新型的中性粒细胞弹性蛋白酶的基于活性的探针及其用途

技术领域

本发明涉及可用作中性粒细胞弹性蛋白酶的基于活性的探针和/或抑制剂的化合物，检测中性粒细胞弹性蛋白酶活性的方法，以及相关诊断方法。

背景技术

根据Lechtenberg等人，ACS Chem.Biol.(2015)，“蛋白酶是多种生理过程的中心介质。蛋白水解裂解事件是蛋白质降解、酶活化和蛋白质成熟的基础，并调节从细胞死亡、迁移和增殖，炎症和免疫应答，到凝血的多种途径(Rawlings and Salvesen(2012))。另一方面，异常蛋白水解通常与严重的病症相关。此外，蛋白酶通常在细胞中表达或作为无活性酶原分泌，该无活性酶原需要通过如蛋白水解裂解或二聚化的过程来活化。蛋白酶的活化基于严格的时间和空间调控，因此通常蛋白酶位置不是蛋白酶功能的理想标记。相反，给定蛋白酶的活性形式的时空位置对于理解其功能是必要的。为此目的，已针对各种蛋白酶开发了基于活性的探针(Deu等人，Nat.Struct.Mol.Biol.(2012))。这些探针的设计类似于活性位点反应蛋白酶抑制剂，可以特异性标记活性蛋白酶，因此是进行研究和诊断的有力工具。此外，这些探针还为开发用于潜在治疗用途的选择蛋白酶的有效抑制剂铺平了道路(Deu等人，Nat.Struct.Mol.Biol.(2012))。”Lechtenberg等人接着将中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)描述为“用于基于活性的探针设计的理想但困难的靶标的主要示例”。

NE是一种丝氨酸蛋白酶，即在中性粒细胞的嗜天青颗粒内发现的、在其活性位点中使用丝氨酸残基作为亲核氨基酸用于蛋白水解的蛋白酶(Korkmaz等人，Pharmacol Rev(2010))。在感染过程中，活性NE通过裂解微生物蛋白而有助于杀死细胞内病原体(Korkmaz等人，Pharmacol Rev(2010)；Kobayashi等人，Arch Immunol Ther Exp(2005))。缺乏NE的小鼠更容易受到细菌和真菌感染(Reeves等人，Nature(2002))。NE还通过处理细胞因子、趋化因子和生长因子来介导炎症(Korkmaz等人，Pharmacol Rev(2010))。此外，NE裂解蛋白酶活化受体(PAR)(G蛋白偶联受体(GPCR)家族)的细胞外N末端，以引发导致炎症和疼痛的细胞信号传导事件(Jimenez-Vargas等人，Proc Natl Acad Sci(2018)；Lieu等人，Brit JPharmacol(2016)；Zhao等人，J Biol Chem(2015))。NE还可通过裂解细胞外基质组分而促进组织破坏。人们越来越认识到，在乳腺癌、前列腺癌、结肠癌/直肠癌和肺癌中NE活性增加(Lerman&Hammes.Steroids(2018))。NE还参与慢性阻塞性肺病(Demkow&Overveld Eur JMed Res(2010))和肺部感染(Polverino等人，Chest(2017))的发展，该肺部感染可能包括军团菌(Legionella)感染(Narita等人，Nihon Kokyuki Gakkai Zasshi(2007))。

除了其在感染和癌症中的作用之外，最近还发现NE与炎性肠病(IBD)(其特征在于胃肠道中的慢性和复发性炎症)的发病机理有关(Edgington-Mitchell.Am J PhysiolGastrointest Liver Physiol(2015))。IBD包含溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩氏病(CD)，两者均与腹泻、直肠出血、尿急(increased urgency)和疼痛相关。缺乏一个NE拷贝和相关的中性粒细胞丝氨酸蛋白酶(蛋白酶3(PR3))的小鼠在结肠炎小鼠模型中表现出症状改善(Motta等人，Gastroenterol(2011))。通过结肠内施用腺病毒载体或引入表达弹力素(elafin)的乳酸菌来强制性表达弹力素(一种内源性丝氨酸蛋白酶抑制剂)，导致结肠炎小鼠模型中的症状减轻(Motta等人，Gastroenterol(2011))。用NE选择性抑制剂治疗还减轻了结肠炎症状(Morohoshi等人，J Gastroenterol(2006))。与健康对照相比，IBD患者的结肠粘膜活检显示在mRNA和蛋白水平上NE表达均升高(Kuno等人，J Gastroenterol(2002)；Uchiyama等人，Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol(2012))。

由于NE被表达为无活性酶原并且一旦被活化就可以被内源性抑制剂严格控制，因此测量mRNA或总蛋白表达很少能反映出活性功能酶的集合(pool)(Edgington等人，CurrOp Chem Biol(2011))。因此，需要用于测量NE的比活性的工具以更准确地确定其与病理学的关系。

市售的显色底物探针和荧光底物探针(分别包括AAPV-对硝基苯胺和BODIPY-FL-弹性蛋白)显示了在UC和CD患者的活检以及在IBD小鼠模型中的弹性蛋白酶样活性的增加(Gecse Ket al.Gut(2008)；Morohoshi等人，J Gastroenterol(2006)；Motta等人，SciTrans Med(2012)；Motta等人，Gastroenterol(2011))。然而，这些探针不仅缺乏特异性，而且可以被组织和组织样品中存在的多种蛋白酶切割(Edgington等人，Curr Op Chem Biol(2011)；Edgington-Mitchell.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol(2015))。

先前使用了用于NE的荧光性的基于活性的探针(ABP)(Cy5-V-DPP)来追踪结肠炎期间的NE活化(Edgington-Mitchell等人，Bioorganic Med Chem Lett(2017))。该探针含有磺化花青5(sulfoCy5)荧光团和P1缬氨酸残基，该P1缬氨酸残基与二苯基膦酸亲电体(DPP；'弹头')偶联，后者以共价、不可逆的方式与活性NE的活性位点丝氨酸反应。尽管Cy5-V-DPP在高表达的纯化细胞(例如，骨髓)中有效标记了重组NE和内源性NE，但缺乏灵敏度导致很少成功在结肠炎组织中检测NE活性。

因此，需要用于NE的基于活性的探针，其允许在更复杂的样品诸如组织裂解物中检测NE活性，例如，如下的探针：该探针显示出对其它蛋白酶切割的抗性和/或其灵敏度足够高到允许标记NE并由此检测组织裂解物中NE活性。类似地，需要如下的方法：该方法使用这些基于活性的探针来检测组织裂解物中的NE活性，抑制组织裂解物中的NE，和/或通过测试组织裂解物来诊断患有其中NE活性起作用的病理的受试者。

本发明人现在发现，如下所述的具有可检测元件、识别序列Nle(O-Bzl)-Met(O)2-Oic-Abu和DPP弹头的基于活性的探针化合物可用作基于活性的探针，该基于活性的探针用于检测组织裂解物中NE活性。迄今为止，这种结构的化合物，如PK101探针(其具有生物素标签、PEG接头、识别序列Nle(O-Bzl)-Met(O)2-Oic-Abu和DPP弹头)和PK10X系列的探针(其具有不同的标签、PEG接头、识别序列Nle(O-Bzl)-Met(O)2-Oic-Abu和DPP弹头)，仅被描述为对纯化细胞中的NE具有功效和特异性(Kasperkiewicz等人，J Am Chem Soc(2017)；Kasperkiewicz等人，FEBS(2017)；Kasperkiewicz等人，Proc Natl Acad Sci(2014)；Lechtenberg等人，ACS Chem Biol(2015))，其代表了较少挑战的样本类型。

发明内容

本发明某些实施方案的目的是提供检测组织样品裂解物中的中性粒细胞弹性蛋白酶活性的方法。

本发明某些实施方案的目的是提供诊断与(增加的)中性粒细胞弹性蛋白酶活性相关的疾病的体外方法。

本发明某些实施方案的目的是提供诊断疾病的体外方法，该疾病选自由以下组成的组：乳糜泻(celiac disease)、胃肠动力障碍、疼痛、瘙痒、皮肤病、饮食诱导的肥胖、代谢障碍、哮喘、类风湿性关节炎、牙周炎、炎性胃肠(GI)病症、功能性GI病症、癌症、纤维化疾病、代谢功能紊乱、神经系统疾病、慢性阻塞性肺病(COPD)和感染。

本发明某些实施方案的目的是提供诊断受试者中疾病的体外方法，该疾病选自下组：炎性肠病、感染、慢性阻塞性肺病和癌症。

本发明某些实施方案的目的是提供抑制中性粒细胞弹性蛋白酶的体外方法。

本发明某些实施方案的目的是提供基于活性的探针化合物，其允许(例如，在组织裂解物中)检测中性粒细胞弹性蛋白酶活性，具有对中性粒细胞弹性蛋白酶的高效力，诸如与基于活性的探针Cy5-V-DPP相比改善的对中性粒细胞弹性蛋白酶的效力。

本发明某些实施方案的目的是提供中性粒细胞弹性蛋白酶的抑制剂。

本发明某些实施方案的目的是提供可用于诊断与中性粒细胞弹性蛋白酶活性相关的疾病的化合物。

本发明某些实施方案的目的是提供可用于诊断疾病的化合物，该疾病选自由以下组成的组：乳糜泻、胃肠动力障碍、疼痛、瘙痒、皮肤病、饮食诱导的肥胖、代谢障碍、哮喘、类风湿性关节炎、牙周炎、炎性GI病症、功能性GI病症、癌症、纤维化疾病、代谢功能紊乱、神经系统疾病、慢性阻塞性肺病(COPD)和感染。

本发明某些实施方案的目的是提供可用于诊断疾病的化合物，该疾病选自由以下组成的组：炎性肠病、感染、慢性阻塞性肺病和癌症。

应当理解，上述目的还涉及相应的方法以及在相应的方法中使用的化合物/组合物。

在某些实施方案中，本发明涉及检测组织样品裂解物中的中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)活性的方法，其包含：

(1)以获自受试者的组织样品制备裂解物，

(2)使裂解物与式I化合物或其盐接触，

[化学式1]

其中D为可检测元件，

(3)随后对步骤(2)的裂解物的至少一个等分试样进行凝胶电泳；以及之后

(4)测量可检测信号。

在某些实施方案中，本发明涉及诊断受试者中与NE活性相关的疾病的方法，其包含：

(1)以获自受试者的组织样品制备裂解物，

(2)使裂解物与式I化合物或其盐接触，

[化学式2]

其中D为可检测元件，

(3)随后对裂解物进行凝胶电泳；以及之后

(4)测量可检测信号。

在某些实施方案中，本发明涉及抑制NE的体外方法，其包含：

(1)以获自受试者的组织样品制备裂解物，

(2)使裂解物与式I化合物或其盐接触，

[化学式3]

其中D为可检测元件。

在某些实施方案中，本发明涉及前述方法，其中在步骤(2)中，使裂解物与具有式IA的化合物或其盐接触：

[化学式4]

其中D为可检测元件。

在某些实施方案中，本发明涉及在受试者中诊断炎性肠病的体外方法，其包含检测NE的活化形式，该NE的活化形式为成熟NE的修剪形式。

在某些实施方案中，本发明涉及式I的化合物

[化学式5]

或其盐，

其中D为可检测元件，

条件是不包括其中D对应于下式之一的化合物：

[化学式6]

[化学式7]

[化学式8]

[化学式9]

[化学式10]

其中在上述各式中，曲线代表与分子的其余部分的连接点。在某些此类实施方案中，本发明涉及一种具有式IA的化合物：

[化学式11]

或其盐，其中D为可检测元件。

在某些实施方案中，本发明涉及一种式II的化合物

[化学式12]

或其盐。

在某些实施方案中，本发明涉及一种式IIA化合物

[化学式13]

或其盐。

在某些实施方案中，本发明涉及包含任何一种上述化合物或其盐和赋形剂的组合物。

附图说明

[图1A]图1A描绘了通过用HPLC测量214nm处的吸光度得到的合成sulfoCy5-Nle(OBzl)-Met(O)

[图1B]图1B描绘了合成的sulfoCy5-Nle(OBzl)-Met(O)

[图2A]图2A描绘了通过用HPLC测量214nm处的吸光度得到的合成PK105b的纯度。

[图2B]图2B描绘了PK105b的API-ES分析：计算的m/z；C

[图3]图3描绘了Cy5-V-DPP和PK105b与重组丝氨酸蛋白酶的浓度依赖性结合的凝胶内荧光结果。

[图4A]图4A描绘了用Cy5-V-DPP或PK105b离体标记的鼠骨髓裂解物的凝胶内荧光结果。

[图4B]图4B描绘了用NE特异性抗体对图4A的PK105b标记的裂解物进行免疫沉淀的结果。

[图4C]图4C描绘了用Cy5-V-DPP或PK105b离体标记的鼠胰腺裂解物的凝胶内荧光结果。

[图4D]图4D描绘了用对NE、胰腺弹性蛋白酶(PE)和胰蛋白酶3(Try3)具有特异性的抗体对图4A的PK105b标记的裂解物进行免疫沉淀的结果。

[图5A]图5A描绘了通过凝胶内荧光检测的PK105b对从小鼠身上切除的远端或近端结肠进行离体标记(上；*表示身份未知的高分子量物质)以及用NE特异性抗体对相同样品进行免疫印迹以揭示总NE表达(下；n＝3-5)的结果，其中所述小鼠患有由TNBS诱导的急性结肠炎。

[图5B]图5B描绘了用NE特异性抗体对PK105b标记的发炎的远端结肠裂解物进行免疫沉淀的结果。

[图5C]图5C描绘了带有或不带有PK105b标记的远端结肠裂解物的凝胶内荧光(上)和NE免疫印迹(下)的结果。

[图6A]图6A描绘了用Cy5-V-DPP探针离体标记的远端结肠裂解物(对照或用TNBS处理)的凝胶内荧光结果。

[图6B]图6B描绘了用PK105b标记的对照或用TNBS处理的小鼠的管腔液(luminalfluid)的凝胶内荧光的结果。

[图6C]图6C描绘了来自用PK105b标记的对照或用TNBS处理的小鼠的粪便颗粒的凝胶内荧光结果。

[图6D]图6D描绘了用对NE、PE或胰蛋白酶3具有特异性的抗体对PK105b标记的粪便样品进行免疫沉淀的结果。

[图7A]图7A描绘了通过凝胶内荧光检测的PK105b对健康患者或患有炎性肠病(IBD)的那些患者的粘膜活检的离体标记(上)以及用NE特异性抗体对相同样品进行免疫印迹以揭示总NE表达(下)的结果。活动性溃疡性结肠炎(UC；n＝9)或健康对照(正常；n＝5)。

[图7B]图7B描绘了活性NE(左)和通过免疫印迹检测到的最精简形式(the mosttrimmed species)的NE(右；SEM)的光密度分析。

[图7C]图7C描绘了用NE特异性抗体对PK105b标记的UC活检裂解物进行免疫沉淀的结果。

[图8A]图8A描绘了从对照或军团菌感染的小鼠身上切除并用PK105b离体标记的肺的凝胶内荧光(*表示身份未知的高分子量物质)以及用NE特异性抗体对样品进行免疫印迹(n＝3-5)的结果。

[图8B]图8B描述了图8A中的NE活性(左)和通过免疫印迹检测到的成熟NE(右)的光密度分析。

[图8C]图8C描述了用NE特异性抗体对PK105b标记的肺裂解物进行免疫沉淀的结果。

[图9A]图9A描绘了用PK105b离体标记的正常小鼠舌头或HSC-3口腔鳞状细胞癌异种移植肿瘤的凝胶内荧光(*表示身份未知的高分子量物质)以及用NE特异性抗体对样品进行免疫印迹(n＝3-5)的结果。

[图9B]图9B描绘了图9A中的NE活性(左)和通过免疫印迹检测到的成熟NE(右)的光密度分析。

[图9C]图9C描述了用NE特异性抗体对PK105b标记的肿瘤裂解物进行免疫沉淀的结果。

具体实施方式

在描述本发明时，以下术语如下所述地使用。

如本文所用，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括复数指代，除非上下文另外明确指出。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同含义。

术语“中性粒细胞弹性蛋白酶活性”是指丝氨酸蛋白酶中性粒细胞弹性蛋白酶的蛋白水解活性。中性粒细胞弹性蛋白酶也称为白细胞弹性蛋白酶、弹性蛋白酶-2、丝氨酸弹性蛋白酶、亚型人白细胞弹性蛋白酶(HLE)、medullasin、PMN弹性蛋白酶或骨髓弹性蛋白酶。

术语“成熟中性粒细胞弹性蛋白酶”或“成熟NE”是指通过对最初由NE基因通过转录和翻译产生的37kDa无活性酶原形式(称为ELANE或ELA2)进行修剪(即缩短)所得的25kDa形式。成熟NE可以显示出NE活性。

术语“成熟NE的修剪形式”是指由成熟NE的进一步修剪产生的NE的形式，因此<25kDa。

术语“NE的活化形式”是指可以显示出NE活性的NE形式。成熟NE和成熟NE的修剪形式可以为NE的活化形式。

术语“组织样品”或“组织活检”是指从受试者获得的生物组织的样品，如通过切除、针抽吸、活检钳或拭子获得的样品。组织样品还包含粘膜活检、痰液样品和粪便样品。采样的组织可以为活的、死亡的、健康的或患病的，并且含有细胞类型和细胞外因子的异种混合物。

“粘膜活检”通常通过擦拭积聚在另一组织(例如粘膜或肠道上皮)表面上的粘液获得。粘膜活检含有其上积聚了粘液的组织的脱落细胞和细胞分泌物。

术语“痰液样品”是指如下的样品：其是唾液和从呼吸道咳出的粘液的混合物。“痰液样品”可以通过侵入性或非侵入性方式获得。侵入性方法涉及在受试者插管时进行口咽或气管内抽吸，并将获得的内容物采集在痰液采集器中。非侵入性方法采集受试者咳嗽时产生的内容物，有时在用盐水雾化使分泌物松散之后进行。

术语“粪便样品(fecal sample)”或“粪样品(stool sample)”是指从受试者的粪便采集的样品。粪便样品包含从受试者的胃肠道脱落的细胞和来自胃肠道的细胞分泌物。

术语“组织样品裂解物”是指通过裂解组织样品的细胞而获得的溶液。术语“裂解(lysing)”或“裂解(lysis)”是指细胞膜的分解或破裂，导致细胞内容物的释放和/或随后的细胞死亡。裂解可以例如通过细胞膜的机械、酶促或渗透破坏来实现。

术语“基于活性的探针”旨在具有与本领域普通技术人员通常理解的相同含义。基于活性的探针(ABP)是以活性依赖性方式(即，标记反应需要酶活性)与酶(诸如蛋白酶)或一组酶的活性位点共价结合的小分子。ABP通常包括三个要素：(i)被称为“弹头”的亲电子部分，(ii)接头或识别序列，以及(iii)用于检测的可检测元件或“报告基因部分”。酶攻击亲电子弹头，导致形成共价加合物，该共价加合物随后可以直接检测(例如，如果可检测元件为荧光标记)，或者通过两步标记检测(例如，连接柄(ligation handle)的标记后修饰)。

术语“可检测元件”或“报告基因基团/部分”是指化合物(基于活性的探针)中的官能团，其可以使用包括但不限于以下的技术来检测：光学方法(例如，荧光或UV-VIS吸光度的测量)、放射线照相术、生化方法(例如，使用免疫化学试剂诸如抗体)等。术语“可检测元件”包括可“直接”检测(例如，在进行SDS-PAGE后通过荧光测量)的官能团，以及可在进行二次标记步骤和随后的二次标记检测后进行检测的官能团。此类基团的示例为生物素标记，其可以例如在用荧光标记的链霉亲和素进行二次标记并随后进行荧光测量之后被检测。这种基团的另一个示例为点击化学标记(生物正交连接柄)，其可以在例如使用点击化学(生物正交)反应的荧光标记进行二次标记并随后进行荧光测量之后被检测。

因此，“生物正交连接柄(bioorthogonal ligation handle)”是在初始探针标记步骤(蛋白酶/生物学样品/受试者与本发明化合物的体内或离体接触)中存在于本发明化合物中的官能团，其使得能够在二次标记步骤中使用例如在体外进行的点击化学(生物正交)反应进行后续的二次标记的连接。

在例如以下文献中描述了用于二次标记(即连接实际要检测的标记)的点击化学标记和各自的点击化学反应：例如，Martell等人，Molecules(2014)和Willems等人，Acc.Chem.Res.(2011)。

可检测元件产生“可检测信号”，其可在本文所述的分析检测方法中进行测量。

术语“患者”是指如下的受试者(特别是人类受试者)：该受试者已经表现出表明需要治疗的一种或多种特定症状的临床表现，接受针对病症的预防性(preventatively)或预防性(prophylactically)治疗，或已被诊断患有待治疗的病症。

术语“受试者”是指包含哺乳动物受试者，特别是人类受试者，并且包括术语“患者”的定义，并且不排除在所有方面或就特定病症而言完全正常的个体。

如本文所用，术语“与中性粒细胞弹性蛋白酶活性相关的疾病”或“与NE活性相关的疾病”表示其中中性粒细胞弹性蛋白酶活性与疾病的发病机理有关的疾病。在“与NE活性相关的疾病”中，在身体的患病状态或患病区域(例如，身体部分、器官、包括肿瘤组织在内的病理组织)中的NE活性水平偏离在身体的无病理状态或相应的无病理区域中发现的NE活性的相应水平。在某些实施方案中，与在身体的无病理状态或相应的无病理区域中发现的NE活性的相应水平相比，在身体的患病状态下或患病区域中的NE活性的水平增加。例如，在无病理状态或区域中，NE活性水平可以低于可检测极限，而在患病状态下或区域中，NE活性水平高于可检测极限。与中性粒细胞相关的疾病为，例如，乳糜泻、胃肠动力障碍、疼痛、瘙痒、皮肤病诸如特应性皮炎(topic dermatitis)、饮食诱导的肥胖、代谢障碍(包括，但不限于非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝和胰腺疾病)、哮喘、类风湿性关节炎、牙周炎、炎性GI病症(诸如炎性肠病(IBD)、感染性腹泻、肠系膜缺血、憩室炎和坏死性小肠结肠炎(NEC))、功能性GI病症(诸如肠易激综合症、功能性胸痛、功能性消化不良、恶心和呕吐疾病、功能性便秘、功能性腹泻、大便失禁、功能性肛门直肠疼痛和功能性排便障碍)、癌症、纤维化疾病、代谢功能紊乱、神经系统疾病、慢性阻塞性肺病(COPD)和感染。

如本文所用，术语“炎性胃肠疾病”、“炎性胃肠病症”或“炎性GI疾病”表示胃肠疾病，即涉及胃肠道(即口腔、食道、胃、小肠、大肠(结肠)和直肠)和消化的附属器官(例如，舌头、唾液腺、胰腺、肝脏和胆囊)的疾病，其中存在胃肠道的一个或多个部位的炎症。炎性GI疾病包含，例如，炎性肠病、感染性腹泻、肠系膜缺血、憩室炎和坏死性小肠结肠炎。

术语“炎性肠病”或“IBD”是指以胃肠道中的慢性和复发性炎症为特征的疾病的集合。IBD最显著包含溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩氏病(CD)，这两者均与腹泻、直肠出血、尿急和疼痛有关，但也包括较不普遍的疾病，诸如急性结肠炎、免疫肿瘤学结肠炎、化疗/放射性结肠炎、移植物抗宿主疾病结肠炎、胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎、显微镜结肠炎、改道性结肠炎(diversion colitis)、贝赫切特病(

如本文所用，术语“功能性胃肠病症”、“功能性GI病症”或“功能性GI疾病”表示肠-脑相互作用的病症。其为由与下列任何组合相关的GI症状分类的一组疾病：动力障碍，内脏过敏症，粘膜和免疫功能改变，肠道微生物群改变以及中枢神经系统(CNS)处理改变。术语“功能性”通常用于如下病症：其中就肠的运动、肠神经的敏感性或大脑控制其中一些功能的方式而言，机体的正常活动受到损害。然而，通过内窥镜检查、x射线或血液检查没有观察到结构异常。因此，这些病症主要通过症状的特征来鉴定。功能性GI病症包括肠易激综合征、功能性胸痛、功能性消化不良、恶心和呕吐病症、功能性便秘、功能性腹泻、大便失禁、功能性肛门直肠疼痛和功能性排便障碍。

术语“感染”是指如下的过程或状态：其中感染剂(诸如，例如，致病性的细菌、真菌、原生动物、病毒、朊病毒、类病毒、线虫和蠕虫)侵入并在受感染的受试者的身体组织中繁殖。

术语“慢性阻塞性肺病”是指一组进行性肺病，且包括肺气肿、慢性支气管炎和难治性(不可逆性)哮喘。这些疾病的特征在于呼吸急促增加和气短(poor air-flow)。

术语“癌症”是指以不受控制的异常细胞生长为特征、具有侵入或扩散至身体其他部位的潜能的疾病的集合。癌症可影响任何组织，并以起源组织命名。术语“口腔癌”是指口腔的癌症，即位于受试者口腔中的任何癌性组织生长。口腔癌的示例性组织学类型为畸胎瘤(teratoma)，衍生自大或小唾液腺的腺癌，扁桃体或其它淋巴组织的淋巴瘤，或口腔粘膜的色素产生细胞的黑素瘤。口腔癌的最常见类型为起源于衬于口腔和唇部的组织的鳞状细胞癌，较不常见的类型包括卡波西肉瘤(Kaposi’s sarcoma)。口腔癌最常累及舌头，但也可能发生在口腔底、颊内里(cheek lining)、牙龈、嘴唇或上颚。术语“乳腺癌”是指乳腺的癌症。示例性的乳腺癌为原位导管癌(DCIS)、原位小叶癌(LCIS)、浸润性导管癌(IDC)、浸润性小叶癌(ILC)、乳头佩吉特病(Paget disease)、叶状肿瘤和血管肉瘤。术语“前列腺癌”是指前列腺的癌症。示例性前列腺癌包括前列腺的腺癌。术语“结肠直肠癌”是指结肠和/或直肠癌。示例性结肠直肠癌为起源于结肠或直肠的腺癌、类癌瘤、胃肠道间质瘤(GIST)、淋巴瘤和肉瘤。

当与化学基团诸如烷基和芳基结合使用时，术语“(C

如本文所用，术语“烷基”表示直链或支链烷基。烷基的示例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、2-丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基和2，2-二甲基丙基等。在某些实施方案中，术语“烷基”表示直链烷基，诸如甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基、正庚基和正辛基。

如本文所用，术语“芳基”表示通过从环碳原子上除去氢原子而衍生自单环或多环芳香烃的基团。芳基的示例包括苯基和萘基。

如本文所用，术语“磺基”是本领域公认的，并且是指基团-SO

表示带正电荷或负电荷的原子或基团的式(诸如N

出于本发明的目的，术语“盐”包括无机酸盐，诸如盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、磷酸盐等；有机酸盐，诸如肉豆蔻酸盐、甲酸盐、乙酸盐、三氟乙酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、酒石酸氢盐等；磺酸盐，诸如甲磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐等；以及氨基酸盐，诸如精氨酸盐、天冬酰胺盐、谷氨酸盐等。术语“盐”包括相应盐的溶剂合物，诸如水合物。

在某些实施方案中，如本文所用，术语“盐”是指诊断上可接受的盐。在某些实施方案中，如本文所用，术语“盐”是指诊断上和药学上可接受的盐。

如本文所用，术语“药学上可接受的盐”是指对于哺乳动物的局部或全身使用安全且有效并且具有所需的生物学活性的本发明化合物的盐。抗衡离子适合于预期用途，无毒，并且不会干扰化合物的所需生物学作用。在本发明的上下文中，药学上可接受的盐包括在IUPAC Handbook of Pharmaceutically Acceptable Salts中综述的盐(Wermuth，C.G.andStahl，P.H.，Pharmaceutical Salts:Properties，Selection and Use-A Handbook，Verlag Helvetica Chimica Acta(2002))。

如本文所用，术语“诊断上可接受的盐”是指对所需诊断方法有用且有效的本发明化合物的盐。其抗衡离子不会干扰检测靶蛋白所必需的反应，也不会干扰检测/诊断方法。

在某些实施方案中，本发明的化合物以三氟乙酸盐的形式存在，例如，以包括三氟乙酸(TFA)的洗脱溶剂进行HPLC纯化之后。

如本文所用，术语“使裂解物与式I化合物(或其盐)接触”还涵盖其中使裂解物与包含式I化合物(或其盐)和赋形剂的组合物接触的实施方案。

在某些此类实施方案中，该组合物为包含例如水、生理缓冲盐水或缓冲液作为赋形剂的水溶液。在某些此类实施方案中，水溶液还包含洗涤剂诸如triton X-100。

在某些实施方案中，“赋形剂”是指在诊断上和/或药学上可接受的赋形剂。可用于本发明组合物中的在诊断上和/或药学上可接受的赋形剂是本领域技术人员已知的。此类药学上可接受的赋形剂的示例包括例如在WO 2018/119476的第[0114]至[0118]段中描述的那些，其内容由此引入本公开中。

在显示与化学结构邻近的曲线的分子式中，曲线表示或指示与分子其余部分的连接点。如果化学结构内的键被绘制为曲线(如本文所述的式IA和IIA)，这表明未定义各个位置的立体化学，即，通过该键连接的取代基(在式IA和IIA中，乙基)可以指向背面或指向正面。

式I或式II的化合物可以含有一个或多个不对称中心，因此可以产生对映异构体、非对映异构体和其它立体异构形式。除非另外具体指明，否则本公开涵盖具有所有此类可能形式的化合物，以及其外消旋和拆分形式或其任何混合物。当式(I)的化合物含有烯键式双键或其它几何不对称中心时，并且除非另外具体指明，否则其意图包括所有“几何异构体”，例如，E和Z几何异构体。除非另外特别指出，否则所有“互变异构体”，例如，酮-烯醇，酰胺-亚胺酸，内酰胺-内酰亚胺，烯胺-亚胺，胺-亚胺和烯胺-烯胺互变异构体也旨在被本公开涵盖。

如本文所用，术语“立体异构体”、“立体异构形式”等是仅在其原子的空间取向上不同的单个分子的所有异构体的总称。其包括对映异构体和具有一个以上手性中心的化合物的非互为镜像的异构体(“非对映异构体”)。

术语“手性中心”是指连接有四个不同基团的碳原子。

术语“对映异构体”或“对映体”是指在其镜像上不可重叠并且因此具有光学活性的分子，其中对映异构体在一个方向上旋转偏振光的平面，而其镜像在相反方向上旋转偏振光的平面。

术语“外消旋”是指等份对映异构体的混合物，其是非光学活性的。

术语“拆分”是指分子的两种对映体形式之一的分离或浓缩或耗尽。式(I)化合物的旋光异构体可通过已知技术获得，诸如手性色谱法或由光学活性的酸或碱形成非对映体盐。

光学纯度可以以对映体过量(％ee)表示，其通过下式确定：

在一个实施方案中，本发明涉及具有由式IA或IIA表示的绝对立体化学的化合物。

本发明的化合物可以使用标准合成化学技术合成，例如使用在以下实施例部分中描述的方法。其它有用的合成技术描述于，例如，March's Advanced Organic Chemistry:Reactions，Mechanisms，and Structure，7th Ed.，(Wiley，2013)；Carey and Sundberg，Advanced Organic Chemistry 4thEd.，Vols.A and B(Plenum 2000，2001)；Fiesers'Reagents for Organic Synthesis，Volumes 1-27(Wiley，2013)；Rodd's Chemistry ofCarbon Compounds，Volumes 1-5and Supplementals(Elsevier Science Publishers，1989)；Organic Reactions，Volumes 1-81(Wiley，2013)；以及Larock's ComprehensiveOrganic Transformations(VCH Publishers Inc.，1989)(全部通过引用整体并入本文)。化合物通常使用通常可从商业来源获得的或使用本领域技术人员熟知的方法容易地制备的起始材料来合成。参见，例如，Fiesers'Reagents for Organic Synthesis，Volumes 1-27(Wiley，2013)或Beilsteins Handbuch der organischen Chemie，4，Aufl.ed.Springer-Verlag，Berlin，包括增补。

在根据本发明的检测中性粒细胞弹性蛋白酶活性的方法中，仅检测中性粒细胞弹性蛋白酶的蛋白水解活性形式。

在基于活性的探针化合物与中性粒细胞弹性蛋白酶之间的反应(其导致形成共价键)发生之后测量可检测信号。所测量的可检测信号由标记的酶发出，即由共价连接至中性粒细胞弹性蛋白酶的基于活性的探针化合物的可检测元件发出。在某些实施方案中，在对标记的酶进行二次标记步骤后测量可检测信号。

使用基于活性的探针检测酶活性的概念以及相应的检测方法和基础实验方案是本领域技术人员已知的(参见，例如，Edgington and Bogyo，2013；Edgington-Mitchell，L.E.，and Bogyo，M.(2016).Detection of Active Caspases During Apoptosis UsingFluorescent Activity-Based Probes.Methods Mol Biol.1419，27-39；以及Edgington-Mitchell，L.E.，Bogyo，M.，and Verdoes，M.(2017).Live Cell Imaging and Profilingof Cysteine Cathepsin Activity Using a Quenched Activity-Based Probe.MethodsMol Biol.1491，145-159；其内容通过引用整体并入本文)。本领域技术人员知晓如何适当地调整这些方法/方案以用于本发明的方法中。

在某些实施方案中，本发明涉及一种检测组织样品裂解物中的中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)活性的方法，其包含：

(1)以获自受试者的组织样品制备裂解物，

(2)使裂解物与式I化合物或其盐接触，

[化学式14]

其中D为可检测元件，

(3)随后对步骤(2)的裂解物的至少一个等分试样进行凝胶电泳；以及之后

(4)测量可检测信号。

在某些此类实施方案中，本发明涉及在步骤(3)之后还包括以下步骤的方法：

(5)用抗NE抗体进行免疫印迹。

在某些实施方案中，本发明涉及其中还进行以下步骤的方法：

(3a)使用对式I化合物具有特异性或对其部分具有特异性(即对式I化合物的一部分具有特异性)的抗体，对步骤(2)的裂解物的单独等分试样中的式I化合物进行免疫沉淀，

(4a)随后分析共沉淀的物质。

在某些此类实施方案中，本发明涉及其中步骤(4a)的分析包含以下的方法：

-凝胶电泳以及随后的使用抗NE抗体进行的免疫印迹，或

-蛋白质测序，

并且优选包含凝胶电泳以及随后的使用抗NE抗体进行的免疫印迹。

在某些实施方案中，本发明涉及前述实施方案中任一项的方法，其中在步骤(2)之前，将步骤(1)的裂解物的等分试样用特异性NE抑制剂预处理，并且其中，随后将预处理的等分试样以类似于步骤(1)的未预处理的裂解物的方式进行处理。

在某些实施方案中，本发明涉及前述实施方案中任一项的方法，其中组织样品选自由以下组成的组：口腔活检、食道样品、胃样品、小肠样品、肺样品、痰液样品、胰腺样品、骨髓样品、结肠样品、远端结肠样品、近端结肠样品、乳房活检、前列腺活检、直肠活检、肝脏样品、皮肤样品、肿瘤样品、粪便样品和粘膜活检。在某些此类实施方案中，组织样品为粘膜活检，并且该粘膜活检选自由以下组成的组：结肠粘膜活检、远端结肠粘膜活检、近端结肠粘膜活检、小肠粘膜活检、肺粘膜活检、直肠粘膜活检、食道粘膜活检和口腔粘膜活检。

在某些实施方案中，本发明涉及前述实施方案任一项的方法，其中受试者为人类受试者。

在某些实施方案中，本发明涉及前述实施方式任一项的方法，其中检测NE的活化形式，该NE的活化形式为成熟NE的修剪形式。在某些此类实施方案中，本发明涉及其中组织样品选自由以下组成的组的方法：口腔活检、食道样品、胃样品、小肠样品、结肠样品、近端结肠样品、远端结肠样品、直肠样品、粪便样品和粘膜活检。在某些此类实施方案中，组织样品是粘膜活检，并且该粘膜活检选自由以下组成的组：口腔粘膜活检、食道粘膜活检、小肠粘膜活检、结肠粘膜活检和直肠粘膜活检。

在上述方法的某些实施方案中，制备裂解物包含清除步骤。清除步骤可包含通过重力或离心作用使未溶解的物质沉降的步骤。

在上述方法的某些实施方案中，凝胶电泳为一维或二维凝胶电泳。在某些此类实施方案中，凝胶电泳为SDS-PAGE或天然PAGE，优选SDS-PAGE。

在上述方法的某些实施方案中，可检测元件选自由以下组成的组：荧光标记、生物素标记、放射性标记、螯合剂和生物正交连接柄。在某些此类实施方案中，可检测信号通过荧光测量或放射线照相术测量。在某些此类实施方案中，测量通过荧光测量进行，并且荧光测量为凝胶内荧光。在某些此类实施方案中，在荧光测量之前进行二次标记(secondarylabelling)。在某些此类实施方案中，二次标记选自由以下组成的组：用标记的链霉亲和素进行二次标记、用荧光团进行二次标记，以及用标记的抗体(tagged antibody)进行二次标记。

在上述方法中每一个的某些实施方案中，步骤(4)中可检测信号的测量包含选自由以下组成的组的测量：放射线照相术，以及凝胶电泳和随后的放射线照相术。在某些此类实施方案中，所述化合物包含放射性标记形式的可检测元件。在某些其它实施方案中，所述化合物包含放射性标记螯合剂形式的可检测元件。在某些其他实施方案中，所述化合物包含生物正交连接柄形式的可检测元件，并且步骤(4)还包含在进行放射线照相术测量之前通过点击化学进行二次标记以应用放射性标记或放射性标记螯合剂。

在上述方法中每一个的某些实施方案中，步骤(4)中可检测信号的测量包含选自由以下组成的组的测量：亲和纯化和随后的质谱分析，以及亲和纯化和随后的蛋白质组学。在某些此类实施方案中，所述化合物包含生物素标记形式的可检测元件。在某些其他实施方案中，所述化合物包含生物正交连接柄形式的可检测元件，并且步骤(4)还包含在进行亲和纯化之前通过点击化学进行二次标记以应用生物素标记。在生物素标记的情况下，亲和纯化可以使用例如用链霉亲和素包被的珠子或用生物素特异性抗体包被的珠子来进行。

在某些实施方案中，亲和纯化可以使用以对某个标签具有特异性的抗体包被的珠子进行。在某些此类实施方案中，所述化合物包含所述标签作为可检测元件。在某些其他实施方案中，所述化合物包含生物正交连接柄形式的可检测元件，并且步骤(4)还包含在进行亲和纯化之前通过点击化学进行二次标记以应用所述标签。

在上述方法中每一个的某些实施方案中，步骤(4)中可检测信号的测量包含凝胶电泳和随后的免疫印迹。在某些此类实施方案中，所述化合物包含生物素标记形式的可检测元件，并且步骤(4)还包含在进行免疫印迹之前例如用HRP标记的链霉亲和素进行二次标记。在某些其他实施方案中，所述化合物包含生物正交连接柄形式的可检测元件，并且步骤(4)还包含在进行免疫印迹之前通过点击化学进行二次标记以应用生物素标记，并随后例如用HRP标记的链霉亲和素进行标记。

在某些实施方案中，本发明涉及诊断受试者中炎性肠病(IBD)的体外方法，其包含检测NE的活化形式，该NE的活化形式为成熟NE的修剪形式。在某些此类实施方案中，受试者为人类受试者。在某些实施方案中，本发明涉及诊断受试者中炎性肠病的体外方法，其中该方法包含使NE的活化形式与基于活性的探针接触的步骤。在某些实施方案中，本发明涉及诊断受试者中炎性肠病的体外方法，其中该方法包含使NE的活化形式与抗NE抗体接触的步骤。

在某些其它实施方案中，本发明涉及诊断受试者中与NE活性相关的疾病的体外方法，其包含：

(1)以获自受试者的组织样品制备裂解物，

(2)使裂解物与式I化合物或其盐接触，

[化学式15]

其中D为可检测元件，

(3)随后对裂解物进行凝胶电泳；以及之后

(4)测量可检测信号。在某些此类实施方案中，疾病选自由以下组成的组：感染(诸如伤口感染或肺部感染)、炎性疾病(诸如炎性肠病)、自身免疫性疾病(诸如糖尿病)、慢性阻塞性肺病和癌症。在某些此类实施方案中，上述方法在步骤(3)之后还包含以下步骤：

(5)用抗NE抗体进行免疫印迹。

在某些此类实施方案中，与NE活性相关的疾病选自由以下组成的组：乳糜泻、胃肠动力障碍、疼痛、瘙痒、皮肤病、饮食诱导的肥胖、代谢障碍、哮喘、类风湿性关节炎、牙周炎、炎性GI病症、功能性GI病症、癌症、纤维化疾病、代谢功能紊乱、神经系统疾病、慢性阻塞性肺病(COPD)和感染。

在某些其它这种实施方案中，与NE活性相关的疾病选自由以下组成的组：炎性肠病、感染、慢性阻塞性肺病和癌症。

在某些实施方案中，上述方法在步骤(3)之后还包含以下步骤：

(5)用抗NE抗体进行免疫印迹。

在某些实施方案中，本发明涉及其中还进行以下步骤的方法：

(3a)使用对式I化合物或其部分具有特异性的抗体，在步骤(2)的裂解物的单独等分试样中对式I化合物进行免疫沉淀，

(4a)随后分析共沉淀的物质。在某些此类实施方案中，步骤(4a)的分析包含：

-凝胶电泳以及随后的使用抗NE抗体进行的免疫印迹，或

-蛋白质测序，

并且优选包含凝胶电泳以及随后的使用抗NE抗体进行的免疫印迹。

在某些实施方案中，本发明涉及前述实施方案中任一项的诊断方法，其中在步骤(2)之前，将步骤(1)的裂解物的等分试样用特异性NE抑制剂预处理，并且其中，随后将经预处理的等分试样以类似于步骤(1)的未预处理的裂解物的方式进行处理。

在前述诊断方法的某些实施方案中，组织样品选自由以下组成的组：口腔活检、食道样品、胃样品、小肠样品、肺样品、痰液样品、胰腺样品、骨髓样品、结肠样品、远端结肠样品、近端结肠样品、乳房活检、前列腺活检、直肠活检、肝脏样品、皮肤样品、肿瘤样品、粪便样品和粘膜活检。在某些此类实施方案中，组织样品为粘膜活检，并且该粘膜活检选自由以下组成的组：结肠粘膜活检、远端结肠粘膜活检、近端结肠粘膜活检、小肠粘膜活检、肺粘膜活检、直肠粘膜活检、食道粘膜活检和口腔粘膜活检。

在某些实施方案中，本发明涉及前述实施方案中任一项的诊断方法，其中受试者为人类受试者。

炎性肠病

在某些实施方案中，本发明涉及前述实施方案任一项的诊断方法，其中该方法用于诊断炎性肠病。在某些此类实施方案中，检测NE的活化形式，该NE的活化形式为成熟NE的修剪形式。在某些此类实施方案中，如果检测到NE的活化形式，则受试者被诊断为患有炎性肠病。

在某些实施方案中，本发明涉及上述实施方案任一项的诊断炎性肠病的方法，其中组织样品选自由以下组成的组：口腔活检、食道样品、胃样品、小肠样品、结肠样品、近端结肠样品、远端结肠样品、直肠样品、粪便样品和粘膜样品。在某些此类实施方案中，组织样品为粘膜活检，并且该粘膜活检选自由以下组成的组：口腔粘膜活检、食道粘膜活检、小肠粘膜活检、结肠粘膜活检和直肠粘膜活检。

在某些实施方案中，本发明涉及上述实施方案中任一项的炎性肠病的诊断方法，其中该炎性肠病选自由以下组成的组：急性结肠炎、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、显微镜结肠炎、改道性结肠炎(diversion colitis)、贝赫切特病(

在某些实施方案中，本发明涉及上述实施方案任一项的炎性肠病的诊断方法，其中该炎性肠病为溃疡性结肠炎。在某些此类实施方案中，组织样品为结肠样品、近端结肠样品、远端结肠样品或结肠粘膜活检。

在其他某些实施方案中，本发明涉及上述实施方案中任一项的炎性肠病的诊断方法，其中该炎性肠病为克罗恩氏病。在某些此类实施方案中，组织样品选自由以下组成的组：口腔活检、食道样品、胃样品、小肠样品、结肠样品、近端结肠样品、远端结肠样品、直肠样品、粪便样品和粘膜活检。在某些此类实施方案中，组织样品为粘膜活检，并且该粘膜活检选自由以下组成的组：口腔粘膜活检、食道粘膜活检、小肠粘膜活检、结肠粘膜活检和直肠粘膜活检。

感染

在其它某些实施方案中，本发明涉及诊断方法，其中该方法用于诊断感染。在某些此类实施方案中，感染选自由以下组成的组：细菌感染和真菌感染。在某些此类实施方案中，组织样品为来自受感染组织的样品。在某些实施方案中，感染组织选自由以下组成的组：伤口样品(例如伤口渗出液(wound fluid))、肺样品、肺粘膜活检和痰液样品。

在某些实施方案中，本发明涉及上述实施方案任一项的感染的诊断方法，其中感染为肺部感染。在某些此类实施方案中，肺部感染为细菌感染。在某些此类实施方案中，细菌感染为军团菌感染。

在某些实施方案中，本发明涉及上述实施方案任一项的肺部感染的诊断方法，其中组织样品选自由以下组成的组：肺样品、肺粘膜活检和痰液样品。

癌症

在其它某些实施方案中，本发明涉及诊断方法，其中该方法用于诊断癌症。在某些此类实施方案中，组织样品选自由以下组成的组：肿瘤样品、口腔活检、口腔粘膜活检、乳腺活检、前列腺活检、结肠活检、结肠粘膜活检、直肠活检、直肠粘膜活检、肺活检、肺粘膜活检和痰液样品。

在某些实施方案中，本发明涉及上述实施方案中任一项的癌症的诊断方法，其中癌症选自由以下组成的组：口腔癌、乳腺癌、前列腺癌、结肠直肠癌和肺癌。在某些此类实施方案中，癌症为口腔癌。在某些此类实施方案中，口腔癌为鳞状细胞癌。

在涉及癌症诊断的某些实施方案中，其中癌症为乳腺癌，组织为从受试者的乳腺获得(例如从乳腺肿瘤获得)的如上所述的样品。

在涉及癌症诊断的某些实施方案中，其中癌症为肺癌，组织为从受试者的肺获得(例如从肺肿瘤获得)的如上所述的样品、痰液样品或粘膜活检。

在涉及癌症诊断的某些实施方案中，其中癌症为前列腺癌，组织为从受试者的前列腺获得(例如从前列腺肿瘤获得)的如上所述的样品。

在涉及癌症诊断的某些实施方案中，其中癌症为口腔癌，组织为从受试者的口腔获得(例如从口腔肿瘤获得)的如上所述的样品或粘膜活检。

在涉及癌症诊断的某些实施方案中，其中癌症为结肠直肠癌，组织为从受试者的结肠或直肠获得(例如从结肠或直肠肿瘤获得)的如上所述的样品或粘膜活检。

慢性阻塞性肺病

在其它某些实施方案中，本发明涉及一种诊断方法，其中该方法用于诊断慢性阻塞性肺病。在某些此类实施方案中，组织样品选自由以下组成的组：肺样品、肺粘膜活检和痰液样品。

在上述方法的某些实施方案中，制备裂解物包括清除步骤。清除步骤可包含通过重力或离心使未溶解的物质沉降的步骤。

在上述每种诊断方法的某些实施方案中，凝胶电泳为一维或二维凝胶电泳。在某些此类实施方案中，凝胶电泳为SDS-PAGE或天然PAGE，优选为SDS-PAGE。

在上述方法的某些实施方案中，可检测元件选自由以下组成的组：荧光标记、生物素标记、放射性标记、螯合剂和生物正交连接柄。在某些此类实施方案中，可检测信号通过荧光测量或放射线照相术测量。在某些此类实施方案中，测量为通过荧光测量，并且荧光测量为凝胶内荧光。在某些此类实施方案中，在荧光测量之前进行二次标记。在某些此类实施方案中，二次标记选自由以下组成的组：用标记的链霉亲和素进行二次标记、用荧光团进行二次标记以及用标记的抗体进行二次标记。

在上述每种方法的某些实施方案中，步骤(4)中可检测信号的测量包含选自由以下组成的组的测量：放射线照相术，以及凝胶电泳和随后的放射线照相术。在某些此类实施方案中，所述化合物包含放射性标记形式的可检测元件。在某些其他实施方案中，所述化合物包含放射性标记螯合剂形式的可检测元件。在某些其他实施方案中，所述化合物包含生物正交连接柄形式的可检测元件，并且步骤(4)还包含在进行射线照相测量之前通过点击化学进行二次标记以应用放射性标记或放射性标记螯合剂。

在上述每种方法的某些实施方案中，步骤(4)中可检测信号的测量包含选自由以下组成的组中的测量：亲和纯化和随后的质谱分析，以及亲和纯化和随后的蛋白质组学。在某些此类实施方案中，所述化合物包含生物素标记形式的可检测元件。在某些其他实施方案中，所述化合物包含生物正交连接柄形式的可检测元件，并且步骤(4)还包含在进行亲和纯化之前通过点击化学进行二次标记以应用生物素标记。在生物素标记的情况下，亲和纯化可以使用例如用链霉亲和素包被的珠子或用生物素特异性抗体包被的珠子进行。

在某些实施方案中，亲和纯化可以使用以对某个标签具有特异性的抗体包被的珠子进行。在某些此类实施方案中，所述化合物包含所述标签作为可检测元件。在某些其他实施方案中，所述化合物包含生物正交连接柄形式的可检测元件，并且步骤(4)还包含在进行亲和纯化之前通过点击化学进行二次标记以应用所述标签。

在上述每种方法的某些实施方案中，步骤(4)中可检测信号的测量包含凝胶电泳和随后的免疫印迹。在某些此类实施方案中，所述化合物包含生物素标记形式的可检测元件，并且步骤(4)还包含在进行免疫印迹之前例如用HRP标记的链霉亲和素进行二次标记。在某些其他实施方案中，所述化合物包含生物正交连接柄形式的可检测元件，并且步骤(4)还包含在进行免疫印迹之前通过点击化学进行二次标记以应用生物素标记，并随后例如用HRP标记的链霉亲和素进行标记。

在某些实施方案中，本发明涉及抑制NE的体外方法，其包含：

(1)以获自受试者的组织样品制备裂解物，

(2)使裂解物与式I化合物或其盐接触，

[化学式16]

其中D为可检测元件。

在某些此类实施方案中，组织样品选自由以下组成的组：口腔活检、食道样品、胃样品、小肠样品、肺样品、痰液样品、胰腺样品、骨髓样品、结肠样品、远端结肠样品、近端结肠样品、乳腺活检、前列腺活检、直肠活检、肝脏样品、皮肤样品、肿瘤样品、粪便样品和粘膜活检。在某些此类实施方案中，组织样品为粘膜活检，并且该粘膜活检选自由以下组成的组：结肠粘膜活检、远端结肠粘膜活检、近端结肠粘膜活检、小肠粘膜活检、肺粘膜活检、直肠粘膜活检、食道粘膜活检和口腔粘膜活检。

在某些实施方案中，本发明涉及上述实施方案中任一项的抑制中性白细胞弹性蛋白酶活性的体外方法，其中受试者为人类受试者。

在上述方法的某些实施方案中，制备裂解物包含清除步骤。清除步骤可包含通过重力或离心使未溶解的物质沉降的步骤。

上述检测NE活性的方法、诊断方法和抑制NE的体外方法各自包含使裂解物与式(I)化合物或其盐接触的步骤(2)：

[化学式17]

其中D为可检测元件。

在某些此类实施方案中，在步骤(2)中，使裂解物与具有式IA的化合物或其盐接触：

[化学式18]

其中D为可检测元件。

在某些实施方案中，本发明还涉及式I的化合物：

[化学式19]

或其盐，

或涉及式IA的化合物：

[化学式20]

或其盐，

其中D为可检测元件，

条件是本发明不包括其中D对应于下式之一的(式I或式IA)化合物：

[化学式21]

[化学式22]

[化学式23]

[化学式24]

[化学式25]

其中在上述各式中，曲线表示与分子的其余部分的连接点。

可检测元件：

在某些实施方案中，可检测元件选自由以下组成的组：荧光标记、生物素标记、放射性标记、螯合剂(例如，用于放射性标记)和生物正交连接柄。

可检测元件，诸如荧光标记、生物素标记、放射性标记、螯合剂或生物正交连接柄，可以包括用于加入本发明化合物中的接头(即，用于将可检测元件或标记连接到分子的其余部分)。合适的接头是本领域技术人员已知的。可用于本发明的化合物中的接头的示例描述于WO 2012/118715 A2(参见第18页第9-18行)，其内容由此包括在本公开中。接头还可以包括聚乙二醇(PEG)部分，诸如PEG-4、PEG-6或PEG-8，用于连接至分子的其余部分。

可用于本发明化合物的术语“放射性标记”的定义和放射性标记的示例描述于WO2009/124265 A1中(参见第11页第25行至第13页第3行)，其内容由此包括在本公开中。

可用于本发明化合物的术语“螯合剂”的定义和螯合剂的示例描述于WO 2009/124265 A1中(参见第10页第26行至第11页第14行)，其内容由此包括在本公开中。

可用于本发明化合物的术语“生物正交连接柄”的定义和生物正交连接柄的示例以及相应的“点击”反应描述于，例如，Martell等人，Applications of Copper-CatalyzedClick Chemistry in Activity-Based Protein Profiling，Molecules 2014，19，1378-1393，其通过引用并入本文。修改这些方法以产生或修饰本权利要求的化合物在本领域的技术范围内。

用于连接二次标记的生物正交或点击反应包括：

A.将叠氮化物与三芳基膦偶联以产生酰胺键的无痕施陶丁格连接(tracelessStaudinger Ligation)，

B.利用1，2，4，5-四嗪和张力二烯(strained diene)(反式-环辛烯)的四嗪环加成，

C.产生1，4-二取代1，2，3-三唑的叠氮化物与末端炔烃之间的铜(I)催化叠氮化物-炔烃环加成(CuAAC)反应，以及

D.利用张力炔烃(strained alkyne)加速反应的叠氮化物-炔烃环加成的无铜变型。

在这方面，特别参考Martell等人，Molecules 2014，19，1378-1393的图1B和图2，其内容由此包括在本公开中。

因此，在某些实施方案中，生物正交连接柄包含选自由以下组成的组中的官能团：叠氮化物、1,2,4,5-四嗪和炔烃(诸如末端炔烃)。这些官能团允许使用上述生物正交反应(A)至(D)之一来连接二次标记。

在某些实施方案中，可检测元件为荧光标记。如本领域技术人员已知的，当被入射电磁辐射吸收激发时，荧光标记发射电磁辐射，优选可见光。各种荧光标记，包括具有用于将标记偶联至反应性基团(诸如，例如，氨基、硫醇基等)的反应性部分的标记，是可商购的。参见，例如，The Molecular

可用于本发明化合物的荧光标记的示例描述于WO 2018/119476 A1(参见第[0084]至[0095]段)和WO 2012/118715 A2(参见第15页第18行至第17页第12行，以及第18页第19行至第21页第1行)中，其内容由此包括在本公开中。这种荧光标记可以包括用于加入本发明化合物中的接头，例如，如WO 2012/118715 A2(参见第18页第9-18行)中所述，其内容由此包括在本公开中。

在某些实施方案中，可检测元件为荧光标记。在某些此类实施方案中，荧光标记选自由以下组成的组：荧光黄(fluorescein)、俄勒冈绿(Oregon green)(荧光素的氟化衍生物)、硼杂-二氮杂-引达省(bora-diaza-indecene)染料、罗丹明染料(诸如四甲基罗丹明和羧基四甲基罗丹明)、苯并吡喃鎓(benzopyrillium)染料、香豆素染料、花青标记或苯并吲哚标记(诸如吲哚菁绿)。

此类染料的可商购示例包括

在某些实施方案中，荧光标记为花青标记。在某些此类实施方案中，荧光标记为花青标记，该花青标记选自由以下组成的组：Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、Cy7.5、sCy3、sCy5和sCy7。在某些此类实施方案中，荧光标记为Cyc 5或sCy5。在某些实施方案中，荧光标记为sCy5。

在某些实施方案中，荧光标记为花青标记，该花青标记具有选自下组的式的花青标记：

[化学式26]

[化学式27]

[化学式28]

[化学式29]

[化学式30]

[化学式31]

其中在以上各式中，

A选自由以下组成的组：CH

R

其中：

p为2、3、4、5、6、7或8；

q为2、3、4、5、6、7或8；

r为2、3、4、5、6、7或8；

$代表与花青部分的氮原子的连接点；

且&代表与分子的其余部分的连接点；

R

R

在某些实施方案中，其中荧光标记为具有上式之一的花青标记，

A选自由以下组成的组：CH

R

其中：

p为2、3、4、5或6；

q是2、3、4、5或6；

r为2、3、4、5或6；

$代表与花青部分的氮原子的连接点；

且&代表与分子的其余部分的连接点；

R

R

在某些实施方案中，其中荧光标记是具有上式之一的花青标记，

A为C(CH

R

其中：

p为2、3、4、5或6；

q是2、3、4、5或6；

r为2、3、4、5或6；

$代表与花青部分的氮原子的连接点；

且&代表与分子的其余部分的连接点；

R

R

在某些实施方案中，其中荧光标记为具有上式之一的花青标记，

A是C(CH

R

其中：

p为4、5或6；

q为4、5或6；

r为3、4、5或6；

$代表与花青部分的氮原子的连接点；

且&代表与分子的其余部分的连接点；

R

R

在某些实施方案中，其中荧光标记为具有上式之一的花青标记，

A是C(CH

R

p为4、5或6；以及

$代表与花青部分的氮原子的连接点；

且&代表与分子的其余部分的连接点；

R

R

在某些实施方案中，其中荧光标记为具有上式之一的花青标记，

A为C(CH

R

其中：

q为4、5或6；

r为3、4、5或6；

$代表与花青部分的氮原子的连接点；

且&代表与分子的其余部分的连接点；

R

R

在某些实施方案中，荧光标记为花青标记，该花青标记具有选自下组的式：

[化学式32]

[化学式33]

[化学式34]

其中在以上各式中，

曲线表示与分子的其余部分的连接点；

并且R

在某些实施方案中，荧光标记为具有下式的花青标记：

[化学式35]

其中曲线代表与分子的其余部分的连接点；并且R

因此，在本文所述的检测NE活性的方法、诊断方法和抑制NE的体外方法的某些实施方案中，在步骤(2)中，使裂解物与式II的化合物或其盐接触：

[化学式36]

在某些此类实施方案中，在步骤(2)中，使裂解物与式IIA化合物或其盐接触：

[化学式37]

在某些实施方案中，本发明还涉及式II的化合物：

[化学式38]

或其盐，或式IIA化合物：

[化学式39]

或其盐。

在某些实施方案中，本发明涉及包含如本文所述的(式I、IA、II或IIA)化合物或其盐和赋形剂的组合物。

优选实施方案的详细说明

现在参考所附的实施例更充分地描述本发明。然而，应当理解，以下描述仅是说明性的，而不应以任何方式限制本发明。

实施例

I.

基本信息

Fmoc氨基酸购自Chem-Impex和Novabiochem，偶联试剂购自GL Biochem，溶剂和其它试剂购自Merck并且不经进一步纯化即可使用。

树脂购自Chem-Impex。

Cy5-酸购自Lumiprobe。

粗肽的RP-HPLC纯化通过Agilent 1200四级泵系统、光电二极管阵列检测器(214nm)进行，使用Phenomenex Axia柱(Luna C8(2)，50×21.3mm ID)，用在0.1％TFA水溶液中的5-100％0.1％TFA/乙腈，以10mL/min的流速进行60分钟梯度洗脱。所收集的合适级分在Agilent 1260SQ系统上通过LC-MS分析，该系统包含与API-ES四极质谱分析仪直接偶联的光电二极管阵列检测器(214nm)。将合并的级分冷冻干燥两天，以得到作为TFA盐的纯化肽，通过反相HPLC估算其纯度>90％，该反相HPLC使用Poroshell 120EC-C18 3.0X50mm2.7-Micron，以如下条件进行梯度洗脱：用5-100％乙腈的0.1％甲酸水溶液洗脱3.8min，并保持至100％乙腈直至5min，流速为0.5mL/min，检测波长为214nm。

通过API-ES MS分析确认化合物具有正确的分子量。以负离子模式获得质谱，扫描范围为200-2000m/z。

使用具有标准Fmoc固相肽化学的人工肽合成法进行受保护的线性肽(Cy5-Nle(OBzl)-Met(O)

随后的Fmoc-氨基酸的偶联使用1.5摩尔当量(相对于树脂负载量)的Fmoc氨基酸、PyBOP(1H-苯并三唑-1-基氧基)(三-1-吡咯烷基)六氟磷酸鏻的DMF溶液(5mL/g树脂)进行，后者使用3摩尔当量DIPEA原位活化。其在室温(RT)进行1小时。在此阶段，使用TNBS测试来监测肽偶联，得到阴性结果。然后将树脂用DMF洗涤(每次3×5mL×2min，然后用DCM，每次2×5mL×2min)。然后将树脂暴露于脱保护溶液，该脱保护溶液为哌啶在DMF中的20％溶液(每次3×5mL×5min)中，并在第三脱保护步骤之后，获得阳性TNBS测试结果。将树脂用DMF(每次3×5mL×2min，然后用DCM，每次2×5mL×2min)洗涤，然后用下一个Fmoc氨基酸继续偶联过程，直至完成序列。

将肽树脂上的最终氨基酸用哌啶在DFM中的20％溶液(每次3×5mL×5min)进行Fmoc脱保护，然后依次用DMF和DCM彻底洗涤。将一部分树脂(30mg，0.03mmol)悬浮于4：1的DMF：DMSO中，向混合物中加入sulfoCy5酸(30mg，0.046mmol)，然后加入PyBOP(0.1mmol)，最后加入DIPEA(0.6mmol)。将混合物在间歇搅拌下保留24h，然后用DMSO充分洗涤(直至获得无色滤液)，然后依次用DMF、DCM、MeOH和醚洗涤。将干燥的树脂溶于5mL HFIP(六氟异丙醇)：DCM：TIPS(v：v：v，30：69：1)并静置2h。将滤液从树脂中过滤并将树脂用HFIP洗涤直至无色。将合并的滤液和洗涤液浓缩成残余物(10.1mg)，然后通过RP-HPLC纯化，得到3mg蓝色粉末状的中间体sulfoCy5-Nle(OBzl)-Met(O)

通过HPLC测量214nm处的吸光度来检查该化合物的纯度(图1A)，并通过API-ES分析确认其具有正确分子量：计算的m/z；C

[化学式39]

在微量离心管(Eppendorf tube)(1.5mL)中，将实施例1的Cy5-Nle(OBzl)-Met(O)

通过HPLC测量214nm处的吸光度来检查化合物的纯度(图2A)，并通过API-ES分析确认其具有正确分子量：计算的m/z；C

II.

基本信息

探针的合成和表征

如实施例1和2中所述进行PK105b的合成和表征。如Edgington-Mitchell等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.(2017)中所述进行Cy5-V-DPP的合成和表征。

小鼠

C57BL/6J小鼠购自莫纳什大学(Monash University)的内部种群(in-housecolony)或墨尔本大学(University of Melbourne)的Bio21内部种群。BALB/c裸鼠购自Charles River Laboratories。除非另外指明，否则动物实验由莫纳什大学动物伦理学委员会(Animal Ethics Committee of Monash University)根据研究中实验动物使用指南批准。

重组蛋白酶标记/荧光SDS-PAGE

将重组蛋白酶(500ng)在20μl磷酸盐缓冲盐水(PBS)中稀释：中性粒细胞弹性蛋白酶(Elastin Products Company)，猪胰蛋白酶II-S型(β胰蛋白酶；Sigma)和人蛋白酶-3(Sigma)。从100x DMSO原液中添加PK105b或Cy5-V-DPP(0，0.1，0.5或1μM)，并在37℃反应30分钟。将蛋白质溶于1μM样品缓冲液(40％甘油，200mM Tris-Cl[pH 6.8]，8％SDS，0.04％溴酚蓝，5％β-巯基乙醇)中，煮沸5分钟，并在15％SDS-PAGE凝胶上解析。通过在Typhoon 5平板激光扫描仪(GE Healthcare)上扫描凝胶的Cys荧光来检测探针标记。用于ABP应用的详细方案可在Edgington and Bogyo Curr Protoc Chem Biol(2013)中获得。

离体组织标记

通过用PBS冲洗健康C57BL/6J小鼠的胫骨和股骨获得骨髓。将细胞洗涤并重悬于PBS中，然后在冰上超声处理。通过在PBS中在冰上超声处理来裂解胰腺、结肠组织、粘膜活检、肺和肿瘤(10μl/mg组织)，并通过在4℃在21g下离心10min来清除上清液。将总蛋白(60μg，通过BCA测定法测量，Pierce)等分至总体积为20μl的PBS中，并如上所述进行探针标记和SDS-PAGE。

蛋白质印迹

将荧光凝胶转移至硝酸纤维素膜上，并使用Turbo Blot系统(BioRad)进行印迹。使用以含有0.05％Tween 20的PBS稀释50％的LiCor Odyssey封闭缓冲液来封闭膜。将绵羊抗小鼠中性粒细胞弹性蛋白酶/ELA2(1：1000；R&D AF4517)在4℃温育过夜。将第二抗体(山羊-IR 800，1：5000；LiCor)于室温温育1小时。通过在Typhoon 5平板激光扫描仪(GEHealthcare)上用IRLong滤镜扫描来检测结合。

免疫沉淀

将PK105b标记的裂解物(在样品缓冲液中煮沸5分钟)分成输入和免疫沉淀(IP)样品(每次100μg)。将IP样品连同10μl以下抗体之一在500μl IP缓冲液(PBS[pH 7.4]，1mMEDTA，0.5％NP-40)中：绵羊抗中性粒细胞弹性蛋白酶/ELAz(R&D AF4517)；兔抗PRSS3(胰蛋白酶3；Abcam ab105123)；兔抗胰腺弹性蛋白酶(Abcam ab21593)中稀释。将蛋白A/G珠(40μl悬浮液(slurry)；Santa Cruz)用IP缓冲液洗涤，然后加入样品中。将试管在4℃振荡过夜。将珠子用IP缓冲液洗涤4次，用0.9％氯化钠洗涤1次。在最后一次洗涤后，除去所有缓冲液，并将珠子在2x样品缓冲液(20μl)中煮沸5分钟。然后如上通过荧光SDS-PAGE与输入样品一起分析上清液。

结肠炎模型

通过结肠内输注苦基磺酸溶液(2，4，6-三硝基苯磺酸溶液，TNBS；Sigma；2.5mg溶于50％乙醇中)在10周龄雄性C57BL/6J小鼠中诱导结肠炎。每天记录体重和症状，并在3天后将小鼠人道地处死。提取结肠后，通过用PBS冲洗结肠来收集管腔液。通过离心除去固体，并使用3-KDa截止离心过滤器(Amgen)浓缩上清液。将近端和远端结肠块冷冻用于蛋白酶分析，或在4％多聚甲醛中固定过夜，石蜡包埋，切片，并用苏木精和曙红染色。

人粘膜活检

在Hotel Dieu Hospital in Kingston(Ontario，Canada)结肠镜检查过程中从个体获得人粘膜活检(表1)。患者为特征明确的患有活动性溃疡性结肠炎(UC)的个体或接受常规结肠镜检查用于癌症筛查的健康个体。对于UC患者，从活动性炎症部位获得活检。在登记前已获得书面和口头同意，所有方案均通过皇后大学人类伦理委员会(Queen’sUniversity Human Ethics Committee)批准。将新鲜的活检样品在PBS中洗涤，然后速冻以用于如上所述的蛋白酶分析。

表1：人类患者数据

嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)感染小鼠模型

这些实验是在墨尔本大学动物伦理委员会(University of Melbourne AnimalEthics Committee)的批准下根据研究中实验动物使用指南进行的。通过鼻内接种2.5x10

口腔癌小鼠模型

这些实验获得纽约大学的动物研究委员会(Committee on Animal Research atNew York University)根据研究中实验动物使用指南批准。雌性BALB/c裸鼠(6-8周龄，Charles River Laboratories)在麻醉下于左侧舌中接受注射(3x10

统计分析

所有实验以至少三次生物重复进行。数据以平均值±SEM报告。通过使用Student'st检验比较两组来确定统计显著性，并且p值小于0.05被认为是显著的。

测试了PK105b对重组人丝氨酸蛋白酶的反应性，并将其效力与Cy5-V-DPP进行了比较。在将增加量的PK105b(0、0.1、0.5或1μM)与等量的丝氨酸蛋白酶(中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)、蛋白酶-3(PR-3)或胰蛋白酶)短暂温育后，通过SDS-PAGE解析该混合物，并通过凝胶内荧光检测Cy5-V-DPP或PK105b与丝氨酸蛋白酶的结合。

尽管PK105b比Cy5-V-DPP更有效，但这两种探针均以浓度依赖性方式清楚地标记了NE和PR-3(图3A)。PK105b还标记了胰蛋白酶(另一种丝氨酸蛋白酶)，而通过Cy5-V-DPP结合的胰蛋白酶则可忽略不计(图3A，下图)。

测试了PK105b在组织裂解物中检测丝氨酸蛋白酶活性的能力，并将其与Cy5-V-DPP进行了比较。

PK105b以0.1、0.5和1μM标记了从小鼠骨髓制备的裂解物中的多个条带，且其显示出比Cy5-V-DPP效力更高(图4A)。在这些条带中，通过用NE特异性抗体进行免疫沉淀，证实了25-KDa蛋白为NE(图4B)。

还检测了Cy5-V-DPP和PK105b在由小鼠胰腺(富含丝氨酸蛋白酶的组织)制备的裂解物中的反应性。在此，PK105b以0.1、0.5和1μM强烈标记了25-KDa蛋白，但这在Cy5-V-DPP中没有观察到(图4C)。对PK105b标记的小鼠胰腺裂解物的免疫沉淀显示，靶标由NE、胰腺弹性蛋白酶(PE)和胰蛋白酶3(Try3，也称为PRSS3或中胰蛋白酶；图4D)组成。

将PK105b用于研究在三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的急性结肠炎期间NE的应用。诱导实验性结肠炎的小鼠表现出稀便，排便延迟，体重减轻和结肠缩短。通过组织学评估观察粘膜损伤以及水肿和炎性浸润。通过PK105b标记和凝胶内荧光测量来分析结肠裂解物的NE活化。在发炎结肠的远端区域(其在TNBS模型受影响最大)，观察到25-KDa的单个蛋白的清晰标记(图5A，上排，左图)。在接受媒介物而非TNBS的健康小鼠的远端结肠，以及健康和发炎结肠的更近端区域，几乎没有该条带(图5A，上排)。通过用NE特异性抗体进行免疫沉淀，证实了该条带的身份为NE(图5B)。

将荧光凝胶转移至硝酸纤维素膜上对样品进行免疫印迹，以检测总NE表达。在健康的远端结肠中，观察到NE的37-KDa前形式(pro-form)以及25-KD成熟形式(图5A，下排，左图)。在TNBS处理的结肠中，25-KDa条带呈现为二重态(doublet)。只有下面的物质被PK105b标记。为了证实这种较小的NE物质的出现不是探针标记的假象，在存在和不存在PK105b的情况下，对发炎的远端结肠样品进行了免疫印迹。无论是否存在PK105b，均检测到较小物质(图5C)。此外，在TNBS处理的小鼠的近端结肠中未检测到更小的物质(图5A，图的右列)。总之，这些数据表明NE在结肠的发炎区域受到修剪，从而使其活化并因此与PK105b探针反应。

为了进行比较，还在远端结肠裂解物中测试了探针Cy5-V-DPP。25-KDa物质的标记与背景几乎没有区别(图6A)。因此，PK105b在检测组织裂解物中NE活性的能力方面明显优于Cy5-V-DPP。两种探针均显示出与50-75-KDa范围内的几种物质结合(图5A，6A)。

此外，还对PK105b测试了在结肠腔中发现的分泌的丝氨酸蛋白酶(管腔冲洗液或粪粒)(图6B-C)。在两个样品中，均观察到两种标记的25kDa丝氨酸蛋白酶。免疫沉淀证实了这些样品中NE水平较低，其中主要为胰腺弹性蛋白酶和胰蛋白酶3(图6D)。尽管如此，在结肠组织的裂解物中，可以通过PK105b清楚地描述NE活性。

为了将上述小鼠结肠炎中的发现转化至患者，检查了人类结肠粘膜活检中的PK105b标记。如在小鼠中一样，与结肠常规结肠镜检查筛选的健康个体相比，观察到活动性溃疡性结肠炎(UC)患者的样品中标记显著增加(图7A上图，图7B)。与其中观察到由PK105b标记的单一25-KDa物质的小鼠不同，在人类粘膜裂解物中标记了三种物质，其中最小的形式具有最高的活性。带型与观察到的重组人NE的带型相似(图3A-B和Schultz-Fincke etal，ACS Med Chem Lett(2018)，Dau et al，Nat Comm(2015))。通过用NE特异性抗体进行免疫沉淀，证实了这些条带为NE(图7C)。

此外，当对相同样品进行免疫印迹以检测总NE的表达时，在健康组织中观察到分别为37kDa和25kDa的NE的原始形式和成熟形式(图7A，下图)。然而，UC组织显示了额外的二重态，其比25-KDa物质更小。如PK105b标记所指示，活性最高的物质对应于这些较小的物质。因此，如在小鼠结肠炎中观察到的，NE在人类UC期间经过差异化修剪(differentialtrimming)，从而使其活化并与PK105b结合。

在嗜肺军团菌感染的小鼠模型中检查了PK105b在感染期间测量NE活化的有效性。与对照肺相比，在从感染的肺组织制备的裂解物中，PK105b标记显著增加(图8A上图，图8B)。通过用NE特异性抗体进行免疫印迹(图8A，下图)和免疫沉淀(图8C)，证实了主要25-KDa物质的身份为NE。

为了确定PK105b在癌症环境中检测NE活化的效用，使用了口腔鳞状细胞癌的小鼠异种移植模型，其中将人类癌细胞(HSC-3)注射到舌头中。在这种情况下，在肿瘤组织中观察到了25-KDa物质的清晰标记，而在正常舌头组织中并未观察到(图9A上图，图9B)。该物质与通过免疫印迹测定的成熟NE的大小一致(图9A下图)，并且还与NE特异性抗体免疫沉淀(图9C)。在这些裂解物中，几种其它未鉴定的高分子量物质被PK105b大量标记。

本发明的实施例、方法、程序、特定化合物和分子意在例示和说明本发明，而绝不应视为对本发明的范围的显示，本发明的范围由所附权利要求的字面和等同范围限定。本说明书中提及的任何专利或出版物均指示本专利所属领域的技术人员的水平，并且旨在传达本发明的细节，这些细节可能未明确陈述但将本领域技术人员会理解。这些专利或出版物在此通过引用的方式并入，其程度与每件专利或出版物通过引用具体地和单独地并入一样，且出于描述和实现所提及的方法或材料的目的。

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本发明的其它实施方案涉及：

1.检测组织样品裂解物中的中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)活性的方法，其包含：

(1)以获自受试者的组织样品制备裂解物，

(2)使所述裂解物与式I化合物或其盐接触，

[化学式41]

其中D为可检测元件，

(3)随后对步骤(2)的裂解物的至少一个等分试样进行凝胶电泳；以及之后

(4)测量可检测信号。

2.根据项目1所述的方法，其在步骤(3)之后还包含以下步骤：

(5)用抗NE抗体进行免疫印迹。

3.根据项目1或2所述的方法，其中还进行以下步骤：

(3a)使用对式I化合物或其部分具有特异性的抗体，对步骤(2)的裂解物的单独等分试样中的式I化合物进行免疫沉淀，

(4a)随后分析共沉淀的物质。

4.根据项目3所述的方法，其中步骤(4a)的分析包含：

-凝胶电泳以及随后的使用抗NE抗体进行的免疫印迹，或

-蛋白质测序，

并且优选包含凝胶电泳以及随后的使用抗NE抗体进行的免疫印迹。

5.前述项目中任一项所述的方法，其中在步骤(2)之前，将步骤(1)的裂解物的等分试样用特异性NE抑制剂预处理，并且其中，随后将经预处理的等分试样以类似于步骤(1)的未预处理的裂解物的方式进行处理。

6.前述项目中任一项所述的方法，其中所述组织样品选自由以下组成的组：口腔活检、食道样品、胃样品、小肠样品、肺样品、痰液样品、胰腺样品、骨髓样品、结肠样品、远端结肠样品、近端结肠样品、乳腺活检、前列腺活检、直肠活检、肝脏样品、皮肤样品、肿瘤样品、粪便样品和粘膜活检。

7.根据项目6所述的方法，其中所述粘膜活检选自由以下组成的组：结肠粘膜活检、远端结肠粘膜活检、近端结肠粘膜活检、小肠粘膜活检、肺粘膜活检、直肠粘膜活检、食道粘膜活检和口腔粘膜活检。

8.根据前述项目中任一项所述的方法，其中所述受试者为人类受试者。

9.根据前述项目中任一项所述的方法，其中检测NE的活化形式，所述NE的活化形式为成熟NE的修剪形式。

10.根据项目9所述的方法，其中所述组织样品选自由以下组成的组：口腔活检、食道样品、胃样品、小肠样品、结肠样品、近端结肠样品、远端结肠样品、直肠样品、粪便样品和粘膜活检。

11.根据项目10所述的方法，其中所述组织样品为粘膜活检，其选自由以下组成的组：口腔粘膜活检、食道粘膜活检、小肠粘膜活检、结肠粘膜活检和直肠粘膜活检。

12.诊断受试者中与NE活性相关的疾病的方法，其包含：

(1)以获自所述受试者的组织样品制备裂解物，

(2)使所述裂解物与式I化合物或其盐接触，

[化学式42]

其中D为可检测元件，

(3)随后对所述裂解物进行凝胶电泳；以及之后

(4)测量可检测信号。

13.根据项目12所述的方法，其中所述与NE活性相关的疾病选自由以下组成的组：乳糜泻、胃肠动力障碍、疼痛、瘙痒、皮肤病、饮食诱导的肥胖、代谢障碍、哮喘、类风湿性关节炎、牙周炎、炎性GI病症、功能性GI病症、癌症、纤维化疾病、代谢功能紊乱、神经系统疾病、慢性阻塞性肺病(COPD)和感染。

14.根据项目12所述的方法，其中所述与NE活性相关的疾病选自由以下组成的组：炎性肠病、感染、慢性阻塞性肺病和癌症。

15.根据项目12至14中任一项所述的方法，其在步骤(3)之后还包含以下步骤：

(5)用抗NE抗体进行免疫印迹。

16.根据项目12至15中任一项所述的方法，其中还进行以下步骤：

(3a)使用对式I化合物或其部分具有特异性的抗体，对步骤(2)的裂解物的单独等分试样中的式I化合物进行免疫沉淀，

(4a)随后分析共沉淀的物质。

17.根据项目16所述的方法，其中步骤(4a)的分析包含：

-凝胶电泳以及随后的使用抗NE抗体进行的免疫印迹，或

-蛋白质测序，

并且优选包含凝胶电泳以及随后的使用抗NE抗体进行的免疫印迹。

18.根据项目12至17中任一项所述的方法，其中在步骤(2)之前，将步骤(1)的裂解物的等分试样用特异性NE抑制剂预处理，并且其中，随后将经预处理的等分试样以类似于步骤(1)的未预处理的裂解物的方式进行处理。

19.根据项目12至18中任一项所述的方法，其中所述组织样品选自由以下组成的组：口腔活检、食道样品、胃样品、小肠样品、肺样品、痰液样品、胰腺样品、骨髓样品、结肠样品、远端结肠样品、近端结肠样品、乳腺活检、前列腺活检、直肠活检、肝脏样品、皮肤样品、肿瘤样品、粪便样品和粘膜活检。

20.根据项目19所述的方法，其中所述粘膜活检选自由以下组成的组：结肠粘膜活检、远端结肠粘膜活检、近端结肠粘膜活检、小肠粘膜活检、肺粘膜活检、直肠粘膜活检、食道粘膜活检和口腔粘膜活检。

21.根据项目12至20中任一项所述的方法，其中所述受试者为人类受试者。

22.根据第12至21项中任一项所述的方法，其中所述方法用于诊断炎性肠病。

23.根据项目22所述的方法，其中检测NE的活化形式，所述NE的活化形式为成熟NE的修剪形式。

24.根据项目23所述的方法，其中如果检测到所述NE的活化形式，则所述受试者被诊断为患有炎性肠病。

25.根据项目22至24中任一项所述的方法，其中所述组织样品选自由以下组成的组：口腔活检、食道样品、胃样品、小肠样品、结肠样品、近端结肠样品、远端结肠样品、直肠样品、粪便样品和粘膜活检。

26.根据项目25所述的方法，其中所述组织样品为粘膜活检，其选自由以下组成的组：口腔粘膜活检、食道粘膜活检、小肠粘膜活检、结肠粘膜活检和直肠粘膜活检。

27.根据项目12至26中任一项所述的方法，其中所述炎性肠病选自由以下组成的组：急性结肠炎、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、显微镜结肠炎、改道性结肠炎、贝赫切特病、免疫肿瘤学结肠炎、化疗/放射性结肠炎、移植物抗宿主病结肠炎、胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎以及不确定性结肠炎和结肠袋炎。

28.根据项目12至27中任一项所述的方法，其中所述炎性肠病为溃疡性结肠炎。

29.根据项目12至27中任一项所述的方法，其中所述炎性肠病为克罗恩氏病。

30.根据项目12至21中任一项所述的方法，其中所述方法用于诊断感染。

31.根据项目30所述的方法，其中所述感染选自由以下组成的组：细菌感染和真菌感染。

32.根据项目30或31所述的方法，其中所述组织样品为来自受感染组织的样品。

33.根据项目30至32中任一项所述的方法，其中所述感染为肺部感染。

34.根据项目33所述的方法，其中所述肺部感染为细菌感染。

35.根据项目34所述的方法，其中所述细菌感染为军团菌感染。

36.根据项目33至35中任一项所述的方法，其中所述组织样品选自由以下组成的组：肺样品、肺粘膜活检和痰液样品。

37.根据项目12至21中任一项的方法，其中所述方法用于诊断癌症。

38.根据项目37所述的方法，其中所述组织样品选自由以下组成的组：肿瘤样品、口腔活检、口腔粘膜活检、乳腺活检、前列腺活检、结肠活检、结肠粘膜活检、直肠活检、直肠粘膜活检、肺活检、肺粘膜活检和痰液样品。

39.根据项目37或38所述的方法，其中所述癌症选自由以下组成的组：口腔癌、乳腺癌、前列腺癌、结肠直肠癌和肺癌。

40.根据项目37至39中任一项所述的方法，其中所述癌症为口腔癌，并且所述口腔癌为鳞状细胞癌。

41.根据项目12至21中任一项所述的方法，其中所述方法用于诊断慢性阻塞性肺病。

42.根据项目41所述的方法，其中所述组织样品选自由以下组成的组：肺样品、肺粘膜活检和痰液样品。

43.抑制NE的体外方法，其包含：

(1)以获自受试者的组织样品制备裂解物，

(2)使所述裂解物与式I化合物或其盐接触，

[化学式43]

其中D为可检测元件。

44.根据项目43所述的方法，其中所述组织样品选自由以下组成的组：口腔活检、食道样品、胃样品、小肠样品、肺样品、痰液样品、胰腺样品、骨髓样品、结肠样品、远端结肠样品、近端结肠样品、乳腺活检、前列腺活检、直肠活检、肝脏样品、皮肤样品、肿瘤样品、粪便样品和粘膜活检。

45.根据项目44所述的方法，其中所述粘膜活检选自由以下组成的组：结肠粘膜活检、远端结肠粘膜活检、近端结肠粘膜活检、小肠粘膜活检、肺粘膜活检、直肠粘膜活检、食道粘膜活检和口腔粘膜活检。

46.根据项目43至45中任一项所述的方法，其中所述受试者为人类受试者。

47.根据前述项目中任一项所述的方法，其中制备所述裂解物包含清除步骤。

48.根据项目1至42和47中任一项所述的方法，其中所述凝胶电泳为一维或二维凝胶电泳。

49.根据项目1至42、47和48中任一项所述的方法，其中所述凝胶电泳为SDS-PAGE或天然PAGE，优选为SDS-PAGE。

50.根据前述项目中任一项所述的方法，其中可检测元件选自由以下组成的组：荧光标记、生物素标记、放射性标记、螯合剂和生物正交连接柄。

51.根据项目1至42和47至50中任一项所述的方法，其中所述可检测信号通过荧光测量或放射线照相术测量。

52.根据项目51所述的方法，其中，所述荧光测量为凝胶内荧光。

53.根据项目51所述的方法，其中在荧光测量之前进行二次标记。

54.根据项目53所述的方法，其中所述二次标记选自由以下组成的组：用标记的链霉亲和素进行二次标记、用荧光团进行二次标记以及用标记的抗体进行二次标记。

55.根据前述项目任一项所述的方法，其中在步骤(2)中，使所述裂解物与具有式IA的化合物或其盐接触：

[化学式44]

其中D为可检测元件。

56.根据项目1至55中任一项所述的方法，其中所述可检测元件为荧光标记。

57.根据项目56所述的方法，其中所述荧光标记选自由以下组成的组：荧光黄、俄勒冈绿、硼杂-二氮杂-引达省染料、罗丹明染料、苯并吡喃鎓染料、香豆素染料、花青标记或苯并吲哚标记。

58.根据项目57所述的方法，其中所述荧光标记为花青标记。

59.根据项目57所述的方法，其中所述荧光标记为具有选自由下式组成的组的式的花青标记：

[化学式45]

[化学式46]

[化学式47]

[化学式48]

[化学式49]

[化学式50]

其中在以上各式中，

A选自由以下组成的组：CH

R

其中：

p为2、3、4、5、6、7或8；

q为2、3、4、5、6、7或8；

r为2、3、4、5、6、7或8；

$代表与花青部分的氮原子的连接点；

且&代表与分子的其余部分的连接点；

R

R

60.根据项目59所述的方法，其中

A选自由以下组成的组：CH

R

其中：

p为2、3、4、5或6；

q是2、3、4、5或6；

r为2、3、4、5或6；

$代表与花青部分的氮原子的连接点；

且&代表与分子的其余部分的连接点；

R

R

61.根据项目59所述的方法，其中

A为C(CH

R

其中：

p为2、3、4、5或6；

q是2、3、4、5或6；

r为2、3、4、5或6；

$代表与花青部分的氮原子的连接点；

且&代表与分子的其余部分的连接点；

R

R

62.根据项目59所述的方法，其中

A为C(CH

R

其中：

p为4、5或6；

q为4、5或6；

r为3、4、5或6；

$代表与花青部分的氮原子的连接点；

且&代表与分子的其余部分的连接点；

R

R

63.根据项目59至62中任一项所述的方法，其中R

64.根据项目59至63中任一项所述的方法，其中R

65.根据项目59的方法，其中

A为C(CH

R

p为4、5或6；以及

$代表与花青部分的氮原子的连接点；

且&代表与分子的其余部分的连接点；

R

R

66.根据项目59的方法，其中

A为C(CH

R

其中：

q为4、5或6；

r为3、4、5或6；

$代表与花青部分的氮原子的连接点；

且&代表与分子的其余部分的连接点；

R

R

67.根据项目59至66中任一项所述的方法，其中p为5，q为5且r为4。

68.根据项目56所述的方法，其中所述荧光标记为花青标记，该花青标记具有选自下组的式：

[化学式51]

[化学式52]

[化学式53]

其中在以上各式中，

曲线代表与分子的其余部分的连接点；

并且R

69.根据项目68所述的方法，其中R

70.根据项目68所述的方法，其中R

71.根据项目56所述的方法，其中所述荧光标记是具有下式的花青标记：

[化学式54]

其中曲线代表与分子的其余部分的连接点；并且R

72.根据项目1至65和67至71中任一项所述的方法，其中在步骤(2)中，使所述裂解物与式II的化合物或其盐接触：

[化学式55]

73.根据项目1至65和67至72中任一项所述的方法，其中在步骤(2)中，使所述裂解物与式IIA的化合物或其盐接触：

[化学式56]

74.根据项目56至73中任一项所述的方法，其中所述可检测信号通过凝胶内荧光测量。

75.诊断受试者中炎性肠病的体外方法，其包含检测NE的活化形式，所述NE的活化形式为成熟NE的修剪形式。

76.根据项目75所述的方法，其中所述受试者为人类受试者。

77.根据项目75或76所述的方法，其中所述方法包含使NE的活化形式与基于活性的探针接触的步骤。

78.根据项目75至77任一项所述的方法，其中所述方法包含使NE的活化形式与抗NE抗体接触的步骤。

79.式I的化合物

[化学式57]

或其盐，

其中D为可检测元件，

条件是不包括其中D对应于下式之一的化合物：

[化学式58]

[化学式59]

[化学式60]

[化学式61]

[化学式62]

其中在上述各式中，曲线代表与分子的其余部分的连接点。

80.根据项目79所述的化合物，其具有式IA：

[化学式63]

或其盐，

其中D为可检测元件。

81.根据项目79或80所述的化合物，其中所述可检测元件选自由以下组成的组：荧光标记、生物素标记、放射性标记、螯合剂和生物正交连接柄。

82.根据项目79至81中任一项所述的化合物，其中所述可检测元件为荧光标记。

83.根据项目82所述的化合物，其中所述荧光标记选自由以下组成的组：荧光黄、俄勒冈绿、硼杂-二氮杂-引达省染料、罗丹明染料、苯并吡喃鎓染料、香豆素染料、花青标记或苯并吲哚标记。

84.根据项目82所述的化合物，其中所述荧光标记为花青标记。

85.根据项目82所述的化合物，其中所述荧光标记为花青标记，所述花青标记具有选自下组的式：

[化学式64]

[化学式65]

[化学式66]

[化学式67]

[化学式68]

[化学式69]

其中在以上各式中，

A选自由以下组成的组：CH

R

其中：

p为2、3、4、5、6、7或8；

q为2、3、4、5、6、7或8；

r为2、3、4、5、6、7或8；

$代表与花青部分的氮原子的连接点；

且&代表与分子的其余部分的连接点；

R

R

86.根据项目85所述的化合物，其中

A选自由以下组成的组：CH

R

其中：

p为2、3、4、5或6；

q是2、3、4、5或6；

r为2、3、4、5或6；

$代表与花青部分的氮原子的连接点；

且&代表与分子的其余部分的连接点；

R

R

87.根据项目85所述的化合物，其中

A为C(CH

R

其中：

p为2、3、4、5或6；

q是2、3、4、5或6；

r为2、3、4、5或6；

$代表与花青部分的氮原子的连接点；

且&代表与分子的其余部分的连接点；

R

R

88.根据项目85所述的化合物，其中

A为C(CH

R

其中：

p为4、5或6；

q为4、5或6；

r为3、4、5或6；

$代表与花青部分的氮原子的连接点；

且&代表与分子的其余部分的连接点；

R

R

89.根据项目85至88中任一项所述的化合物，其中R

90.根据项目85至89中任一项所述的化合物，其中R

91.根据项目85所述的化合物，其中

A为C(CH

R

p为4、5或6；以及

$代表与花青部分的氮原子的连接点；

且&代表与分子的其余部分的连接点；

R

R

92.根据项目85所述的化合物，其中

A为C(CH

R

其中：

q为4、5或6；

r为3、4、5或6；

$代表与花青部分的氮原子的连接点；

且&代表与分子的其余部分的连接点；

R

R

93.根据项目85至92中任一项所述的化合物，其中p为5，q为5且r为4。

94.根据项目82所述的化合物，其中所述荧光标记为花青标记，所述花青标记具有选自下组的式：

[化学式70]

[化学式71]

[化学式72]

其中在以上各式中，

曲线代表与分子的其余部分的连接点；

并且R

95.根据项目94所述的化合物，其中R

96.根据项目94所述的化合物，其中R

97.根据项目82所述的化合物，其中所述荧光标记是具有下式的花青标记：

[化学式73]

其中曲线代表与分子的其余部分的连接点；并且R

98.式II的化合物

[化学式74]

或其盐。

99.式IIA化合物

[化学式75]

或其盐。

100.组合物，其包含根据项目79至99中任一项所述的化合物或其盐和赋形剂。