一种用于构建萝卜分子身份证的SV分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种用于构建萝卜分子身份证的SV分子标记及其应用。

背景技术

萝卜(Raphanus sativus L.)属于十字花科萝卜属蔬菜，其幼苗、肉质根和叶片均可食用，种子可入药。我国是萝卜生产大国，常年的萝卜种植面积约120万公倾，总产量约4000万吨。萝卜产业在保障农民收入、维持夏秋季蔬菜供应方面起着重要作用，栽培萝卜形态多样，可以分为亚洲大萝卜(R.sativus var.hortensis)、欧洲樱桃萝卜(R.sativusvar.sativus)、黑萝卜(R.sativus var.niger)、油用萝卜(R.sativus var.chinensis)以及鼠尾萝卜(R.sativus var.caudatus)。

在生产上，萝卜品种繁多，对不同品种进行亲缘关系鉴定是进行种子生产与销售的前提。因此，开发能够鉴别不同萝卜品种材料的分子标记，构建萝卜的分子标记身份证，对鉴定萝卜品种纯度和亲缘关系具有重要意义。

分子标记主要有限制性内切酶片段长度多态性(Restriction Fragment LengthPolymorphism，RFLP)、随机扩增多态性DNA标记(Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD)、扩增片段长度多态性(Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP)、简单重复序列标记(Simple Sequence Repeats，SSR)、插入缺失标记(insertion-deletion，InDel)和单核苷酸多态性分子标记(single nucleotide polymorphism，SNP)等。其中RFLP、RAPD、SSR和AFLP分子标记数目较少且检测难度大，SNP分子标记开发成本和检测成本高昂，InDel分子标记具有标记数目多、准确性高、检测安全无毒等特点，是分子育种中的理想标记，但是难以通过普通琼脂糖凝胶进行区分。

发明内容

基于此，本发明的目的之一在于提供一种用于构建萝卜分子身份证的SV分子标记引物，所述SV分子标记引物至少包括下述九对引物，HY004正向引物：AGGATCCAAAAGGTACCACACA(SEQ ID NO:1)，反向引物：ACTACATCACGTGCCCAACA(SEQ ID NO:2)；和HY009正向引物：GGTTGCAGGTGTGGGTAAGA(SEQ ID NO:3)，反向引物：CCACCTCATTGCCCATCACT(SEQ ID NO:4)；和HY022正向引物：TTGATCTGACACGTACCTCA(SEQ IDNO:5)，反向引物：TCTGAAACTCGATTACCAACA(SEQ ID NO:6)；和HY024正向引物：ATAAACCTCTCAGCTCCGGC(SEQ ID NO:7)，反向引物：CCGTACAGAAGGCGTGATGA(SEQ ID NO:8)；和HY042正向引物：AGCTTTTCTCCTGGTTCCGG(SEQ ID NO:9)，反向引物：CGTGTCACTATGAGGCCGAA(SEQ ID NO:10)；和HY055正向引物：TGTGTCATGTGTGTAGTCATCT(SEQID NO:11)，反向引物：TCAACTCATTTTCAAAACGTCA(SEQ ID NO:12)；和HY068正向引物：TTCGCAGCGTGAGTTGATAA(SEQ ID NO:13)，反向引物：CGAGGTGAGCTTTTTAAATACT(SEQ ID NO:14)；和HY076正向引物：GAAGGGATTAGAGCGACGAC(SEQ ID NO:15)，反向引物：TTCGGACCGAACACAATGTA(SEQ ID NO:16)；和HY092正向引物：CTCCTGCCATGCATCTAAGG(SEQID NO:17)，反向引物：CACAAGGTTCTCGTCACCAT(SEQ ID NO:18)。

本发明的目的之二在于提供一种鉴定萝卜品种亲缘关系和/或纯度的方法，包括以下步骤：(1)提取待测萝卜样本的总DNA；(2)以待测萝卜样本的总DNA为模板，采用上述SV分子标记引物进行PCR扩增，并电泳检测；(3)PCR产物赋值：将每一对引物扩增出的产物根据条带带型长、短以及长短均有的杂合态分别赋值为“0”、“1”或者“2”，按照染色体顺序构建含有9个数字的萝卜分子身份证；(4)亲缘关系判定：两个材料在同一位点的标记有3个及3个以上赋值不同，则亲缘关系远，2个及2个以下赋值不同，则亲缘关系近；和/或纯合度判定：同一种材料有2个及2个以下位点赋值为“2”，则品种纯合度高，有3个以上赋值为“2”，则纯合度低。

本发明的目的之三在于提供一种用于构建萝卜分子身份证的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括上述SV分子标记引物。

本发明的目的之四在于提供上述特异性DNA片段或上述SV分子标记引物或试剂盒在构建萝卜分子身份证的应用。

本发明采用大片段的结构变异开发了9个分子标记，采用普通琼脂糖凝胶即可完成检测，安全无毒，操作简便，在萝卜的每个染色体上均含有一个分子标记，每个位点有3种可能性(AA，Aa和aa)，总计3

附图说明

图1为实施例3中HY004标记对24个萝卜材料的筛选胶图；

图2为实施例3中HY009标记对24个萝卜材料的筛选胶图；

图3为实施例3中HY022标记对24个萝卜材料的筛选胶图；

图4为实施例3中HY024标记对24个萝卜材料的筛选胶图；

图5为实施例3中HY042标记对24个萝卜材料的筛选胶图；

图6为实施例3中HY055标记对24个萝卜材料的筛选胶图；

图7为实施例3中HY068标记对24个萝卜材料的筛选胶图；

图8为实施例3中HY076标记对24个萝卜材料的筛选胶图；

图9为实施例3中HY092标记对24个萝卜材料的筛选胶图；

图10为实施例3中24个萝卜材料根据萝卜分子身份证所做的亲缘关系分析结果。

其中图1～9中泳道1为2000bp DNA Marker，泳道2～25均为所选用萝卜材料的泳道，依次为编号Rs197、Rs198、Rs199、Rs201、Rs202、Rs205、Rs218、Rs224、Rs229、Rs244、Rs252、Rs260、Rs261、Rs262、Rs269、Rs275、Rs282、Rs291、Rs317、Rs331、Rs345、Rs347、Rs367、Rs117。

具体实施方式

以下结合具体实施方式对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语均属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

实施例1分子标记的开发

在萝卜全基因组共筛选到9对引物，分别命名为HY004、HY009、HY022、HY024、HY042、HY055、HY068、HY076、HY092，其中，HY004引物扩增位置位于1号染色体上(Rs1)，HY009引物扩增位置位于2号染色体上(Rs2)，HY022引物扩增位置位于3号染色体上(Rs3)，HY024引物扩增位置位于4号染色体上(Rs4)，HY042引物扩增位置位于5号染色体上(Rs5)，HY055引物扩增位置位于6号染色体上(Rs6)，HY068引物扩增位置位于7号染色体上(Rs7)，HY076引物扩增位置位于8号染色体上(Rs8)，HY092引物扩增位置位于9号染色体上(Rs9)。对应的引物的碱基序列如下表1所示:

表1特异性引物序列

实施例2鉴定萝卜品种亲缘关系的方法

鉴定萝卜品种亲缘关系的方法包括如下步骤：

(1)采用CTAB法提取待测萝卜样本的总DNA，具体提取步骤为：取2cm新鲜萝卜叶片于2mL离心管中，加入800μL预热至65℃的2％CTAB并加入两颗钢珠，在磨样机上，65Hz，90s研磨；65℃水浴30min，期间每10min上下颠倒混匀一次；加入600μL氯仿/异戊醇(24:1,V/V)，缓慢震荡，室温下10000r/min离心10min；取500μL上清液，加入2/3异丙醇，缓慢颠倒混匀；12000r/min离心10min，去上清，加入1mL75％乙醇洗涤；12000r/min离心5min，去乙醇，风干；用100μLddH

(2)以该待测萝卜的总DNA为模板，分别采用表1中的引物进行PCR扩增反应：PCR反应体系为10μL，其中2XEs Taq 5μL、ddH

(3)对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。

(4)PCR产物赋值：将每一个位点扩增出的产物根据条带带型长、短以及长短均有的杂合态分别赋值为“0”、“1”或者“2”，通过对9个扩增产物的赋值，按照染色体顺序构建含有9个数字的萝卜分子身份证；其中，HY004引物扩增出的条带分别为281bp和228bp，HY009引物扩增出的条带分别为344bp和294bp，HY022引物扩增出的条带分别为556bp和390bp，HY024引物扩增出的条带分别为279bp和238bp，HY042引物扩增出的条带分别为268bp和315bp，HY055引物扩增出的条带分别为299bp和240bp，HY068引物扩增出的条带分别为300bp和251bp，HY076引物扩增出的条带分别为286bp和243bp，HY092引物扩增出的条带分别为312bp和256bp。

(5)亲缘关系判定规则：两个材料在同一位点的标记有3个及3个以上赋值不同，则亲缘关系远，2个及2个以下赋值不同，则亲缘关系近。

(6)品种纯合度判定规则：同一材料在9个标记中有2个以下(含2个)赋值为“2”，则品种纯合度高，若9个标记中有3个以上位点赋值为“2”，则品种纯合度低。

实施例3准确性验证或应用

实验材料：Rs197、Rs198、Rs199、Rs201、Rs202、Rs205、Rs218、Rs224、Rs229、Rs244、Rs252、Rs260、Rs261、Rs262、Rs269、Rs275、Rs282、Rs291、Rs317、Rs331、Rs345、Rs347、Rs367、Rs117来源于蔬菜种质创新与遗传改良湖北省重点实验室，具体商品名称见表2。

采用实施例1中的9个分子标记对24个萝卜材料按照实施例2所述的方法进行鉴定，鉴定结果如下表2所示：

表2 9个标记对24个萝卜材料的鉴定结果

使用NTSYSpc(v2.1)软件对上述结果进行亲缘关系分析，发现偏20(Rs244)、19小浪底(Rs252)和吴大沟长白(Rs262)聚为一组；特新父本(Rs229)和锤(Rs331)聚为一组，而上述材料对应的为不同地点的相同品种取样；QZ-33(Rs198)和2015种子(Rs291)聚为一组；1905单(Rs201)和QZ-46(Rs345)聚为一组；喜诺青(Rs347)和荆沙(Rs367)聚为一组，通过对上述各组中材料的表型进行观察，发现上述三组中组内植物的形态、肉质根大小具有一定的相似之处，而组间植物的形态、肉质根大小差异相对较大；可见，上述萝卜分子身份证用于萝卜的亲缘关系鉴定是可靠的。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<120> 一种用于构建萝卜分子身份证的SV标记及其应用

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> HY004-正向引物(Artificial Synthesis)

<400> 1

aggatccaaa aggtaccaca ca 22

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> HY004-反向引物(Artificial Synthesis)

<400> 2

actacatcac gtgcccaaca 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> HY009-正向引物(Artificial Synthesis)

<400> 3

ggttgcaggt gtgggtaaga 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> HY009-反向引物(Artificial Synthesis)

<400> 4

ccacctcatt gcccatcact 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> HY022-正向引物(Artificial Synthesis)

<400> 5

ttgatctgac acgtacctca 20

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> HY022-反向引物(Artificial Synthesis)

<400> 6

tctgaaactc gattaccaac a 21

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> HY024-正向引物(Artificial Synthesis)

<400> 7

ataaacctct cagctccggc 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> HY024-反向引物(Artificial Synthesis)

<400> 8

ccgtacagaa ggcgtgatga 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> HY042-正向引物(Artificial Synthesis)

<400> 9

agcttttctc ctggttccgg 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> HY042-反向引物(Artificial Synthesis)

<400> 10

cgtgtcacta tgaggccgaa 20

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> HY055-正向引物(Artificial Synthesis)

<400> 11

tgtgtcatgt gtgtagtcat ct 22

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> HY055-反向引物(Artificial Synthesis)

<400> 12

tcaactcatt ttcaaaacgt ca 22

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> HY068-正向引物(Artificial Synthesis)

<400> 13

ttcgcagcgt gagttgataa 20

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> HY068-反向引物(Artificial Synthesis)

<400> 14

cgaggtgagc tttttaaata ct 22

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> HY076-正向引物(Artificial Synthesis)

<400> 15

gaagggatta gagcgacgac 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> HY076-反向引物(Artificial Synthesis)

<400> 16

ttcggaccga acacaatgta 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> HY092-正向引物(Artificial Synthesis)

<400> 17

ctcctgccat gcatctaagg 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> HY092-反向引物(Artificial Synthesis)

<400> 18

cacaaggttc tcgtcaccat 20