一种采用二联PCR检测猪PPV、JEV的试剂及方法

技术领域

本发明涉及检测试剂领域，具体涉及一种采用二联PCR检测猪PPV、JEV的试剂及方法。

背景技术

猪细小病毒病是由猪细小病毒(PPV)引起的一种猪的繁殖障碍病。以怀孕母猪发生流产、死产、产木乃伊为特征。猪流行性乙型脑炎是由日本乙型脑炎病毒(JEV)引起的猪繁殖障碍性疾病，主要以母猪流产、死胎和公猪睾丸炎为特征。在种猪场发生的繁殖障碍性疫病中，这两种疾病繁殖障碍性疾病往往会严重降低种猪的生产效率。生产上对种猪场繁殖障碍性疾病的摸底排查、临床诊断，为猪场制定免疫程序提供科学的理论依据具有重大的实践意义。目前对本病的诊断目前主要是PCR和血清学诊断方法。但是血清学方法不如PCR方法敏感性高，PCR方法大多都是单一PCR检测，要检测这两种病毒的混合感染需要分别进行 PCR操作，因此相对比较繁琐。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是现有检测PPV、JEV两种病毒混合感染的方法为分别进行单一PCR检测操作，相对比较繁琐，目的在于提供一种采用二联PCR检测猪PPV、JEV的试剂及方法，可在同一体系中检测两种感染病毒的存在，能够大大的提高诊断效率。

本发明通过下述技术方案实现：

一种采用二联PCR检测猪PPV、JEV的试剂，包含能扩增PPV的NS1基因和JEV的 NS1基因的两对特异性引物，其中P1和P2引物扩增PPV的NS1基因片段，扩增长度为750bp， P3和P4引物扩增JEV的NS1基因片段，扩增长度为475bp；所述引物序列为如下核苷酸序列：P1：SEQ ID NO：1；5'-GGGACCAGGCAACAGACAT-3'；

P2：SEQ ID NO：2；5'-CTGCGGTTTGAGCCATCA-3'；

P3：SEQ ID NO：3；5'-AGGCATCACATCAACCCG-3'；

P4：SEQ ID NO：4：5'-AAGGGAGCAACTGCGACA-3'。

一种采用二联PCR检测猪PPV、JEV的试剂，包括10×PCR缓冲液2.5μL， 2.5mmol/LdNTP 4μL，25mmol/L Mg

一种采用二联PCR检测猪PPV、JEV试剂的制备方法，主要包括以下步骤：

(1)PPV的NS1基因和JEV的NS1基因序列的选择：从GenBank数据库中下载已经发表的PPV-VRI-1株的NS1、JEV-WHe株的NS1基因序列，

(2)根据选择的PPV的NS1基因和JEV的NS1基因的靶序列，用PCR引物设计软件分别进行引物的设计，将设计的引物进行最佳配对筛选试验，得到2最佳引物：P1、P2及 P3、P4，用全自动DNA合成仪进行引物的合成，其中P1和P2引物扩增PPV的NS1基因片段，扩增长度为750bp，P3和P4引物扩增JEV的NS1基因片段，扩增长度为475bp；所述引物序列为如下核苷酸序列：

P1：SEQ ID NO：1；5'-GGGACCAGGCAACAGACAT-3'；

P2：SEQ ID NO：2；5'-CTGCGGTTTGAGCCATCA-3'；

P3：SEQ ID NO：3；5'-AGGCATCACATCAACCCG-3'；

P4：SEQ ID NO：4：5'-AAGGGAGCAACTGCGACA-3'。

一种采用二联PCR检测猪PPV、JEV的方法，主要包括以下步骤：

(1)样品的处理；

(2)病料样品RNA和DNA的提取；

(3)二联PCR反应：

采用25μL PCR反应体系；PCR反应体系的组成为：10×PCR缓冲液2.5μL， 2.5mmol/L dNTP 4μL，25mmol/L Mg

(4)结果判定

取二联PCR产物在琼脂糖凝胶上，电泳后在凝胶成像系统中观察拍照，以标准 DNAmarker(D,L-2000)作参考；电泳后，若琼脂糖凝胶中同时出现2条核酸带，且片段大小分别为750bp和475bp，说明病料样品中同时含有PRV、JEV病毒；如果仅出现其中一个对应长度的核酸片段，则表明病料样品中只含有其中一种病毒；若不出现任何核酸片段，则表明病料样品中不含有PRV、JEV病毒。

步骤(4)中，取5μl产物在1.5％的琼脂糖凝胶上电泳30min后在凝胶成像系统中进行观察。

步骤(3)中，JEV的cDNA的合成反应体系：5×PrimeScript

本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：

本发明一种采用二联PCR检测猪PPV、JEV的试剂及方法，具有快速、特异性强等优点，通过联合PCR技术可以快速、有效地鉴别PPV、JEV三种病毒，与单一PCR检测相比，具有省时、省力的优点。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：

图1为二联PCR的特异性实验结果图；

图2为6份猪病料样品检测结果，其中M为D,L-2000(2000，1000，750，500，250，100)，其中1-6为6份临床猪病料。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。

实施例1

引物的设计

(1)PPV、JEV基因靶序列的选择

从GenBank数据库中下载已经发表的PPV-VRI-1株的NS1、JEV-WHe株的NS1基因序列作为两对引物的靶序列。

(2)特异性引物的设计及合成

将选择的PPV-VRI-1株的NS1基因、JEV-WHe株的NS1基因的靶序列分别输入primerpremier 5.0软件和oligo 6.0软件程序中联合进行引物设计，分别设计两种基因的特异性引物。 PPV的NS1基因引物设计具体的要求为：G+C含量为55.6～57.9％，引物长度18～19nt，Tm 值57.4～58.2℃，扩增产物长度750bp；JEV的NS1基因引物设计要求为：G+C含量为55.6％，引物长度18nt，Tm值56.8～58.4℃，扩增产物长度475bp。将得到的引物序列进行引物之间的最佳配对筛选试验，得到候选的引物对，用全自动DNA合成仪进行候选引物的合成。

实施例2

二联PCR扩增的体系条件的优化

(1)先后对退火温度、酶浓度、引物浓度、Mg2+分别进行优化；体系中变量较多，优化某一变量时，保持其它变量恒定。确定了测定PPV的NS1基因单项PCR的最佳引物量，确定单项PCR的反应条件如下：25μL PCR反应体系，单联PCR的体系组成为：

扩增程序为：95.5℃5min预变性，进入95℃变性30s、57℃退火30s，72℃延伸45s共35个循环，最后72℃延伸5min。反应完成后取5μl产物，在1.5％的琼脂糖凝胶上电泳30min后在凝胶成像系统中进行观察；

(2)在二联PCR反应体系中分别加入PPV的NS1基因的最佳引物量及不同浓度的JEV的NS1基因引物，进行二联PCR，筛选出PPV的NS1基因二联PCR反应体系中JEV的NS1 基因引物的最佳工作浓度和最佳的二联PCR扩增模式，确定二联PCR扩增反应条件如下：采用25μLPCR反应体系；PCR反应体系的组成为：

PCR反应条件为：95.5℃，预变性5min；95℃，变性30s；53.3℃，退火30s；72℃，延伸45s，共35个循环，最后72℃延伸5min。

实施例3

二联PCR特异性实验

用所建立的二联PCR进行单一模板和二联模板的检测，并以PRV-SA215、PCV1和发病猪及健康猪淋巴结DNA抽提物作为对照，确定本方法具有极强的特异性，不会出现无关扩增条带。

如图1所示，M：DL2000；1-4为分别含有PPV、JEV、PRV-SA215、PCV1病毒的病料， 5为健康猪淋巴结核酸抽提物；实验结果表明，PPV、JEV都扩增出了明亮的条带，而 PRV-SA215、PCV1、健康猪淋巴结核酸抽提物均未扩增出任何条带，表明该方法具有很强的特异性。

实施例4

用建立的二联PCR检测方法对6份具有繁殖障碍性疾病的病料样品进行PPV、JEV病毒的检测

(1)6个病料样品的选取：经过单一PCR检测，6粉病料PPV和JEV均为阳性的病料

(2)样品的处理；

(3)6个病料样品DNA的提取；

(4)二联PCR反应：

采用25μL PCR反应体系；PCR反应体系的组成为：10×PCR缓冲液2.5μL， 2.5mmol/L dNTP 4μL，25mmol/L Mg

(5)分别取5μl 6个病料的二联PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶上电泳30分钟后在下观察拍照，以标准DNA marker(D,L-2000)作参考，结果如图2所示，可以看出1-6号病料的琼脂糖凝胶中同时出现2条核酸带，片段大小分别为750bp，和475bp，说明病料1-6感染了JEV、PPV两种混合病毒。

以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

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<120> 一种采用二联PCR检测猪PPV、JEV的试剂及方法

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<170> SIPOSequenceListing 1.0

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<212> DNA

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gggaccaggc aacagacat 19

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<212> DNA

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