一种新型rpoB基因SNP位点引起利福平抗性的精准检测方法及其应用

技术领域

本发明涉及环境和生物检测技术领域，尤其是涉及一种新型rpoB基因SNP位点引起利福平抗性的精准检测方法及其应用。

背景技术

近年来，随着抗生素的不规范使用，细菌耐药性问题日趋严重，多重耐药细菌和超级细菌的滋生和蔓延使得现有抗生素药效显著降低甚至彻底失效，进而增加了治疗难度和成本，对人类的生命健康造成巨大威胁。因此，对细菌耐药性及其形成机制的检测有助于提高人们对细菌耐药性的认知，进而更好的预防和解决细菌耐药性问题。

细菌耐药性是指细菌对现有抗菌药物的耐受作用，其产生机制主要包括：1)降低细胞膜的通透性和生物被膜的形成进而减少抗生素进入胞内；2)细菌合成钝化酶进而弱化或者使抗生素完全失去抗菌活性；3)细菌通过主动外排机制排除胞内抗生素；4)抗生素作用靶点的基因突变使其与抗生素的结合作用减弱。利福平是一类利福霉素类广谱抗生素，对革兰氏阳性或阴性细菌具有较强的抗菌活性。利福平主要是与RNA多聚酶的β亚基结合，抑制细菌RNA的合成，进而起到杀菌作用。现有已知的利福平抗性主要是由rpoB基因上的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点引起的，该位点主要位于该基因507-533位氨基酸和563-572位氨基酸，但对于新型SNP突变位点导致利福平抗性的研究尚有欠缺。目前应用较为广泛的SNP位点检测技术主要是PCR技术，然而rpoB基因全长约有3.5kb，容易出现PCR偏好性导致的碱基错配，进而无法明确判断SNP位点是PCR过程中产生的还是自身突变的结果。因此，精准识别菌株rpoB基因上SNP位点信息有助于发现新型SNP位点且有利于快速判断菌株是否带有利福霉素类抗生素抗性。

发明内容

为了解决上述背景技术中所提出的问题，本发明的目的在于提供一种新型rpoB基因SNP位点引起利福平抗性的精准检测方法及其应用，该方法操作简单易行，可对ropB基因上SNP位点进行精准识别。

为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案为：一方面，本发明提供了一种新型rpoB基因SNP位点引起利福平抗性的精准检测方法，包括以下步骤：

(1)菌株的收集；

(2)基因组DNA提取；

(3)基因组测序；

(4)基因组的组装与注释；

(5)精准获得SNP位点信息。

进一步地，所述菌株包括不同利福平抗性菌株。

进一步地，步骤(1)中所述菌株菌体的收集为：将过夜培养的菌液通过6000-8000rpm，4℃离心5-10分钟，弃上清后收集沉淀。

进一步地，步骤(3)中所述基因组测序采用的平台为Nanopore PromethION和Illumina NovaSeq 6000。

进一步地，步骤(4)中所述基因组的组装为通过采用Unicycler软件对样品质控后的测序数据进行混合组装，获得菌株的完整基因组数据。

进一步地，所述Unicycler软件的具体参数如下：unicycler-1ATCC25923_1.fq-2ATCC25923_2.fq-l ATCC25923.nano.fq-o ATCC25923-t 46--mode normal–min_polish_size 2000；其中ATCC25923_1.fq和ATCC25923_2.fq为Illlumina测序的双端数据，ATCC25923.nano.fq为Nanopore测序数据。

进一步地，步骤(4)中所述基因组的注释为通过利用Prokka软件对获得的菌株的完整基因组数据进行注释。

进一步地，所述Prokka软件的具体参数如下：prokka ATCC25923.fa--cpus 20--outdir 25923_annotation--prefix 25923--kingdom Bacteria；其中ATCC25923.fa为unicycler混合组装获得的基因组。

进一步地，步骤(5)中所述精准获得SNP位点信息为从注释结果中提取不同菌株的rpoB基因核酸序列及其编码蛋白序列，使用DNAMAN软件将不同菌株进行序列比对，精准获得SNP位点信息，进而得到引起利福平抗性的新型rpoB基因SNP位点。

另一方面，本发明提供了一种上述任一所述的新型rpoB基因SNP位点引起利福平抗性的精准检测方法的应用，用于引起利福平抗性的新型rpoB基因SNP位点的精准检测。

与现有的检测技术相比较，本发明具有如下显著特征和优点：

本发明采用Nanopore和Illumina测序技术，测序通量更高、读长更长、精确度更高，组装过程中可对数据进行自我校准，获得的基因组准确度更高，进而能够获得更加精准的SNP位点信息，有效避免了PCR扩增过程中错配率问题对检测结果的干扰，进而能够精准识别引起利福平抗性的新型SNP位点。

附图说明

图1是利福平对本发明实施例1中菌株的MIC值。

图2是本发明实施例3中不同菌株rpoB基因核酸序列。

图3是本发明实施例3中不同菌株rpoB基因编码蛋白序列。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的实施方法及结果分析进行详细地描述，以充分地理解本发明的特点和效果。这里需指出的是，所描述的实施例是叙述性的，不限定全部实施例，不能以此限定本发明的保护范围。

本发明提供了一种新型rpoB基因SNP位点引起利福平抗性的精准检测方法及其应用，包括菌株的收集及其基因组DNA提取、Nanopore和Illumina测序和生物信息学分析，所述菌株包括不同利福平抗性的纯培养菌株；所述菌株菌体的收集和基因组DNA提取方式如下：将2ml过夜培养的菌液通过6000rpm，4℃离心5分钟，弃上清后收集沉淀，使用BacteriaDNA Kit试剂盒完成其基因组DNA的提取；所述的Nanopore和Illumina测序平台分别为PromethION和NovaSeq 6000；所述的生物信息学分析主要是通过Unicycler软件对样品的测序数据进行混合组装，获得菌株的完整基因组数据，再经过Prokka软件对获得的基因组进行注释，利用DANMAN软件对注释结果中不同菌株的rpoB基因进行比对获得SNP位点信息。

优选的，所述Unicycler软件的具体参数如下：unicycler-1ATCC25923_1.fq-2ATCC25923_2.fq-l ATCC25923.nano.fq-o ATCC25923-t 46--mode normal–min_polish_size 2000，其中ATCC25923_1.fq和ATCC25923_2.fq为Illlumina测序的双端数据，ATCC25923.nano.fq为Nanopore测序数据；

优选的，所述Prokka软件的具体参数如下：prokka ATCC25923.fa--cpus 20--outdir 25923_annotation--prefix 25923--kingdom Bacteria，其中ATCC25923.fa为unicycler混合组装获得的基因组。

实施例1：不同利福平抗性纯培养菌株基因组DNA的提取和测序

这里以利福平敏感型模式菌株Staphylococcus aureus ATCC25923和具有利福平抗性的抗性菌株Staphylococcus aureus li4为例。如图1所示利福平对敏感型模式菌株S.aureus ATCC25923和利福平抗性菌株S.aureus li4的最小抑制浓度(MIC)分别为0.016μg/ml和256μg/ml。将2ml过夜培养的菌液通过6000rpm，4℃离心5分钟，弃上清后收集沉淀，使用Bacteria DNA Kit试剂盒完成其基因组DNA的提取，通过1％的琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop One超微量分光光度计(Thermo Fisher Scientific,USA)检验基因组DNA的完整性和浓度，随后将获得的基因组DNA送至北京诺禾致源生物信息科技有限公司利用Nanopore PromethION和Illumina NovaSeq 6000平台对其进行测序。

实施例2：菌株基因组的组装与注释

对实施例1中获得的测序数据进行质控获得clean data，随后采用Unicycler软件对样品的测序数据进行混合组装，获得菌株的完整基因组数据，所述Unicycler软件的具体参数如下：

unicycler-1ATCC25923_1.fq-2ATCC25923_2.fq-l ATCC25923.nano.fq-oATCC25923-t46--mode normal–min_polish_size 2000

其中ATCC25923_1.fq和ATCC25923_2.fq为Illlumina测序的双端数据，ATCC25923.nano.fq为Nanopore测序结果。

随后利用Prokka软件对获得的基因组进行注释，所述Prokka软件的具体参数如下：

prokka ATCC25923.fa--cpus 20--outdir 25923_annotation--prefix 25923--kingdom Bacteria

其中ATCC25923.fa为unicycler混合组装获得的基因组。

实施例3：基于DNAMAN软件精准识别rpoB基因上SNP位点

分别从实施例2得到的注释结果中提取S.aureus ATCC25923和S.aureus li4的rpoB基因核酸序列及其编码蛋白序列，使用DNAMAN软件进行序列比对，获得SNP位点信息。如图2所示，相比较于敏感菌株S.aureus ATCC25923，菌株S.aureus li4的rpoB基因上有三处SNP位点，第1412位碱基由A突变为G，第1457为碱基由C突变为T，第2256位碱基由G突变为A，这三处SNP位点导致相应位置的氨基酸发生错义突变，如图3所示，这三处SNP位点分别导致第471位氨基酸天冬氨酸突变成了甘氨酸，第486位氨基酸丝氨酸突变成了亮氨酸，第752位氨基酸蛋氨酸突变成了异亮氨酸，而这些SNP位点均不在现有已发现的范围之内(第507-533位氨基酸和第563-572位氨基酸)，表明这些SNP位点为新型SNP位点，而这些SNP位点的产生导致了菌株具有较高的利福平抗性。

上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所述技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。