可生物降解的组织置换植入物及其用途

本发明要求2018年11月19日提交的美国临时申请号62/769,484的权益，其通过引用并入本文。

本发明获得由美国国立卫生研究院，美国国立眼科研究所提供的项目号ZA1#:ET000542-03的政府支持。政府拥有本发明的某些权利。

技术领域

本公开内容涉及基于细胞的疗法领域，具体地涉及包括视网膜色素上皮(RPE)细胞的组织置换植入物，以及产生和使用这些组织置换植入物的方法。

背景技术

基于细胞的疗法有望“永久性”置换变性组织。眼睛是人们感兴趣的领域，因为它具有易及性以及迫切需要有效的疗法以帮助不断增长的出现视力丧失的老年人群(Fischbach,et al.,Sci Transl.Med 5,179ps177(2013)；Song and Bharti,Brain Res1638,2-14(2016))。先前使用外科手术成功移植了从同一患者的眼睛周围获得的自体RPE/脉络膜细胞，为开发基于多能干细胞来源的RPE细胞疗法提供了关键原理证明(Joussen etal.,Ophthalmology 114,551-560(2007)；van Zeeburg,et al.,Am J Ophthalmol 153,120-127.e122(2012))。在最近的初步临床研究中，已经在年龄相关性黄斑变性(AMD)患者中检测了基于胚胎干细胞(ESC)和诱导性多能干细胞(iPSC)的疗法，AMD是老年人失明的主要原因(Schwartz et al.,Lancet 379,713-720(2012)；Schwartz et al.,Lancet 385,509-516(2015)；Mandai et al.,N Engl J Med 376,1038-1046(2017)；Bharti et al.,Pigment Cell Melanoma Res 24,21-34(2011)；da Cruz et al.,Nat Biotechnol 36,328-337(2018)；Kashani et al.,Sci Transl Med 10,(2018))。AMD有两个晚期阶段：“干性”AMD或地图样萎缩是由视网膜色素上皮(RPE)死亡引起的，视网膜色素上皮(RPE)是位于眼睛后部的单层色素细胞。“湿性”或脉络膜新生血管性AMD是由脉络膜血管增生引起的，脉络膜血管穿透通过RPE并在视网膜下渗出液体和血液(Ambati and Fowler,Neuron 75,26-39(2012)；Bird,et al.,JAMA Ophthalmol 132,338-345(2014))。两种病况导致感光细胞死亡，引起严重视力丧失，并可能导致失明。

迄今为止，几项研究已经探索了AMD患者中干细胞来源的RPE细胞的视网膜下递送：在AMD的地图样萎缩(“干性”)阶段患者的I期临床试验中检测ESC衍生的RPE细胞悬液(Joussen et al.,Ophthalmology 114,551-560(2007)；van Zeeburg,et al.,Am JOphthalmol 153,120-127.e122(2012))；最近，一名“湿性”形式的AMD患者接受了自体iPSC-RPE(iRPE)细胞移植(Schwartz et al.,Lancet 385,509-516(2015)；Mandai etal.,N Engl J Med 376,1038-1046(2017))。另外，在四名“干性”AMD患者中对paralene支架上的ESC衍生的RPE进行了检测，并在两名“湿性”AMD患者中对聚酯支架上的相同细胞进行了检测(da Cruz et al.,Nat Biotechnol 36,328-337(2018)；Kashani et al.,SciTransl.Med 10(2018))。这些研究证明了干细胞疗法具有安全性，但也揭示了需要创新以开发获批用于临床的商业干细胞疗法。例如，悬液中的RPE细胞不会自组织成融合的极化单层，并且不会在患者的眼睛后部提供屏障功能，从而影响细胞的长期存活(Diniz et al.,Investigative Ophthalmology&Visual Science 54,5087-5096(2013))。先前的方法尚未提供在多名患者中经过功能验证的方法(Kamao et al.,Stem Cell Reports 2,205-218(2014))。本文提供了组织置换植入物，该组织置换植入物在临床上可有效治疗多种视网膜疾病和视网膜功能障碍，并且可以使用质量管理规范(GMP)/临床级生产而产生。

发明内容

在一些实施方式中，公开了一种组织置换植入物，该组织置换植入物包括在聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)支架上的极化的视网膜色素上皮细胞，其中所述PLGA支架的厚度为20-30微米，具有约1:1的DL-丙交酯/乙交酯比例，相邻纤维之间的平均孔径小于约1微米，并且纤维直径为约150至约650nm。

在另外的实施方式中，公开了治疗患有视网膜变性疾病、视网膜或视网膜色素上皮功能障碍、视网膜退化、视网膜损害、或视网膜色素上皮缺失的受试者的方法。这些方法包括向受试者的眼睛局部施用公开的组织置换植入物。

在进一步的实施方式中，公开了产生组织置换植入物的方法。这些方法包括：a)获得包被有玻连蛋白的PLGA，其中PLGA支架包括形成网状结构的纤维，并且其中所述PLGA支架具有上表面和下表面，其中所述PLGA支架的厚度为约20-约30微米，具有约1:1的DL-丙交酯/乙交酯比例，平均孔径小于约1微米，并且纤维直径为约150至约650nm；b)热处理所述支架，以使所述支架的纤维在所述PLGA支架内的纤维交叉点的交汇处融合，以增加所述PLGA支架的机械强度并减小孔径；c)将视网膜色素上皮细胞以每12mm直径的PLGA支架约125,000至约500,000个细胞接种到所述PLGA支架上；和d)在组织培养基中在所述PLGA支架上体外培养所述视网膜色素上皮细胞，在所述PLGA支架的上表面和下表面上均存在培养基，培养时间足以使i)所述视网膜色素上皮细胞极化和ii)所述支架中的所述PLGA整体降解。

结合参考附图，本发明的上述和其他特征和优点将从以下几个实施方式的详细描述中变得更加显而易见。

附图说明

图1A-1F.临床级2D三阶段iPSC-RPE分化方案产生纯RPE细胞。(A)工作流程示出了生产和检测自体临床级iPSC-RPE贴片的管线，用于向FDA提交研究性新药(IND)申请以批准启动I期临床试验。(B)临床级iRPE分化的时间表。临床级iRPE分化需要77天，由单层iPSC引发并使用无外源动物成分(xero-free)试剂进行。神经外胚层诱导培养基(NEIM)；RPE诱导培养基(RPEIM)；RPE定型培养基(RPECM)；RPE生长培养基(RPEGM)；RPE成熟培养基(RPEMM)。(C)对所有9个临床级AMD iPSC克隆以2000×深度进行223个癌基因的编码区测序。序列的亲缘关系分析证实了iPSC克隆与它们各自的供体之间的同一性，除了供体2克隆B表现出几个序列变化。(D，E)在RPE祖细胞阶段(D)17、RPE定型阶段(D27)和RPE未成熟阶段(D42)进行的衍生自所有三名AMD患者的临床级iPSC-RPE的流式细胞术分析揭示了在祖细胞阶段具有高PAX6/MITF双+细胞，其数量随细胞向RPE细胞系(趋势线)成熟而逐渐减少。从RPE祖细胞到未成熟RPE阶段，MITF+细胞的数量一直增加。此外，RPE祖细胞标志物PMEL17+和色素沉着酶TYRP1+细胞在RPE祖细胞阶段高，而成熟RPE标志物CRABP和BEST1+细胞在RPE定型阶段开始并持续增加至未成熟RPE阶段(趋势线)(n＝6)。(F)从D5-D42临床级iPSC-RPE分化的RPE特异性基因表达逐渐增加(n＝6)。

图2A-2I.可生物降解的PLGA支架有助于生成功能成熟的AMD iRPE贴片。(A)确定不同PLGA支架的杨氏模量，以识别最佳移植支架(**p<0.001)。(B)SEM证实单层融合的PLGA支架的表面拓扑结构。(C)通过对以下成分进行免疫染色证实iRPE贴片成熟：成熟RPE标志物RPE65(细胞质)和人特异性抗原STEM121(细胞质)，上图；RPE色素蛋白GPNMB(细胞质)和Bruch膜蛋白COLLAGEN IV(基底)，中间图；和COLLAGEN VIII，Bruch膜标志物(基底)，下图(n＝3)。(D)Transwell膜或PLGA支架上iRPE贴片的TEM证实了具有相似成熟。仅在PLGA支架的情况下才存在基底内折(Basal infolding)(插图)(n＝3)。(E)显示了来自三个AMD供体的所有八个iRPE贴片的RPE特异基因的ΔcT值(n＝8)。(F)在iRPE贴片成熟的最后三周(D54-77)进行的实时TER测量显示，贴片电完整性和成熟度逐渐增加。显示来自三个克隆(3A，3D，4A)的代表性数据(n＝8)。(G)图显示了大多数AMD-iRPE贴片(n＝8)的吞噬率相似。(H，I)主成分分析(PCA)来自所有测定(形态测定，基因表达，TER和吞噬作用)的组合数据，显示了跨PC1克隆之间的大多数变异，除了样品D2B(H)。绘制的PCA(未使用D2B数据)显示，与克隆之间的变异相比，供体之间的变异更高(I)(n＝8)。

图3A-3K.与啮齿动物模型中注射的RPE细胞相比，临床级AMD iRPE贴片显示出提高的整合性。(A-C)正面(En face)红外图像(A)、OCT(B)和人抗原的免疫组织化学(STEM121–细胞质，C)证实直径为0.5mm的临床级AMD-iRPE贴片(较浅箭头；较深箭头标记大鼠RPE细胞–见放大图)在术后10周免疫功能低下大鼠的视网膜下间隙的正确视网膜下位置和完全整合。(n＝20)(D)STEM121的免疫组织化学-(箭头，放大图见插图)证实在大鼠眼睛中存在注射的临床级AMD-iRPE细胞。大鼠RPE未呈STEM121阳性(插图中的箭头表示更高放大倍数)。(E)Ki67免疫染色的缺失证实注射的人细胞缺少增殖(较浅箭头，较高放大倍数见插图；大鼠RPE用较深箭头标记)。(F)STEM121-免疫染色(较浅箭头)还显示了大鼠RPE中少量人细胞整合(较深箭头；放大倍数见插图)(n＝10)。(G，I)RCS大鼠视网膜的合成照片显示，与未移植区中的变性ONL相比(箭头，n＝10)，移植iPSC-RPE贴片(直径为0.5mm的贴片上～2,500个细胞)(G)或iRPE细胞悬液(100,000个细胞)(I)挽救外核层(ONL)(箭头)。(H，J)植入iRPE贴片(H)或iRPE细胞悬液(J)的视网膜的免疫荧光染色，具有ONL挽救(浅箭头)(HuNu，人核抗原–核，人特异性抗PMEL17–细胞质)。注：(H)中较深箭头指出在移植过程中可能从支架脱落的iRPE细胞。(K)在P90的视动追踪阈值。即使剂量减少40倍，iRPE贴片在p90的表现仍类似于细胞悬液，表明iRPE贴片具有更好有效性(n＝10，*p<0.05，**p<0.001)。

图4A-4I.通过激光诱导的猪RPE消融建立iRPE贴片有效性模型。(A)微脉冲激光损伤猪RPE的示意图；插图，荧光素血管造影描绘了激光诱导的血液-视网膜外屏障破裂。(B，C)OCT显示在激光照射后24h时RPE脱离和在1％占空比激光后48h时RPE变薄(箭头)。(D)1％或3％占空比激光(激光区用虚线勾括出)后视觉带区的P1值的热图。指示了P1值比例尺。(E)来自健康、1％和3％占空比激光区的平均mfERG波形。(F-I)48小时时的TUNEL(核)、RPE65(RPE的细胞质)和PNA(感光细胞的细胞质)的免疫染色(F，G)以及H&E染色(H，I)显示受损的、脱离的和凋亡的RPE单层(箭头)，以及对ONL层造成一些损害。

图5A-5N.临床级AMD iRPE贴片在激光诱导的视网膜变性猪模型中有效。(A-C)比较健康区的视网膜、移植空PLGA支架的视网膜或移植临床级AMD iRPE贴片(水平线)的视网膜的OCT，显示与其中可以看到视网膜小管的空支架相比，iRPE贴片整合和贴片上的健康视网膜。(D-F)STEM 121(细胞质–RPE，箭头，F)和RPE65(细胞质–RPE)免疫染色证实猪眼睛中临床级AMD iRPE贴片的整合。PNA染色(感光细胞外节段中的亮信号)显示，与空支架移植视网膜相比，iRPE贴片移植的视网膜(F)中的感光细胞保持更好(E，箭头标记视网膜小管)。(G)(视锥蛋白用箭头标记)的免疫染色证实视锥感光细胞保持在人(SPE121，RPE的细胞质)iRPE贴片移植区上方。(H，I)视紫红质免疫染色显示，用RPE65免疫染色(RPE中的细胞质)的健康猪RPE和用STEM121免疫染色的人iRPE细胞(RPE中的细胞质)吞噬感光细胞外段(POS)。Z剖视图显示POS定位于猪和人RPE细胞内部。(J-L)N1P1 mfERG响应的热图显示，RPE激光消融后视觉带区中的信号减弱(J与K比较)，并且临床级iRPE贴片(L)移植后部分信号恢复。(M，N)平均mfERG波形(M)和组合数据(N)显示，与空支架(下线)相比，在随访10周内PLGA上临床级iRPE贴片的信号明显改善(p<0.05)(上线)。n＝7。

图6A-6N.在激光诱导的视网膜变性猪模型中，与iRPE细胞悬液相比，iRPE贴片显示出更好的整合和视网膜恢复。(A-H)OCT显示，在激光损伤RPE的猪中，移植后2周和5周，与空PLGA支架和iRPE细胞悬液相比，PLGA-iRPE贴片和transwell-iRPE贴片中的视网膜健康改善(水平线和箭头指出移植物)。(I-L)人抗原STEM121(RPE中的细胞质信号)和RPE65(RPE中的细胞质信号)的免疫染色证实，与空支架区和细胞悬液移植区中极低PNA染色相比，在健康区和iRPE贴片移植区中猪眼睛中的人iRPE贴片整合(J中的水平线和较浅箭头)，并具有组织化的外核层(PNA白色，较深箭头J)，表明覆盖iRPE贴片的感光细胞恢复。n＝3。(M，N)与空支架和iRPE细胞注射相比，单个和平均mfERG反应显示在transwell-iRPE贴片和PLGA-iRPE贴片中视网膜健康改善(n＝3；*p<0.05)。

图7A-7O.(A)研究级iPSC-RPE分化的时间表。分化为成熟的RPE需要107天，并在神经外胚层诱导培养基(NEIM)中使用3D iPSC聚集体起始分化。(B，C)从RPE诱导培养基(RPEIM)中去除FGF2使GFP阳性RPE细胞数量增加一倍，其通过在酪氨酸酶基因启动子42控制下表达GFP的报告子iPSC细胞系测量。(D)PD0325901在RPEIM中对MEK的抑制降低iPSC分化为GFP阳性RPE祖细胞的变异性。(E)RPEIM中的少量NOGGIN(50ng/ml)的轻度双SMAD抑制作用结合RPE定型培养基(RPECM)中的激活素A(100ng/ml)进一步增加了GFP阳性RPE祖细胞的数量。(F)RPECM中的激活素A和WNT3a未显示GFP阳性RPE祖细胞数量的任何协同增加，如最近所示15(n＝3)。(G)研究级基于3D iPSC聚集体的分化方案可重复地从多个健康和患者iPSC细胞系(成纤维细胞或血液来源)生成RPE(n＝4)。(H，I)研究级分化方案D42时PAX6和MITF阳性RPE细胞的流式细胞仪分析。(J)在临床级分化方案的第12天细胞中上皮表型的确证。(K，L)临床级iRPE分化方案D42时OCT4和TRA1-81的流式细胞术分析证实不存在iPSC。(M-O)三个另外的使用者(图1D中的第一使用者数据)重现了临床级iRPE分化方案，通过在D17时PAX6和MITF双阳性细胞的流式细胞术分析显示。

图8A-8H.(A-H)在降解过程中从边缘(A-D)和正面(E-H)观察PLGA支架的SEM图像，显示由于PLGA纤维整体降解而引起的表面拓扑结构变化和整个支架变薄(n＝3)。

图9A-9J.(A，B)SEM证实在PLGA-iRPE贴片和Transwell-iRPE贴片上存在相当的顶突(n＝3)。(C，D)电生理迹线证实PLGA-iRPE贴片和transwell-iRPE贴片(n＝3)具有相似电性能。(E)与iPSC相比，PLGA-iRPE贴片和transwell-iRPE贴片之间的RPE特异性基因的倍数变化比较显示，两种基底上的单层成熟度相似。但是发现，与transwell相比，不同的生物学重复品在PLGA支架上的变异性较小(n＝3)。(F，G)来自AMD供体4，iPSC克隆C(D4C)的iRPE的明视野和ZO-1免疫染色图像。(H)使用卷积神经网络对ZO-1免疫染色图像进行分割，以突出细胞边界。分割的图像用于形态分析(Schaub等人，待投)。(I)使用REShAPE软件对来自所有三个AMD供体的iRPE贴片的ZO-1染色图像进行形态计量学分析。每个贴片对75,000-100,000个细胞成像，并分析图像以确定每个RPE细胞的六角形性评分(细胞的六角形情况)。数据以小提琴图(violin plots)显示，中心点代表平均值，每个图中的水平线代表99％数据点。源自不同克隆的RPE贴片在不同的点显示(n＝8)。(J)图显示了不同AMD-iRPE-贴片的极化的VEGF分泌(基底/顶端比)(n＝8)。

图10A-10B.(A，B)通过在支架上接种iPSC和RPE的混合培养物(100％iPSC；10％iPSC+90％RPE；1％iPSC+99％RPE；和100％RPE)进行的体外加标研究。在接种后第0、2、7和14天，通过流式细胞术评价iPSC标志物(OCT4和TRA 1-81)(A)。在混合的iPSC、RPE培养物接种后的第0、7和14天评价iPSC(ZFP42，OCT4，NANOG，LIN28A，LEFTY1，DNMT38)和谱系特异性标志物(中胚层–VWF、S100A4、KDR；内胚层–GATA6、FOXA2、AFP；非RPE外胚层–SOX10、MAP2、GFAP)的基因表达分析。数据以相对ΔcT值的热图显示。所有值均标准化为第0天的数据(B)。该实验证实PLGA支架和RPE成熟培养基不支持iPSC或非RPE谱系生长。同样，非RPE谱系基因不在iRPE细胞中表达。

图11A-11F.(A)在大鼠视网膜下间隙中直径为0.5mm的iRPE贴片移植的示意图。手术以1.2mm巩膜切开术开始，然后用透明质酸(HA)进行玻璃体置换，在视网膜下间隙中通过HA注射使视网膜脱离，在移植工具中装载iRPE贴片，在视网膜下间隙中递送，并通过透明质酸使视网膜脱离变平。(B)在大鼠眼睛的视网膜下间隙中成功移植的iRPE贴片的可视化。(C)光学相干断层扫描图像证实已移植的iRPE贴片在大鼠眼睛的视网膜下间隙中成功递送。(D-F)人特异性PMEL17的免疫组织化学(箭头，D)证实注射后10周时视网膜下间隙中注射的AMD iRPE细胞悬液的RPE表型。相反，注射的人iPSC悬液(STEM121–E)导致畸胎瘤形成(F)n＝10

图12A-12G.(A)热图显示在进行激光照射之前，猪眼睛的平均mfERG电波形反应。RPE的激光消融在电活动最高区域进行，即猪眼睛的视觉带(虚线)。(B，C)激光照射后24和48小时的3％占空比激光的OCT显示RPE和ONL损伤和视网膜下水肿(箭头)。(D)3％占空比激光区域的TUNEL(核信号)染色显示24h时ONL中有一些凋亡细胞。线显示RPE单层。(E)在48h，使用3％占空比激光，ONL和RPE看起来均受到严重损害，具有几个凋亡细胞(核信号)以及弱PNA(感光细胞外节段细胞质信号)和RPE65(RPE中的细胞质信号)染色。(F，G)48小时后1％(F)和3％(G)占空比激光的H&E染色。在1％占空比(F，箭头)的左侧，健康区域很明显。注：与1％激光(箭头)相比，在3％激光下感光细胞显著破坏。

图13A-13M.(A，B)移植工具和装有空支架(箭头)的工具尖端的图像。(C-F)猪手术示意图。在标准的四孔玻璃体切除术之后，使用38G钝头套管分离视网膜(C)，然后进行视网膜切开术(D)，扩大巩膜切开术(E)，并将人RPE贴片递送至视网膜下间隙(F)。(G-I)手术过程中进行的术中眼底成像和光学相干断层扫描(iOCT)证实在预期的视网膜下位置已递送4×2mm支架。(J，K)手术后两周(J)和十周(K)的猪眼睛的OCT证实未免疫抑制的猪中空支架降解以及没有由降解PLGA副产物引起的炎症。(L)手术后证实未免疫抑制的猪中空支架降解，并且没有由降解PLGA副产物引起的炎症。(M)空支架上的N1P1 mfERG信号显示直至第3周显著降低，这可能是由于外科手术引起的。随着手术损伤的愈合和支架的降解，信号随时间恢复(双因素ANOVA，p<0.0001)n＝3。

图14A-14I.(A)表达GFP的人iRPE贴片。(B，C)眼底自发荧光图像显示移植后2周(白色箭头)和移植后10周(白色箭头显示iRPE贴片，灰色箭头显示激光区)视网膜下GFP阳性4×2mm iRPE贴片。注：人细胞未从贴片中迁移出。(D-F)人iRPE贴片移植的猪视网膜区域的感光细胞染色图像(PNA，白色，D)；以及人iRPE细胞(STEM121，细胞质，E)和RPE(RPE65，细胞质，F)免疫染色。(G)与iRPE贴片移植区域相比，空支架移植区域上猪视网膜外核层(ONL)的核数定量。数字表示为健康视网膜的分数。(H)人核抗原STEM101(核)和RPE65(细胞质)的免疫染色证实在猪眼睛中的人iRPE贴片整合。(I)猪眼睛中移植的人iRPE贴片的视紫红质(感光细胞外节段)和STEM121(RPE的细胞质)(箭头)的3D重建显示了人RPE细胞内部的感光细胞外节段(POS)。

图15A-15L.(A-I)荧光素血管造影(A，D，G)证实用于空支架(A)、transwell-iRPE贴片(D)和iRPE细胞注射(G)移植的猪眼睛中基于微脉冲激光的RPE损伤。术中眼底成像(B，E，H)和术中OCT(C，F，I)证实空支架(B，C)、transwell-iRPE贴片(E，F)和iRPE细胞注射(H，I)正确递送(白色箭头)。(J-L)猪视网膜的人iRPE贴片移植区域的感光细胞染色图像(PNA，感光细胞外节段的细胞质，J)；以及人iRPE细胞(STEM121，RPE的细胞质，K)和RPE(RPE65，RPE的细胞质，L)的免疫染色。注：人细胞的STEM121标签(见K中的下划线)在猪RPE开始的位置停止。

图16.白化病iPSC中CRISPR介导的基因修正。上图显示了SEQ ID NO:1，其中X是C或T，下图显示了SEQ ID NO:1，其中X是C。

图17.来自患者细胞和CRISPR修正的iPSC的RPE贴片。

图18.OCA2患者RPE细胞和CRISR修正的OCA2 RPE细胞的组织学。

按37C.F.R.1.822所定义，使用核苷酸碱基的标准字母缩写和氨基酸的3个字母代码表示在所附序列表中列出的核酸和氨基酸序列。每个核酸序列仅显示一条链，但是互补链应理解为通过任何对显示链的引用而包括。序列表以ASCII文本文件[Sequence_Listing，2019年11月11日，709字节]提交，其通过引用并入本文。在所附序列表中：

SEQ ID NO:1是OCA2基因的一部分的核酸序列。

具体实施方式

视网膜是位于脊椎动物眼睛内表面的一层特化光敏神经组织。经过角膜、晶状体和玻璃体液后到达视网膜的光转变为化学和电事件，从而触发神经冲动。负责转导的细胞(将光转化为这些生物过程的过程)是称为感光细胞的特化神经元。

视网膜色素上皮(RPE)是哺乳动物眼睛中紧密堆积的六角形细胞的极化单层，其将神经视网膜与脉络膜分开。RPE中的细胞含有色素颗粒，并通过形成血液-视网膜屏障和与感光细胞紧密相互作用，以通过吸收晶状体聚焦在视网膜上的光能来维持视觉功能，从而在视网膜生理学中起着至关重要的作用。这些细胞还将离子、水和代谢终产物从视网膜下间隙转运至血液，并从血液吸收营养素，例如葡萄糖、视黄醇和脂肪酸，并将这些营养素递送至感光细胞。

RPE细胞也是视网膜视觉周期的一部分：由于感光细胞不能将光子吸收后形成的全反式视黄醛重新异构化回11-顺式-视网膜，因此视黄醛被转运到RPE，然后再重新异构化成11-顺式视网膜，并转运回感光细胞。

许多眼科疾病，例如(年龄相关性)黄斑变性、黄斑营养不良(例如Stargardt疾病和Stargardt样疾病)、Best疾病(玻璃体黄斑营养不良)和成人玻璃体营养不良或色素性视网膜炎亚型，与视网膜本身或RPE的变性或退化有关。在动物模型中已证明，通过视网膜下RPE细胞移植可以实现感光细胞挽救和视觉功能保持(Coffey et al.Nat.Neurosci.2002:5,53-56；Lin et al.Curr.Eye Res.1996:15,1069-1077；Little et al.Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.1996:37,204-211；Sauve et al.Neuroscience 2002:114,389-401)。另外，需要可用于治疗视网膜的物理性损伤的方法和植入物。

术语

除非另有说明，否则根据常规用法使用技术术语。分子生物学中常用术语的定义可见Benjamin Lewin,Genes V,published by Oxford University Press,1994(ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew et al.(eds.),The Encyclopedia of Molecular Biology,published by Blackwell Science Ltd.,1994(ISBN 0-632-02182-9)；and RobertA.Meyers(ed.),Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive DeskReference,published by VCH Publishers,Inc.,1995(ISBN 1-56081-569-8)。

为了促进对本公开内容的各种实施方式的评述，提供了对特定术语的以下解释：

激活素(Activin)：转化生长因子β(TGF-β)超家族的成员，参与多种生物学过程的调控，包括细胞分化和增殖。激活素A是该家族的成员，其通过跨膜受体丝氨酸/苏氨酸激酶的复合体介导其生物学作用，并与特定激活素A受体结合。它是由两个亚基组成的二聚体。激活素A通过多能性标志物(如POU 5类同源盒1(Oct-3/4)、nanog、nodal和nodal信号传导调节剂、左-右决定因子1和2(Lefty-B和Lefty-A))的SMAD依赖性激活转录参与干细胞维持的调节。激活素A还刺激几种激素(例如促性腺激素释放激素)的转录。激活素A的示例性序列在登录号NM_002192中提供。

试剂：任何蛋白、核酸分子(包括化学修饰的核酸)、化合物、小分子、有机化合物、无机化合物或其他目标分子。试剂可以包括治疗剂、诊断剂或药剂。治疗剂或药剂是单独或与另外的化合物一起诱导预期反应(例如当施用于受试者时诱导治疗或预防作用)的一种试剂。

激动剂或诱导剂：与细胞的受体或该受体的配体结合并触发该细胞反应的试剂，通常模拟天然物质的作用。在一个实施方式中，卷曲蛋白(Frizzled，Fzd)激动剂与Fzd受体结合并加强或增强Wnt/β-连环蛋白信号传导通路。

改变：有效量的目标物质或参数(例如多核苷酸、多肽或细胞特性)的变化。多肽或多核苷酸或酶活性的改变可影响细胞的生理特性，例如细胞的分化、增殖或衰老。物质的量可以通过产生的物质的量的差异、具有预期功能的物质的量的差异、或物质激活的差异改变。变化可以是增加或减少。改变可以是体内或体外的。在几个实施方式中，改变是有效量(水平)的物质、细胞的增殖和/或存活、或蛋白(例如酶)的活性增加或减少至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。

动物：活的多细胞脊椎动物，包括例如哺乳动物和鸟类的类别。术语哺乳动物包括人和非人哺乳动物。类似地，术语“受试者”包括人和兽医受试者，例如非人灵长类动物、犬、猫、马、兔、猪、小鼠、大鼠和牛。

拮抗剂或抑制剂：与受体或受体的配体结合时可阻断或减弱生物化学或生物反应的试剂。拮抗剂通过防止激动剂诱导的反应，通过受体相互作用介导其作用。在一个实施方式中，卷曲蛋白(Fzd)拮抗剂与Fzd受体或Fzd配体(例如Wnt)结合并抑制Wnt/β-连环蛋白信号传导通路。

抗体：至少包括特异性识别并结合抗原表位的轻链或重链免疫球蛋白可变区的多肽配体。抗体由重链和轻链组成，它们各自具有可变区，称为重链可变(V

抗体包括完整的免疫球蛋白以及本领域公知的抗体的变体和部分，例如Fab片段、Fab'片段、F(ab)'

通常，天然存在的免疫球蛋白具有通过二硫键互相连接的重(H)链和轻(L)链。轻链有两种类型：lambda(λ)和kappa(κ)。有五种主要的重链类别(或同种型)，它们决定了抗体分子的功能活性：IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。

CD34：在人和其他哺乳动物种属中，由CD34基因编码的跨膜磷酸糖蛋白。首先在造血干细胞上描述了CD34。表达CD34的细胞(CD34

细胞：生物体的结构和功能单元，可以独立复制、被膜包封并且包含生物分子和遗传物质。本文使用的细胞可以是天然存在的细胞或人工修饰的细胞(例如，融合细胞、基因修饰的细胞等)。

术语“细胞群”是指一组细胞，通常为普通类型。细胞群可以衍生自共同的祖细胞，或者可以包含多于一种细胞类型。“富集的”细胞群是指衍生自起始细胞群(例如，未分级的异质细胞群)的细胞群，其包含的特定细胞类型的百分比大于起始细胞群中该细胞类型的百分比。可以富集一种或更多种细胞类型的细胞群，并消耗一种或更多种细胞类型的细胞群。“富集的”细胞群是指衍生自起始细胞群的细胞群(例如，未分级的异质细胞群)，其所包含的特定细胞类型的百分比大于起始细胞群中该细胞类型的百分比。细胞群可以是一种或更多种细胞类型富集的，以及是一种或更多种细胞类型耗竭的。

术语“干细胞”是指在合适的条件下能够分化成各种各样的特化细胞类型，而在其他合适的条件下能够自更新并保持基本未分化的多能状态的细胞。术语“干细胞”还涵盖多能细胞、多效细胞、前体细胞和祖细胞。示例性人干细胞可以从获自骨髓组织的造血或间充质干细胞、获自胚胎组织的胚胎干细胞或获自胎儿生殖器组织的胚胎生殖细胞获得。示例性多能干细胞还可以通过表达某些与多能性相关的转录因子将它们重编程为多能状态而从体细胞中产生；这些细胞称为“诱导性多能干细胞”或“iPSC”。

分化：指相对非特化的细胞(例如胚胎干细胞或其他干细胞)获得成熟细胞特有的结构和/或功能特征的过程。类似地，“分化”是指此过程。通常，在分化过程中，细胞结构发生改变并出现组织特异性蛋白。

确定的或“完全确定的”：提及培养基、细胞外基质或培养条件时是指其中化学组合物和大约所有成分的量已知的培养基、细胞外基质或培养条件。例如，确定的培养基不包含不确定的因子，例如胎牛血清、牛血清白蛋白或人血清白蛋白。通常，确定的培养基包括基础培养基(例如，Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)、F12或Roswell Park MemorialInstitute培养基(RPMI)1640，含氨基酸、维生素、无机盐、缓冲液、抗氧化剂和能源)，其补充重组白蛋白、化学成分确定的脂质和重组胰岛素。示例性完全确定的培养基是Essential8

胚状体：多能干细胞的三维聚集体。这些细胞可以经历分化为内胚层、中胚层和外胚层的细胞。与单层培养物相反，多能干细胞聚集时形成的球状结构能够在悬液中进行EB非粘附培养，这对于生物处理方法很有用。三维结构(包括在EB微环境中建立复杂的细胞粘附和旁分泌信号传导)可实现分化和形态发生。

胚胎：由受精卵或具有人工重编程的核的活化的卵母细胞分裂一次或多次而获得的细胞团，其与是否已植入雌性无关。“桑椹胚”是受精后3-4天的植入前胚胎，当它是固体团时，通常由12-32个细胞(卵裂球)组成。“胚泡”是指胎盘哺乳动物中的植入前胚胎(小鼠受精后约3天，人受精后约5天)约30-150个细胞。胚泡期紧随桑椹胚期，可以通过其独特的形态进行区分。胚泡通常是由一层细胞(滋养外胚层)、充满液体的腔(囊胚腔或胚泡腔)和内部的一群细胞(内细胞团，ICM)组成的球体。如果胚泡植入子宫，则由未分化细胞组成的ICM可产生胎儿。

胚胎干细胞：衍生自胚泡或桑椹胚的内细胞团的胚胎细胞，任选地以细胞系连续传代。该术语包括从胚胎的一个或更多个卵裂球分离的细胞，优选地未破坏胚胎的其余部分。该术语还包括通过体细胞核转移产生的细胞。“人胚胎干细胞”(hES细胞)包括源自人胚泡或桑椹胚的内细胞团的胚胎细胞，其任选地以细胞系连续传代。hES细胞可以衍生自卵细胞与精子或DNA受精、核移植、孤雌生殖或通过产生在HLA区具有纯合性的hES细胞的方法。人ES细胞可以产生或衍生自受精卵、卵裂球、或通过精子与卵细胞融合产生的胚泡阶段哺乳动物胚胎、核移植、孤雌生殖、或染色质重编程且随后将重编程的染色质掺入质膜以产生胚胎细胞。人胚胎干细胞包括但不限于MAO1、MAO9、ACT-4、No.3、H1、H7、H9、H14和ACT30胚胎干细胞。人胚胎干细胞，无论其来源或使用何种方法产生，都可以基于以下条件识别：(i)分化为所有三个胚层的细胞的能力，(ii)至少表达Oct-4和碱性磷酸酶，以及(iii)移植到免疫功能低下的动物中时产生畸胎瘤的能力。

扩增(Expand)：由于细胞分裂而增加细胞培养物中细胞数量或量的过程。类似地，术语“扩增(expansion)”或“扩增的(expanded)”是指该过程。术语“增殖(proliferate)”、“增殖(proliferation)”或“增殖的(proliferated)”可与词语“扩增(expand)”、“扩增(expansion)”或“扩增的(expanded)”互换使用。通常，在扩增期间，细胞不分化形成成熟细胞，而是分裂形成更多细胞。

表达：将基因的编码信息转换为细胞的可操作、不可操作或结构部分的过程，例如蛋白合成。基因表达可受外部信号的影响。例如，将细胞暴露于激素可刺激激素诱导的基因的表达。不同类型的细胞对相同信号的反应可能不同。基因的表达也可以在从DNA到RNA到蛋白的途径中的任何地方受到调控。调控可包括控制转录、翻译、RNA转运和加工、中介分子(如mRNA)的降解，或特定蛋白分子产生后的活化、失活、区室化或降解。

饲养层：可用于支持干细胞增殖的非增殖细胞(例如经辐射细胞)。用于产生饲养层的方案是本领域已知的，并且可以在互联网上获得，例如在美国典型培养物保藏中心(ATCC)维护的国家干细胞资源网站上。本文使用“无饲养细胞”或“非饲养细胞依赖的”是指补充有细胞因子和生长因子(例如，TGFβ、bFGF、LIF)的培养物，以替代饲养细胞层。因此，“无饲养细胞”或非饲养细胞依赖的培养系统和培养基可用于培养和维持多能细胞处于未分化和增殖状态。在一些情况下，无饲养细胞的培养物利用基于动物的基质(例如

胎儿：出生前处于胚胎期的发育中的哺乳动物。在人中，产前发育的胎儿阶段从受精后的第9周开始。在人眼睛中，从受孕后第4周已经形成RPE。RPE在接下来的几周内将继续成熟。

成纤维细胞生长因子(FGF)：源自任何动物的任何合适的成纤维细胞生长因子及其功能性片段，例如结合受体并诱导与受体活化有关的生物学效应的那些。多种FGF是已知的，包括但不限于FGF-1(酸性成纤维细胞生长因子)、FGF-2(碱性成纤维细胞生长因子bFGF)、FGF-3(int-2)、FGF-4(hst/K-FGF)、FGF-5、FGF-6、FGF-7、FGF-8、FGF-9和FGF-98。“FGF”是指成纤维细胞生长因子蛋白，例如FGF-1、FGF-2、FGF-4、FGF-6、FGF-8、FGF-9或FGF-98，或其生物活性片段或突变体。FGF可以来自任何动物种属。在一个实施方式中，FGF是哺乳动物FGF，包括但不限于啮齿动物、禽类、犬、牛、猪、马和人。用于制备多种FGF的氨基酸序列和方法是本领域公知的。

人bFGF的氨基酸序列及其重组表达的方法在美国专利号5,439,818中公开，其通过引用并入本文。牛bFGF的氨基酸序列及其重组表达的各种方法在美国专利号5,155,214中公开，其也通过引用并入本文。当比较146个残基形式时，它们的氨基酸序列几乎相同，仅有两个残基不同。可以使用美国专利号4,956,455中详细描述的技术将重组的bFGF-2和其他FGF纯化至药品质量(98％或更高的纯度)。

FGF诱导剂包括FGF的活性片段。最简单的形式是，使用公知的N端蛋氨酸去除技术，例如用蛋氨酸氨基肽酶处理，通过去除N端蛋氨酸制备活性片段。第二种理想的截短包括没有其前导序列的FGF。本领域技术人员将前导序列识别为蛋白N端的一系列疏水残基，其有助于其通过细胞膜但对于活性不是必需的并且在成熟蛋白上没有发现。人和鼠bFGF可商购获得。

卷曲蛋白(Fzd)：七次跨膜哺乳动物蛋白家族，其具有G蛋白偶联受体的特征，并结合脂糖蛋白Wnt家族的蛋白、分泌的卷曲蛋白相关蛋白(sFRP)、R-spondin和Norrin并激活下游信号传导。卷曲蛋白(也称为卷曲受体)包含与其同系配体结合的富含半胱氨酸的结构域(CRD)、羧基末端PDZ(Psd-95/disc large/ZO-1同源)结合结构域以及用于丝氨酸/苏氨酸激酶和酪氨酸激酶的多个共有位点。氨基酸亲水性分析表明，卷曲蛋白含有一个细胞外氨基末端、三个细胞外蛋白环、三个细胞内蛋白环和细胞内羧基末端。

卷曲蛋白在胚胎发育过程中具有重要的调节作用，并且在人和动物模型中还与多种疾病相关，包括各种癌症、心脏肥大、家族性渗出性玻璃体视网膜病变和精神分裂症。

至少有10种哺乳动物卷曲蛋白，并且编码哺乳动物卷曲蛋白的基因与果蝇卷曲基因有关。人卷曲蛋白包括Frizzled1(Fzd1；

生长因子：促进细胞生长、存活和/或分化的物质。生长因子包括充当生长刺激剂(促分裂原)的分子、刺激细胞迁移的因子、充当趋化剂或抑制细胞迁移或侵袭肿瘤细胞的因子、调节细胞分化功能的因子、参与凋亡的因子、或促进细胞存活而不影响生长和分化的因素。生长因子的实例是成纤维细胞生长因子(例如FGF-2)、表皮生长因子(EGF)、睫状神经营养因子(CNTF)和神经生长因子(NGF)以及actvin-A。

单倍型：沿单个染色体在多个基因座处的等位基因的组合。单倍型可以基于单个染色体上的一组单核苷酸多态性(SNP)和/或主要组织相容性复合物中的等位基因。术语“单倍型匹配的”是指细胞(例如iPSC)和待治疗的受试者共享一种或更多种主要的组织相容性基因座单倍型。可以使用本领域公知的测定法容易地确定受试者的单倍型。单体型匹配的iPSC可以是自体的或同种的。在组织培养中生长并固有地分化为RPE细胞的自体细胞与受试者单倍型匹配。“基本上相同的HLA类型”表示供体的HLA类型与患者的HLA类型匹配的程度是，通过诱导衍生自供体体细胞的iPSC的分化而获得的移植细胞当其被移植给患者时可以获得植入(be engrafted)。

宿主细胞：载体可在其中增殖并表达其DNA的细胞。该细胞可以是原核的或真核的。该术语还包括受试者宿主细胞的任何后代。应当理解，所有后代可能与亲代细胞并不相同，因为在复制过程中可能发生突变。然而，当使用术语“宿主细胞”时，包括了这种后代。

分离的：“分离的”生物成分，例如已经与该成分天然存在的环境(例如细胞)中的其他生物成分(例如细胞，染色体以及染色体外DNA和RNA、蛋白和细胞器)进行基本上分离或纯化的核酸、蛋白或细胞器。已“分离”的核酸和蛋白包括通过标准纯化方法纯化的核酸和蛋白。该术语还涵盖通过在宿主细胞中重组表达制备的核酸和蛋白，以及化学合成的核酸和蛋白。类似地，“分离的”细胞已经与天然存在该细胞的生物的其他细胞基本上分离、产生距离或远离。分离的细胞可以是，例如，至少99％、至少98％、至少97％、至少96％、95％、至少94％、至少93％、至少92％、或至少90％纯的。

哺乳动物：该术语包括人和非人哺乳动物。哺乳动物的实例包括但不限于：人以及兽医和实验动物，例如猪、牛、山羊、猫、犬、兔和小鼠。

标志物或标记：能够例如通过ELISA、分光光度法、流式细胞术、免疫组织化学、免疫荧光、显微镜、Northern分析或Southern分析进行检测的试剂。例如，可将标志物附着于核酸分子或蛋白，从而实现核酸分子或蛋白检测。标志物的实例包括但不限于放射性同位素、硝咪唑、酶底物、辅因子、配体、化学发光剂、荧光团、半抗原、酶及其组合。用于各种目的的标志物选择中的标记和指导方法例如在Sambrook et al.(Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor,New York,1989)and Ausubel et al.(InCurrent Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York,1998)中讨论。

在一些实施方式中，标志物是荧光团(“荧光标记”)。荧光团是化学化合物，当通过暴露于特定波长的光而激发时，其发出例如不同波长的光(即，荧光)。荧光团可以用其发射谱或“颜色”进行描述。绿色荧光团(例如Cy3、FITC和俄勒冈绿)的特征在于它们的发射波长通常在515-540λ范围内。红色荧光团(例如德克萨斯红、Cy5和四甲基罗丹明)的特征在于它们在通常在590-690λ范围内的波长下发射。在其他实施方式中，标志物是被抗体识别的蛋白标签，例如组氨酸(His)标签、血凝素(HA)标签或c-Myc标签。

膜电位：细胞内部相对于环境(例如外部浴液)的电位。本领域技术人员可以容易地评估细胞的膜电位，例如通过使用常规的全细胞技术。可以使用许多方法来评估膜电位，例如使用常规的全细胞接触(whole cell access)，或使用例如穿孔贴片全细胞和细胞吸附式配置。

培养基：一组合成的培养条件，具有支持特定细胞群的生长(细胞增殖/扩增)和/或分化所需的营养物。在一个实施方式中，细胞是干细胞，例如iPSC。在另一实施方式中，细胞是RPE细胞。培养基通常包括碳源、氮源和保持pH的缓冲液。在一个实施方式中，生长培养基包含最低基础培养基，例如DMEM，补充有各种营养物以增强干细胞生长。另外，最低基础培养基可以补充有添加剂，例如马、小牛或胎牛血清。

“视网膜诱导培养基(RIM)”是指包含WNT通路抑制剂和BMP通路抑制剂并且可以导致PSC分化为视网膜谱系细胞的生长培养基。RIM还包含TGFβ通路抑制剂。

“视网膜分化培养基(RDM)”是包含WNT通路抑制剂、BMP通路抑制剂和MEK抑制剂并且分化视网膜细胞的培养基。RDM还包含TGFβ通路抑制剂。

“视网膜培养基(RM)”是指用于培养视网膜细胞的生长培养基，其包含激活素A和烟酰胺。

“RPE成熟培养基(RPE-MM)”是指用于RPE细胞成熟的培养基，其包含牛磺酸和氢化可的松。RPE-MM还包含三碘甲状腺素。RPE-MM还可以包含PD0325901或PGE2。

Nodal：由NODAL基因编码的分泌蛋白，属于转化生长因子(TGF-β)超家族。在胚胎发育过程中，脊椎动物的内脏器官左右(LR)不对称是通过nodal信号传导建立的。Nodal在早期发育中在生物体的左侧表达，而在后口动物中高度保守。示例性Nodal序列可见

核酸：由通过磷酸二酯键、相关的天然存在的结构变体及其合成的非天然存在的类似物连接的核苷酸单元(核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、相关的天然存在的结构变体及其合成的非天然存在的类似物)组成的聚合物。因此，该术语包括核苷酸聚合物，其中核苷酸及其之间的连接包括非天然存在的合成类似物，例如但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽核酸(PNA)等。此类多核苷酸可以例如使用自动化DNA合成仪合成。将理解的是，当核苷酸序列由DNA序列(即，A、T、G、C)表示时，其还包括其中“U”替代“T”的RNA序列(即，A、U、G、C)。

“核苷酸”包括但不限于单体，该单体包括与糖连接的碱基，如嘧啶、嘌呤或其合成类似物，或与氨基酸连接的碱基，如在肽核酸(PNA)中。核苷酸是多核苷酸中的一种单体。核苷酸序列是指多核苷酸中的碱基序列。

本文使用常规符号来描述核苷酸序列：单链核苷酸序列的左端是5'端；双链核苷酸序列的左侧方向称为5'方向。将核苷酸以5'至3'添加到新生RNA转录物中的方向称为转录方向。具有与mRNA相同的序列的DNA链被称为“编码链”；具有与从该DNA转录的mRNA相同的序列并且位于RNA转录物的5'至5'端的DNA链上的序列被称为“上游序列”；具有与RNA相同的序列并且在编码RNA转录物的3'至3'端的DNA链上的序列称为“下游序列”。

“cDNA”是指与mRNA互补或相同的DNA，呈单链或双链形式。

“编码”是指多核苷酸(例如基因、cDNA或mRNA)中特定核苷酸序列的固有特性，以用作在具有确定核苷酸序列的生物过程中合成其他聚合物和大分子的模板(例如，rRNA、tRNA和mRNA)或确定的氨基酸序列以及由此产生的生物学特性。因此，如果由该基因产生的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生该蛋白，则该基因编码该蛋白。核苷酸序列与mRNA序列相同且通常在序列表中提供的编码链和用作转录模板的基因或cDNA的非编码链均可以称为编码蛋白或该基因或cDNA的其他产物。除非另有说明，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此为简并形式并且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白和RNA的核苷酸序列可能包括内含子。在一些实例中，核酸编码公开的抗原。

Noggin：由NOG基因编码的蛋白。Noggin通过与TGF-β家族配体结合并阻止它们与它们相应的受体结合来抑制TGF-β信号转导。Noggin与其他TGF-β信号抑制剂(如脊索蛋白和卵泡抑素)一起抑制BMP4，在神经诱导中起关键作用。Noggin的示例性序列是

Oct-4：一种蛋白，也称为POU5-F1或MGC22487或OCT3或OCT4或OTF3或OTF4，是Oct-4基因的基因产物。该术语包括来自任何种属或来源的Oct-4，并且包括保留用于产生iPSC的能力的Oct-4的类似物和片段或部分。Oct-4蛋白可以具有可以从公共来源(如

可操作地连接：当第一核酸序列与第二核酸序列处于功能关系时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则该启动子可操作地连接至该编码序列。通常，可操作地连接的DNA序列是连续的，并且在需要连接两个蛋白编码区的情况下，它们在同一阅读框中。

药学上可接受的载体：常规药学上可接受的载体可用于实施本文公开的方法和形成组合物。Remington’s Pharmaceutical Sciences,by E.W.Martin,Mack PublishingCo.,Easton,PA,15th Edition,1975，描述了适用于药物递送本文公开的抗微生物化合物的组合物和制剂的实例。

通常，载体的性质将依赖于所采用的特定施用方式。例如，肠胃外制剂通常包含注射液，该注射液包括药学上和生理学上可接受的流体(例如水、生理盐水、平衡盐溶液、右旋糖水溶液、甘油等)作为溶媒。对于固体组合物(例如散剂、丸剂、片剂或胶囊剂形式)，常规的无毒固体载体可以包括例如药用级甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除生物学中性载体外，待施用的药物组合物还可以包含少量的无毒辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂和pH缓冲剂等，例如乙酸钠或脱水山梨糖醇单月桂酸酯。

多能干细胞：干细胞：(a)移植到免疫缺陷(SCID)小鼠中时能够诱导畸胎瘤；(b)能够分化为所有三个胚层的细胞类型(例如，可以分化为外胚层、中胚层和内胚层细胞类型)；和(c)表达一种或更多种胚胎干细胞标志物(例如，表达Oct 4、碱性磷酸酶、SSEA-3表面抗原、SSEA-4表面抗原、nanog、TRA-1-60、TRA-1-81、SOX2、REX1等)，但不能形成胚胎和胚外膜(不具有全能性)。

示例性多能干细胞包括衍生自胚泡期胚胎的内细胞团(ICM)的胚胎干细胞，以及衍生自卵裂期或桑椹胚期胚胎的一个或更多个卵裂球的胚胎干细胞(可选地不破坏胚胎的其余部分)。这些胚胎干细胞可以由受精或无性繁殖产生的胚胎材料产生，包括体细胞核移植(SCNT)、孤雌生殖和雄激素生成。仅将PSC移植到子宫内不能发育成胎儿或成年动物，因为它们缺乏促进所有胚外组织(例如体内胎盘或体外滋养细胞)的潜力。

多能干细胞还包括“诱导性多能干细胞(iPSC)”，其通过表达或诱导多种因子(本文称为重编程因子)的表达来重编程体细胞而产生。可以使用胎儿、出生后、新生儿、少年或成人体细胞生成iPSC。在某些实施方式中，可用于将体细胞重编程为多能干细胞的因子包括例如Oct4(有时称为Oct 3/4)、Sox2、c-Myc和Klf4、Nanog和Lin28。在一些实施方式中，通过表达至少两种重编程因子、至少三种重编程因子、或四种重编程因子来重编程体细胞以将体细胞重编程为多能干细胞。iPSC在性质上与胚胎干细胞相似。

多肽：一种聚合物，其中的单体是通过酰胺键连接在一起的氨基酸残基。当氨基酸是α-氨基酸时，可以使用L-光学异构体或D-光学异构体，L-异构体在本质上是优选的。术语多肽特别旨在涵盖天然存在的蛋白以及重组或合成产生的蛋白。

如本文所用，基本上纯化的多肽是指基本上不含与其天然缔合的其他蛋白、脂质、碳水化合物或其他材料的多肽。在一个实施方式中，该多肽至少50％，例如至少80％，不含与其天然缔合的其他蛋白、脂质、碳水化合物或其他材料。在另一实施方式中，该多肽至少90％不含与其天然缔合的其他蛋白、脂质、碳水化合物或其他材料。在另一实施方式中，该多肽至少95％不含与其天然缔合的其他蛋白、脂质、碳水化合物或其他材料。

提供功能上相似的氨基酸的保守氨基酸取代表是本领域普通技术人员公知的。以下六组是被认为是彼此的保守取代氨基酸的实例：

1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；

2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；

3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；

4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；

5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、缬氨酸(V)；和

6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。

非保守的氨基酸取代可以由以下方面的变化引起：(a)取代区域中氨基酸主链的结构；(b)氨基酸的电荷或疏水性；(c)大部分氨基酸侧链。通常期望产生最大蛋白特性变化的取代包括：(a)亲水性残基取代为(或被取代为)疏水性残基；(b)脯氨酸取代为(或被取代为)其他任何残基；(c)具有大侧链的残基(例如苯丙氨酸)取代为(或被取代为)没有侧链的残基(例如甘氨酸)；或(d)具有带正电侧链的残基(例如赖氨酰基、精氨酰基或组胺基)取代为(或被取代为)带负电残基(例如谷氨酰基或天冬氨酰)。

变体氨基酸序列可以例如与天然氨基酸序列具有80、90或甚至95或98％的同一性。确定百分比同一性的程序和算法可见NCBI网站。

预汇合：其中被细胞覆盖的培养物表面的比例约为60-80％的细胞培养物。在一个实施方式中，预汇合是指其中约70％的培养物表面被细胞覆盖的培养物。

产前：在出生前存在或发生。同样，“产后”是在出生后存在或发生。

重组：重组核酸或多肽分子是具有非天然存在的序列或具有由两个原本分离的序列片段的人工组合制成的序列的重组核酸或多肽分子。可以通过化学合成多肽或核酸分子，或通过人工操作核酸分子的分离片段，例如通过基因工程技术，来实现这种人工组合。

视网膜色素上皮(RPE)细胞：RPE细胞可以基于色素沉着、上皮形态和顶端-基底极化细胞识别。RPE细胞在mRNA和蛋白水平上表达以下一种或更多种：Pax6、MITF、RPE65、CRALBP、PEDF、Bestrophin和/或Otx2。在某些其他实施方式中，RPE细胞在mRNA和蛋白水平上表达Pax-6、MitF和酪氨酸酶中的一种或更多种。RPE细胞不表达(在任何可检测的水平上)胚胎干细胞标志物Oct-4、nanog或Rex-1。具体地，当通过定量RT-PCR评估时，这些基因在RPE细胞中的表达比在ES细胞或iPSC中低约100-1000倍。分化的RPE细胞还可以通过其鹅卵石形态和色素的初始外观在视觉上识别。此外，分化的RPE细胞具有跨单层的跨上皮电阻/TER和跨上皮电位/TEP(TER>100ohms.cm

“成熟的”RPE细胞在本文中是指具有未成熟的RPE标志物(例如Pax6)的表达下调和具有成熟的RPE标志物(例如RPE65)的表达上调的RPE细胞。

RPE细胞“成熟”在本文中是指通过其调节RPE发育途径以产生成熟的RPE细胞的过程。例如，纤毛功能的调节可导致RPE成熟。本文中的“视网膜谱系细胞”是指可以产生或分化为RPE细胞的细胞。

视网膜色素上皮：哺乳动物体内存在的六角形细胞的色素层，位于附着于下面脉络膜的神经感觉性视网膜的外面。这些细胞密布着色素颗粒，遮挡视网膜免受入射光的影响。视网膜色素上皮还可以作为限制转运因子，通过提供小分子(例如氨基酸、抗坏血酸和D-葡萄糖)来维持视网膜环境，同时保持对脉络膜血源性物质的紧密屏障。

分泌型卷曲蛋白相关蛋白(sFRP)：sFRP蛋白家族为约32-40kDa糖蛋白，被识别为Wnt信号的拮抗剂(Rattner et al.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:2859-63；Melkonyan et al.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:13636-41；Finch et al.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:6770-5；Uren et al.(2000)J.Biol.Chem.275:4374-82；Kawano et al.(2003)J.Cell.Sci.116:2627-34)。在哺乳动物中，有五个sFRP。2013年1月1日可获得人sFRP包括sFRP1(

sFRP包含三个结构单元：氨基末端信号肽，卷曲蛋白型富含半胱氨酸的结构域(CRD)和羧基末端netrin(NTR)结构域。CRD跨约120个氨基酸，包含10个保守半胱氨酸残基，并且与Fzd受体的CRD具有30-50％的序列相似性。Netrin结构域由六个半胱氨酸残基以及疏水性残基的几个保守区段和二级结构定义。sFRP的生物学活性很大程度上归因于它们作为Wnt功能的调节剂。

音猬因子(Sonic hedgehog,SHH)：音猬因子(SHH)是果蝇刺猬信号传导分子的三个哺乳动物同系物之一，并在发育中的胚的脊索和底板中高水平表达。已知SHH在神经元管模式(Echerlard et al.,Cell 75:1417-30,1993)、四肢、腹节、肺和皮肤的发育中起关键作用。此外，已经在基底细胞癌中发现了SHH过表达。SHH的示例性氨基酸序列在美国专利号6,277,820中阐述。人Sonic的示例性序列如GENBANK登录号NG_007504.1(2013年1月1日)所示，其通过引用并入本文。

受试者：接受治疗、观察或实验的动物或人。

超级供体：对于某些I类和II类MHC基因纯合的个体。这些纯合的个体可以用作超级供体，并且它们的细胞，包括构成其细胞的组织和其他材料，可以被移植到对于该单倍型是纯合的或杂合的个体中。超级供体对于HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DR、HLA-DP或HLA-DQ基因座/基因座等位基因可以分别是纯合的。

组织置换植入物：一种生物相容的结构，包括体外产生的基质和细胞，可用于体内置换组织。

全能性的或全能性：细胞体内分裂并最终产生整个生物体(包括所有胚外组织)的能力。在一个方面，术语“全能性的”是指细胞在体外通过一系列分裂进入胚泡的能力。胚泡包含内细胞团(ICM)和滋养外胚层。在ICM中发现的细胞产生多能干细胞(PSC)，这些干细胞具有无限增殖能力，或者如果被正确诱导，可以在构成生物体的所有细胞类型中分化。滋养外胚层细胞产生胚外组织，包括胎盘和羊膜。

治疗：可治愈、减慢、减轻已诊断病理状况或病症的症状和/或阻止其进展的治疗措施。在某些实施方式中，治疗患有视网膜病症的受试者导致视网膜恶化降低；视网膜色素上皮细胞数量增加、视力改善或多种效应组合。

酪氨酸酶：含铜的氧化酶，可通过氧化作用催化酪氨酸生成黑色素和其他色素。该酶是控制黑色素产生的限速酶。酪氨酸酶作用于单酚的羟基化以及邻二酚向相应邻醌的转化。邻醌经历数个反应，最终形成黑色素。在人中，酪氨酸酶由TYR基因编码。示例性氨基酸和核酸序列如

未分化的：显示未分化的细胞特征标志物和形态特征的细胞，将它们与胚胎或成体来源的分化细胞区分开。因此，在一些实施方式中，未分化的细胞不表达细胞谱系特异性标记，包括但不限于RPE标志物。

载体：被引入宿主细胞中的核酸分子，从而产生转化的宿主细胞。载体可以包括允许其在宿主细胞中复制的核酸序列，例如复制起点。载体还可以包括一个或更多个选择标志物基因和本领域已知的其他遗传元件。载体还可以包括编码有助于分离预期蛋白产物的氨基酸基序的序列，例如编码麦芽糖结合蛋白、c-myc或GST的序列。

Wnt：高度保守的分泌信号分子家族，调节细胞间相互作用，并与果蝇节段极性基因(无翅基因(wingless))相关。在人中，Wnt基因家族编码38至43kDa的富含半胱氨酸的糖蛋白。Wnt蛋白具有疏水信号序列，保守的天冬酰胺连接的寡糖共有序列(参见，例如，Shimizu et al Cell Growth Differ 8:1349-1358(1997))和22个保守的半胱氨酸残基。由于Wnt蛋白具有促进细胞质β-连环蛋白稳定的能力，因此它们可以充当转录激活因子并抑制细胞凋亡。已经显示特定Wnt蛋白的过表达与某些癌症有关。

Wnt家族包含至少19个哺乳动物成员。示例性Wnt蛋白包括Wnt-1、Wnt-2、Wnt2b、Wnt-3、Wnt-3a、Wnt-4、Wnt-5a、Wnt5b、Wnt-6、Wnt-7a、Wnt-7b、Wnt-8a、Wnt-8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt-10b、Wnt-11和Wnt 16。这些分泌的配体激活至少三种不同的信号传导通路。在经典的(或Wnt/β-连环蛋白)Wnt信号通路中，Wnt激活由卷曲蛋白(Fzd)受体家族成员和低密度脂蛋白(LDL)受体相关蛋白5或6(LRP5/6)组成的受体复合物。为了形成结合Fzd配体的受体复合物，Fzd受体与LRP5/6(具有四个细胞外EGF样结构域(由六个YWTD氨基酸重复序列隔开)的单次跨膜蛋白)相互作用(Johnson et al.,2004,J.Bone Mineral Res.19:1749)。受体结合后激活的经典Wnt信号通路由与Fzd受体直接相互作用的细胞质蛋白Disheveled(Dvl)介导，并导致β-连环蛋白的细胞质稳定和累积。在不存在Wnt信号的情况下，β-连环蛋白定位于细胞质破坏复合体，该复合体包括肿瘤抑制蛋白腺瘤性息肉病大肠杆菌(APC)和Axin。这些蛋白起关键支架的作用，允许糖原合酶激酶(GSK)-3β结合并磷酸化β-连环蛋白，从而标记其以通泛素/蛋白酶体通路降解。Dvl的激活导致该破坏复合体解离。然后，累积的细胞质β-连环蛋白被转运到细胞核中，其中它与TCF/LEF家族的DNA结合蛋白相互作用以激活转录。

非典型WNT通路受其中三个WNT配体(WNT4、WNT5a和WNT11)的调控。这些配体在不存在共受体(LRP5/6)的情况下与WNT受体卷曲蛋白结合。这导致RHO GTPase和ROCK激酶的激活而不激活细胞质的β-连环蛋白。ROCK调节细胞骨架以调节细胞的顶端-极低极化。由于竞争同一个受体，非典型WNT配体也导致典型WNT信号传导的抑制。

Xeno-Free(XF)：提及培养基、细胞外基质或培养条件时，是指基本上不含异源动物衍生成分的培养基、细胞外基质或培养条件。为了培养人细胞，非人动物(例如小鼠)的任何蛋白都是异种成分。在某些方面，Xeno-free基质可基本上不含任何非人动物来源的成分，因此不包括小鼠饲养细胞或MATRIGEL

除非另有说明，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。除非上下文另有明确规定，否则单数术语“a”、“an”和“the”包括复数指示物。类似地，除非上下文另有明确规定，否则单词“或”旨在包括“和”。还应理解，针对核酸或多肽给出的所有碱基大小或氨基酸大小以及所有分子量或分子量值均为近似值，并提供用于描述。尽管与本文描述的那些类似或等同的方法和材料可以用于本公开的实践或检测中，但是在下面描述了合适的方法和材料。术语“包括”是指“包含”。除非另有说明，否则“约”表示不超过5％。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用以其全文并入本文。在发生冲突的情况下，以本说明书(包括术语解释)为准。另外，材料、方法和实施例仅是说明性的，并不旨在限制。

组织置换植入物和产生方法

视网膜中对光直接敏感的细胞是感光细胞。感光细胞是视网膜外部的感光神经元，可以呈棒状或圆锥状。在光转导过程中，感光细胞将由晶状体聚焦的入射光能转换为电信号，然后通过视神经发送到大脑。脊椎动物具有两种类型的感光细胞，包括视锥和视杆。视锥适应于检测精细详情、中心和彩色视觉，并在明亮的光线下能很好地发挥作用。视杆负责周围和昏暗的灯光视觉。来自视杆和视锥的神经信号受到视网膜其他神经元的加工。

视网膜色素上皮充当血液和视网膜之间的屏障，并在维持视觉功能时与感光细胞紧密相互作用。视网膜色素上皮由单层六角形细胞组成，这些细胞密密地堆积有黑色素颗粒，黑色素颗粒吸收到达视网膜的光能。特化RPE细胞的主要功能包括：从血液向感光细胞转运营养物(例如葡萄糖、视黄醇和脂肪酸)；将水，代谢终产物和离子从视网膜下间隙运输到血液；吸收光并防止光氧化；全反式视黄醇再异构化成11-顺式-视黄醛；脱落的感光膜的吞噬作用；并分泌出各种重要的视网膜结构完整性因子。

RPE细胞的功能障碍、损伤和缺失是许多眼部疾病和病症的因素，包括年龄相关性黄斑变性(AMD)和遗传性黄斑变性，例如Best病和色素性视网膜炎。其他疾病如下所述。视网膜损害(例如由于物理性损伤)也需要治疗。本文公开了包括RPE细胞的组织置换植入物，其可以局部引入需要治疗的人的眼睛中。组织置换植入物可改善视网膜功能，并防止由这种病况引起的失明。

在一些实施例中，公开了包括RPE细胞的组织置换植入物以及产生这些组织植入物的方法。这些组织置换植入物可用于治疗受试者的视网膜变性疾病、视网膜或视网膜色素上皮功能障碍、视网膜退化、视网膜损害、或视网膜色素上皮缺失。这些RPE细胞可以例如使用在PCT公开号WO2014/121077和PCT公开号WO 2017/044483中公开的方法产生，其均通过引用并入本文。

在一些实施方式中，RPE细胞对于正在使用组织植入物治疗的受试者是自体的。自体细胞包括来自同一受试者的经修饰的细胞，例如以修正目的基因突变、表达异源蛋白或使突变基因的表达沉默。在其他实施方式中，RPE细胞与使用组织植入物治疗的受试者是同种异体的。在一些非限制性实例中，RPE细胞与使用组织植入物治疗的受试者MHC匹配。RPE细胞可以源自单个受试者或源自多个受试者，例如2、3、4或5个受试者。在进一步的实施方式中，RPE细胞由多能干细胞产生。公开了组织植入物和用于产生包括RPE细胞的组织置换植入物的方法。

A.多能干细胞

1.胚胎干细胞

ES细胞源自胚泡的内细胞团，并且具有高体外分化能力。可以通过除去发育中的胚胎的外滋养胚层来分离ES细胞，然后在无生长细胞的饲养层上培养内部大细胞。被复盖的细胞可以继续增殖并产生新的ES细胞集落，其可以被去除、分离、再接种(replated)并使其生长。可以多次重复这种“传代培养”未分化的ES细胞的过程，以产生含有未分化的ES细胞的细胞系(美国专利号5,843,780；6,200,806；7,029,913)。ES细胞具有在保持其多能性的同时具有增殖的潜力。例如，ES细胞可用于研究细胞和控制细胞分化的基因。ES细胞的多能性与基因操作和选择相结合，可通过生成转基因、嵌合和敲除小鼠用于体内基因分析研究。

产生小鼠ES细胞的方法是公知的。在一种方法中，来自129个小鼠品系的植入前胚泡经小鼠抗血清处理以去除滋养外胚层，并且在包含胎牛血清的培养基中将内细胞团培养在化学灭活的小鼠胚胎成纤维细胞的饲养细胞层上。在胎牛血清存在下，将发育中的未分化ES细胞集落在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上传代培养，以产生ES细胞群。在一些方法中，可以通过在含血清的培养基中添加细胞因子白血病抑制因子(LIF)，在不存在饲养层的情况下培养小鼠ES细胞(Smith，2000)。在其他方法中，小鼠ES细胞可以在骨形态发生蛋白和LIF存在的条件下在无血清培养基中生长(Ying et al.,2003)。

人ES细胞可以产生或衍生自受精卵或通过精子与卵细胞融合产生的胚泡阶段的哺乳动物胚胎、核移植、发病机理、或通过之前描述的方法(Thomson and Marshall,1998；Reubinoff et al.,2000)让染色质重编程并将重编程的染色质掺入质膜中来产生胚胎细胞。在一种方法中，将人胚泡暴露于抗人血清中，并从内细胞团中溶解并去除滋养外胚层细胞，该内细胞团培养在小鼠胚胎成纤维细胞的饲养层上。此外，将来自内细胞团的细胞团化学或机械解离，再沉淀，并通过微量移液器选择具有未分化形态的集落、解离并再沉淀(美国专利号6,833,269)。在一些方法中，可以通过在碱性成纤维细胞生长因子存在下在成纤维细胞的饲养层上培养ES细胞来使人ES细胞在无血清的情况下生长(Amit et al.,2000)。在其他方法中，可以通过在含有碱性成纤维细胞生长因子的“条件”培养基的存在下，在例如

ES细胞还可以通过先前描述的方法(Thomson,and Marshall,1998；Thomson etal.,1995；Thomson and Odorico,2000)衍生自其他生物，包括恒河猴和狨猴，以及已建立的小鼠和人细胞系。例如，已建立的人ES细胞系包括MAOI、MA09、ACT-4、HI、H7、H9、H13、H14和ACT30。作为进一步的实例，已经建立的小鼠ES细胞系包括由小鼠品系129胚胎的内细胞团建立的CGR8细胞系，并且CGR8细胞的培养物可以在无饲养层的LIF存在下生长。

ES干细胞可通过蛋白标志物(包括转录因子Oct4、碱性磷酸酶(AP)、阶段特异性胚胎抗原SSEA-1、阶段特异性胚胎抗原SSEA-3、阶段特异性胚胎抗原SSEA-4、转录因子NANOG、肿瘤排斥抗原1-60(TRA-1-60)、肿瘤排斥抗原1-81(TRA-1-81)、SOX2或REX1)检测。

a.体细胞核移植

多能干细胞可以通过体细胞核移植的方法制备。体细胞核移植涉及将供体核转移到无纺锤体的卵母细胞中。在一种方法中，通过电融合将来自灵长类动物的皮肤成纤维细胞的供体成纤维细胞核引入到无纺锤体，成熟的中期II灵长类动物卵母细胞的细胞质中(Byrne et al.,2007)。通过暴露于离子霉素激活融合的卵母细胞，然后孵育直至胚泡阶段。然后培养选定的胚泡的内细胞团，以产生胚胎干细胞系。胚胎干细胞系显示正常的ES细胞形态，表达各种ES细胞标志物，并在体外和体内分化为多种细胞类型。

2.诱导性多能干细胞

多能性的诱导最初是在2006年使用小鼠细胞(Yamanaka et al.2006)和2007年使用人细胞(Yu et al.2007；Takahashi et al.2007)通过引入与多能性有关的转录因子对体细胞进行重编程而实现的。多能干细胞可以保持未分化状态，并且能够分化为几乎任何细胞类型。iPSC的使用规避了与ES细胞大规模临床使用相关的大多数伦理和实践问题，并且带有iPSC衍生的自体移植物的患者可能不需要终生免疫抑制治疗以防止移植物排斥。

除生殖细胞外，任何细胞均可用作iPSC的起点。例如，细胞类型可以是角质形成细胞、成纤维细胞、造血细胞、间充质细胞、肝细胞或胃细胞。细胞可以是多能细胞，例如但不限于造血干细胞，例如但不限于CD34+细胞。T细胞还可以用作体细胞的来源用于重编程(美国专利号8,741,648)。对细胞分化的程度或采集细胞的动物的年龄没有限制；在本文公开的方法中，甚至未分化的祖细胞(包括体干细胞)和最终分化的成熟细胞也可以用作体细胞的来源。在一个实施方式中，体细胞本身是RPE细胞，例如人RPE细胞。RPE细胞可以是成年或胎儿的RPE细胞。iPSC可以在已知可将人ES细胞分化为特定细胞类型并且表达人ES细胞标志物(包括：SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81)的条件下生长。

体细胞和多能干细胞，例如CD34+细胞，可以使用本领域技术人员已知的方法重编程以产生诱导性多能干细胞(iPSC)。本领域技术人员可以容易地产生诱导性多能干细胞，例如参见，公开的美国专利申请号20090246875、公开的美国专利申请号2010/0210014；公开的美国专利申请号20120276636；美国专利号8,058,065；美国专利号8,129,187；美国专利号8,278,620；PCT公开号WO 2007/069666 A1和美国专利号8,268,620，其通过引用并入本文。通常，核重编程因子用于从体细胞产生多能干细胞。在一些实施方式中，使用Klf4、c-Myc、Oct3/4、Sox2、Nanog和Lin28中的至少三个或至少四个。在其他实施方式中，使用Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4。

细胞经核重编程物质处理，该核重编程物质通常是一种或更多种能够从体细胞诱导iPSC的因子或编码这些物质的核酸(包括整合在载体中的形式)。核重编程物质通常包括至少Oct3/4、Klf4和Sox2或编码这些分子的核酸。p53的功能抑制剂、L-myc或编码L-myc的核酸以及Lin28或Lin28b或者编码Lin28或Lin28b的核酸可以用作其他核重编程物质。Nanog也可用于核重编程。如公开的美国专利申请号20120196360中所公开的，用于产生iPSC的示例性重编程因子包括(1)Oct3/4、Klf4、Sox2、L-Myc(Sox2可以替换为Soxl、Sox3、Soxl5、Soxl7或Soxl8；Klf4可替换为Klfl、Klf2或Klf5)；(2)Oct3/4、Klf4、Sox2、L-Myc、TERT、SV40大T抗原(SV40LT)；(3)Oct3/4、Klf4、Sox2、L-Myc、TERT、人乳头瘤病毒(HPV)16E6；(4)Oct3/4、Klf4、Sox2、L-Myc、TERT、HPV16 E7(5)Oct3/4、Klf4、Sox2、L-Myc、TERT、HPV16 E6、HPV16 E7；(6)Oct3/4、Klf4、Sox2、L-Myc、TERT、Bmil；(7)Oct3/4、Klf4、Sox2、L-Myc、Lin28；(8)Oct3/4、Klf4、Sox2、L-Myc、Lin28、SV40LT；(9)Oct3/4、Klf4、Sox2、L-Myc、Lin28、TERT、SV40LT；(10)Oct3/4、Klf4、Sox2、L-Myc、SV40LT；(11)Oct3/4、Esrrb、Sox2、L-Myc(Esrrb替换为Esrrg)；(12)Oct3/4、Klf4、Sox2；(13)Oct3/4、Klf4、Sox2、TERT、SV40LT；(14)Oct3/4、Klf4、Sox2、TERT、HP VI 6E6；(15)Oct3/4、Klf4、Sox2、TERT、HPV16 E7；(16)Oct3/4、Klf4、Sox2、TERT、HPV16 E6、HPV16 E7；(17)Oct3/4、Klf4、Sox2、TERT、Bmil；(18)Oct3/4、Klf4、Sox2、Lin28(19)Oct3/4、Klf4、Sox2、Lin28、SV40LT；(20)Oct3/4、Klf4、Sox2、Lin28、TERT、SV40LT；(21)Oct3/4、Klf4、Sox2、SV40LT；或(22)Oct3/4、Esrrb、Sox2(Esrrb可替换为Esrrg)。在一个非限制性实例中，使用Oct3/4、Klf4、Sox2和c-Myc。在其他实施方式中，使用Oct4、Nanog和Sox2，参见例如美国专利号7,682,828，其通过引用并入本文。这些因子包括但不限于Oct3/4、Klf4和Sox2。在其他实例中，这些因子包括但不限于Oct 3/4、Klf4和Myc。在一些非限制性实例中，使用Oct3/4、Klf4、c-Myc和Sox2。在其他非限制性实例中，使用Oct3/4、Klf4、Sox2和Sal 4。因子(例如Nanog、Lin28、Klf4或c-Myc)可以提高重编程效率，并且可以从几种不同的表达载体表达。例如，可以使用整合载体，例如基于EBV元件的系统(美国专利号8,546,140)。在另一方面，可以通过蛋白转导将重编程蛋白直接引入体细胞。重编程可以进一步包括使细胞与一种或更多种信号传导受体(包括糖原合酶激酶3(GSK-3)抑制剂、丝裂原活化蛋白激酶(MEK)抑制剂、转化生长因子β(TGF-β)受体或信号传导抑制剂、白血病抑制因子(LIF)、p53抑制剂、NF-κB抑制剂或其组合)接触。这些调节剂可以包括小分子、抑制性核苷酸、表达盒或蛋白因子。预期实际上可以使用任何iPS细胞或细胞系。

这些核重编程物质的小鼠和人cDNA序列可参考WO 2007/069666中提及的NCBI登录号获得，其通过引用并入本文。引入一种或更多种重编程物质或编码这些重编程物质的核酸的方法是本领域已知的，并且例如如公开的美国专利申请号2012/0196360和美国专利号8,071,369中所公开的，二者均通过引用并入本文。

衍生后，iPSC可以在足以维持多能性的培养基中培养。iPSC可以与多种培养基和技术一起使用，以培养多能干细胞，更具体地，胚胎干细胞，如美国专利号7,442,548和美国专利公开号2003/0211603中所述。在小鼠细胞的情况下，通过在普通培养基中添加白血病抑制因子(LIF)作为分化抑制因子进行培养。在人细胞的情况下，预期添加碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)替代LIF。如本领域技术人员已知的，可以使用用于培养和维持iPSC的其他方法。

在某些实施方式中，可以使用未确定的条件；例如多能细胞可以在成纤维细胞饲养细胞上或已经暴露于成纤维细胞饲养细胞的培养基中培养，以使干细胞保持未分化状态。在一些实施方式中，细胞在与小鼠胚胎成纤维细胞共存的情况下培养，该小鼠胚胎成纤维细胞经放射线或抗生素处理以终止细胞分裂而作为饲养细胞。可选地，可以使用确定的、饲养细胞非依赖的培养系统，例如TESR

在一些实施方式中，iPSC可经修饰，例如以表达外源基因、增加内源基因的表达、增加基因的拷贝数、修正基因突变或使突变基因的表达沉默。在一些特定的非限制性实例中，内源基因中的突变或缺失被修正。该基因可以编码，例如，类维生素A异构水合酶(RPE65)、Bestrophin(BEST)1、MER酪氨酸激酶原癌基因(MERTK)、RAB护送蛋白(REP1)、细胞视网膜色素结合蛋白(CRALBP)、mRNA前加工因子(PPRF)、补体因子H(CFH)、细胞视网膜色素结合蛋白(CRALBP)、mRNA前加工因子(PPRF)、补体因子H(CFH)、补体成分3a受体(C3aR)1、补体成分5受体(C5aR1)、血管内皮生长因子(VEGF)、色素上皮衍生因子(PEDF)、补体因子I(CFI)、补体因子2B(C2B)、ATP结合盒，亚家族A，成员4(ABCA4)、ATP结合盒，亚家族A，成员1(ABCA1)、膜型卷曲相关蛋白(MFRP)、C1q和肿瘤坏死因子相关蛋白5(C1qTNF5)、精子发生相关蛋白7(SPATA7)、中心体蛋白，290kd(CEP290)、肌球蛋白VIIA(MYO7A)、睫状神经营养因子(CNTF)、FMS相关酪氨酸激酶1(FLT-1)、Usher综合征I型(USH1A)、酪氨酸酶、纤溶酶原(PLG)、胶原蛋白，XVIII型，α-1(COL18A1)、TTRA丝氨酸肽酶(HTRA)1、ARMS2、金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)3、包含类纤维蛋白样细胞外基质蛋白(EFEMP)1的上皮生长因子(EGF)、小眼症相关转录因子(MITF)、转录因子EC(TFEC)、正小齿果蝇同源物2(OTX2)、锌指蛋白503(ZNF503或NLZ2)。在一个非限制性实例中，该基因是RPE65。在另一非限制性实例中，该基因是BEST1。在又一非限制性实例中，该基因编码METRK。在iPSC中进行基因编辑的方法公开于例如Hockenmeyer and Jaenisch,“Induced Pluripotent Stem Cell Meets GenomeEditing,”Cell Stem Cell 18:573-586,2016，其通过引用并入本文。其中公开的任何方法均可用。该方法可以包括使用病毒载体，例如腺相关病毒载体或终止目的转基因的慢病毒载体。该方法可以包括使用CRISPR/Cas9、TALEN核酸酶、锌指核酸酶、慢病毒介导的修正、腺相关病毒介导的修正、shRNA、siRNA或F-prime编辑。

在一些实施方式中，可以修饰iPSC以表达外源核酸，例如包括可操作地连接至启动子的酪氨酸酶增强子和编码第一标志物的核酸序列。酪氨酸酶基因例如2013年1月1日可获得的

设计质粒时要考虑许多目标，例如达到调节的高拷贝数并避免细菌中质粒不稳定的潜在原因，并提供与哺乳动物细胞(包括人细胞)相容的质粒选择方法。对于在人细胞中使用的质粒有双重要求。首先，它们适合在大肠杆菌中进行维持和发酵，使得可以生产和纯化大量DNA。其次，它们具有安全性并且适合用于人患者和动物。第一个要求需要高拷贝数的质粒，该质粒可以为此而选择并且在细菌发酵过程中稳定地相对容易地维持。第二个要求需要注意例如可选择的标志物和其他编码序列的要素。在一些实施方式中，编码标志物的质粒由以下组成：(1)高拷贝数复制起点，(2)可选择的标志物，例如但不限于用卡那霉素进行抗生素选择的neo基因，(3)转录终止序列，包括酪氨酸酶增强子和(4)用于掺入各种核酸盒的多克隆位点；和(5)编码与酪氨酸酶启动子可操作地连接的标志物的核酸序列。有许多本领域已知用于诱导编码蛋白的核酸的质粒载体。这些包括但不限于美国专利号6,103,470；美国专利号7,598,364；美国专利号7,989,425；和美国专利号6,416,998中公开的载体，其通过引用并入本文。

病毒基因递送系统可以是基于RNA或基于DNA的病毒载体。附加体基因递送系统可以是质粒、基于Epstein-Barr病毒(EBV)的附加体载体、基于酵母的载体、基于腺病毒的载体、基于猿猴病毒40(SV40)的附加体载体、基于牛乳头瘤病毒(BPV)的载体或慢病毒载体。

在一些实施方式中，用编码标志物的核酸分子转染细胞。标志物包括但不限于荧光蛋白(例如，绿色荧光蛋白或红色荧光蛋白)、酶(例如，辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶或萤火虫/海肾荧光素酶或nanoluc)或其他蛋白。标志物可以是蛋白(包括分泌的、细胞表面或内部蛋白；可以是细胞合成的或由细胞吸收的)；核酸(例如mRNA，或具有酶活性的核酸分子)或多糖。包括可通过抗体、凝集素、探针或核酸扩增反应检测到的任何此类细胞成分的决定子，这些决定子对目标细胞类型的标志物具有特异性。还可通过依赖于基因产物功能的生化或酶测定或生物反应来识别标志物。可以将编码这些标志物的核酸序列可操作地连接至酪氨酸酶增强子。另外，可以包括其他基因，例如可能影响干细胞向RPE分化或RPE功能或生理学或病理学的基因。因此，在一些实施方式中，包括编码MITF、PAX6、TFEC、OTX2、LHX2、VMD2、CFTR、RPE65、MFRP、CTRP5、CFH、C3、C2B、APOE、APOB、mTOR、FOXO、AMPK、SIRT1-6、HTRP1、ABCA4、TIMP3、VEGFA、CFI、TLR3、TLR4、APP、CD46、BACE1、ELOLV4、ADAM 10、CD55、CD59和ARMS中的一种或更多中的核酸。

a.MHC单倍型匹配

主要组织相容性复合物是异体器官移植免疫排斥的主要原因。有三种主要的I类MHC单倍型(A、B和C)和三种主要的MHC II类单倍型(DR、DP和DQ)。HLA基因座具有高度多态性，在6号染色体上分布超过4Mb。在该区域内单倍型HLA基因的能力在临床上很重要，因为该区域与自身免疫和感染性疾病有关，并且HLA单倍型在供体和受体之间的相容性影响移植的临床结果。对应于I类MHC的HLA从细胞内部呈递肽，对应于II类MHC的HLA从细胞外部向T淋巴细胞呈递抗原。移植物和宿主之间MHC单倍型的不相容性引发针对移植物的免疫应答，并导致其排斥。因此，可以用免疫抑制剂治疗受试者以防止排斥。HLA匹配的干细胞系可以克服免疫排斥的风险。

由于HLA在移植中的重要性，通常通过血清学和PCR对HLA基因座进行分型，以识别有利的供体-受体对。HLA I类和II类抗原的血清学检测可以使用纯化的T或B淋巴细胞进行补体介导的淋巴细胞毒性试验来完成。此过程主要用于匹配HLA-A和-B基因座。基于分子的组织分型通常比血清学检测更准确。低分辨率分子方法(例如SSOP(序列特异性寡核苷酸探针)方法)可用于识别HLA抗原，其中SSPCR(一系列特异性寡核苷酸探针)针对一系列寡核苷酸探针进行检测，目前，这些方法是用于II-HLA类分型的最常用方法。利用等位基因特异性引物进行PCR扩增的高分辨率技术(例如SSP(序列特异性引物)方法)可以识别特定的MHC等位基因。

如果供体细胞是HLA纯合的，即每个抗原递呈蛋白包含相同的等位基因，则供体和受体之间的MHC相容性将显著提高。大多数个体对于MHC I类和II类基因是杂合的，但是某些个体对于这些基因是纯合的。这些纯合的个体可以充当超级供体，并且可以将从其细胞产生的移植物移植到该单倍型的纯合或杂合的所有个体中。此外，如果纯合子供体细胞具有在人群中高频率发现的单倍型，则这些细胞可能在大量个体的移植治疗中得到应用。

因此，可以从待治疗的受试者或具有与患者相同或基本相同的HLA类型的另一受试者的细胞(例如CD34+细胞)产生iPSC。在一种情况下，供者的主要HLA(例如HLA-A、HLA-B和HLA-DR的三个主要基因座)与受体的主要HLA相同。在一些情况下，体细胞供体可能是超级供体。因此，源自MHC纯合超级供体的iPSC可用于产生RPE细胞。因此，可以将源自超级供体的iPSC移植到对于该单倍型为纯合子或杂合子的受试者中。例如，iPSC在两个HLA等位基因(例如HLA-A和HLA-B)上可以是纯合的。如此，由超级供体产生的iPSC可以用于本文公开的方法中，以产生可以潜在地“匹配”大量潜在受体的RPE细胞。

b.附加体载体

在某些方面，重编程因子从包含在一种或更多种外源性附加体遗传基因元件中的表达盒表达(参见美国专利公开2010/0003757，其通过引用并入本文)。因此，iPSC可以基本上不含外源遗传元件，例如来自逆转录病毒或慢病毒载体元件。这些iPSC通过使用染色体外复制载体(即附加体载体)制备，该载体是能够附加地复制以产生基本上不含外源载体或病毒元件的iPSC的载体，(参见美国专利号8,546,140，其通过引用并入本文；Yu et al.,2009)。许多DNA病毒，例如腺病毒、猿猴病毒40(SV40)或牛乳头瘤病毒(BPV)、或含芽孢酵母ARS(自主复制序列)的质粒，均在哺乳动物细胞中染色体外或附加地复制。这些附加体质粒本质上没有与整合性载体有关的所有这些缺点(Bode et al.,2001)。例如，如上文所定义的基于淋巴营养性疱疹病毒或Epstein Barr病毒(EBV)可在染色体外复制并有助于将重编程基因递送至体细胞。有用的EBV元件是OriP和EBNA-1，或其变体或功能等效物。附加体载体的另一个优点是，外源元件在引入细胞后将随着时间而丢失，从而导致自我维持的iPSC基本不含这些元件。

其他染色体外载体包括其他基于淋巴细胞营养性疱疹病毒的载体。淋巴营养性疱疹病毒是在淋巴母细胞(例如人B淋巴母细胞)中复制并成为其自然生命周期一部分的质粒的疱疹病毒。单纯疱疹病毒(HSV)不是“淋巴营养性”疱疹病毒。示例性淋巴营养性疱疹病毒包括但不限于EBV、Kaposi肉瘤疱疹病毒(KSHV)；疱疹病毒saimiri(HS)和马Marek病病毒(MDV)。考虑基于附加体的载体的其他来源，例如酵母ARS、腺病毒、SV40或BPV。

B视网膜色素上皮细胞

在公开的组织植入物中使用RPE细胞。在一些实施方式中，细胞可以从干细胞产生，例如ESC或iPSC。

视网膜色素上皮表达标志物，例如细胞视黄醛结合蛋白(CRALBP)、RPE65、best玻璃状黄斑营养不良基因(VMD2)和色素上皮衍生因子(PEDF)。视网膜色素上皮的功能异常与多种视觉改变病况有关，例如视网膜色素上皮脱离、发育不良、萎缩、视网膜病变、色素性视网膜炎、黄斑营养不良或变性。

视网膜色素上皮细胞(RPE)可以根据其色素沉着、上皮形态和顶端-基底极性进行表征。分化的RPE细胞可以通过它们的鹅卵石形态和色素的初始外观在视觉上识别。此外，分化的RPE细胞具有跨单层的跨上皮电阻/TER和跨上皮电位/TEP(TER>200Oms*cm

RPE细胞表达几种蛋白，这些蛋白可以作为标志物通过使用例如免疫细胞化学、Western印迹分析、流式细胞术和酶联免疫分析(ELISA)等方法进行检测。例如，RPE特异性标志物可以包括：细胞视黄醛结合蛋白(CRALBP)、小眼症相关转录因子(MITF)、酪氨酸酶相关蛋白1(TYRP-1)、视网膜色素上皮特异性65kDa蛋白(RPE65)、黑素体前体蛋白(PMEL17)、Bestrophin 1(BEST1)和c-mer原癌基因酪氨酸激酶(MERTK)。RPE细胞不表达(在任何可检测的水平)胚胎干细胞标志物Oct-4、nanog或Rex-2。具体地，当通过定量RT-PCR评估时，这些基因在RPE细胞中的表达比在ES细胞或iPSC中低约100-1000倍。

可以在mRNA水平上检测RPE细胞标志物，例如通过逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)、Northern印迹分析或点印迹杂交分析，使用标准扩增方法中的序列特异性引物，使用公开可获得的序列数据

以下公开了用于从iPSC和ESC产生RPE的示例性方法。本节末尾公开了可在培养基中使用的抑制剂的说明。应该注意的是，任何特定的抑制剂都可以使用其中的参考类别的抑制剂。

1.从PSC的胚状体衍生RPE细胞

可以使用公知的重编程因子重编程iPSC，例如但不限于从CD34+细胞产生iPSC，以产生RPE细胞。PCT公开号2014/121077(其通过引用以其全文并入本文)公开了方法，其中在悬浮培养物中用Wnt和Nodal拮抗剂处理从iPSC产生的胚状体(EB)，以诱导视网膜祖细胞标志物表达。该出版物公开了通过iPSC的EB分化为高度富含RPE细胞的培养物的过程，从iPSC衍生RPE细胞的方法。例如，通过添加rho相关的卷曲螺旋激酶(ROCK)抑制剂从iPSC产生胚状体，并在包含两种WNT通路抑制剂和Nodal通路抑制剂的第一培养基中培养。此外，将EB接种在第二培养基中的包被

使用EB产生分化的细胞类型有几个缺点。例如，EB的产生是随效率变化的不一致和不可复制的过程。由iPSC或ES细胞产生的EB的大小和形状不均一，并且EBS的产生还涉及限速离心处理。本公开提供了允许大规模产生非依赖于EB的临床、研究或治疗应用所需的iPSC或ES来源的细胞的方法。

2.从基本上单细胞PSC衍生RPE细胞

在一些实施方式中，RPE细胞由多能干细胞(PSC)例如人iPSC的基本上单细胞悬液产生。在一些实施方式中，将PSC培养至预汇合以防止任何细胞聚集。在某些方面，通过与细胞解离酶孵育来解离PSC，例如以TRYPSIN

为了有效地从单细胞PSC分化为RPE细胞，准确计数输入密度可以提高RPE分化效率。因此，通常在接种之前对PSC的单细胞悬液进行计数。例如，通过血细胞计数器或自动细胞计数器(例如

一旦以已知的细胞密度获得了PSC的单细胞悬液，通常将细胞接种在适当的培养容器中，例如组织培养板，例如烧瓶，6孔、24孔或96孔培养皿。用于培养细胞的培养容器可以包括但不特别限于：烧瓶、用于组织培养的烧瓶、培养皿、有盖培养皿、用于组织培养的培养皿、多格培养皿、微型板、微孔板、多功能培养板、多孔板、微量载玻片、室载玻片、试管、托盘、

在某些方面，将PSC(例如iPSC)以适合于有效分化的细胞密度进行铺板。通常，将细胞以约1,000至约75,000个细胞/cm2，例如约5,000至约40,000个细胞/cm2的细胞密度铺板。在6孔板中，可以以每孔约50,000至约400,000个细胞的细胞密度接种细胞。在示例性方法中，以每孔约100,000、约150,00、约200,000、约250,000、约300,000或约350,000个细胞(例如每孔约200,00个细胞)的细胞密度接种细胞。

PSC(例如iPSC)通常在由一种或更多种细胞粘附蛋白包被的培养板上培养，以促进细胞粘附，同时保持细胞活力。例如，优选的细胞粘附蛋白包括细胞外基质蛋白，例如玻连蛋白、层粘连蛋白、胶原蛋白和/或纤连蛋白，它们可用于包被培养表面，从而为多能细胞生长提供固体支持。术语“细胞外基质”是本领域公认的。其成分包括以下一种或更多种蛋白：纤连蛋白、层粘连蛋白、玻连蛋白、腱生蛋白、动蛋白、血小板反应蛋白、弹性蛋白、明胶、胶原蛋白、原纤维蛋白、黑素蛋白、锚蛋白、软骨素、连接蛋白、骨唾液蛋白、骨钙蛋白、骨桥蛋白、表皮连接蛋白、透明质粘连蛋白、粗纤维调节素、表皮整联配体蛋白和kalinin。在示例性方法中，PSC在玻连蛋白或纤连蛋白包被的培养板上生长。在一些实施方式中，细胞粘附蛋白是人蛋白。

细胞外基质(ECM)蛋白可以是天然来源的，并且可以从人或动物组织中纯化得到，可选地，ECM蛋白可以是基因工程化的重组蛋白或天然合成的。ECM蛋白可以是天然蛋白或工程化蛋白的完整蛋白或肽片段形式。在细胞培养基质中有用的ECM蛋白的实例包括层粘连蛋白、胶原I、胶原IV、纤连蛋白和玻连蛋白。在一些实施方式中，基质组合物包括纤连蛋白或重组纤连蛋白的合成产生的肽片段。在一些实施方式中，基质组合物是无异种的。例如，在用于培养人细胞的无异种基质中，可以使用人来源的基质成分，其中可以排除任何非人动物成分。

在一些方面，基质组合物中的总蛋白浓度可以为约1ng/mL至约1mg/mL。在一些优选的实施方式中，基质组合物中的总蛋白浓度为约1μg/mL至约300μg/mL。在更优选的实施方式中，基质组合物中的总蛋白浓度为约5μg/mL至约200μg/mL。

a.培养条件

细胞，例如RPE细胞或PSC，可以与支持每种特定细胞群生长所需的营养物一起培养。通常，细胞在生长培养基(包括碳源、氮源和维持pH的缓冲液)中培养。培养基还可以包含脂肪酸或脂质、氨基酸(例如非必需氨基酸)、维生素、生长因子、细胞因子、抗氧化剂、丙酮酸、缓冲剂和无机盐。示例性生长培养基包含最低基础培养基，例如Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)或ESSENTIAL 8

因此，通常在铺板后在完全确定的培养基中培养单细胞PSC。在某些方面，在接种后约18-24小时，吸出培养基并将新鲜的培养基(例如E8

在一些实施方式中，培养基可以包含血清替代品。血清替代品可以包括适当含有白蛋白的物质(例如富含脂质的白蛋白，白蛋白替代品例如重组白蛋白、植物淀粉、葡聚糖和蛋白水解物)、转铁蛋白(或其他铁转运蛋白)、脂肪酸、胰岛素、胶原前体、微量元素、2-巯基乙醇、3'-硫羟甘油，或它们的等同物。血清替代品可以通过例如国际公开号WO 98/30679中公开的方法来制备。可选地，可以使用任何可商购获得的材料以更加方便。可商购获得的材料包括KNOCKOUT

可以适当地定义其他培养条件。例如，培养温度可以为约30至40℃，例如至少或约31、32、33、34、35、36、37、38、39℃，但具体不限于此。在一个实施方式中，细胞在37℃下培养。CO2浓度可以为约1至10％，例如约2至5％，或在其中可衍生的任何范围。氧张力可以为至少、高达或约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20％，或其中可衍生的任何范围。

b.分化培养基

i.视网膜诱导培养基

在单细胞PSC贴壁之后，优选在视网膜诱导培养基中培养细胞以开始分化为视网膜谱系细胞的过程。视网膜诱导培养基(RIM)包含WNT通路抑制剂，可导致PSC分化为视网膜谱系细胞。RIM另外包含TGFβ通路抑制剂和BMP通路抑制剂。

RIM可以约1:1的比例包含DMEM和F12。在示例性方法中，RIM中包括WNT通路抑制剂，例如CKI-7，包括BMP通路抑制剂，例如LDN193189，并且包括TGFβ通路抑制剂，例如SB431542。例如，RIM包括约5nM至约50nM(例如约10nM)的LDN193189，约0.1μM至约5μM(例如约0.5μM)的CKI-7，以及约0.5μM至约10μM(例如约1μM)的SB431542。另外，RIM可以包括敲除血清替代品(例如约1％至约5％)、MEM非必需氨基酸(NEAA)、丙酮酸钠、N-2补充剂、B-27补充剂、抗坏血酸和胰岛素生长因子1(IGF1)。在一些实施方式中，IGF1是不含动物的IGF1(AF-IGF1)，并且在RIM中包括约0.1ng/mL至约10ng/mL，例如约1ng/mL。培养基如此每日抽吸并用新鲜的RIM换液。通常将细胞在RIM中培养约1至约5天，例如约1、2、3、4或5天，例如约2天，以产生视网膜谱系细胞。

ii.视网膜分化培养基

然后可以在视网膜分化培养基(RDM)中培养视网膜谱系细胞以进一步分化。RDM包括WNT通路抑制剂、BMP通路抑制剂、TGFβ通路抑制剂和MEK抑制剂。在一个实施方式中，RDM包括WNT通路抑制剂，例如CKI-7；BMP通路抑制剂，例如LDN193189；TGFβ通路抑制剂，例如SB431542；以及MEK抑制剂，例如PD0325901。可选地，RDM可以包括WNT通路抑制剂、BMP通路抑制剂、TGFβ通路抑制剂和bFGF抑制剂。通常，与RIM相比，RDM中的Wnt通路抑制剂、BMP通路抑制剂和TGFβ通路抑制剂的浓度较高，例如高约9至约11倍，例如高约10倍。在示例性方法中，RDM包括约50nM至约200nM(例如约100nM)的LDN193189，约1μM至约10μM(例如约5μM)的CKI-7，约1μM至约50μM(例如约10μM)的SB431542，以及约0.1μM至约10μM(例如约1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM或9μM)的PD0325901。

通常，RDM包括约1:1的比例的DMEM和F12，敲除血清替代品(例如，约1％至约5％，例如约1.5％)、MEM NEAA、丙酮酸钠，N-2补充剂、B-27补充剂、抗坏血酸和IGF1(例如，约1ng/mL至约50ng/mL，例如约10ng/mL)。在特定方法中，吸出来自前一天的培养基后，每天为细胞提供新鲜的RDM。通常，细胞在RDM中培养约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16天，例如约7天，以衍生分化的视网膜细胞。

iii.视网膜培养基

接下来，通过在视网膜培养基(RM)中培养细胞，甚至可以使分化的视网膜细胞进一步分化。视网膜培养基包括活化素A，并且可以另外包括烟酰胺。RM可以包括约50至约200ng/mL(例如约100ng/mL)的激活素A(ACTIVIN A)，和约1mM至约50mM(例如约10mM)的烟酰胺。可选地，RM可以包括其他TGF-β通路激活剂，例如GDF1和/或WNT通路激活剂，例如WAY-316606、IQ1、QS11、SB-216763、BIO(6-溴靛玉红-3'-肟)，或2-氨基-4-[3,4-(亚甲基二氧基)苄基-氨基]-6-(3-甲氧基苯基)嘧啶。可选地，RM可以另外包括WNT3a。

RM可以以约1:1的比例包括DMEM和F12、约1％至约5％(例如约1.5％)的敲除血清替代品、MEM非必需氨基酸(NEAA)、丙酮酸钠、N-2补充剂、B-27补充剂和抗坏血酸。培养基可以每天在室温RM下更换。通常将细胞在RM中培养约8、9、10、11、12、13、14、15、16或17天，例如约10天，以衍生出分化的RPE细胞。

可以冷冻保存通过本文公开的方法产生的视网膜色素上皮细胞，参见例如PCT公开号2012/149484A2，其通过引用并入本文。可以在有或没有基质的情况下将细胞冷冻保存。在一些实施方式中，保存温度为约-50℃至约-60℃、约-60℃至约-70℃、约-70℃至约-80℃、约-80℃至约-90℃、约-90℃至约-100℃及其重叠范围。在一些实施方式中，更低的温度用于冷冻保存的细胞的保存(例如维持)。在几个实施方式中，液氮(或其他类似的液体冷却剂)用于保存细胞。在另外的实施方式中，细胞被保存大于约6小时。在另外的实施方式中，细胞被保存约72小时。在几个实施方式中，将细胞保存48小时至约一周。在另外的实施方式中，细胞被保存约1、2、3、4、5、6、7或8周。在进一步的实施方式中，细胞被保存1、2、3、4、5、67、8、9、10、11或12个月。细胞也可以保存更长的时间。可以将细胞单独冷冻保存或保存在基质上，例如本文公开的任何基质上。

在一些实施方式中，可以使用另外的冷冻保护剂。例如，可以将细胞冷冻保存在包含一种或更多种冷冻保护剂(例如DM80)、血清白蛋白(例如人或牛血清白蛋白)的冷冻保存溶液中。在某些实施方式中，溶液包含约1％至约3％、约2％至约4％、约3％至约5％、约4％至约6％、约5％至约7％、约6％至约8％、约7％至约9％、或约8％至约10％二甲基亚砜(DMSO)或白蛋白。在具体的实施方式中，溶液包含2.5％DMSO。在另一具体的实施方式中，溶液包含10％DMSO。

在冷冻保存期间，可以将细胞冷却，例如，在约1℃下冷却。在一些实施方式中，低温保存温度为约-80℃至约-180℃，或约-125℃至约-140℃。在一些实施方式中，在以约1℃/分钟的速度冷却之前，将细胞冷却至4℃。冷冻保存的细胞可在解冻使用前转移到液氮的气相中。在一些实施方式中，例如，一旦细胞达到约-80℃，就将它们转移至液氮保存区。冷冻保存也可以使用控制速率的冰箱进行。冷冻保存的细胞可以例如在约25℃至约40℃的温度下解冻，并且通常在约37℃的温度下解冻。然后如下所述在支架上使细胞成熟。

iv.RPE成熟培养基

为了进一步分化RPE细胞，优选将细胞在RPE成熟培养基(RPE-MM)中培养。RPE成熟培养基可以包括约100μg/mL至约300μg/mL(例如约250μg/mL)的牛磺酸、约10μg/L至约30μg/L(例如约20μg/L)的氢化可的松，以及约0.001μg/L至约0.1μg/L(例如约0.013μg/L)的三碘甲状腺素。另外，RPE-MM可以包括MEM Alpha、N-2补充剂、MEM非必需氨基酸(NEAA)和丙酮酸钠以及胎牛血清(例如，约0.5％至约10％，例如约1％至约5％)。培养基可以每隔一天更换为室温下的RPE-MM。通常细胞在RPE-MM中培养约5至约10天，例如约5天。然后可以将细胞例如用细胞解离酶解离，再接种，并培养另外的时间，例如另外约5至约30天，例如约15至20天，以进一步分化成RPE细胞。在进一步的实施方式中，RPE-MM不包括WNT通路抑制剂。RPE细胞可以在此阶段冷冻保存。

b.支架和组织置换植入物上RPE细胞的成熟

然后可以将RPE细胞在RPE-MM中培养持续一段时间以使其成熟。在一些实施方式中，RPE细胞在孔中生长，例如6孔、12孔、24孔或10cm板。RPE细胞可以在支架上在RPE培养基中维持约四至约十周，例如约六至八周，例如四、五、六、七或八周。在一些非限制性实例中，将RPE细胞在支架上在培养基中培养约两至六周，例如约五周，以获得成熟且具有功能性的RPE细胞单层。该培养在支架上产生极化的RPE细胞，它们一起形成组织植入物。

多种生物或合成的固体基质材料(即，固体支持基质、生物粘合剂或敷料以及生物/医学支架)均适合用作支架。基质材料通常是生理上可接受的并且适合用于体内应用。此类生理上可接受的材料的非限制性实例包括但不限于可生物降解的固体基质材料，例如交联或非交联的藻酸盐、水胶体、泡沫体、胶原蛋白凝胶、胶原蛋白海绵、聚乙醇酸(PGA)网、聚凝胶素(PGL)网和生物粘合剂(例如纤维蛋白胶和纤维蛋白凝胶)。该聚合物可以是聚(DL)-乳酸-共-乙醇)酸(PLGA)(参见Lu et al.,J.Biomater Sci Polym Ed.9(11):1187-205,1998)。在其他实施方式中，基质包括聚(L-乳酸)(PLLA)和聚(D,L-乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)，例如具有约90:10、75:25、50:50、25:75、10:90(PLLA:PLGA)的共聚物比(参见Thomson et al.,J.Biomed.Mater Res.A 95:1233-42,2010)。

合适的聚合物载体还包括由合成或天然聚合物形成的多孔网或海绵。非限制性实例是聚合物水凝胶。可以使用的天然聚合物包括蛋白(例如胶原蛋白、白蛋白和纤维蛋白)；和多糖，例如藻酸盐和透明质酸聚合物。合成聚合物可以是可生物降解的。可生物降解的聚合物的实例包括羟基酸的聚合物，例如聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)和聚乳酸-乙醇酸(PLGA)、聚原酸酯、聚酸酐、聚磷腈及其组合。

在一些实施方式中，支架是PLGA支架，如下所述。PLGA是聚乳酸(PLA)和聚乙醇酸(PGA)的共聚物。聚乳酸包含不对称的α-碳，其典型地以经典的立体化学术语描述为D或L形式，有时分别描述为R和S形式。聚合物PLA的对映体形式是聚D-乳酸(PDLA)和聚L-乳酸(PLLA)。PLGA是聚D,L-乳酸-共-乙醇酸，其中D-和L-乳酸形式通常是相等的比例。PLGA通过其酯键的水解而生物降解。

在一些实施方式中，将PLGA支架培养足够的时间，以使得从支架释放的大部分乳酸在体外发生。在一些实施方式中，大于50％、60％、70％、80％、90％或95％的乳酸释放在体外发生。乳酸释放随时间发生。因此，在一些实施方式中，将RPE在支架上在RPE培养基中维持约四至约十周，例如约六至八周，例如四、五、六、七或八周，可以达到这种效果。在一些非限制性实例中，将RPE细胞在支架上在培养基中培养约两至六周，例如约五周，可达到此效果。

在一些实施方式中，PLGA支架可以具有约5:1至约1:5，例如约4:1至约1:4、约3:10至约3:3、约2:1至约1:2的DL-丙交酯/乙交酯比。在一个特定的非限制性实例中，DL-丙交酯/乙交酯比为1:1。在这种情况下，“约”表示在5％以内。

在更多的实施方式中，PLGA支架的厚度为约10至约50微米，例如厚度为约20至约40微米，例如厚度为约20至约30微米。PLGA支架的厚度可以为约20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30微米。在这种情况下，约表示在5％以内。

支架具有彼此相交的纳米纤维，使得它们相交并形成交汇处。可以对支架进行处理，以使支架的纤维在PLGA支架内的纤维交叉点的交汇处融合，以提高机械强度。平均孔径是PLGA支架中纤维之间的空间。

在另外的实施方式中，PLGA支架的孔径小于约2微米，例如小于约1.5微米、小于约1.25微米或小于约1微米。在一些实施方式中，PLGA支架的孔径为约0.5微米至约2微米、约0.5至1微米、约1至约2微米。PLGA支架的孔径为约0.5、0.75、1、1.25、1.5、1.75或2微米。在这种情况下，约表示在5％以内。

在进一步的实施方式中，PLGA支架的纤维直径为约100至约700nm，例如约150至约650nm，例如约200至约600nm，例如约300至约500nm。在一些实施方式中，PLGA支架的纤维直径为约100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600或650nm。在这种情况下，“约”表示在5％以内。

应当注意，PLGA支架的厚度、孔径和纤维直径的任何特征均可以组合。本领域技术人员可以理解，改变DL-丙交酯/乙交酯比将调节孔和纤维直径。因此，本领域技术人员可以生产所公开的厚度、孔径和纤维直径的PLGA支架。可以组合任何特征，以达到通过改变DL-丙交酯/乙交酯比产生的特定组合。这些全部被理解为在本文中公开。在特定的非限制性实例中，PLGA支架的DL-丙交酯/乙交酯比为1:1，平均孔径小于1微米，并且纤维直径为150至650nm。

在一些实施方式中，对支架进行热处理以使支架的纤维在PLGA支架内的交汇点(纤维交叉点)处融合以增加PLGA支架的机械强度。这种热处理还通过在交汇处融合纤维来减小孔径，从而使细胞在支架顶部形成单层。在一些非限制性实例中，在一些实施方式中，将支架放置在合适的表面上，例如金属表面，例如铝箔，例如以包封的形式，将其放置在设定为期望的处理温度的烤箱内。合适的温度包括约35℃至约55℃，例如约40℃至约50℃，例如约43℃、44℃、45℃、46℃或47℃。可以将支架加热约5至约20分钟，例如约10至约15分钟，例如约10、11、12、13、14或15分钟。在一个实施方式中，将支架在约45℃至约10分钟下处理。然后可以相对于第一温度升高温度，例如至约50℃至约70℃，例如约55℃至约60℃，例如约55℃、56℃、57℃、58℃、59℃或60℃。高温处理可以持续约45分钟至约75分钟，例如约50分钟至约70分钟，或约55分钟至约65分钟。高温处理可以应用约55、56、57、58、59、60、61、62、63、64或65分钟。在一些实施方式中，将支架在约60℃下处理约60分钟。在一个非限制性实例中，可将支架在约45℃至约10分钟下处理，然后在约60℃下处理约60分钟。热处理后，可以将支架保存。

在一些实施方式中，PLGA支架包被有玻连蛋白。在其他实施方式中，PLGA支架包被有细胞外基质或明胶。如上所述，这可以在加热支架之后发生。

在其他实施方式中，PLGA支架包被有细胞外基质。细胞外基质是结构和功能性生物分子和/或生物大分子的复杂混合物，包括但不限于围绕并支持哺乳动物组织内细胞的结构蛋白、特化蛋白、蛋白聚糖、糖胺聚糖和生长因子，除非另有说明，其是无细胞的。细胞外基质公开于，例如但不限于，美国专利号4,902,508；4,956,178；5,281,422；5,352,463；5,372,821；5,554,389；5,573,784；5,645,860；5,771,969；5,753,267；5,762,966；5,866,414；6,099,567；6,485,723；6,576,265；6,579,538；6,696,270；6,783,776；6,793,939；6,849,273；6,852,339；6,861,074；6,887,495；6,890,562；6,890,563；6,890,564；其各自通过引用以其全文并入本文)。然而，ECM可以从任何组织产生，或者从任何体外来源产生，其中ECM由培养的细胞产生并且包含天然ECM的一种或更多种聚合物成分(组分)。ECM制剂可以被认为是“脱细胞的”或“无细胞的”，这表示已经从源组织或培养物中去除了细胞。

在一些实施方式中，ECM从脊椎动物分离，例如从哺乳动物脊椎动物(包括但不限于人、猴、猪、牛、绵羊等)分离。ECM可以源自任何器官或组织，包括但不限于膀胱、肠、肝、心脏、食道、脾、胃和真皮。在特定的非限制性实例中，细胞外基质分离自食道组织、膀胱、小肠粘膜下层、真皮、脐带、心包、心脏组织或骨骼肌。ECM可以包括获自器官的任何部分或组织，包括例如但不限于粘膜下层、上皮基底膜、固有膜等。在一个非限制性实施方式中，ECM从膀胱分离。

支架可以包括目的药剂。在一些实施方式中，支架提供一种或更多种药剂缓释。在更多的实施方式中，药剂是抑制RPE细胞的去分化(或上皮到间充质转变)或抑制RPE细胞下方的玻璃疣沉积物形成或抑制RPE细胞中的活性氧种类的分子。在一些非限制性实例中，RPE细胞去分化的抑制剂可以是L,745,870(3-([4-(4-氯苯基)哌嗪-1-基]甲基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶)或多巴胺受体抑制剂。药剂可以是二甲双胍、Nox4抑制剂、活性氧抑制剂氨基己酸、利鲁唑或NK-κβ抑制剂。在特定的非限制性实例中，药剂是L,745,870。在另一个具体的非限制性实例中，药剂是二甲双胍。在进一步非限制性实例中，药剂是Nox4抑制剂(VAS2870、GKT 137831或GLX7013114)。在进一步非限制性实例中，药剂是活性氧类抑制剂(GKT 137831或GLX7013114或N-乙酰基半胱氨酸)。

可以在将视网膜色素上皮细胞接种到支架上之前对支架进行灭菌。在一些实施方式中，利用γ辐射对支架进行灭菌。在其他实施方式中，电子束(e束)用于对支架进行灭菌。示例性方法公开于例如Bruyas et al.,Tissue Eng.Part A,doi:10.1089/ten.TEA.2018.0130(2018年9月20日)和Proffen et al.,J.Orthop.Res.33(7)1015-1023(2015)。

在一些实施方式中，将视网膜色素上皮细胞以每12mm直径的PLGA支架约125,000至约500,000个细胞接种到PLGA支架上，例如每12mm直径的PLGA支架约150,000个细胞，每12mm直径的PLGA支架约200,000个细胞，每12mm直径的PLGA支架约250,000个细胞，每12mm直径的PLGA支架约300,000个细胞，每12mm直径的PLGA支架约350,000个细胞，每12mm直径的PLGA支架约400,000个细胞，或每12mm直径的PLGA支架约450,000个细胞。

在一些实施方式中，通过在RPE-MM中与促进支架上的RPE成熟的另外的化学物质或小分子继续培养，成熟的RPE细胞发育为功能上完整的RPE组织的功能性RPE细胞单层。在一些实施方式中，这些小分子是初级纤毛诱导剂，例如前列腺素E2(PGE2)或阿非迪霉素。可以将PGE 2以约25μM至约250μM，例如约50μM至约100μM的浓度添加至培养基。可选地，RPE-MM可以包括典型WNT通路抑制剂。示例性典型WNT通路抑制剂是N-(6-甲基-2-苯并噻唑基)-2-[(3,4,6,7-四氢-4-氧代-3-苯基噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-基)硫基]-乙酰胺(IWP2)或4-(1,3,3a,4,7,7a-六氢-1,3-二氧代-4,7-甲醇-2H-异吲哚-2-基)-N-8-喹啉基苯甲酰胺(endo-IWR1)。

在一些实施方式中，为了使RPE细胞持续成熟，可以将细胞在细胞解离酶(例如TRYPLE

在其他实施方式中，支架上的RPE细胞的静息电位为约-50至约-60mV，以及流体运输速率为约5至约10μl cm

在一个非限制性实例中，用于产生组织置换植入物的方法包括：a)获得包被有玻连蛋白的PLGA，其中PLGA支架包括形成网状结构的纤维，并且其中所述PLGA支架具有上表面和下表面，其中所述PLGA支架的厚度为约20-约30微米，具有约1:1的DL-丙交酯/乙交酯比例，平均孔径小于约1微米，并且纤维直径为约150至约650nm；b)热处理所述支架，以使所述支架的纤维在所述PLGA支架内的纤维交叉点的交汇处融合，以增加所述PLGA支架的机械强度并减小孔径；c)将视网膜色素上皮细胞以每12mm直径的PLGA支架约125,000至约500,000个细胞接种到所述PLGA支架上；和d)在组织培养基中在所述PLGA支架上体外培养所述视网膜色素上皮细胞，在所述PLGA支架的上表面和下表面上均存在培养基，培养时间足以使i)所述视网膜色素上皮细胞极化和ii)所述PLGA支架整体降解。

用于制备组织置换植入物的抑制剂

以下公开了用于制备RPE细胞和公开的组织植入物的抑制剂。

1.WNT通路抑制剂

WNT是一类高度保守的分泌信号分子，可调节细胞之间的相互作用，并与果蝇节段极性基因(无翅)有关。在人中，WNT基因家族编码38至43kDa的富含半胱氨酸的糖蛋白。WNT蛋白具有疏水信号序列，保守的天冬酰胺连接的寡糖共有序列(参见，例如，Shimizu et alCell Growth Differ 8:1349-1358(1997))和22个保守的半胱氨酸残基。由于其促进细胞质β-连环蛋白稳定的能力，WNT蛋白可以充当转录激活因子并抑制细胞凋亡。已经显示出特定WNT蛋白的过表达与某些癌症有关。

本文中的WNT抑制剂通常是指WNT抑制剂。因此，WNT抑制剂是指WNT家族蛋白成员的任何抑制剂，包括Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt4、Wnt5A、Wnt6、Wnt7A、Wnt7B、Wnt8A、Wnt9A、Wnt10a、Wnt11和Wnt16。本方法的某些实施方式涉及分化培养基中的WNT抑制剂。在本领域中已知的合适的WNT抑制剂的实例包括N-(2-氨基乙基)-5-氯异喹啉-8-磺酰胺二盐酸盐(CKI-7)、N-(6-甲基-2-苯并噻唑基)-2-[(3,4,6,7-四氢-4-氧代-3-苯基噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-基)硫代]-乙酰胺(IWP2)、N-(6-甲基-2-苯并噻唑基)-2-[(3,4,6,7-四氢-3-(2-甲氧基苯基)-4-氧噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-基)硫代]-乙酰胺(IWP4)、2-苯氧基苯甲酸-[(5-甲基-2-呋喃基)亚甲基]酰肼(PNU 74654)2,4-二氨基喹唑啉、槲皮素、3,5,7,8-四氢-2-[4-(三氟甲基)苯基]-4H-硫代吡喃并[4,3-d]嘧啶-4-酮(XAV939)、2,5-二氯-N-(2-甲基-4-硝基苯基)苯磺酰胺(FH 535)、N-[4-[2-乙基-4-(3-甲基苯基)-5-噻唑基]-2-吡啶基]苯甲酰胺(TAK 715)、Dickkopf相关蛋白1(DKK1)和分泌型卷曲相关蛋白(SFRP1)1。另外，WNT抑制剂可以包括针对WNT的显性失活(dominant negative)变体的抗体以及抑制WNT表达的siRNA和反义核酸。还可以使用RNA介导的干扰(RNAi)以抑制WNT。

2.BMP通路抑制剂

骨形态发生蛋白(BMP)是多功能生长因子，属于转化生长因子β(TGFβ)超家族。BMP被认为构成一组关键的形态发生信号，协调人体架构。BMP信号在病理过程中的许多失调强调BMP信号在生理学中的重要功能。

BMP通路抑制剂通常可以包括BMP信号传导的抑制剂或对BMP1、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8a、BMP8b、BMP10或BMP15具有特异性的抑制剂。示例性BMP抑制剂包括4-(6-(4-(哌嗪-1-基)苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)喹啉盐酸盐(LDN193189)、6-[4-[2-(1-哌啶基)乙氧基]苯基]-3-(4-吡啶基)-吡唑并[1,5-a]嘧啶二盐酸盐(Dorsomorphin)、4-[6-[4-(1-甲基乙氧基)苯基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基]-喹啉(DMH1)、4-[6-[4-[2-(4-(吗啉基)乙氧基]苯基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基]喹啉(DMH-2)和5-[6-(4-甲氧基苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基]喹啉(ML 347)。

3.TGFβ通路抑制剂

转化生长因子β(TGFβ)是分泌型蛋白，可控制大多数细胞中的增殖、细胞分化和其他功能。它是一种细胞因子，在免疫、癌症、支气管哮喘、肺纤维化、心脏病、糖尿病和多发性硬化中起作用。TGF-β以至少三种亚型存在，分别称为TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3。TGF-β家族是蛋白超家族的一部分，该家族被称为转化生长因子β超家族，其中包括抑制素、激活素、抗苗勒管激素(Anti-Müllerian Hormone)、骨形态发生蛋白、decapentaplegic和Vg-1。

TGFβ通路抑制剂一般可包括任何TGFβ信号传导抑制剂。例如，TGFβ通路抑制剂是4-[4-(1,3-苯并二恶唑-5-基)-5-(2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]苯甲酰胺(SB431542)、6-[2-(1,1-二甲基乙基)-5-(6-甲基-2-吡啶基)-1H-咪唑-4-基]喹喔啉(SB525334)、2-(5-苯并[1,3]二氧杂-5-基-2-基-丁基-3H-咪唑-4-基)-6-甲基吡啶盐酸盐水合物(SB-505124)、4-(5-苯并[1,3]二氧杂-5-基-4-吡啶-2-基-1H-咪唑-2-基)-苯甲酰胺水合物、4-[4-(1,3-苯并二恶唑-5-基)-5-(2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]-苯甲酰胺水合物、左-右决定因子(左)、3-(6-甲基-2-吡啶基)-N-苯基-4-(4-喹啉基)-1H-吡唑-1-碳硫酰胺(A 83-01)、4-[4-(2,3-二氢-1,4-苯并二恶英-6-基)-5-(2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]苯甲酰胺(D 4476)、4-[4-[3-(2-吡啶基)-1H-吡唑-4-基]-2-吡啶基]-N-(四氢-2H-吡喃-4-基)-苯甲酰胺(GW 788388)、4-[3-(2-吡啶基)-1H-吡唑-4-基]-喹啉(LY 364847)、4-[2-氟-5-[3-(6-甲基-2-吡啶基)-1H-吡唑-4-基]苯基]-1H-吡唑-1-乙醇(R 268712)或2-(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基)-1,5-萘啶(RepSox)。

4.MEK抑制剂

MEK抑制剂是抑制促分裂原活化的蛋白激酶MEK1或MEK2的化学药品或药物。它们可用于影响MAPK/ERK通路。例如，MEK抑制剂包括N-[(2R)-2,3-二羟基丙氧基]-3,4-二氟-2-[(2-氟-4-碘苯基)氨基]-苯甲酰胺(PD0325901)、N-[3-[3-环丙基-5-(2-氟-4-碘苯胺基)-6,8-二甲基-2,4,7-三氧吡喃并[4,3-d]嘧啶-1-基]苯基]乙酰胺(GSK1120212)、6-(4-溴-2-氟苯胺基)-7-氟-N-(2-羟基乙氧基)-3-甲基苯并咪唑-5-羧酰胺(MEK162)、N-[3,4-二氟-2-(2-氟-4-碘苯胺基)-6-甲氧基苯基]-1-(2,3-二羟丙基)环丙烷-1-磺酰胺(RDEA119)和6-(4-溴-2-氯苯胺基)-7-氟-N-(2-羟基乙氧基)-3-甲基苯并咪唑-5-羧酰胺(AZD6244)。

5.bFGF抑制剂

碱性成纤维细胞生长因子(也称为bFGF、FGF2或FGF-β)是成纤维细胞生长因子家族的成员。bFGF存在于基底膜和血管内皮下细胞外基质中。另外，bFGF是人ESC培养基的常见成分，为细胞保持未分化状态所需。

本文中的bFGF抑制剂通常是指bFGF抑制剂。例如，bFGF抑制剂包括但不限于N-[2-[[4-(二乙基氨基)丁基]氨基-6-(3,5-二甲氧基苯基)吡啶基[2,3-d]嘧啶-7-基]-N'-(1,1-二甲基乙基)尿素(PD173074)、2-(2-氨基-3-甲氧基苯基)-4H-1-苯并吡喃-4-酮(PD98059)、1-叔丁基-3-[6-(2,6-二氯苯基)-2-[[4-(二乙基氨基)丁基]氨基]吡啶基[2,3-d]嘧啶-7-基]脲(PD161570)、6-(2,6-二氯苯基)-2-[[4-[2-(二乙基氨基)乙氧基]苯基]氨基]-8-甲基-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-二盐酸盐水合物(PD166285)、N-[2-氨基-6-(3,5-二甲氧基苯基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-基]-N'-(1,1-二甲基乙基)-尿素(PD166866)和MK-2206。

组织置换植入物的使用和治疗方法

提供了组织置换植入物，其包括可生物降解的支架和有效量的RPE细胞。本文所述的组织置换植入物，以及包括这些植入物的药物组合物，可用于生产药物以治疗需要其的患者的病况。

在一些实施方式中，公开的RPE细胞衍生自iPSC，因此可以用于为患有眼部疾病的患者提供“个性化药物”。在一些实施方式中，获自患者的细胞，例如体细胞或CD34+细胞或脐带细胞，可用于产生iPSC，然后其用于产生RPE细胞。在一些实施方式中，可以对RPE细胞(或起始iPSC)进行基因工程化以修正引起疾病的突变，分化为RPE，并进行工程化以形成组织植入物。该组织置换植入物可用于替代同一受试者的内源性变性RPE。

可选地，可以从健康供体或从HLA纯合的“超级供体”或“通用”供体iPS细胞产生iPSC，并将其用于制备组织植入物。可以使用某些因子(例如色素上皮衍生因子(PEDF)、转化生长因子(TGF)-β和/或视黄酸)在体外对RPE细胞进行处理，以在体内产生抗炎和免疫抑制的环境。这些“超级供体”iPSC可以商购获得，参见Cellular Dynamics International(例如，参见互联网，globenewswire.com/news-release/2015/02/09/704392/10119161/en/Cellular-Dynamics-Manufactures-cGMP-HLA-Superdonor-Stem-Cell-Lines-to-Enable-Cell-Therapy-With-Genetic-Matching，2015年2月15日)。

受试者可以是人或兽医受试者。RPE细胞可以衍生自单个受试者，或者可以在植入物中使用数种RPE细胞群，例如1、2、3、4，或5种类型的RPE，其各自衍生自不同的受试者。

可以通过引入组织植入物以治疗或预防各种眼部病况。这些病况包括通常与视网膜功能障碍或退化、视网膜损伤和/或视网膜色素上皮缺失有关的视网膜疾病或病症。公开的组织置换植入物用于治疗视网膜变性疾病、视网膜或视网膜色素上皮功能障碍、视网膜退化、视网膜或视网膜色素上皮损伤，例如由光、激光、炎性、感染性、放射、新血管或创伤性损伤引起的损害。公开的组织置换植入物还用于治疗视网膜色素上皮缺失。该方法包括向受试者的眼睛局部施用组织置换植入物。

在一些实施方式中，视网膜变性疾病是Stargardt黄斑营养不良、视网膜色素变性、年龄相关性黄斑变性、青光眼、糖尿病性视网膜病、Lebers先天性黑蒙、迟发性视网膜变性、遗传性黄斑或视网膜变性、Best疾病、Sorsby眼底营养不良、视网膜脱离、回旋状萎缩、创伤性眼损伤或无脉络膜、模式营养不良(pattern dystrophy)。另外的病况包括视网膜脱离、模式营养不良和RPE的其他营养不良。在特定的非限制性实例中，受试者患有年龄相关性黄斑变性。在某些实施方式中，提供了用于治疗或预防以视网膜变性为特征的病况的方法，其包括向有此需要的受试者施用组织置换植入物。

这些方法可以包括选择患有这些病况中的一种或更多种的受试者，并施用组织置换植入物以治疗该病况和/或减轻该病况的症状。组织置换植入物还可以与其他视网膜细胞(例如感光细胞)一起移植(共移植)。在一些实施方式中，组织置换植入物中的RPE细胞来自待治疗的受试者，因此是自体的。在其他实施方式中，组织置换植入物中的RPE细胞由MHC匹配的供体或通用供体产生。在另一个实施方式中，组织置换植入物中的RPE细胞是同种异体的。

可以将组织置换植入物引入受试者眼睛内的各个靶部位。在一些实施方式中，组织置换植入物被引入(例如通过移植)到眼睛的视网膜下间隙，其是RPE在哺乳动物中RPE的解剖位置(在感光外节段和脉络膜之间)。示例性方法公开于例如PCT公开号WO 2018/089521，其通过引用并入本文。在一些实施方式中，将组织置换植入物引入视网膜的外部、视网膜外围、黄斑或黄斑周围区或脉络膜内。另外，依赖于细胞的迁移能力和/或积极的旁分泌作用，可以考虑引入另外的眼区，例如玻璃体腔、视网膜的内部或外部、视网膜外围以及脉络膜内。

通常可以通过将特定患者中存在的视网膜病理区的尺寸的临床评估与递送特定尺寸的植入物的手术可行性所施加的限制进行比较来确定待移植的组织置换植入物的尺寸。例如，在涉及中央视网膜的变性(例如，年龄相关性黄斑变性)中，近似于解剖中心凹的直径约1.0-2.5mm(例如，直径约1.5mm)的圆形植入物通常是合适的。在一些情况下，较大的植入物可能是合适的，最大对应于位于颞部血管动脉弓之间的后视网膜区(组织性黄斑，临床后极)，其卵形面积约为6.0mm(垂直)×7.5mm(水平)，以中央凹为中心或位于中央凹区。在一些实例中，同样合适的是，将较小尺寸的聚合物支架制成约0.5mm，以放置在限定病理区中。另外，可能会感兴趣的是定制不规则形状的植入物以适合患者，例如覆盖病理区，同时避免残留的高视力区。

可以通过本领域已知的各种技术引入组织置换植入物。进行移植的方法公开在例如美国专利号5,962,027、美国专利号6,045,791和美国专利号5,941,250；BiochemBiophys Res Commun Feb.24,2000；268(3):842-6；和Opthalmic Surg February 1991；22(2):102-8)。进行角膜移植的方法如下所述，例如，美国专利号5,755,785；Curr OpinOpthalmol August 1992；3(4):473-81；Ophthalmic Surg Lasers April 1998；29(4):305-8；和Opthalmology April 2000；107(4):719-24。在一些实施方式中，移植通过parspana玻璃体切除术进行，然后通过小视网膜开口将组织置换植入物递送到视网膜下间隙中。可选地，组织置换植入物可以通过跨巩膜、跨脉络膜途径被递送到视网膜下间隙。另外，可以将跨巩膜直接插入到睫状体附近的视网膜前周边。

组织置换植入物还可以与其他细胞(例如感光细胞)一起移植(共移植)。

在一些实施方式中，该方法包括施用免疫抑制剂，该免疫抑制剂例如通过下调炎性细胞的应答或通过诱导炎性细胞的凋亡以降低免疫应答。在其他实施方式中，该方法包括施用治疗有效量的神经保护剂，该神经保护剂促进视网膜神经元存活和/或减少视网膜神经元变性。在其他实施方式中，该方法可以包括施用治疗有效量的试剂以抑制非期望的血管生成，例如以抵消AMD患者中中央凹下脉络膜新血管(CNV)的生长。示例性治疗剂可以例如通过结合至活性形式的VEGF的受体位点并防止VEGF与其受体相互作用而降低血管内皮生长因子(VEGF)的活性。治疗有效量的VEGF通过抑制导致VEGF分泌的通路(例如STAT3、NF-kB、HIF-1α)抑制VEGF。其他药物可以通过靶向补体通路、自噬或NF-kB通路来预防RPE细胞萎缩。

在进一步的实施方式中，该方法包括向受试者施用治疗有效量的睫状神经营养因子(CNTF)、脑源性神经营养因子(BDNF)或色素上皮源性因子(PEDF)，其可以例如用于促进神经元例如感光细胞的发育或功能。其他示例性非限制性实施方式包括向受试者施用治疗有效量的血小板反应蛋白1，一种抗炎细胞因子(例如，白介素(IL)-1ra、IL-6、Fas配体)或肿瘤生长因子(TGF)-β，一种神经营养性/神经保护性生长因子，例如但不限于神经胶质细胞系源性生长因子，脑源性神经营养因子，神经生长因子，神经营养因子-3、-4/5、-6和维生素E。此类药物可以单独或组合提供。

通过以下非限制性实施例说明本公开内容。

实施例

将质量管理规范(GMP)/临床级生产用于使用可生物降解的支架生产AMD患者特定的iPSC衍生的RPE(iRPE)贴片(patch)。这些贴片在两种不同的动物模型中进行检测。自体iRPE贴片避免患者细胞的免疫排斥反应，并且由于这些iRPE细胞不显示AMD的任何细胞表型，因此可以增加自体iRPE贴片的存活和在患者眼睛中的整合。这种将贴片移植到干性AMD病变边界处的方法可以挽救RPE萎缩并且感光细胞仍存活的过渡区中的感光细胞(Bird,etal.,JAMA Ophthalmol 132,338-345(2014))。此外，可以使用主要组织相容性(MHC)匹配的RPE细胞或异源RPE细胞生成这些贴片。这些贴片可以包括来自一个受试者或来自多个受试者的RPE细胞。

在本文公开的研究中，使用从AMD患者外周血中分离的CD34+细胞可以开发无致癌突变的临床级iPSC库。这些iPSC库用于开发临床级RPE分化过程，与研究级分化相比，该过程更加有效和可重现。提供的证据表明，源自三个AMD患者的iRPE贴片未显示该疾病的任何细胞表型，并且其成熟和功能达到相似的程度。此外，已证明在免疫功能低下大鼠、RPE功能障碍相关性视网膜变性的大鼠以及激光诱发的RPE损伤的猪模型(在其中试验了临床剂量的iRPE贴片)中，与移植的细胞悬液相比，将iRPE细胞接种在可生物降解的基质上可显著改善RPE单层的整合。这些实验证实这些组织植入物的有效性，并提供了用于进行临床前研究的完整工作流程，以支持针对黄斑变性和其他疾病适应症的基于自体iPSC的I期临床试验(图1A)。

实施例1

材料和方法

研究和临床级iPSC衍生、维持和RPE分化：在酪氨酸酶增强子和组成型RFP的控制下表达GFP的报告子iPSC细胞系先前已发表(Maruotti et al.,Proc Natl Acad Sci U SA112,10950-10955(2015))，并用于优化研究级分化方案。在用于分化之前，iPSC在MEF上培养4天。为了制备细胞聚集体，将iPSC用胶原酶处理20min。抽吸胶原酶后，将NEIM(DMEM/F12，KOSR，补充N2、B27、LDN-193189 10uM、SB431452 10nM、CKI-7盐酸盐0.5uM和IGF-11ng/ml)添加到孔中(1ml/孔)，然后用细胞刮除器刮下集落。细胞聚集体在NEIM培养基中在10cm

表1用于iPSC生成和RPE分化的临床级试剂的详细列表

所有这些试剂的检验报告均已通过关于我们临床级生产工艺的所有这些试剂的验证。

对于临床级方案，使用先前发表的报告(Mack,et al.,PLoS One 6,e27956(2011))从CD34+PBMC衍生无饲养层的iPSC克隆。通过流式细胞术、灭菌(WuXiApp Tech，Marietta，GA)、正常G带核型分析(Cell Line Genetics，Madison，WI)、STR识别(Univ.Madison Clinics，Madison，WI)、质粒丢失(Cellular Dynamics Inc.,Madison,WI)和致癌基因测序(Q2 Solutions，Morrisville，NC)，验证高达8个克隆的迷你库的多能性。然后将iPSC细胞接种在E8培养基(A1517001,ThermoFisher,Carlsbad,CA)中包被玻连蛋白(A14701S,ThermoFisher,Carlsbad,CA)的表面上。2天后，将细胞转移至RPEIM 10天，然后再转移至RPECM 10天。在第22天，细胞转换至RPEGM，在第27天用胰蛋白酶消化，并重新接种在RPEGM中。在第42天，将细胞重新接种在RPEMM(MEM，Sigma；1％N2补充剂，ThermoFisher；1％谷氨酰胺，ThermoFisher；1％非必需氨基酸，ThermoFisher；125mg牛磺酸(Sigma)/500ml；10ug氢化可的松(Sigma)/500ml；0.0065ug三碘甲状腺原氨酸(Sigma)/500ml；5％FBS，Sigma；50uM PGE2，R&D Biosystems)中支架上。

实时PCR：根据方案，使用NucleoSpin RNA(#740955，Macherey-Nagel)分离总RNA。使用ND-1000分光光度计(Nanodrop Technologies)对RNA进行定量。cDNA合成和定制的24个RPE基因阵列板购自Bio-rad。根据生产商方案，基于Sybr green的Qpcr在ViiA 7实时PCR系统(Thermo Fisher Scientific)上运行。每个样品至少以3个生物学重复品运行，并在基于R的软件中分析数据。

反式上皮电阻：使用EVOM2和EndOhm室(World Precision Instruments)测量电完整性，并且每个克隆测量对3个生物学重复品的电阻。

六角形性(Hexagonality)测量方法学：将细胞固定在4％多聚甲醛中，并对与AlexaFluor 594缀合的Anti-Zonula Occluden-1(ZO1)进行染色。固定整个trans-well，并使用Zeiss Axio Scan-1对每个孔的2mm×4mm×60微米切片进行20倍成像。然后，对Z堆栈进行最大强度投影(MIP)，并使用卷积神经网络分析MIP中的细胞边界。一旦确定了细胞边界，创建二进制“掩模(mask)”来测量细胞的形态学特性。使用称为“六角形性”的新型度量，测量RPE与理想的凸正六角形的接近程度。简而言之，六角形性是通过取两个不同比率的平均值的10倍(公式3)进行评估。这两个比率是等式1所定义的六角形边比(HSR)和由等式2定义的六角形面积比(HAR)。

等式1：

等式2：

等式3：

在以上P

感光细胞外节段的吞噬作用：iRPE细胞的吞噬能力使用已公开的方案进行轻微修改后进行测量(55)。根据生产商的方案，用pH-rodo染料(ThermoFisher)标记牛感光细胞外节段(POS)(InVision Bio)。在transwell或PLGA支架上培养5周后，将成熟的iRPE细胞在37℃下以5POS/1RPE细胞的浓度饲养培养4小时。用DPBS洗涤细胞3次，并在0.25％胰蛋白酶中孵育20分钟。用1ml移液器收集胰蛋白酶消化的细胞，并将其悬浮在装有10ml RPE MM的15ml管中。将具有细胞的15ml试管以400g离心5分钟，将细胞沉淀在10ml DPBS中洗涤3次，重悬于10ml DPBS中，并使细胞悬液通过0.44um细胞过滤器。

细胞样品通过MACS Miltenyi流式细胞仪运行。选择活细胞作为DAPI阴性。使用在586nm处激发并在515nm处发射的激光通道确定来自摄取的pH-rodo标记的POS的荧光。使用flowjo软件分析流式细胞仪数据，并计算饲养培养的和非饲养培养的样品的通道Y1阳性群的中位荧光。计算饲养培养的样品与非饲养培养的样品的比例，并制图。

乳酸测量：在用于培养iPSC-RPE贴片的相同条件下孵育PLGA支架。每隔一天更换培养基，并将培养的培养基收集在15ml管中。来自三个连续更换培养基的培养基合并在一个试管中。六个技术重复品均遵循相同的程序。立即将收集的培养基冷冻，并保存在-80℃。进行乳酸测量。由于来自三个连续的培养基集合的每个技术重复试管均包含12ml培养基，因此将其冻干以减少总体积。将冻干的物质重悬于1ml的1×D-PBS中。乳酸测量使用Lactate Gen.2机器进行，测量范围为0.2-15.5mmol/L(1.8-140mg/dL)。

统计分析：所有统计分析均使用R软件以及Dunn.test软件包(适用的话)进行。首先通过确定数据偏度、峰度和q-q图来评估数据的正态性。发现所有基因表达、TER、形状度量和吞噬作用数据的偏度或峰度值均在-1至1范围之外，并且在q-q图中显示出明显的偏差，因此作为非正态来处理。因此，在对k组进行随机占优的Kruskal-Wallis检验之后，使用Dunn检验报告多重配对比较。所有配对比较均使用Bonferroni-Dunn校正，并且将校正后的α为0.05用于显著性。对于主成分分析，使用所有度量的总合并数据，将全部天数和克隆中吞噬作用、TER和基因表达谱的数据从0放大为1。进行PCA并显示了基于k最近邻聚类。

癌基因编码变异分析：通过Q

动物：使用阉割的Yucatan小型猪(RRID:NSRRC_0012)和约Yorkshire猪(年龄：5-11个月；体重：30-40Kg)，Crl:NIH-Foxn1

啮齿动物细胞的手术递送：

A.悬液：将出生后(P)21-28日，RCS大鼠(RRID:RGD_1358258)或成年免疫功能低下的大鼠、Crl:NIH-Foxn1

mm)。使用30号针头进行小侧面角膜穿刺，以限制眼内压的增加并减少注射后细胞的外流。使用插入视网膜下间隙的细玻璃移液管(内径75–150μm)将两微升的含有总细胞剂量(100,000个细胞)的悬液递送到一只眼睛的视网膜下间隙。然后将结膜再置于巩膜切口上方。纳入研究的所有动物均接受具有至少90％的给药前和给药后细胞活力的细胞注射。所有RCS大鼠在细胞移植后2周每天接受腹膜内注射地塞米松(1.6mg/Kg)，以最大程度地减少潜在的炎症反应。

B.iRPE贴片：iRPE贴片的放置遵循与悬液注射相同的一般步骤，但以下情况除外。使用2-3μl平衡盐溶液(BSS+)产生视网膜下小泡，并使用18号针延长巩膜切口以适应1mm圆形植入物的插入。使用无菌环钻，从培养板中取出RPE支架的1mm钻出物(punch)。使用ILM剥皮钳，将1mm植入物抓紧在远端，以在植入过程中为支架提供保护和稳定性。将镊子以RPE面向感光细胞的方向轻轻插入视网膜下间隙。

视动追踪：视动追踪(OKT)阈值使用虚拟视动系统(VOS；CerebralMechanics,Lethbridge,AB,Canada)测量，该系统可以独立评估左眼和右眼。使用其他处介绍的方法在P90评价阈值(39,56)。单个原理操作员评价阈值，该阈值由第二操作员核实。

免疫抑制：口服使用四环素抗生素强力霉素(Doxycline)和米诺环素(Minocycline)，每天两次，剂量为5mg/Kg。肌肉注射甲泼尼龙(metilprednisolone)，负荷量为5mg/Kg，随后每天口服相似剂量的泼尼松(prednisone)。口服使用雷帕霉素(Rapamycin)，负荷量为2mg，然后每日1mg。以0.5mg/天的口服剂量使用他克莫司(Tacrolimus)。

激光损伤模型：使用带有TxCell

猪iRPE贴片移植：用聚维酮碘对手术区进行消毒，临时眦切开术，上直肌牵引和瞬膜缩回以增加手术暴露面积。进行鼻腔球结膜环状切开术(nasal peritomy)以暴露巩膜，并使用25G有阀trocar套管(Alcon surgical,Fort Worth USA)在距角膜缘3.5mm处创建4个手术口(输液，枝形吊灯照明和两个工作口)。玻璃体切除术和玻璃体后脱离后，使用25G/38G插管(MedOne Surgical Inc.Sarasota,FL)在视觉带(激光区)中进行局部视网膜脱离(RD)，并在RD的底部进行剪刀切开术。在鼻孔区进行巩膜切开术(2.3-2.5mm)，以容纳移植工具。通过玻璃体切开术将工具的尖端引入视网膜下间隙，借助玻璃体切除术系统(Alconsurgical,Fort Worth USA)的粘性流体注射器装置释放iRPE支架。眼部伤口钳闭合巩膜切开术以维持眼压，同时进行流体空气交换以使分离区变平，这由术中OCT证实。用尼龙8-0封闭硬化切开术。

光学相干断层扫描和荧光素血管造影：在将动物充分麻醉后，将喷气电极(Jet-Electrode)与适量的GenTeal Tears一起放在眼睛上(Alcon Fort Worth TX,NDC 0078-429-47)。OCT使用配有55°透镜的Spectralis(Heidelberg Engineering)进行。感兴趣区域(ROI)置于中心，并且跨ROI进行平均单次B扫描，并且进行覆盖整个ROI的体积OCT扫描。仪器的跟踪功能用于在每个检查时间点在同一视网膜位置进行OCT扫描。通过静脉注射荧光素钠(SF，Akorn Inc，Lake Forest，IL)，Spectralis还用于捕获荧光素血管造影照片。记录早期(第一min)和晚期(15min)血管造影照片。

多焦点视网膜电图(mfERG)：使用RETImap系统(Roland Consult,BrandenburgGermany)记录mfERG。简言之，将双极接触镜(The GoldLens Corneal Electrode,DoranInstruments,Inc；Littleton,MA)放置在眼睛上。将接地电极，Genuine Grass铂皮下针电极(F-E2-12，Natus Manufacturing Limited，Galaway Ireland)放置在动物下巴的皮肤下面。每次记录至少使用3个周期，测量一共3个重叠的视网膜区。在每次记录中，ROI在视场周围略有偏移，以解决光学方面的细微差异。使用10hz的低带通和300hz的高带通。由MATLAB程序确定的7个mfERG成分(mfERG components)为N1(第一个主要波谷)和P1(随后的峰值)幅度(nV/deg

免疫染色和组织学：摘除眼球后，将眼睛置于4％PFA中最多4小时，从而完成用于免疫组织化学的组织制备。切开手术区，并放置在10％蔗糖/PBS中过夜，然后放置在20％蔗糖/PBS中24小时。然后将样品置于2:1OCT:20％蔗糖溶液中，并在低温恒温器模具中快速冷冻，并置于-80冰箱中，直到可以在恒冷箱上进行切片为止。恒冷箱切片以10μm切片进行，组织切片每50μm间隔开。免疫组织化学通常如下进行：5％天然山羊血清(NGS)(ThermoFisher Scientific,Grand Island NY；#31873)封闭溶液2小时，然后将一抗在室温下于1％NHS中孵育过夜。一抗包括：RPE65(1:300,Abcam,Cambridge,MA；ab78036和来自M.Redmond lab/NEI 1:400的定制抗体)，生物素化花生凝集素(PNA)(1:300,VectorLaboratories,Burlingame CA；B-1075)，STEM121(1:300Takara Clontech Mountain ViewCA；Y40410)，STEM101(1:300,Takara Clonetch,Mountain View,CA)，视紫红质(1:10,00,Encor Biotechnology Inc.Gainesville FL,MCA-B630)；红色/绿色视蛋白(1:300Millipore Burlingotn MA；AB5405)；蓝色视蛋白(1:300Millipore Burlingotn MA；AB5407)；iPSC-OCT4(#653704，Biolegend，RRID：AB_2562018)，TRA 1-81(#560124，BDBiosciences)；和SSEA-4(#560126，BD Biosciences)；RPE祖细胞-MITF(#X2397M，Exalpha)，PAX6(#PRB-278P，Covance)；定型的RPE-PMEL17(#HMB45，Dako)，TYRP1(#NBP2-32901，Novus Biologicals)和成熟的RPE-BEST1(#NB300-164，Novus Biologicals)。Ezrin(#E8897，SigmaAldrich)，胶原IV(#ab6311，Abcam)，ALDH1A3(#ab80176,Santa CruzBiotechnology)。过夜孵育后，将组织样品在1％NGS溶液中洗涤3次，然后将对应适当一抗的与荧光标志物Alexa 488、Alexa 555和或Alexa 633(Thermo Fisher Scientific，GrandIsland NY)偶联的二抗在1％NGS溶液中以1：300稀释。然后将载玻片在Zeiss 800共聚焦显微镜或Zeiss Axio Scan Z1载玻片扫描仪上成像。将植入物区(空支架或iRPE贴片)中的核数(DAPI)标准化为相同切片上相应健康区。跨视网膜的相同距离(～400μm)用于植入物区和相应的健康区进行计数。(非配对t检验p<0.05；对于空支架，N＝4，对于iRPE贴片，N＝5)。

实施例2

临床级三阶段方案有效且可重复地产生AMD-iRPE细胞

衍生自AMD患者皮肤成纤维细胞的iPSC在临床级别条件下获得染色体拷贝数变化，很可能在重编程过程中获得(Mandai et al.,N Engl J Med 376,1038-1046(2017))。然而，从年龄大的患者中衍生iPSC时，皮肤成纤维细胞被认为并非理想的起始来源(Kanget al.,Cell Stem Cell 18,625-636(2016))。因此，开发了用于从患者CD34+外周血细胞中获得自体iPSC衍生的RPE贴片的生产工作流程。开发用于临床级AMD患者特异的iPSC-RPE贴片的生成、功能验证和体内检测的管路图(图1A，B)。由于具有祖细胞和增殖特性，从患者外周血中分离出的CD34+细胞可以为iPSC产生提供良好的来源。使用临床级别的附加基因重编程方案，从三名晚期“干性”AMD患者(年龄分别为85、89和87岁)的CD34+细胞和皮肤成纤维细胞生成多个iPSC克隆(Mack,et al.,PLoS One 6,e27956(2011))。在基因上，CD34+细胞衍生的iPSC比皮肤成纤维细胞衍生的iPSC更稳定(Mandai et al.,N Engl J Med376,1038-1046(2017))。从3个iPSC克隆/患者(衍生自CD34+细胞)成功生成了第10代库(表2)。

表2：GMP级AMD iPSC工作库验证。第10代iPSC工作库经验证是无菌的(不含细菌、真菌和支原体)；正常的G带核型分析，多能性标志物的表达(SSEA4、TRA1-60、TRA1-81和OCT4阳性)；丢失重编程质粒的细胞百分比；iPSC与患者材料的同一性。

这些库经过进一步验证：无菌性；SSEA4、TRA1-60、TRA1-81和OCT4的表达超过85％；正常G带核型分析；重编程质粒丢失；匹配的STR鉴定；并将致癌基因序列与患者匹配(表2)。为了确定CD34+细胞来源的iPSC在临床级重编程和扩增过程中是否获得了任何序列改变，对9个iPSC克隆全部223个癌基因的编码区进行测序。8个iPSC克隆与它们各自的供体PBMC匹配，但来自供体2的克隆B(D2B)除外(图1C)。但是，iPSC克隆D2B中的序列变化均与任何已知的癌表型无关(Q2 Solutions，Morrisville，NC)，与Merkle et al不同，在p53抑癌基因的编码区未见突变(Mandai et al.,N Engl J Med 376,1038-1046(2017)；Merkle etal.,Nature 545,229-233(2017))。因此，CD34+细胞可能在重编程期间产生具有最小突变的iPSC，并可用于基于iPSC的自体疗法。使用上述标准，每个供体选择了三个经过验证的iPSC克隆用于iRPE贴片生产。

可以通过激活TGF或典型WNT通路在干细胞衍生的神经外胚层细胞中诱导RPE分化(Idelson et al.,Cell Stem Cell 5,396-408(2009).；Leach,et al.,InvestOphthalmol Vis Sci56,1002-1013(2015)；Lamba,et al.,Proc Natl Acad Sci U S A103,12769-12774(2006)；Reh,et al.,Methods Mol Biol 636,139-153(2010))。为了进一步提高分化的效率和重复性，并使iPSC-RPE生产在临床上相容，对三阶段分化方案进行优化。(图7)。该方案包括以下三个结果：(1)双SMAD抑制促进神经元命运(neuronal-fate)，和FGF通路激活抑制RPE表型(Fuhrmann,Curr Top Dev Biol 93,61-84(2010)；Bharti etal.,PLoS Genet 8,e1002757(2012)；Chambers et al.,Nat Biotechnol 27,275-280(2009)；Meyer et al.,Proc Natl Acad Sci U S A 106,16698-16703(2009))并且基于这些观察，将允许双SMAD和FGF抑制水平组合以促进iPSC进入RPE-始发态(RPE-primed)的神经外胚层细胞，并将分化效率从24％提高至81％(图7B-E)；(2)与已发表的方案相比，TGF或WNT通路的激活以更高的效率和重复性在这些RPE-始发态的神经外胚层中诱导定型的RPE命运(参见Idelson et al.,Cell Stem Cell 5,396-408(2009)；Fuhrmann,Curr Top DevBiol 93,61-84(2010)；Carr et al.,PLoS One 4,e8152(2009))(图7F,G)；和(3)通过在细胞中用PGE2处理诱导初级纤毛以主动抑制典型WNT通路，让定型的RPE成熟。总之，这种三阶段分化方案提高iPSC-RPE分化效率、重复性，并生成成熟的RPE细胞。

为了检测多个iPSC克隆和多个患者之间的临床级别分化方案的重复性，在衍生自所有三名AMD患者的iPSC(每名患者两个iPSC克隆)上进行检测。比较两种不同的起始条件，即3D细胞聚集体相对2D单层分化。2D单层方案的优点是它提高分化效率，并使其与使用者无关(图1B，图7A，M)。尽管在3D和2D方案中以相同数量的细胞开始，但2D方案在诱导细胞上皮表型方面更快。到第(D)12天，细胞表现出上皮形态，促使向RPE定型培养基(RPECM)转移。到D17，在6个克隆中的4个中的超过80％的细胞共表达PAX6/MITF，而小百分比仅表达MITF，证实神经外胚层细胞的RPE-始发态阶段(图1D)。正如预期的那样，到D27时，PAX6/MITF双阳性RPE祖细胞的数量下降到30-40％，仅MITF阳性的细胞数量急剧增加(在所有六个克隆中为20-60％)，这表明向定型RPE群转变。到D42，所有六个iPSC克隆中超过80％的细胞表达MITF，同时伴有PAX6/MITF双阳性群丢失，证实向未成熟RPE表型的转变(图1D)(Idelson etal.,Cell Stem Cell 5,396-408(2009))。相反，在3D方案中，大多数细胞到D42仍为PAX6阳性，表明细胞的祖细胞阶段延长(图7H，I)。通过分析这些基因的下游和已知靶点，进一步证实PAX6和MITF表达细胞的结果(Idelson et al.,Cell Stem Cell 5,396-408(2009)；Fuhrmann,Curr Top Dev Biol 93,61-84(2010))。所有六个iPSC克隆中的大多数细胞在D17时表达RPE祖细胞标志物PMEL17(40-85％)和TYRP1(六个iPSC克隆中20-60％)，并且很少有细胞表达RPE成熟标志物CRALBP和BEST1(图1E)。随着细胞继续成熟，PMEL17和TYRP1的表达在D27时保持稳定，并在细胞富集后到D42在所有六个iPSC克隆中增加至99％以上，证实了细胞纯度(图1E)。相反，CRALBP和BEST1阳性细胞随时间持续增加，在所有六个iPSC克隆中CRALBP超过95％，BEST1超过70％(图1E)。所得的RPE细胞没有可检测的iPSC(没有OCT4或TRA1-81+细胞；图7K，7L)。对涉及RPE色素沉着(GPNMB和TYR)，视觉周期(ALDH1A3、TRPM1、RPE65)和RPE成熟(RPE65和BEST1)的基因的表达分析(Strunnikova et al.,HumanMolecular Genetics 19,2468-2486(2010))证实所有六个AMD-iPSC克隆均以相似的效率分化并逐渐达到成熟，从而突出了临床级分化过程的重复性(图1F)。此外，在四个不同的使用者之间证实了生产工艺的重复性(图7M-7O)。总之，与3D研究级方案相比，2D方案在iPSC-RPE分化方面至少快40％且效率更高。

实施例3

可生物降解的支架有助于临床级AMD-iRPE细胞在功能上成熟为单层组织

假设可生物降解的支架将为RPE细胞分泌细胞外基质(ECM)以形成极化单层提供合适的材料。随着支架的降解，ECM和细胞将组成类似RPE的天然组织，这将增加iRPE贴片在患者眼中长期整合的可能性。临床级过程中使用的支架使用聚(乳酸-共-乙醇酸)(poly-(lactic-co-glycolic acid))/PLGA(50:50乳酸/乙醇酸，IV中点1.0dl/g)生产，平均纤维直径先前显示为350nm以最适合RPE增长(Liu,et al.,Biomaterials 35,2837-2850(2014)；Stanzel et al.,Stem Cell Reports 2,64-77(2014))。选择单层热熔纳米纤维支架用于iRPE贴片生产，因为它的高杨氏模量与易于移植相关(图2A，2B)。如对可生物降解的支架所期望的，它在80-90天后完全降解(SEM证实支架的厚度在D49-10μm；D56-5μm；D63-2-4μm；和D80-90-完全降解；图8A-8H；3C)。通过高RPE65和GPNMB表达以及ECM蛋白COLLAGENIV和VIII的基底分布(图2C中所示的代表性供体3克隆C(D3C))证实，衍生自所有三名患者的iRPE在支架上成熟并极化。这表明iRPE细胞重新合成了新的Bruch膜等效物，支持了我们的假设，即PLGA支架的3D结构将触发iRPE细胞分泌ECM蛋白。

先前，初级RPE和iRPE单层成熟度和功能性已在半透性transwell(聚酯)膜上得到验证(May-Simera et al.,Cell Reports 22,189-205(2018)；Maminishkis et al.,CInvest Ophthalmol Vis Sci 47,3612-3624(2006))。为了确定AMD患者衍生的在PLGA支架和transwell上的临床级iRPE贴片是否表现相似，在两个表面上的D3C iRPE贴片之间进行了结构、分子和功能的比较。TEM和SEM证实存在密集的顶突(具有位于顶部的黑素体)和相邻细胞之间的紧密连接；仅在PLGA支架上检测到了基底内折(basal infoldings)(插图2D；图9A，9B)。与两种贴片类型之间的结构相似性相一致，两个单分子层均表现出相似的电性能(图8C，8D)和关键RPE特异基因OCA2、GPPNB、TYRP1、TRPM1、ALDH1A3、RPE65和BEST1的相似表达，以及与聚酯膜相比，在PLGA支架上的样品之间的变异性较低(图9E)。总之，这些结果表明iRPE在聚酯膜或PLGA支架上成熟相似，但是在PLGA支架上具有天然特征，显示出其优越性。

供体遗传学是iPSC来源的细胞类型变异的最大来源(Miyagishima et al.,StemCells Transl Med 5,1562-1574(2016)；Kajiwara et al.,Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America 109,12538-12543(2012))。为了确定这种差异是否存在于衍生自不同患者的临床级iRPE贴片中，并制定标准以在患者移植前对iRPE贴片进行功能验证，从所有八个iPSC克隆中制备iRPE贴片(图1C)。设计“六角形性”性能度量，以测量iRPE贴片与理想的凸正六角形图案的接近程度(参见实施例1)。在用紧密连接染色获得的图像上进行的iRPE贴片的定量形态学评估(ZO-1，图9F，9G)显示，在所有八个iRPE贴片上都具有相似的六角形性(六角形性评分8.1±0.1；10个中；图9H)，提示来自所有三名患者的iRPE贴片具有相似的上皮表型。来自所有八个iPSC克隆的RPE贴片的基因表达分析表明，RPE标志物的表达相似，并且表明不同患者iRPE之间的RPE单层成熟度相似(图2E)。在来自克隆D3A、D3D、D4A的iRPE贴片成熟的最后三周期间，TER的测量进一步证实了这一结论。所有三个iRPE贴片均显示出TER(250-1000Ohms.cm

终产品中分化细胞的纯度是开发干细胞疗法的目标。为了检查iPSC是否无法在iRPE贴片成熟所使用的培养条件下存活，进行体外加标研究(spiking study)。接种与100％、10％、1％或0％iPSC混合的RPE细胞，并在PLGA支架上培养35天。流式细胞术证实在培养的两天内超过90％的iPSC已经死亡，并且在PLGA支架上的D14之后未检测到iPSC(图10A)。基因表达分析还证实在所有培养物中RPE细胞中不存在iPSC、非RPE细胞以及不存在非RPE谱系标志物(如所预期的，除100％iPSC外；图10B)。总之，体外加标实验证实iPSC不能在RPE成熟条件下存活，并且iRPE贴片所含的iPSC或非RPE细胞水平低于(若有)可检测水平。

实施例4

啮齿动物临床前研究中临床级AMD iRPE贴片安全地整合到眼睛并显示出比细胞悬液更高的有效性

为了检测AMD-iRPE贴片的长期整合性和安全性，将0.5mm直径(～2,500个细胞)的临床级贴片移植到免疫功能低下(Crl:NIH-Foxn1

表3：为证明临床级AMD iPSC-RPE贴片的安全性和有效性而进行的临床前大鼠和猪研究总结

为了比较其有效性，在出生后(p)第21天和第28天之间进行将iRPE贴片和iRPE细胞悬液移植到先前建立的皇家外科医学院(RCS)大鼠模型(35-38)，具有溶媒对照(BSS+或空支架)，直径为0.5mm的iRPE贴片(～2,500个细胞)或悬液中的100,000个iRPE细胞。RPE贴片和细胞悬液均能挽救叠加其上的感光细胞。注意与非移植区相比，移植区中感光细胞外核层(ONL)的厚度增加(箭头标记人细胞，人核抗原/HuNu；人特异性PMEL17；图3G-J)。iRPE贴片和iRPE细胞悬液移植的大鼠视网膜之间ONL厚度的明显差异很可能是因为与悬液中的细胞注射相比，用于递送贴片的手术方法相对更具侵入性。视动(OKN)测量(Douglas etal.,Visual Neuroscience 22,677-684(2005))证实，p90天时，与溶媒对照动物相比，iRPE贴片和iRPE细胞悬液移植动物显示出相似的恢复(图3K；表2)。总之，这些大鼠实验表明，临床级AMD iRPE贴片能够完全整合到啮齿动物眼的视网膜下间隙，而细胞悬液相反，其整合能力有限。贴片上的细胞剂量是悬浮液中细胞的1/40(0.5mm贴片上的2500个细胞对比100,000个iRPE细胞悬液)。尽管有40倍的差异，但iRPE贴片和细胞悬液的OKN恢复相似。因此，与细胞悬液相比，AMD iRPE贴片更有效。

实施例5

人临床剂量的AMD iRPE贴片在激光诱导的RPE损伤猪模型的眼睛中整合并挽救变性的视网膜

在RCS大鼠中，RPE单层功能障碍，但仍存在，这与AMD患者不同。为了在具有萎缩性RPE的动物模型中检测AMD iRPE贴片，利用整个人临床剂量的4×2mm iRPE贴片，对猪激光诱导RPE消融进行了优化。利用黑色素的性质来有效吸收532nm波长，并且使用微脉冲激光来选择性地损伤猪RPE(Sivaprasad,et al.,Surv Ophthalmol 55,516-530(2010))(图4A)。RPE损伤针对猪的视觉带，其包含最高密度的视锥感光细胞(图12A)。由330msec的曝光时间下1％或3％激光占空比(DC)引起的RPE/视网膜损伤的OCT分析显示，激光后24h，RPE在1％DC中分离，在48h，RPE变薄(图4B，4C)，而3％的DC还在激光照射后24h引起视网膜下积液，并在48h时引起RPE/感光细胞外节段界面明显损伤(图12B，12C)。激光前mfERG证实整个视网膜视觉带的电反应相似，而激光后1％和3％的DC激光处理区均显示mfERG信号有相当的降低(图4D，4E，虚线)。通过TUNEL染色结合RPE65和PNA免疫染色在细胞水平上证实了OCT和mfERG结果，结果显示1％和3％DC激光治疗的眼睛均出现凋亡性RPE和感光细胞，与1％DC激光相比，3％下感光细胞的凋亡更高(图4F，4G，箭头图12D，12E)。H&E染色进一步证实，两种激光功率均热损坏RPE，但是1％的DC在24h和48h对感光细胞外节段的损害较小(图4H，4I；12F，12G，箭头)。总之，OCT、mfERG和组织学数据表明，在对猪RPE产生特定损害的同时，保持视网膜电反应，1％的DC微脉冲激光相对于3％是优选的。

为了递送4×2mm贴片，设计具有S形套管的特定移植工具，该套管适合人(或猪)的眼睛曲率，并实现iRPE贴片轻易递送，同时保持其取向(图13A，13B，箭头)。手术包括四口玻璃体切除术、玻璃体和视网膜后脱离、2.5mm视网膜切开术、巩膜切开术扩大以及iRPE贴片在视网膜下的递送(图13C-13F，箭头)。术中光学相干断层扫描(iOCT)证实该贴片的正确视网膜下递送(图13G-13I，箭头)。首先在非免疫抑制、非激光损伤的猪的视网膜下间隙检测无细胞的裸露PLGA支架，以确定PLGA降解产物(乳酸和乙醇酸)是否引起眼睛发炎。手术后两周的猪眼睛OCT证实，空支架可以在最小视网膜损伤的情况下被递送(图13J，箭头)。手术后十周，没有发炎体征，但感光细胞外节段层较薄，并显示出视网膜小管，提示感光细胞的损害可能是因为空支架干扰了来自宿主RPE的营养供应、RPE感光细胞的视觉循环以及感光细胞的外节段的吞噬作用(图13K)。伴随支架降解(手术后5周)，在植入物区上高达80％的N1P1多焦点ERG信号已经恢复，表明由空支架引起的损害最小(图13M)。这些体内结果与降解PLGA支架的乳酸释放曲线一致。在体外培养过程中，83％的乳酸总量从支架释放。其中包括约70％的乳酸在我们PLGA支架的整体降解阶段(bulk degradation phase)释放，该阶段从第3周开始，直到第5周结束，而支架仍在培养中(表4)。此外，在整体降解阶段，支架释放的乳酸量最高(0.0074±0.0014mmol/L/支架/天)，比血液中乳酸的全身浓度(2.3mmol/L)低310倍(Wacharasint,et al.,Shock 38,4-10(2012))和比眼睛中RPE顶表面处的乳酸浓度低513倍(Adler and Southwick,Ophthalmic Res 24,243-252(1992))。总体上，该数据证实PLGA支架在猪眼睛的视网膜下间隙中无炎性，并且新开发的移植工具可以安全地递送贴片。

表4.PLGA支架在降解过程中释放的乳酸。第1-35天是支架的体外阶段，第35天以后是体内移植后的阶段。灰色突出显示了PLGA支架整体降解阶段的天数(第19-36天)。注：支架的整体降解在体外发生。

移植表达GFP的iRPE贴片的猪眼睛的眼底成像证实人细胞存活10周(图14A-14C，箭头)，这通过使用泼尼松、强力霉素和米诺环素抑制全身和常驻的先天免疫应答，以及他克莫司和西罗莫司抑制适应性免疫应答来实现(Santa-Cecília et al.,Neurotox Res29,447-459(2016)；Scholz et al.,J Neuroinflammation 12,209(2015)；Swijnenburget al.,Proc Natl Acad Sci U S A 105,12991-12996(2008)；Xian and Huang,StemCell Res Ther 6,161(2015))。这种可能性是，一旦可生物降解的PLGA支架降解，人临床剂量的AMD患者衍生的iRPE贴片就可以在猪的Bruch膜上整合并且有效。将4×2mm贴片移植到猪眼睛中激光诱导RPE消融的区域上。OCT证实，随着PLGA支架在10周内降解，临床级iRPE膜在猪眼睛中整合，并且，与移植空PLGA支架的动物相比(其中有明显的视网膜小管)，iRPE贴片上方的视网膜维持内和外视网膜层(图5A-C；5B和5E中的箭头)。免疫染色证实AMD-iRPE贴片在激光损伤的猪眼中整合以及移植细胞的成熟表型，这已通过iRPE细胞中的强RPE65免疫染色得到证实(STEM121；RPE65，图5D-F，图14D-14F)。与空支架移植的视网膜相比，PNA染色证实与iRPE贴片移植的视网膜相比，感光细胞外节段的组织得到改善(白色PNA，图5D-F)。

为了定量空支架移植和iRPE贴片移植之间感光细胞挽救的差异，计算两个移植区上方的ONL中感光细胞核的数量，并将结果与邻近的健康视网膜进行比较。分析表明，在空支架上的ONL中，核数为相邻健康区的42％，而在iRPE贴片区中，核数为健康区的73％(p<0.05，T-检验；图14G)。为了排除STEM121标记不是由猪RPE吞噬人iRPE细胞引起的可能性，对细胞核特异性人抗原(STEM101)进行免疫染色(图14H)。该数据显示仅在RPE的一部分中进行了特定的核标记，从而提供了人iRPE贴片在猪眼睛中整合的额外证据。

因为在猪眼睛的视觉带区(visual streak area)进行了激光损伤和随后的iRPE贴片移植，所以可以确定人RPE细胞是否能够保存猪锥状感光细胞。对特定视锥蛋白(S、L和M)的免疫染色证实了在iRPE贴片区上方保留了猪视锥感光细胞(图5G，箭头)。为了检测人iRPE贴片在猪眼睛中的功能整合，检测了人RPE细胞是否能够吞噬猪感光细胞外节段(POS)。健康猪视网膜和移植临床级人iRPE贴片的视网膜的视紫红质染色显示了人RPE细胞内的POS吞噬，这与天然猪RPE相似(图5H，I中的箭头)。视锥感光细胞的保留和人RPE在猪眼睛中的功能整合，促使对iRPE贴片区上激光损伤的猪视网膜电反应的恢复情况进行检测。与移植空支架的猪相比，mfERG反应的热图显示，在移植iRPE贴片的激光损伤的视觉带区上，信号有所改善(图5J-L)。为了解决关于激光损伤的位置和程度对iRPE贴片的影响的区变异性的问题，使用所有mfERG成分的线性混合效应(LME)分析。对所有mfERG成分(N1、N1宽度、P1、P1宽度、N1P1、曲线下面积(AUC)和标量积)的LME分析显示，在10周内，iRPE贴片和空贴片之间存在显著差异(p<0.05)(图5M)。该观察结果在曲线下面积的线性回归分析中得到了进一步证实，该线性回归分析还显示了两组之间的显著差异(图5N，y截距差异，p＜0.05)。总之，这些结果证实在猪RPE激光损伤后，临床级AMD-iRPE贴片与猪视网膜整合并拯救猪感光细胞，并且来自不同患者的iRPE贴片显示出相似的有效性反应。

为了进行PLGA-iRPE贴片和transwell-iRPE贴片(不可降解的transwell膜)以及iRPE细胞悬液和空支架的比较分析，在具有激光消融的RPE的猪中检测全部四个移植物(图15A-I)。术后两周，OCT证实所有四种移植物均正确递送，炎症体征极少(图6A-D)。术后两周，OCT证实所有四次移植均正确递送，炎症体征极少(图6A-D)。手术后五周，空支架和iRPE悬液显示了视网膜外核层和外界膜中的破坏以及使人想起经常在变性视网膜中看到的外层视网膜小管(47)的结构(图6E,H中的箭头)。相反，OCT表明，覆盖在iRPE膜上的视网膜(PLGA和transwell)均未表现出任何如此视网膜小管，并且外核层和外边界膜均完好无损(图6F，G)。对于每种处理评估的所有三只猪，OCT分析均一致。PLGA-iRPE贴片的免疫组织化学证实人RPE细胞成熟表型在猪眼睛后部的整合和移植后维持性(比较6I-K；白色，STEM121，人特异性；灰色，RPE65)和在人iRPE贴片上方但不在空支架或细胞悬液移植物上方维持感光细胞的数量。(PNA，感光细胞；图6I-L；图8SD-1；表2)。相反，如在OCT中所见，空支架和iRPE悬液上方的ONL显示出管形成和变性(图6I中的箭头)。此外，与iRPE贴片不同，悬液中的iRPE细胞失去RPE成熟标志物RPE65的表达(图6L中的箭头)。不受理论的束缚，这很可能是因为胰蛋白酶处理的RPE细胞，如果不重新组织成汇合的单层，将无法维持稳定的上皮表型(Radeke et al.,Genome Med 7,58(2015))。与OCT和免疫染色数据一致，与空PLGA支架或iRPE细胞悬液相比，mfERG证实在PLGA-iRPE贴片和transwell-iRPE贴片的激光区中，在5周内，mfERG单个波形和整合数据的恢复更高(图6M，N)。这些结果表明，单层iRPE贴片在挽救激光损伤的猪眼中的视网膜变性方面优于细胞悬液。

成功的自体细胞疗法需要高效且可重复的生产工艺，以产生安全有效的产品。公开的临床级过程提供了生产工艺的重复性，并确保了临床产品的安全性和有效性(Schwartz et al.,Lancet 385,509-516(2015)；Mandai et al.,N Engl J Med 376,1038-1046(2017)；Kamao et al.,Stem Cell Reports 2,205-218(2014))。生产工艺使用三名晚期AMD(地图样萎缩)患者的CD34+细胞开发(Mack,et al.,PLoS One 6,e27956(2011)；Badenes et al.,PLoS One 11,e0155296(2016)；Badenes et al.,PLoS One 11,e0151264(2016))。临床级iPSC的第10代工作库已生成，每名患者多至3个库，以验证iPSC关键质量属性(表2)。

除了其多能性和正确的G带核型分析外，还有两个安全性属性，特别是重编程质粒丢失和癌基因测序。来自三名患者的所有九个克隆均在第10代中丢失重编程质粒。不受理论的束缚，这可能是因为使用低拷贝数的基于复制的质粒的EBNA起源(Carr et al.,PLoSOne 4,e8152(2009))。iPSC克隆中没有在重编程或扩增过程中获得任何致癌突变，并且9个iPSC克隆中有8个未观察到序列变化(Kwon et al.,Proc Natl Acad Sci U S A 114,1964-1969(2017))(图1C)。

一个显示几个序列和拷贝数变化的iPSC克隆D2B也显示了iRPE贴片功能输出的变化(图2H)。不受理论的束缚，这些序列变化可能是在iRPE贴片水平上功能输出变化的原因。可以执行iPSC致癌基因测序和检测制品功能分析的组合，以鉴定iPSC的可移植衍生物。

证明了在可生物降解的基于PLGA的支架上，iPSC临床级分化为成熟和极化的RPE贴片(图1，2)。iPSC分化为可移植RPE贴片需要约10周的时间(Kamao et al.,Stem CellReports 2,205-218(2014))。该过程是不依赖于使用者(图7M-7O)，并且可扩展到多个iPSC克隆(图1，2)。PCA建议，患者遗传学可能是导致任何变异的最大单一因素。尽管源自不同患者的iRPE贴片显示出不同的功能反应，但可以对这些贴片进行功能验证以产生可移植产品。

与ESC-RPE悬液相比(Schwartz et al.,Lancet 379,713-720(2012)；Schwartzet al.,Lancet 385,509-516(2015))，iRPE贴片包含完全极化的单层细胞，它们在免疫诱导的RPE损伤后整合到免疫功能低下大鼠和猪的Bruch膜中(图3C，3H，3J，5D-5I，6I-6L)。这一结果可能反映了iRPE对PLGA支架连续降解和ECM产生的协调作用，这有助于与宿主Bruch膜整合。结果表明，PLGA支架上的iRPE细胞产生了Bruch膜蛋白胶原IV和胶原VIII(图2C)。此外，与可能无法执行大多数RPE功能的细胞悬液不同，PLGA-iRPE贴片和transwell-iRPE贴片上的极化RPE单层执行了许多RPE功能(图2，图9。总之，iRPE贴片的这些特性表明了一种使用贴片方法而看到的改善功效的作用方式。激光损伤猪模型中的RPE消融类似于经历地图样萎缩的晚期AMD眼中RPE缺失(Bird,et al.,JAMA Ophthalmol 132,338-345(2014))。因此，在AMD患者中，移植的iRPE贴片的整合可以使用分泌金属蛋白酶的“年轻的”iRPE细胞，其可以修饰“老化的”Bruch膜(Greene,et al.,Journal of OcularPharmacology and Therapeutics:The Official Journal of the Association forOcular Pharmacology and Therapeutics 33,132-140(2017).)。与PLGA-iRPE贴片和transwell-iRPE贴片相比，RPE细胞悬液仅表现出偶然整合，如先前的建议(Weisz et al.,Retina(Philadelphia,Pa.)19,540-545(1999))(图3C，F)。

尽管RCS大鼠模型和猪激光诱导的RPE损伤模型无法完全概括AMD的病理生理，但这些模型为AMD患者衍生的iRPE细胞的存活、整合和潜在有效性提供了重要见解(图3-6)。在啮齿动物和猪中，使用RPE悬液和iRPE贴片恢复视网膜功能具有差异。从细胞悬液(100,000个细胞)和iPSC-RPE贴片(2,500个细胞)中均观察到相似程度的视觉功能挽救。悬液中的细胞未在大鼠眼睛后部形成完整的极化单层细胞，而是充当同位(isotopically)分泌神经营养因子的化学生物反应器。与细胞悬液不同，整个RPE贴片是极化的细胞单层，可整合到大鼠眼睛内，同时满足上方感光细胞的需求，同时保持其与脉络膜的界面完整性。在以4×2mm贴片中相同数量细胞v/s 100,000个细胞悬液移植了的猪中，使用该贴片可以显著提高对感光细胞的保护。此外，来自不同AMD患者的临床级iRPE贴片的表现相似(图5)，表明可重复的生产工艺。

因此，本文提供了更稳健的临床级生产工艺和在可生物降解支架上的RPE贴片，以实现更好的整合和功能。

实施例6

白化病iPSC中CRISPR介导的基因修正

获得患者iPSC，其在OCA2基因中包含杂合的c.593C>T(p.P198L)，导致该基因的活性丧失。使用CRISPR/Cas9技术修正此突变。从商业来源设计并获得向导RNA，使其接近OCA2基因中c.593C>T突变的确切基因组位置。商业上也获得了在该位置上含有野生型序列的供体质粒。供体质粒还包含嘌呤霉素选择盒和编码绿色荧光蛋白(GFP)的cDNA。向导RNA、野生型供体质粒和CAS9蛋白编码质粒均使用lipofectamine试剂(ThermoFisher)转染到iPSC中。选择并扩增抗嘌呤霉素的iPSC集落。选定的集落通过流式细胞术针对GFP进一步纯化。通过测序证实突变修正。然后使用以上公开的方法将修正的iPSC分化为RPE贴片。

在图16中，上图显示了突变区周围的区的序列(SEQ ID NO:1，其中X是C或T)。注：双峰，一个是胞嘧啶峰，一个是胸苷峰，表明患者在该位置是杂合的。下图显示在基因修正后，仅有核苷酸胞嘧啶的一个峰(SEQ ID NO:1，其中X是C)。

如图17所示，当来自患者iPSC系的RPE细胞分化为RPE贴片时，这些细胞保持无色素沉着，因为它们缺乏OCA2蛋白产物的活性。相反，当CRISPR修正的iPSC分化为RPE贴片时，它们有色素沉着。因此，RPE贴片技术可与基因工程化的细胞良好配合，可用于治疗单基因疾病患者。图18还显示了OCA2患者的RPE，以及CRISPR修正的RPE。

显而易见的是，在不背离所描述的本发明的精神的情况下，可以改变或修改所描述的方法或组合物的精确详情。我们要求落入所附权利要求的范围和精神内的所有此类修改和变型。

序列表

<110> 美国政府（由卫生和人类服务部的部长所代表）

<120> 可生物降解的组织置换植入物及其用途

<130> 4239-101522-02

<150> 62/769,484

<151> 2018-11-19

<160> 2

<170> PatentIn 3.5 version

<210> 1

<211> 13

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 1

cagaaayggg att 13

<210> 2

<211> 13

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 2

cagaaacggg att 13