的微流体结构图；

图9A和图9B所示为HEC(羟乙基纤维素)作为多孔基质成分时对光学测量的影响，图9C和图9D所示为多孔基质内的HEC的分子量对凝血时间的影响；

图10所示为多孔基质的其他成分对光学测量的影响：图10A所示为全血样品的凝血时间与ACL INR关系，其中多孔基质含浓度为10％的PEG(聚乙二醇)；图10B所示为Avicel对分析速度的影响；

图11所示为多孔基质内的CMC(羧甲基纤维素钠)对分析的影响：图11A和图11B所示为多孔基质内CMC浓度对凝血时间的影响；图11C所示为CMC的其他形式(不同取代度(DS)的CMC)对分析的影响；

图12为使用不同浓度CMC和PEG时用于光学检测的多孔基质内产生的信号发展状况图像；

图13A和图13B所示为根据本发明的实施方式的凝血酶转化作为INR量度的模型示意图；

图14所示为不同样品的分析结果；

图15所示为本发明实现的扩大后分析范围；

图16所示为在本发明的一种实施方式中可采用的凝血时间(以及INR)计算方法，其中，PT为凝血开始时测得的，其计算为信号变为超过基线6个SD(标准偏差)的时间；

图17所示为多孔基质在45℃下保存13周后(图17A)以及在5℃～70℃下保存120天后(图17B)的稳定性状况；

图18为胆固醇途径以及根据本发明有潜力用于胆固醇检测的试剂的示意图；

图19所示为二氢罗丹明123；

图20A和图20B所示为根据本发明的实施方式的胆固醇分析结果。

具体实施方式

图1所示为参与凝血途径的分析物，凝血途径为产生凝血块的一系列酶促生化反应。对于许多个人，如接受华法林或香豆素等抗凝治疗的患者而言，必须对凝血状态进行定期监测，从而能够对治疗剂量进行定期调整，以使其始终处于治疗范围内，并防止增加出血等严重的副作用。

如图1A所示，凝血级联具有以下两条途径：内源性途径，或称接触激活途径；以及外源性途径，或称组织因子途径。凝血级联一旦开启便可自行增生蔓延，但与此同时，由于血液系统中存在若干种能够阻碍促凝步骤并分解所形成的血块的抑制剂，凝血级联还具有自我调节作用。外源性和内源性途径相互融合成共同途径，该途径的中心角色为凝血酶。该分子具有蛋白质水解活性，从而能够裂解可溶性的纤维蛋白原，并释放出对血块具有交联作用的不溶性纤维蛋白。

在已知分析方法中，为了对凝血状态进行监测，在患者样品中加入能够启动凝血的成分，如组织因子。组织因子为一种仅存在于组织物质中的脂蛋白，因此一般不见于心血管系统中。当血管破裂且无法继续有效地提供阻挡组织物质的作用时，组织因子将进入血流，并导致外源性凝血级联启动。随后，可对一种或多种下游分析物进行测定。在以下实施方式中，将凝血酶作为由本发明的分析检测的分析物。然而，由于凝血级联具有自行增生蔓延的性质，因此还可将该途径内的多种分析物视为有潜力的凝血状态生物标志物。如图1B所示，可在患者样品中加入山蝰毒素(Russell’s Viper Venom)，锯鳞蝰毒素(Ecarin)，东部拟眼镜蛇毒素(Textarin)，太攀蛇毒素(Taipan Venom)，立止血(Reptilase)或蛋白降解靶向嵌合体(PROTAC)等其他因子，以在凝血途径的不同节点上启动凝血。相应地，还存在对凝血级联的其他成分，如因子X，因子Xa，因子II，纤维蛋白单体或蛋白C进行监测的可能性。因此，还可很容易地想到能够对外源性或内源性途径中的其他成分或者对其他不相关分析物的影响进行检测和/或测定的方法。

本发明人发现，凝血酶可通过裂解某种淬灭试剂而发出荧光。图2所示为所述凝血酶可裂解的试剂——罗丹明110的双酰胺衍生物(罗丹明110/双-(对甲苯磺酰基-L-甘氨酰基-L-脯氨酰基-L-精氨酸酰胺)，该产品为Thermo Fisher Scientific的分子探针，产品目录号为R22124)。该试剂含与罗丹明110的每一氨基共价连接的纤维蛋白原肽单元(肽臂)。

如图所示，在凝血级联中，凝血酶将纤维蛋白原肽单元A和B裂解，从而将纤维蛋白原转化为不溶性纤维蛋白单体。罗丹明110上结合的肽臂复制凝血酶天然可识别的纤维蛋白单元原肽。因此，凝血酶能够裂解所述罗丹明110双酰胺衍生物的肽臂。

在本发明的一种实施方式中，所述凝血酶可裂解的罗丹明110双酰胺衍生物存在于多孔基质内。该多孔基质固着在微流体通道的可透光部分的内腔面上。然而，应该理解的是，在其他实施方式中，也可不需要多孔基质。在分析过程中，所述凝血酶可裂解的罗丹明110双酰胺衍生物与样品(如血液)的一部分发生接触。当该血液样品内存在凝血酶时，凝血酶将裂解所述罗丹明110双酰胺衍生物的肽臂。该肽臂的裂解将所述罗丹明110双酰胺衍生物激活，从而使得其发出光学信号。

以下，对所述光学信号进行更加详细的描述。由于所述肽臂(Arg-Pro-Gly序列)的裂解，非荧光性的罗丹明110双酰胺衍生物首先转化为荧光单酰胺，然后转化为罗丹明110。随后，罗丹明110发出可在上述光学检测装置的波长(激发波长498～505nm，发射波长521～525nm)下测量的荧光信号。随着凝血级联逐步向下游进行，凝血酶原越来越多地转化为凝血酶，使得罗丹明110更多地被释放，从而增大所述荧光信号的强度。在给定时间内，凝血酶原向凝血酶的转化量与荧光信号的生成量成正比。确定凝血酶合成量的值已知为凝血酶原时间(PT)以及自其派生而出的度量值——国际标准化比值(INR)。

因此，荧光信号的生成速率越高，则表示凝血酶原向凝血酶转化的速度越快(低INR)，而荧光信号的生成速率越低，则表示凝血酶原向凝血酶转化的速度越慢(高INR)。

对于未接受抗凝治疗的患者样品(非治疗样品)而言，凝血酶原向凝血酶的转化极快，因此荧光信号的生成速度也非常快速。对于治疗样品(接受抗凝治疗的患者样品)，例如在华法林治疗的情形中，由于凝血反应级联在维生素K因子的作用下变慢，因此接受抗凝治疗的患者的PT增长。

图3为上述分析的一种示例的示意图。在该图中，供光学变化/信号生成的多孔基质21示出为固定在微流体通道4的检测区域26的上部内腔面5上。血液样品7进入固定有多孔基质21的检测区域26内，从而使得血液样品7与多孔基质21内的包括试剂在内的成分接触。血液样品7内的凝血酶原首先与多孔基质21内的凝血活酶(TP)反应，从而如图所示，启动凝血级联，并将凝血酶激活。如此，最终生成凝血酶，而所生成的凝血酶又进一步能够与上述罗丹明110双酰胺衍生物(R110)反应，从而将其肽臂裂解，并在多孔基质21内生成可光学检测的信号。该光学信号透过检测区域26的可透光部分9，并由设于关联读取设备内的光学检测器检测。在本实施方式中，上部内腔面5和可透光部分9由相同透光材料制成。然而，在其他实施方式中，应该理解的是，可透光部分9可与上部内腔面5的其他部分由不同材料制成。

在上述示例中，所有必要成分均处于单个多孔基质内。图4所示为一种替代实施方式，其中，部分反应成分分隔于两个多孔基质(121，221)内。在该示例中，第一多孔基质221含用于启动凝血级联的凝血活酶(TP)。血液样品7首先与第一多孔基质221接触，以使得血液样品7中的凝血酶原与第一多孔基质221内的凝血活酶相接触，从而启动凝血级联。随后，血液样品7向下游输送至含R110双酰胺衍生物这一试剂的第二多孔基质121(供光学变化/信号生成的多孔基质)。血液样品7内的凝血酶将R110双酰胺衍生物裂解，从而生成试剂反应产物和可光学检测的信号。在本实施方式中，所述信号可透过微流体通道4的检测区域26的可透光部分9检测。

应该理解的是，虽然图4示出了仅第二多孔基质121设于检测区域26内的实施方式，但是在其他实施方式中，第一多孔基质221也可设于检测区域26内。

将成分/试剂(如图4中示意性例示举出的成分/试剂)隔开或分离这一做法可能会对以下情形具有用处：各种成分/试剂有可能会彼此干扰；有可能需要改变每种多孔基质的物理和/或化学性质。例如，可以通过改变每种基质的孔隙率、润湿性、pH等性质而使得其与每一多孔基质内的具体反应成分相匹配。如上所述，对于某些试剂而言，极有可能的情形在于，其仅需处于供光学检测的多孔基质之外即可。相应地，举例而言，某试剂可能仅需直接干燥在微流体通道的表面上或者与载体偶联即可，无需处于另一多孔基质之内。检测结果表明，此类拆分式的实施方式能够产生重现性极高的结果。

可透光部分9/基质21与光学检测器之间的非常接近性可最大程度减小样品中可能存在的对光学检测具有干扰或模糊作用的成分的任何影响。虽然不希望受到理论的束缚，但发明人仍然认为，所述多孔基质能够排除红细胞等特定大小的物质，从而可减小此等物质在光学检测过程中的干扰。

固着于所述可透光部分的内腔面上的凝血酶可裂解的游离罗丹明110(R110)双酰胺衍生物(此处，“游离”应该理解为，罗丹明110双酰胺衍生物不附着于其他颗粒上)与以凝血酶可裂解的罗丹明110双酰胺衍生物功能化的磁性或乳胶颗粒的分析性能进行了比较。比较结果表明，游离凝血酶可裂解的R110双酰胺衍生物与以凝血酶可裂解的R110双酰胺衍生物功能化的乳胶颗粒的性能(以INR值衡量)彼此相当。然而，以凝血酶可裂解的R110双酰胺衍生物功能化的磁性颗粒的性能不如其他两组的性能。

在后续实验中，决定采用凝血酶可裂解的游离R110双酰胺衍生物，其原因在于该游离R110双酰胺衍生物消除了对固相的需求，从而降低了多孔基质的复杂性和成本。

为了简洁起见，本文提及的R22124(产品目录号)是指凝血酶可裂解的游离罗丹明110双酰胺衍生物。

除此之外，还对多孔基质内的R22124浓度对分析性能的影响进行了评价。其中，以人造血浆样品对浓度(即以液体形式提供时的浓度，该液体形式随后允许在基质内通过蒸发或其他方式干燥)为0.1mM，0.25mM，0.5mM，0.75mM及1mM的R22124进行检测后，对其结果进行比较。如表1结果所示，0.25～0.75mM浓度的性能(以凝血时间衡量)类似，而0.1和1mM浓度的凝血时间最长。

表1：多孔基质内R22124浓度(示出为[Rhod])对分析性能的影响

图5a所示为用于本发明的样品微流体卡盒。在图5a中，卡盒1包括与微流体通道4连接的样品入口3。通道4在卡盒1内延伸，并分支形成多条微流体通道11，每一通道11均与独立的充气腔室10流体连接。在其他实施方式中，所述卡盒可包括一条，两条或三条通道4。

所述卡盒由第一，第二，第三这三个彼此分开的平面层形成，在本实施方式中，顶层、底层以及处于顶层和底层的中间层，这些层叠在一起，限定出微流体通道4和充气腔室10。中间层的形式为粘合层，其与顶层和底层粘黏附。在本实施方式中，所述卡盒的通道位于中间层内。相应地，通道侧壁由中间层形成，而通道底部由底层形成。

图5a实施方式的卡盒应视为自持式装置——在样品施加前，卡盒基本无液体，并视为干态；液体样品施加前卡盒内的唯一流体为气体，在本实施方式中，为空气。

在使用时，液体样品(在本实施方式中，血液样品)充入通道4，并可被与读取设备内的相应电触点电接触的电极检测。当读取设备检测到样品已上样于卡盒1内的相应信号时，读取设备可开始上述分析。

以下，对每一通道11进一步详细描述。每一通道11内设有用于限制任何试剂/多孔基质移动的印制特征(20，22，24)，这些印制特征在制造过程中形成于通道内。印制特征(20，22，24)还用于在样品抵达印制特征区域时，限制样品的进一步移动。在本实施方式中，各印制特征由碳基疏水性油墨形成，且用作电极。在其他实施方式中，各印制特征为银制图形，同样用作电极。应该理解的是，在其他实施方式中，印制特征的数目可有所不同。例如，所述印制特征可包括限定检测区域边界的印制特征(即印制特征20)。所述多孔基质宜最初先沉积于印制特征限定的区域内，然后在其中通过机械方式摊开。如此，可限制并确定出多孔基质所在的区域。所述印制特征还可具有与图5A所示的形状不同的形状。印制特征20可具有与图5A所示的特征不同的形状。例如，印制特征20可以为U形，即一端开口的形状。印制特征20限定出2mm×1.5mm的区域。

在使用时，通过向卡盒1的腔室10施加逐渐增大的作用力将腔室10内的气体驱离。当向卡盒施加血液样品时，先消除施加在腔室上的压力(以下将进一步描述)，然后样品在空气重新进入气体腔室10的作用下吸入卡盒内。当样品到达所述检测区域下游的印制特征24时，通过增大施加于气体腔室的压力而防止样品进一步朝下游移动。

在其他实施方式中，样品先仅在毛细管作用下进入微流体通道，并沿微流体通道流动，直至抵达第一止流特征。随后，如上文和下文所述，为了使样品通过所述止流特征，通过主动作用使样品进一步流动。

每一分析通道11的检测区域26均处于印制特征20的边界之内，而且其内已沉积有多孔基质(未图示)，该多孔基质含有用于与可能存在于待分析样品中的特定分析物或其反应产物反应的试剂。所述多孔基质为可透光物质，并且固着于所述顶层的可透光部分的内腔面。一个微流体卡盒可进行多个分析，而且所进行的分析的数目取决于分开的通道和检测区域的数目。在本附图中，示出了四条不同通道11和检测区域26。

充气腔室10进一步位于检测区域26和印制特征(20，22，24)的下游，并设计为与本发明读取设备内的施力构件(以下将进一步描述)搭配使用，以使得该施力构件能够向充气腔室10施加作用力，从而将腔室10内的气体驱离腔室10并驱入分析通道11。当施加在腔室10上的作用力减小时，将使得空气再次从分析通道11中吸入腔室10内。

当血液样品触及位于检测区域26下游的印制特征24时，该血液样品的进一步移动将受到限制。此外，印制特征24触发光学检测装置取得至少一个光学测量值，并从而启动分析。

有多种试剂可适于固着在检测区域26的多孔基质内。例如，固着于检测区域26的多孔基质内的可以是以设计为与待检测分析物的不同表位特异性结合的另一抗体进行功能化的游离荧光颗粒或荧光标记乳胶颗粒。在本实施方式中，如图2所示，R22124为检测区域26内的试剂。

图5B所示为本发明分析启动后进行信号检测时的检测区域26。如图所示，血液样品的一部分已触及处于检测区域26下游的印制特征24，因此该血液样品的进一步移动受到限制。通过这种方式，可使所述部分血液样品基本固定在检测区域26内，从而确保最佳检测。光学测量值由设于检测区域26上方的LED(未图示)获取。在血液样品充满检测区域26后，基质21仍保持固着于所述可透光部分的内腔面。在分析过程中，图5B中的基质21基本透明，这表示无红细胞进入所述基质，或者仅有极少量的红细胞进入所述基质。因此，信号的光学检测受到的干扰极小。

虽然上述实施方式示出为将多孔基质固定于微流体通道的上部内腔面且从上方进行光学检测，但是还可将多孔基质固定在微流体通道的下部内腔面且从下方进行光学检测。根据本发明，应在多孔基质所固定的相同表面进行检测。因此，如果多孔基质固定于微流体通道的上部内腔面，则光学检测系统不应设置为对透过微流体通道的下部内腔面的任何光学变化进行检测，反之亦然。也就是说，不应将血液样品的主体部分置于多孔固体基质与光学检测系统之间。

图5C所示为将多孔基质置于不同位置处时可获得的信号强度差异。顶部两幅图像所示为当将根据本发明的实施方式的多孔基质保持于紧邻读取设备内的光学检测器的微流体通道内腔面(在本情形中为上表面)时检测区域内重复两次测得的荧光强度。底部两幅图像所示为当将相同多孔基质设于通道的下表面且将光学检测器紧邻上表面设置时(也就是说，通道内的血液样品置于多孔基质和光学检测器之间)重复两次测得的强度，如图所示，该强度显著下降。所有图像所示均为血液样品进入检测区域30秒后的荧光强度，而且每幅图像中的每一多孔基质均使用相同的配方。可以看出，为了确保有效的信号检测，不将血液置于多孔基质和光学检测器之间这一点具有显著的优势。

如图5A所示，多孔基质最初在印制特征20边界内点成斑状并包含于其中。如果仅点成斑状，则最终所得的干燥斑点本质上一般为圆形，而且干燥后的截面厚度不均匀。也就是说，斑点边缘部分的厚度薄于斑点中央部分的厚度。发明人发现，通过在液体斑点干燥之前将其摊开，可以实现更为均一的厚度，从而实现极佳的信号生成重现性。图5D所示为根据本发明的不同多孔基质配方的检测结果，其中，每一液体斑点均在干燥于表面上之前摊薄。可以看出，在每一配方下，整个斑点在三个时间点(血液样品进入检测区域后5秒，15秒及30秒)上，均观察到了良好的信号生成(由试剂反应产物生成)。在该图中，使用如下两个多孔基质：处于检测区域之外的第一多孔基质；以及处于检测区域内且供光学变化/信号生成的第二多孔基质。在顶部两行图像中，供光学变化/信号生成的多孔基质(第二多孔基质)的配方含有ReadiPlasTin、CMC、海藻糖及罗丹明以及其他成分(配方1)。在底部两行图像中，供光学变化/信号生成的多孔基质(第二多孔基质)的配方不含ReadiPlasTin(配方2)。此外，此两实施方式中处于检测区域之外的另一多孔基质(第一多孔基质)均含海藻糖和ReadiPlasTin。应该理解的是，此类配方为例示配方，还可使用除此之外的其他配方。

图5E所示为薄层多孔基质和厚层多孔基质的信号生成情况比较。从该图可明显地看出，当使用薄层(a)时，可获得快速均一的反应(从荧光看出)，而当使用厚层(n)时，反应较慢且分布不均。

图6所示为上述分析所使用的根据本发明的实施方式的卡盒。如图6的步骤I所示，血液样品与卡盒1接触，并经入口3引入卡盒1。血液样品在主动充入机构的作用下充入通道11，在通过以压电弯曲元件(未图示)施加压力而将气体从腔室10中驱离后，通过消除施加于腔室10的压力而使得空气重新进入气室，从而将血液样品被吸入卡盒1和通道11(图6中的步骤II和III)。其中，通过对施加于腔室10上的作用力的减小进行精细控制而控制血液样品吸入以印制特征20为边界的检测区域26内的距离，并最大程度地减小样品差异对充入速度的影响。该控制也可通过电极感测反馈的方式实现。

检测区域26的下游为作为电极的印制特征24。血液样品在充满印制特征20后进一步朝下游移动，从而与印制特征24接触(图6中的步骤IV)。当血液样品接触印制特征24时，该印制特征24发出打开LED(检测器)的信号。随后，读取设备内的该LED(检测器)取得至少一个光学测量值。印制特征24与止流机构限制血液样品的进一步前移。通过在血液样品触及印制特征24时才开始取光学测量值，不但可以使得该分析的起始时间0不受操作错误的影响，而且还可对血液样品已成功充满检测区域26加以确认。

图7和图8示意性地示出先以毛细管作用充入后以主动作用充入的两种实施方式的微流体结构的一部分。每一实施方式均有与微流体通道304第一部分相连的入口303。每一第一部分的末端设有可获得血液样品的血细胞比容值的扩大区域314。用于获得血细胞比容值的合适方式已为人所知，例如US006064474A以及Van Kempen EJ and Zijlstra W.Get al.1983(Spectrophotometry of hemoglobin and hemoglobinderivatives.Advances in Clinical Chemistry,Vol 23,199-257)所述的方法。微流体通道316的第二部分自扩大区域314继续向下游延伸，该部分含有小的通气分支318。关于此类通气分支的进一步详细描述，本领域技术人员可参考WO2018/002668。

在使用时，在血液样品引入入口303时，该血液样品在毛细管作用下充入第一部分304，扩大部分314以及第二部分316，直至抵达通气分支318。此时，血液无法再在毛细管作用下进一步流动。如上所述，如想使得血液进一步流动，需要使用主动充入机构。简言之，该主动充入过程包括将充气(空气/气体)腔室310的减压，以使得血液样品流过通气分支318，并流入如上文所述的含一个或多个多孔基质(未图示)的检测区域326内。随后，检测区域326内发生必要的反应，并如上所述，以光学检测器检测所发生的任何光学变化。

在图8所示的实施方式中，检测区域326上游的第二部分316更长。如此，易于实施本文所述的隔开或分离方法。例如，第一多孔基质或一种或多种试剂可沉积在第二部分316，而其他试剂或含光学变化/信号生成所需的试剂的第二多孔基质可沉积于检测区域326内。所述第一多孔基质或一种或多种试剂可例如沉积于第二部分316处于通气分支318和检测区域326之间的部分中。如上所述，在此类基质分离的实施方式中，每一基质的组成可彼此不同，并可针对必要的具体分析和试剂的要求进行调节。例如，对于本文所述的PT/INR分析，所述第一斑点内的凝血活酶可无需紧密结合在该斑点之内，并且可在与血液样品接触时，自所述多孔基质游离而出。然而，用于反应形成试剂反应产物的试剂(如罗丹明110双酰胺衍生物)应含于多孔基质内，而且该多孔基质应基本上杜绝或最大程度减少该试剂及其所得试剂反应产物从其中冲刷而出。发明人发现，CMC在这一方面尤其奏效。

上文中描述了本发明的一种具体实施方式，本发明设计为可易于做出调整的平台式分析的形式。举例而言，可例如通过在所述卡盒内加入通气点而使得样品在卡盒内仅在毛细管作用下移动。

此外，还可对多种检测形式进行分析。其中，可例如使用带有2条，4条或10条通道的卡盒形式。

虽然该分析的主要测量技术为荧光，但是其还纳入了电化学测量以及其他容易纳入的测量部分。

发明人已开发出用于固着在可透光部分上以对样品进行精确光学测量的各种基质配方，以下将对这些基质配方进行进一步详细描述。

对该基质的评估，最先考虑到的方法为简单的凝血酶-R110方法。在该评估方法中，将R22124溶解在乙醇溶液中(即湿法分析)，并将冻干的凝血酶溶解于缓冲液中后，制成一系列稀释液。随后，使一定体积的凝血酶与溶于乙醇中的R22124在卡盒内反应，并在一定的温育时间之后，通过读取设备(如WO2018/002668所述的读取设备)获取光学测量值。通过这种方式，获得了凝血酶剂量响应曲线，从而证实可通过湿法分析测量凝血酶活性(并因而可测量凝血状态)。

随后，对固着于可透光部分上的干态基质进行评价。将游离R110溶于DMSO或乙醇中后，沉积于微流体通道的可透光部分的内腔面上，其中，以海藻糖作为用于结合的载体分子，以提供粘性和稳定性。海藻糖为一种两个葡萄糖单元以α-1,1糖苷键连接在一起的非还原性同二糖。海藻糖归类为有序结构制造者(kosmotrope)或水结构的标志物。已经发现，当针对冻干的凝血酶或血浆样品测试时，该干态基质发出荧光信号，但该信号较弱。

在对基质中海藻糖的浓度对分析性能的影响进行评估时，以海藻糖浓度为20％，30％，40％或50％(w/v)的基质获取INR值已知为3.5的样品的信号，并对信号进行观察。观察结果表明，海藻糖浓度越高，信号越强。后续研究发现，海藻糖浓度为10％和20％(w/v)时所获得的结果相当。

在此之后，对干态基质中的其他成分进行研究，并评价组织因子对分析性能的影响。如上所述，当在患者样品中加入组织因子时，可启动凝血，从而使得能够对凝血状态进行测定。因此，上述配方(随后允许干燥)中加入介于1×浓度和8×浓度之间的组织因子。

“1×浓度至8×浓度”这一说法源于RecombiPlastin 2G(Werfen)作为组织因子的使用。该产品的说明书建议将冻干的RecombiPlastin 2G溶于20mL稀释液中。由于Werfen未公开该产品中组织因子的实际浓度，因此配方中所使用的组织因子初始浓度未知。

相应地，为了调查组织因子浓度的影响，将冻干物溶于比推荐体积更小的体积中。因此：

1×浓度＝20mL稀释液(制造商推荐的稀释液体积)；

2×浓度＝10mL稀释液；

4×浓度＝5mL稀释液；

8×浓度＝2.5mL稀释液；

16×浓度＝1.25mL稀释液。

经计算，16×组织因子浓度为2189pM。

对INR已知为7的样品进行评价的结果表明，基质内组织因子的量越多，分析中的荧光生成速率越高。

在后续研究中，发明人从Recombiplastin 2G转至ReadiPlasTin。ReadiPlasTin具有与Recombiplastin 2G类似的临床表现。ReadiPlasTin为Recombiplastin 2G去除钙后的一种浓缩液体形式。

随后，通过测量终点荧光，评价凝血因子对分析性能的影响。因子V/Va为一种与因子Xa和钙形成凝血酶原酶复合物的辅因子。该复合物通过将凝血酶原裂解而将其转化为凝血酶这一活性形式。因子V由凝血酶调控——其既可由正反馈回路中的凝血酶直接激活，也可通过血栓调节蛋白-蛋白C复合物(与辅因子蛋白S)途径由凝血酶间接激活。

在样品中加入介于0单位/ml和100单位/ml之间浓度的因子Va并观察其对从具有不同已知INR值(5.0，2.8及3.8)的临床血浆样品中获得的信号的影响进行观察。观察发现，因子Va的添加大体上能够增强信号，但是对于某些高浓度(50单位/ml和100单位/ml)样品，其将稍微减弱信号(在终点处测得的荧光)。

因子X/Xa为可由因子VIIa/组织因子复合物激活的另一种凝血因子。因子Xa可与因子Va和钙结合而形成凝血酶原酶复合物，并将凝血酶原转化为凝血酶。在样品中加入介于0μg/ml和15μg/ml之间浓度的因子Xa并观察其对从具有不同已知INR值(7.8，2.5及3.8)的临床血浆样品中获得的信号的影响。观察发现，因子Xa的添加除了仅在15μg/ml浓度下导致信号稍微减弱之外，其他浓度下均可增强信号。

凝血酶原为凝血酶的失活酶原。本分析通过测量凝血酶原向凝血酶的转化速率而监测凝血时间。在样品中加入介于0mg/mL和0.2mg/mL之间浓度的凝血酶原并观察其对从具有不同已知INR值(2.1，3.9及6.5)的临床血浆样品中获得的信号的影响。观察发现，凝血酶原的浓度越高，信号越强。

钙做为另一种凝血因子也对其进行了研究。在样品中加入介于0mM和25mM之间浓度的Ca

除此之外，还对因子VIIa，因子IXa和因子XIa这三种其他凝血因子进行了研究。

可选地，一种或多种上述凝血因子可用于所述分析的卡盒的质量控制通道。

除此之外，还对所述基质内的不同载体分子对分析速度的影响进行了研究。虽然不希望受到理论的束缚，但发明人认为，载体分子用作保持R22124的支架。发明人还认为，载体分子还用做允许凝血酶(或其他分析物)进入基质且不允许红细胞或其他颗粒物/成分进入基质的选择性过滤器。因此，R22124、凝血酶以及可选地组织因子的相互作用是有利的。

对纳入基质的载体分子羟乙基纤维素(HEC)的影响进行了研究。HEC为一种非离子水溶性聚合物，由环氧乙烷与碱性纤维素酶之间的反应获得。HEC溶液为假塑性或剪切稀化溶液。HEC易溶于冷水或热水中，以产生具有不同粘度的清澈透明溶液。此外，中低分子量的HEC可完全溶于甘油，并且在含60％以内乙醇的水-醇体系中具有良好的溶解性。HEC一般不溶于有机溶剂。HEC可以不同长度和分子量的聚合物形式存在。在本实施例中，HEC的平均分子量为720000g/mol，但是本领域技术人员应该理解的是，还存在具有90000g/mol，250000g/mol，1300000g/mol等分子量的其他市售HEC产品。

图9所示为将HEC作为基质载体分子加入时的影响。图9A所示为当将35％的海藻糖或1％，0.5％或0.25％浓度的HEC含于基质中时血液样品产生的终点信号。如图9A所示，当以HEC替代海藻糖时，所产生的信号(即终点荧光信号)增强。图9B所示为当以HEC替代基质中的海藻糖时信号获得增强的状况。图9B中使用的浓度与图9A相同。图9A和图9B中的终点信号由如WO2018/002668所述的读取设备获取。

此外，还对基质中使用的HEC分子量对凝血时间的影响进行了研究。图9C所示为针对INR值为4.2的样品的结果。如图所示，基质中HEC的分子量越小，凝血时间越短。图9D所示为对HEC分子量对凝血时间的影响进行进一步研究的结果。在该图中，在根据本发明的实施方式的分析中使用具有介于0和8之间的已知INR(以参考系统测量，在本图中，以Roche的Coagu

发明人发现，当不存在海藻糖时，HEC极为粘稠。所以，为了促进可透光部分的覆盖，决定在基质中同时加入HEC和海藻糖，以实现稳定性，并促进游离R110的沉积。当与HEC结合使用时，所含海藻糖的浓度低于以上浓度，例如为10％。

还对其他载体分子进行了评价。其中，以含0.3％HEC，5％海藻糖及20％PEG(聚乙二醇)(以及Triton X 100、游离R110及组织因子)的基质，进行全血样品的检测分析。该分析测得的凝血时间示于图10A。如该图所示，利用上述基质，按照本发明方法测定的凝血时间与INR线性相关。

根据本发明，读取设备对由参考系统(ACL Elite，英国Werfen的基于血浆的实验室分析仪)测得为1的INR的检测时间为10～12秒，对测得为10的INR的检测时间为70～90秒。这些参考INR值由参考血浆样品以及按照Hart Biologicals(英国哈特尔浦)的INR校正试剂盒经恰当稀释的参考血浆样品提供。由此可知，利用本发明方法，可以在少于100秒的时间内测量高INR值。

还将Avicel作为所述基质的潜在载体分子进行了研究。Avicel RC-591为微晶纤维素(MCC)和羧甲基纤维素钠(CMC)的喷雾干燥共混物，用作水分散性有机水胶体。在水和适度剪切力的作用下，Avicel RC-591粉末颗粒先发生膨胀，然后胶溶化，从而形成纤维素微晶的分散体。这些微晶能够产生稳定的晶格结构。

由于微晶的尺寸小(分散体中约60％的微晶＜0.2μm)，因此每一粉末颗粒内均堆填了大量的微晶。这些大量的小微晶颗粒有助于达到更慢且更加均匀的沉降速度，增加悬浮稳定性以及促进硬包块的消除。除此之外，其还可实现分散性和稳定性。

除此之外，还对以Avicel替代HEC和/或海藻糖时对分析速度的影响进行了研究。对具有已知INR值的人造血液样品进行分析检测，其中，固着在可透光部分的内腔面上的基质内的载体分子分别为由HEC和海藻糖组成、仅由HEC组成、由Avicel和海藻糖组成或者仅由Avicel组成。从图10B可以看出，当基质中采用Avicel时，可以缩短分析时间。与仅含HEC的基质相比，同时含Avicel和海藻糖的基质可使值为8的INR的检测快大约140秒。

由于羧甲基纤维素钠(CMC)聚合物为Avicel RC-591的一种成分，因此随后决定对将CMC作为固着于可透光部分的内腔面上的基质的载体分子时的影响进行研究。图11A所示为基质中不同浓度的CMC(0.1％，0.2％或0.5％)对分析中的凝血时间(见y轴)的影响，其中，测试采用的各样品具有相同的已知INR值(该INR值已预先以Coagu

所检测的样品为具有已知INR值的参考血浆样品以及按照Hart Biologicals(英国哈特尔浦)的INR校正试剂盒恰当稀释的参考血浆样品。在该图中，以CMC替代Avicel RC-591。结果表明，分析时间与采用Avicel RC-591时实现的分析时间相当。对1～5的INR值，分析时间仍处于10～60秒内。

除此之外，还对基质中CMC浓度的影响进行了研究。基质中分别掺入0.4％的CMC或0.2％的CMC，并对具有相同已知INR值(以ACL INR参考系统预先测定)的样品进行分析。0.4％浓度CMC的凝血时间(图中y轴，以秒为单位)长于0.2％浓度CMC的凝血时间(图11B)。在这两种CMC浓度下，该分析均可测定较宽范围的INR(图11B所示为1～10.3的INR范围)。

图11A和图11B所使用的CMC为重量和纯度未知的聚合物共混物。经过进一步的找寻，获得了一些具有不同取代度的纯净形式CMC。聚合物的取代度(DS)是指每一基本单元(对于缩聚物而言)或每一单体单元(对于加成聚合物而言)上的取代基的平均数目。所使用的某些市售CMC的DS为0.7(也就是说，每10个脱水葡萄糖单元平均有7个羧甲基)。各项分析中所用的样品具有相同INR值，但CMC具有不同的DS(0.7DS，0.9DS或1.2DS)。图11C所示为已知INR值(以ACL参考系统预先测定)下各项分析的凝血时间(见y轴)。所有三种CMC形式呈现类似的分析速度，但是观察结果表明，凝血时间随取代度的增大而变长。

除此之外，还对供光学检测的多孔基质内的载体分子的组合进行了考量。其中，对供光学检测的多孔基质内的不同CMC和PEG浓度以及CMC/PEG之比的影响进行了评价。具体而言，对所述基质的溶解性以及因而检测所用试剂的分布情况进行了考量。

所检验的配方含质量百分比浓度介于0.83％和3.33％之间的PEG以及质量百分比浓度介于0.08％和0.12％之间的CMC。这些配方用于供光学检测的多孔基质。该多孔基质除其他成分之外，还含有荧光试剂R22124。此外，还以人造INR为2.7的血液样品检验该基质内的不同CMC/PEG之比。

经观察，CMC/PEG之比越高，即多孔基质所含的CMC浓度越低且PEG浓度越高，所产生的荧光越强，而且荧光越发生分布。相应结果(0.08％CMC和0.83％PEG，或0.08％CMC和1.67％PEG)如图12的底部两行图像所示。

图12中的图像所示为血液样品进入检测区域20秒，30秒及40秒(分别对应从左至右的各幅图像)后检测区域内多孔基质中检测到的荧光。在本实施方式中，仅使用一种多孔基质，即检测区域内供光学检测的多孔基质。

顶部一行图像所示为多孔基质含0.08％CMC和0.83％PEG时的荧光。中间一行图像所示为多孔基质含0.08％CMC和1.67％PEG时的荧光。底部一行图像所示为多孔基质含0.08％CMC和3.33％PEG时的荧光。

虽然不希望受到理论的束缚，但是发明人认为，PEG可增进多孔基质的润湿性，而CMC可提高该基质的结合性，即该基质在微流体通道表面上的固着性。通过优化这两种成分的比率，可以实现具有优异的表面固着性和更佳润湿性的基质，以使得分析物及所得反应产物实现均匀分布，从而可有助于改善荧光信号。

发明人决定研究的另一种物质为肝素。肝素为一种防止血块形成的抗凝血剂。当前存在普通肝素(UFH)和低分子量肝素(LMWH)这两种肝素。肝素与抗凝血酶III(AT)这一酶抑制剂结合，导致其构象发生变化，从而使其因反应性位点环柔性的增大而激活。激活后的AT随后使得凝血酶、因子Xa及其他蛋白酶失活。由于与肝素的结合，AT使此类蛋白酶失活的速率可增大达1000倍之多。

一种已知的肝素抑制剂为海美溴铵(HMB或聚凝胺)。，决定在分析中对依诺肝素这一肝素对具有已知INR值的样品的凝血时间的影响进行评价。与不使用依诺肝素的分析(对具有已知INR值的样品进行检测)相比，当在基质中添加浓度为3U(湿态浓度，随后允许干燥)的依诺肝素这一肝素时，将导致凝血时间增长。举例而言，当对大约4.4的INR值进行检测时，基质含依诺肝素钠时的凝血时间比基质不含依诺肝素钠时的凝血时间长大约70秒。这一效应在添加0.25mg/mL的聚凝胺后得到抑制，从而使得基质中含依诺肝素钠和聚凝胺时的分析所得的凝血时间与对照基质的凝血时间相当。

所述基质的干态配方具有许多重要的区别性优势。

首先，该干态配方具有粘性，能够承受血液流动，从而使得基质一直保持与光学检测装置对齐，实现最佳检测。虽然不希望受到理论的束缚，但是本发明人认为，基质的粘稠特性能够充当聚合物支架保持该基质中的活性成分。

干态基质为多孔物质，其多孔性质在允许必要分析物或分析物反应产物(在本实施方式中为凝血酶)进入的同时，防止样品中红细胞等大尺寸的成分进入。如此，可实现快速灵敏的分析。

通过使用干态基质，该基质能够因固着在微流体通道可透光部分的内腔面上而与LED等光学检测装置非常接近，从而防止光学干扰。此外，与已知的分析方法相比，基质与光学检测装置的非常接近还能提高分析的灵敏度。虽然不希望受到理论的束缚，但是本发明人认为，如此，不但可实现远高于本领域已知分析方法的分析速度，而且由于能够对凝血酶活性进行动力学检测，因此还能克服样品中其他成分的干扰。

除此之外，由于该基质的粘性极大，因此虽然其具有多孔性质，但是即使在与样品(如液体)接触时，仍然能够保持到位。如此，确保试剂或其试剂反应产物固着至与样品非常接近，从而进一步有助于分析的快速和灵敏。

基质、样品与光学检测器的非常接近意味着能够通过荧光信号以动力学方式检测凝血酶原向凝血酶的转化。

在本分析中，与高INR值(如INR值等于10，表示凝血程度低)的样品相比，低INR值(如INR值等于1，表示凝血程度高)样品的凝血酶原向凝血酶的转化更快。因此，本分析无需设置终点(即每过去一个固定的温育时间段后取一个测量值，但设置终点的做法仍然处于本发明的设想范围内)，而是可在达到阈值或特定比率后终止分析。如此，可以实现快速有效的分析。

当样品成功充满检测区域后，即表示起始时间0，并触发读取设备取多个光学测量值。在获取多个光学测量值的过程中，进行计时，以作为凝血时间。在这期间，荧光可因凝血酶原持续转化为凝血酶而持续增强，直至达到阈值。一旦达到阈值信号，则停止获取光学测量值。

图13A所示为基于本发明分析的示意性模型。该图表明，高水平的凝血酶转化(即从凝血酶原转化为凝血酶)对应于低INR值，而低水平的凝血酶转化程度对应于高INR值。图13B为表示凝血时间(PT)与INR值间的线性关系的示意图。其中，低的凝血时间值表示高凝血酶转化水平和低INR值，而高的凝血时间时间值表示低凝血酶转化水平和高INR值。所检测的样品为参考血浆样品(以及按照Hart Biologicals(英国哈特尔浦)的INR校正试剂盒恰当稀释的具有已知INR值的参考血浆样品)。

许多已知分析要求在检测前从全血样品中分离血浆。这一工作不但成本高昂，而且较为费时。图14表明，本分析能够用于检测包括经柠檬酸盐处理的血浆、血浆校准品(如本文所述由INR校正试剂盒提供的血浆校准品)及临床全血在内的各种不同样品。该图还对本发明分析所获得的值与其他已知分析获得的值进行了比较。

图14A和图14B所示为对包括经柠檬酸盐处理的血浆、血浆校准品以及临床全血在内的各种不同样品进行检测的结果。除此之外，相同的样品还以如上所述的ACL装置进行了检测。在图14A中，y轴上标的“Lumira PT(秒)”表示通过本发明方法获得的未校准PT，单位为秒。在图14B中，y轴所示为以本发明方法测定的校准后INR值。x轴上标的“ACL INR”表示以ACL Elite参考系统计算的INR值。

图14C所示为以本发明方法获得的临床全血和人造血液样品以秒为单位的未校准PT(y轴)与Coagu

从该图可明显地看出，在对血液或血浆样品进行检测时，本分析同等有效，而且柠檬酸盐处理对结果无影响。本分析具有在较宽INR值范围内保持线性的优点。

本分析的高分析速度使得其能够对凝血酶活性极低的极高INR样品进行测量。因此，如图15所示，根据本发明实施方式的分析具有能够测量极宽INR值范围的临床样品的优点。如该图所示，本分析即使在高INR值下，也能保持线性。

图16A所示为在本分析的一种实施方式中的凝血时间(相对于凝血酶水平)计算方式。时间点0表示样品充斥检测区域的时间点。随着样品充入检测区域，多孔基质由干转湿，并触发凝血级联，并进而触发凝血酶原向凝血酶的转化，从而使得基质中的R22124发生裂解以生成荧光信号。在该例中，荧光信号的发射波长为525nm。凝血酶原时间(或INR)值是凝血开始(图中红点)时测得的，其定义为信号变为超过平均基线6个标准差的时间。图16B为16A凝血开始部分的放大图。

在一种替代的INR测定法中，由分析校准方法根据PT测定值得出INR结果。PT表示样品对卡盒所含的凝血活酶启动的外源性凝血级联的激活作出反应时花费的时间，单位为秒。

其中，对随凝血级联反应的进行而由上述装置测得的荧光信号数据，按顺序实施一系列计算，该系列计算称作“PT算法”。

PT算法可基于以下的参数和步骤：

代码参数

start_wl＝515#待纳入的最小波长

end_wl＝530#待纳入的最大波长

threshold1＝-300#用于确定血液充入的阈值

threshold2＝1000#用于凝血时间初始估计的阈值

threshold3＝200#用于凝血时间最终估计的阈值

loCut＝0.35#回归数据截止下限(例如，0.35为35％)

hiCut＝0.65#回归数据截止上限(例如，0.65为65％)

PT时间＝Tclot-T0

装置对T35(loCut)和T65(hiCut)之间的数据点进行线性回归处理，以确定用于基线校正的斜率和截距。

注意：T35处于T0和T100之间的时间的35％处，T65处于T0和T100之间的时间的65％处。读取设备通过将所得截距和斜率应用至所有数据点上而形成一组基线校正后数据点。

读取设备在基线校正后数据当中寻找T50后的第一个点，在该点处计数值上升到200单位以上。

读取设备将上述时间记录为Tclot。

读取设备通过以所记录的Tclot时间值减去所记录的T0时间值的方式计算PT时间。

读取设备根据批次校准文件中的INR校准表，向PT时间测量值实施校准，以获得INR值。

作为上述标准差(SD)方法的一种替代方法，该方法采用固定阈值，并通过基线校正确保基线始终平坦。

除此之外，还可对其他瞬态特征(下降，斜率)进行检测，并通过捕错机制确保与测试条/分析/装置工作流程相关的所有步骤均按照预期的方式进行(例如，样品在给定时间内到达；样品不发生破坏；斜率在给定的时间内达到某一信号值；超时等)

图17A所示为根据本发明的实施方式的干态多孔基质(含组织因子，罗丹明11，海藻糖以及其他成分)在45℃下储存长达39周后的稳定性状况。在以此类干态基质对具有已知INR值的样品进行分析后表明，基质在上述温度下的长达39周的储存并未影响分析中计算出的凝血时间。

图17B所示为上述干态基质在5℃～70℃下储存长达12天后的稳定性状况。结果表明，即使在高达60℃的温度下保存长达120天，凝血时间仍然保持一致。

在采用多个多孔基质的实施方式中，各多孔基质的配方既可相同，也可不同。例如，供光学变化/信号生成的多孔基质的配方可比其他多孔基质的配方具有更大的粘性和更小的可溶性。一种例示多孔基质设置方案可包括具有低可溶性配方的供光学变化/信号生成的多孔基质(即第二多孔基质)以及具有低可溶性配方的设于检测区域之外的第一多孔基质。

供光学变化/信号生成的多孔基质的一种例示配方可含0.20％的CMC、5％的海藻糖、33.1％的凝血活酶(在涉及凝血酶检测的实施方式中)以及0.125mM的R22124。所述第二多孔基质可含5％的海藻糖。

在设想多个多孔基质的情形中，在一些实施方式中，这些多孔基质可不含PEG。

除此之外，还可设想到其他配方。

本发明可设想用于其他分析，例如样品(如全血)内胆固醇水平测定等动力学分析。

图18和图19所示为可用于胆固醇检测的途径和成分的说明性示例。供检测的胆固醇可包括游离胆固醇和/或胆固醇酯。

当供检测的分析物为胆固醇酯时，该酯可与胆固醇酯酶反应而生成游离胆固醇。

胆固醇在胆固醇氧化酶存在的条件下发生如下反应：

该反应生成的H

相应地，本发明的多孔基质可含有上述成分，以检测胆固醇和/或胆固醇酯水平。例如，对于胆固醇的检测，所述多孔基质可包括胆固醇氧化酶，HRP以及二氢罗丹明123。对于胆固醇酯的检测，所述多孔基质可进一步包括胆固醇酯酶。

如实施例1中所述，上述成分既可含于一个多孔基质内，也可彼此隔开或分离而减小干扰或者在按照需求改变各多孔基质的物理和/或化学性质时彼此隔开或分离。适合用于胆固醇分析的卡盒结构如图7和图8所示，但是应该理解的是，还可设想到其他卡盒结构。

以下，结合图7，对用于胆固醇分析的实施方式进行描述。

样品(如血液)与卡盒接触后，通过入口303引入卡盒。在本实施方式中，所述入口为圆形(但是应该理解的是，还可设想到其他形状)。

在引入入口303后，血液样品在毛细管作用下充入第一部分304、扩大部分314以及第二部分316，直至抵达通气分支318。此时，血液无法再在毛细管作用下进一步流动。随后，血液样品在主动充入机构的控制下，继续朝下游移动，其中，充气(空气/气体)腔室310通过减压而使得血液样品流过通气分支318，并进入含供光学变化/信号生成的多孔基质的检测区域326(未图示)内。在本实施方式中，供光学变化/信号生成的多孔基质固定于检测区域326内的上腔面。应该理解的是，在其他实施方式中，所述多孔基质也可固定在下腔面。

所述检测区域可由印制特征包围，而且如上所述，在本实施方式中，所述印制特征用于通过检测样品的流动而确定分析的起始时间。在本实施方式中，所述印制特征还用于控制所述主动充入机构，以停止、启动、减弱或增强该主动充入机构的作用，从而改变样品的流速，并且/或者使得样品开始或停止朝下游流动。

当血液样品进入检测区域326后，该样品内存在的任何胆固醇酯将与多孔基质内的胆固醇酯酶相互作用，以生成游离胆固醇。游离胆固醇随后与多孔基质内的胆固醇氧化酶反应而生成胆甾-4-烯-3-酮和H

在其他实施方式中，可以使用多于一个的多孔基质。例如，所述通道可具有第一部分(A区)，该第一部分下游的第二部分(B区)以及该第二部分下游的第三部分(C区)。每一区内均可设置多孔基质，各区可由印制特征隔开。C区可包括检测区域326，其内设置有供光学变化/信号生成的多孔基质。在A区内，多孔基质含胆固醇酯酶这一试剂。B区内的多孔基质含胆固醇氧化酶这一试剂。C区内的多孔基质含二氢罗丹明123和HRP此两试剂。在此类实施方式中，样品将充入通道304的第一部分以及向下游充入A区。在A区内，样品内存在的任何胆固醇酯将与多孔基质内的胆固醇酯酶发生反应，以生成游离胆固醇。所生成的游离胆固醇随样品向下游流动，充入B区。在B区内，游离胆固醇与胆固醇氧化酶生成，生成胆甾-4-烯-3-酮和H

上述反应产物混入样品中，并随样品进一步充入下游的C区。在C区内的多孔基质中，H

作为替代方案，所述卡盒也可不设A区，B区及C区，而是仅设A区和B区，并相应仅设置两个多孔基质。在此类实施方式中，A区内的多孔基质可含胆固醇酯酶和/或胆固醇氧化酶。在包括多于一个多孔基质的实施方式中，可仅将这些多孔基质当中的一个沉积在检测区域内。然而，在其他实施方式中，也可将多于一个的多孔基质沉积在检测区域内。

图20所示为根据本发明的实施方式的胆固醇分析结果。在本实施方式中，多孔基质固定在检测区域的内腔面上。在该具体实施方式中，多孔基质固定在检测区域的下部内腔面上，但是应该理解的是，也可设想将多孔基质固定在检测区域的上部内腔面上。该多孔基质所含的成分为胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、HRP以及二氢罗丹明123。该多孔基质还含有作为载体分子的海藻糖。

其中，将含已知浓度胆固醇的10μl样品加至入口后，该样品充入通道，并到达检测区域。在样品处于检测区域内90秒后，开始获取光学测量值。图20A为所检测到的光学信号(本实施方式中为荧光信号)(y轴)的峰值与胆固醇总浓度(x轴)的关系图。图20B所示为更小尺度下的图20A中的低胆固醇浓度值。

1.卡盒插入读取设备；

2.读取设备对卡盒气室加压；

3.样品施加至卡盒后，通过主动作用(腔室的部分减压)使样品充入至位于检测区域下游的印制特征；

4.样品润湿处于检测区域下游的印制特征的检测电极，从而确定检测开始时间，并且启动止流机构，以防止样品进一步朝下游流动；

5.样品润湿固着在卡盒的检测区域的可透光部分的内腔面上的多孔基质，该基质含能够与样品内的分析物或分析物反应产物反应的试剂；

6.试剂与样品内的分析物/分析物反应产物反应，以形成生成光学信号的试剂反应产物；

7.设于可透光部分的腔外的光学检测器获取多个光学测量值，直至达到阈值信号；

8.通过撤除施加于卡盒的气室上的作用力而进一步将气室完全减压。

随着作用力的撤除，所有样品被完全驱入卡盒，以供后续安全处置。

1.卡盒插入读取设备；

2.读取设备对卡盒气室加压；

3.样品施加至卡盒后，通过主动作用(腔室的部分减压)使样品充入至位于检测区域下游的印制特征；

4.样品润湿处于检测区域下游的印制特征的检测电极，从而确定检测开始时间，并且启动止流机构，以防止样品进一步朝下游流动；

5.样品润湿固着在卡盒的检测区域的可透光部分的内腔面上的多孔基质，该基质含能够与样品内的分析物或分析物反应产物反应的试剂；

6.试剂与样品内的分析物/分析物反应产物反应，以形成生成光学信号的试剂反应产物；

7.在固定的一段时间后，设于可透光部分的腔外的光学检测器获取光学测量值。每一测试条批次和分析物通道均分别校准，以使得信号转换为成分浓度。

1.卡盒插入读取设备；

2.样品施加至卡盒后，先通过被动毛细管作用使样品充入微流体通道，然后通过主动作用使样品充入检测区域；

3.在充入微流体通道的过程中，样品润湿固着于微流体通道的内腔面上的第一多孔基质，样品内的分析物与第一多孔基质内的试剂反应；

4.试剂的分析物反应产物与分析物混入样品，并随样品向第一多孔基质下游充入至检测区域；

5.样品润湿固着于检测区域的可透光部分的内腔面上的供光学变化/信号生成的第二多孔基质，该基质含能够与分析物反应产物反应的另一试剂；

6.所述另一试剂与样品内的分析物反应产物反应，从而形成生成光学信号的试剂反应产物；

7.设于可透光部分的腔外的光学检测器获取多个光学测量值，直至达到阈值信号。

1.卡盒插入读取设备；

2.样品施加至卡盒后，先通过被动毛细管作用使样品充入微流体通道，然后通过主动作用使样品充入检测区域；

3.样品润湿固着于检测区域的可透光部分的内腔面上的供光学变化/信号生成的多孔基质，该基质含能够与样品中的分析物反应的试剂；

4.试剂与样品内的分析物反应，从而形成生成光学信号的试剂反应产物；

5.设于可透光部分的腔外的光学检测器获取多个光学测量值，直至达到阈值信号。

1.卡盒插入读取设备；

2.读取设备的施力构件向卡盒气室加压，将卡盒内的气体驱出；

3.血液样品施加至卡盒后，减小施力构件向气室施加的作用力，从而使得气室部分减压，并使得空气重新进入腔室。如此，使得部分血液样品在主动充入机构的作用下流过通道；

4.所述部分血液样品继续朝下游流动，直至抵达位于检测区域下游的印制特征。该印制特征用作防止样品继续朝下游流动的边界，并且还用于启动防止样品继续朝下游流动的止流机构；

5.血液样品润湿位于检测区域下游的印制特征的检测电极，从而确定检测开始时间；

6.血液样品润湿固着在检测区域的可透光部分的内腔面上的供光学变化/信号生成的多孔基质，该基质含R110。样品中的凝血酶将R110的纤维蛋白原肽臂裂解，从而生成荧光性的单酰胺。该荧光性单酰胺被光学检测器发出的光激发而发出525nm的荧光信号；

7.设于可透光部分的腔外的光学检测器获取多个光学测量值，直至达到阈值信号。信号随后转换为成分浓度。

1.卡盒插入读取设备；

2.血液样品施加至卡盒后，同时在被动毛细管作用和主动充入机构的作用下向下游充入微流体通道和检测区域内；

3.血液样品润湿固着在检测区域的可透光部分的内腔面上的供光学变化/信号生成的多孔基质，该基质含R110。样品中的凝血酶将R110的纤维蛋白原肽臂裂解，从而生成荧光性的单酰胺。该荧光性单酰胺被光学检测器发出的光激发而发出525nm的荧光信号；

4.设于可透光部分的腔外的光学检测器获取多个光学测量值，直至达到阈值信号；

5.通过撤除施加于卡盒气室上的作用力而进一步将气室完全减压。

随着作用力的撤除，所有血液样品被完全驱入卡盒，以供后续安全处置。

1.卡盒插入读取设备；

2.读取设备的施力构件向卡盒气室加压，将卡盒内的气体驱出；

3.血液样品施加至卡盒后，减小施力构件向气室施加的作用力，从而使得气室部分减压，并使得空气重新进入腔室。如此，使得部分血液样品在主动充入机构的作用下流过通道；

4.所述部分血液样品继续朝下游流动，直至抵达位于检测区域下游的印制特征。该印制特征用作防止样品继续朝下游流动的边界，并且还用于启动防止样品继续朝下游流动的止流机构；

5.血液样品润湿位于检测区域下游的印制特征的检测电极，从而确定检测开始时间；

6.血液样品润湿固着在检测区域的可透光部分的内腔面上的供光学变化/信号生成的多孔基质，该基质配方含二氢罗丹明123。样品中的过氧化氢将二氢罗丹明123氧化，其中，过氧化氢为胆固醇氧化酶催化胆固醇的氧化反应的产物；

7.氧化后的二氢罗丹明123形成荧光性形式的阳离子罗丹明123这一试剂反应产物，阳离子罗丹明123被光学检测装置发出的光激发而发出530nm的荧光信号；

8.设于可透光部分的腔外的光学检测器获取多个光学测量值，直至达到阈值信号。信号随后转换为分析物(在本实施方式中为胆固醇)浓度。

1.卡盒插入读取设备；

2.样品施加至卡盒后，先通过被动毛细管作用使样品充入微流体通道，然后通过主动作用使样品充入检测区域；

3.在充入微流体通道的过程中，样品润湿固着于微流体通道的内腔面上的第一多孔基质，样品内的胆固醇与第一多孔基质内的胆固醇氧化酶反应；

4.胆固醇的分析物反应产物和胆固醇氧化酶混入样品，并随样品充入第一多孔基质下游至检测区域；

5.样品润湿固着于检测区域的可透光部分的内腔面上的供光学变化/信号生成的第二多孔基质，该基质含能够与分析物反应产物反应的二氢罗丹明123。该第二多孔基质还包括用于促进该相互作用的HRP；

6.二氢罗丹明123与样品中的分析物反应产物反应，以形成生成光学信号的试剂反应产物；

7.设于可透光部分的腔外的光学检测器获取多个光学测量值，直至达到阈值信号。