棒状细菌转化体以及使用其的2-苯基乙醇的制造方法

技术领域

本发明涉及2-苯基乙醇生产技术。更详细而言，本发明涉及为了赋予2-苯基乙醇生产功能而实施特定基因操作得到的谷氨酸棒状杆菌的转化体、以及使用该转化体的有效的2-苯基乙醇的制造技术。

背景技术

2-苯基乙醇具有玫瑰样香味，广泛用于化妆品、香料和芳香剂等。

目前，工业上利用的2-苯基乙醇主要通过以原油为原料的有机合成法来制造。另一方面，由玫瑰花等植物原料提取·制造2-苯基乙醇，原料的确保、提取效率等存在问题，因此非常少。

从原油价格的高涨、供给不稳、减少来自地球环境的温室效应气体排放的观点出发，从原油转变为生物质原料，以使用微生物的对于环境友好的生物工艺为基础的发酵生产备受关注。例如在马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)中存在Ehrlich途径，可由氨基酸之一苯丙氨酸生产2-苯基乙醇。

但是，成为原料的苯丙氨酸作为必需氨基酸被用作食品添加物、饲料添加物，比葡萄糖等糖原料昂贵，因此不适合作为2-苯基乙醇生产用原料进行产业利用。

非专利文献1报告了使用以下酵母基因重组体，由葡萄糖生产1.3g/L(约11mM)的2-苯基乙醇，其中，上述酵母基因重组体以赋予了苯丙氨酸类似物抗性的马克斯克鲁维酵母为宿主，高度表达苯丙酮酸脱羧酶基因(aro10)和醇脱氢酶基因(adh2)，且导入编码来自病原菌肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)的3-脱氧-D-阿拉伯庚糖酮酸-7-磷酸(3-deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphate，DAHP)合酶的反馈抑制型突变体的aroG(fbr)而得到的。

非专利文献2公开了使用导入有酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的2-酮酸脱羧酶(kdc)基因的大肠杆菌，由葡萄糖生产2-苯基乙醇的方法。非专利文献2报告了由葡萄糖生产约8mM的2-苯基乙醇。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1:Kim TY,Lee SW,Oh MK.Biosynthesis of 2-phenylethanol fromglucose with genetically engineered Kluyveromyces marxianus.EnzymeMicrob.Technol.61-62:44-47(2014).

非专利文献2:Guo D,Zhang L,Kong S,Liu Z,Li X,Pan H.Metabolicengineering of Escherichia coli for production of 2-phenylethanol and 2-phenylethyl acetate from glucose.J Agric Food Chem.66:5886-5891(2018).

发明内容

鉴于上述背景，期望由葡萄糖等廉价的糖原料更高效生产2-苯基乙醇。但是，由葡萄糖等糖原料开始的2-苯基乙醇生物合成途径由数十个以上的多阶段步骤构成，另外，存在受到各种反馈控制、转录控制的课题。此外，2-苯基乙醇显示的强细胞毒性使得利用生物法的高生产更加困难。

本发明提供一种能够高浓度生产2-苯基乙醇的微生物，此外，本发明提供一种以糖类为原料高效制造2-苯基乙醇的方法。

在一个方式中，本发明涉及棒状细菌转化体，其经过莽草酸途径的活化，并且编码具有苯丙酮酸脱羧酶活性的酶的基因以能够表达的方式被导入了所述棒状细菌转化体。

在另一个方式中，本发明涉及2-苯基乙醇的制造方法，其包括使本发明涉及的棒状细菌转化体在包含糖类的水中反应的工序。

根据本发明，在一个或多个实施方式中，可使用棒状细菌由糖类高效生产2-苯基乙醇。

附图说明

图1是表示有氧培养条件下的2-苯基乙醇的生产的图。

图2是表示有氧反应条件下的基于树脂吸附的2-苯基乙醇的生产的图。

图3是表示作为2-苯基乙醇生产宿主的适应性试验的图。

具体实施方式

本发明人等发现，棒状细菌对2-苯基乙醇的抗性与马克斯克鲁维酵母、大肠杆菌、作为耐溶剂菌已知的恶臭假单胞菌S12(Pseudomonas putida S12)相比优异。并且，将其作为宿主进行莽草酸途径的强化和苯丙酮酸脱羧酶基因的导入，从而实现创制可由糖原料高效生产2-苯基乙醇的棒状细菌转化体以及使用其的2-苯基乙醇的高效生产。

以下，详细说明本发明。

(I)具有2-苯基乙醇生产能力的转化体

在一个方式中，本发明涉及的转化体是经过莽草酸途径的活化的棒状细菌转化体，并且编码具有苯丙酮酸脱羧酶活性的酶的基因以能够表达的方式被导入了所述棒状细菌转化体。根据本发明涉及的转化体，可生产2-苯基乙醇。

应予说明，在本发明中，作为向棒状细菌中导入基因的方法，可以是导入质粒，也可以是向基因组整合。

宿主

在一个或多个实施方式中，作为宿主使用的棒状细菌为谷氨酸棒状杆菌。谷氨酸棒状杆菌是伯杰氏鉴定细菌学手册〔Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology，Vol.8，599(1974)〕定义的一组微生物。

具体而言，可举出谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)R(FERM BP-18976)、ATCC13032、ATCC13869(DSM1412)、ATCC13058、ATCC13059、ATCC13060、ATCC13232、ATCC13286、ATCC13287、ATCC13655、ATCC13745、ATCC13746、ATCC13761、ATCC14020、ATCC31831、MJ-233(FERM BP-1497)或MJ-233AB-41(FERM BP-1498)等菌株。其中，优选R(FERM BP-18976)株、ATCC13032株和ATCC13869(DSM1412)，更优选R(FERM BP-18976)株。

应予说明，根据分子生物学的分类，黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、乳酸发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)、叉开短杆菌(Brevibacteriumdivaricatum)和百合棒状杆菌(Corynebacterium lilium)等棒状细菌的菌名也统一为谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)，因此包含在本发明中。

另外，从提高2-苯基乙醇生产的观点出发，作为宿主的棒状细菌优选阻断2-苯基乙醇生产途径的副产物生产途径，更优选破坏ldh(乳酸脱氢酶)基因、qsuB(3-脱氢莽草酸脱氢酶)基因、hdpA(二羟丙酮磷酸酶)基因和cgR#1237基因(苯丙氨酸摄取转运蛋白)的全部或一部分。

此外，从相同的观点出发，作为宿主的棒状细菌优选降低磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的消耗，具体而言，更优选破坏作为葡萄糖摄取转运蛋白的亚基之一的ptsH(磷酸烯醇丙酮酸依赖性糖磷酸转移酶系统)基因，取而代之表达iolT1(肌醇促进剂：Myo-inositolfacilitator)基因。进一步优选的是，IolT1高度表达葡萄糖激酶(ATP依赖性和多磷酸依赖性中的任一者或两者)的酶基因，上述酶基因使摄取到细胞内的葡萄糖磷酸化。

苯丙酮酸脱羧酶(pdc)基因

苯丙酮酸脱羧酶(EC4.1.1.43)是催化由苯丙酮酸生产苯乙醛的反应的酶。即使是吲哚-3-丙酮酸脱羧酶(EC4.1.1.74)或支链-2-含氧酸脱羧酶(EC4.1.1.72)，只要能够催化本反应，就可适用于2-苯基乙醇的生产。

作为编码具有苯丙酮酸脱羧酶活性的酶的基因的一个或多个实施方式，可举出ipd(吲哚-3-丙酮酸脱羧酶)C、kivd(α-酮异戊酸脱羧酶)、kdc(α-酮酸脱羧酶)A、aro10(苯丙酮酸脱羧酶)和pdc(丙酮酸脱羧酶)等基因。

该基因的来源为微生物、包含玫瑰的植物、或动物等，没有特别限定，从2-苯基乙醇的生产率的观点出发，优选举出ipdC基因，更优选举出肠杆菌属细菌的ipdC基因或其同源基因，进一步优选举出阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)的ipdC基因或其同源基因。也可以应用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的aro10基因或其同源基因。苯丙酮酸脱羧酶活性可通过公知的方法测定，例如〔Weiss,P.,M.,Characterization ofphenylpyruvate decarboxylase,involved in auxin production of Azospirillumbrasilense.J.Bacteriol.189:7626-7633(2007)〕。

作为阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)的ipdC基因的一个或多个实施方式，为编码具有苯丙酮酸脱羧酶活性的酶的基因，且可举出：(a)具有序列号1的碱基序列的基因，(b)具有在序列号1的碱基序列中缺失、替换或增添1个或多个碱基而得到的碱基序列、且具有相对于序列号1的碱基序列为45％以上的一致性的碱基序列的基因、或者(c)在严格的条件下与具有以下碱基序列的基因杂交的基因：上述碱基序列为与具有序列号1记载的碱基序列的基因互补的碱基序列。

在一个或多个实施方式中，作为上述一致性，可举出50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、97％以上或98％以上。

作为上述严格的条件，是指通常的条件，例如Molecular Cloning,A LaboratoryManual,Second Edition,1989,Vol2,p11.45记载的条件。具体而言，是指在比完全杂交体的熔解温度(Tm)低5～10℃的温度发生杂交的情形。

莽草酸途径的活化

从提高2-苯基乙醇生产的观点出发，优选作为宿主的棒状细菌的莽草酸途径被活化。在一个或多个实施方式中，本发明的莽草酸途径的活化为莽草酸途径的强化，在另一个或多个实施方式中，包含导入参与莽草酸途径的基因而引起的异源表达和/或表达亢进。

在本发明中，在一个或多个实施方式中，莽草酸途径的活化包括：将选自以下基因中的至少1种基因导入到作为宿主的棒状细菌中，编码具有3-脱氧-D-阿拉伯庚糖酮酸-7-磷酸(DAHP)合酶活性的酶的基因、编码具有分支酸变位酶活性和预苯酸脱水酶活性中的至少一者的酶的基因、以及编码具有莽草酸激酶活性的酶的基因。

应予说明，在本发明中，与莽草酸途径相关的基因可以不限于上述，也可以导入其它与莽草酸途径相关的基因。

3-脱氧-D-阿拉伯庚糖酮酸-7-磷酸(DAHP)合酶

DAHP合酶是催化由PEP(磷酸烯醇丙酮酸)和E4P(赤藓糖-4-磷酸)生产DAHP的反应的酶。作为编码具有DAHP合酶活性的酶的基因，其来源为微生物、包含玫瑰的植物、动物等，没有特别限定，可举出DAHP合酶aroF、aroG和aroH、其直系同源物等，从2-苯基乙醇的生产率的观点出发，优选举出抗反馈抑制性突变型aroG基因或其同源基因，更优选举出源自大肠杆菌(Escherichia coli)这类埃希氏菌属细菌的抗反馈抑制性突变型aroG基因或其同源基因。

DAHP合酶活性可通过公知的方法测定，例如〔Liu YJ,Li PP,Zhao KX,Wang BJ,Jiang CY,Drake HL,Liu SJ.Corynebacterium glutamicum contains 3-deoxy-D-arabino-heptulosonate 7-phosphate synthases that display novel biochemicalfeatures.Appl Environ Microbiol.74:5497-503(2008).〕。

分支酸变位酶/预苯酸脱水酶

分支酸变位酶(EC 5.4.99.5)/预苯酸脱水酶(EC 4.2.1.51)是催化由分支酸生产苯丙酮酸的反应的双功能酶。作为编码具有分支酸变位酶/预苯酸脱水酶活性的酶的基因，其来源为微生物、包含玫瑰的植物、动物等，没有特别限定，从2-苯基乙醇的生产率的观点出发，优选举出抗反馈抑制性突变型pheA基因，更优选举出来自于大肠杆菌这类埃希氏菌属细菌的基因。

分支酸变位酶、预苯酸脱水酶基因也可分别应用单独的基因，更优选分别为抗反馈抑制性突变型。

分支酸变位酶活性和预苯酸脱水酶活性可通过公知的方法测定，例如〔Zhou H,Liao X,Wang T,Du G,Chen J.Enhanced l-phenylalanine biosynthesis by co-expression of pheA(fbr)and aroF(wt).Bioresour Technol.101:4151-4156(2010).〕。

莽草酸激酶

莽草酸激酶(EC 2.7.1.71)是催化由莽草酸生产莽草酸-3-磷酸的反应的酶。

作为编码该酶的基因，其来源为微生物、包含玫瑰的植物或动物等，没有特别限定，从2-苯基乙醇的生产率的观点出发，优选举出aroL(莽草酸激酶)基因，更优选举出大肠杆菌这类埃希氏菌属细菌的aroL基因或其同源基因，进一步优选举出大肠杆菌的aroL基因或其同源基因。可以是来自于大肠杆菌的aroK(莽草酸激酶)、来自于谷氨酸棒状杆菌的aroK基因或其同源基因。莽草酸激酶活性可通过公知的方法测定，例如〔R C DeFeyter,Purification and properties of shikimate kinase II from Escherichia coli K-12.,J.Bacteriol.165:331-333(1986)〕。

醇脱氢酶基因

从提高2-苯基乙醇生产的观点出发，本发明涉及的棒状细菌转化体还可以导入醇脱氢酶基因。

醇脱氢酶(EC1.1.1.1)是催化由醛生产醇的反应的酶。在此，是催化由苯乙醛生产2-苯基乙醇的反应的酶。除醇脱氢酶以外，可以是苯乙醛还原酶(EC1.1.1.-)、芳醇脱氢酶(或者别名为苄醇脱氢酶)(EC1.1.1.90)、醛脱氢酶和苯乙醇脱氢酶等，只要是能够由苯乙醛生产2-苯基乙醇的酶即可。

作为该酶基因，其来源为微生物、包含玫瑰的植物、动物等，没有特别限定，从2-苯基乙醇的生产率的观点出发，优选举出yjgB(醇脱氢酶)基因，更优选举出埃希氏菌属细菌的yjgB基因或其同源基因，进一步优选举出大肠杆菌的yjgB基因或其同源基因。

除源自大肠杆菌的yqhD(醇脱氢酶)、yahK(醛还原酶)以外，还可以是与源自短乳杆菌(Lactobacillus brevis)的类似芳基醇脱氢酶的adhC(醇脱氢酶)、源自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的醇脱氢酶即adh1、adh2或它们的直系同源物。

醇脱氢酶活性可通过公知的方法测定，例如〔Retno Indrati,Purification andproperties of alcohol dehydrogenase from a mutant strain of Candidaguilliermondii deficient in one form of the enzyme Can.J.Microbiol.,38:953-957(1992)〕。

(II)2-苯基乙醇的制造方法

通过使上述说明的本发明的转化体在包含碳源的反应液中反应，可制造2-苯基乙醇。因此，在一个方式中，本发明涉及2-苯基乙醇的制造方法，其包括使本发明的转化体在包含糖类的水中反应的工序。

微生物的增殖

在反应之前，优选将转化体在有氧条件下，在温度约25～38℃培养约12～48小时使其增殖。

培养用培养基

反应之前的转化体的有氧培养中使用的培养基可使用含有碳源、氮源、无机盐类和其它营养物质等的天然培养基或合成培养基。

作为碳源，可以使用糖类(葡萄糖、果糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖这类单糖；蔗糖、麦芽糖、乳糖、纤维二糖、木二糖、海藻糖这类二糖；淀粉这类多糖；糖蜜等)、甘露醇、山梨糖醇、木糖醇、甘油这类糖醇；乙酸、柠檬酸、乳酸、富马酸、马来酸、葡糖酸这类有机酸；乙醇、丙醇这类醇；正构烷烃这类烃等。碳源可以单独使用1种，或者也可以混合使用2种以上。

作为氮源，可使用氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、乙酸铵这类无机或有机铵化合物、尿素、氨水、硝酸钠或硝酸钾等。另外，也可使用玉米浆、肉提取物、蛋白胨、NZ胺、蛋白质水解物或氨基酸等含氮有机化合物等。氮源可以单独使用1种，或者也可以混合使用2种以上。氮源在培养基中的浓度因使用的氮化合物而不同，通常设为约0.1～10(w/v％)即可。

作为无机盐类，可举出磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钠、硝酸亚铁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸钴或碳酸钙等。无机盐可单独使用1种，或者混合使用2种以上。无机盐类在培养基中的浓度因使用的无机盐而不同，通常设为约0.01～1(w/v％)即可。

作为营养物质，可举出肉提取物蛋白胨、多聚蛋白胨、酵母提取物、干燥酵母、玉米浆、脱脂奶粉、脱脂大豆盐酸水解物、动植物或微生物菌体的提取物、它们的分解物等。营养物质在培养基中的浓度因使用的营养物质而不同，通常设为约0.1～10(w/v)％即可。

此外，根据需要，也可添加维生素类。作为维生素类，可举出生物素、硫胺素(维生素B1)、吡哆醇(维生素B6)、泛酸、肌醇或烟酸等。培养基的pH优选为约6～8。

作为具体优选的谷氨酸棒状杆菌用培养基，可举出A培养基〔Inui,M.et al.，Metabolic analysis of Corynebacterium glutamicum during lactate and succinateproductions under oxygen deprivation conditions.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.7:182-196(2004)〕、以及BT培养基〔Omumasaba,C.A.et al.,Corynebacterium glutamicumglyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase isoforms with opposite,ATP-dependentregulation.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.8:91-103(2004)〕等。这些培养基中，将糖类浓度设为上述范围使用即可。

反应液可使用含有糖类的水、缓冲液和无机盐培养基等。

作为缓冲液，可举出磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液和碳酸缓冲液等。缓冲液的浓度优选为约10～150mM。

为了使转化体实质上不增殖，优选在反应液中不包含作为增殖因子的生物素。

作为无机盐培养基，可举出包含磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钠、硝酸亚铁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸钴或碳酸钙等无机盐中的1种或2种以上的培养基。其中，优选包含硫酸镁的培养基。作为无机盐培养基，具体可举出BT培养基〔Omumasaba,C.A.et al，Corynebacterium glutamicum glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase isoformswith opposite,ATP-dependent regulation.J.Mol.Microbiol.Biotechnol.8:91-103(2004)〕等。无机盐类在培养基中的浓度因使用的无机盐而不同，通常设为约0.01～1(w/v％)即可。

反应液的pH优选为约6～8。反应中，优选一边使用氨水溶液、氢氧化钠水溶液等，利用pH控制器(例如，able株式会社制造，型号：DT-1023)将反应液的pH控制为中性附近，特别是约7，一边进行反应。

反应条件

反应温度，即反应中的转化体的生存温度优选为约20～50℃，更优选为约25～47℃。如果为上述温度范围，则可高效制造2-苯基乙醇。

另外，反应时间优选为约1～7天，更优选为约1～3天。培养可以为分批式、补料分批式、连续式中的任意种。其中，优选分批式。

通气条件

反应可以在还原条件或微有氧条件下进行。谷氨酸棒状杆菌在任意条件下均以实质上不增殖的反应进行，因此可更高效生产2-苯基乙醇。

还原条件由反应液的氧化还原电位规定。反应液的氧化还原电位优选为约-200mV～-500mV，更优选为-250mV～-500mV。

反应液的还原状态可简便利用刃天青指示剂(如果为还原状态，则从蓝色向无色脱色)推断，可准确使用氧化还原电位差计(例如，BROADLEY JAMES公司制造，ORPElectrodes)测定。

处于还原条件的反应液的制备方法可没有限制地使用公知的方法。

例如，作为反应液制备用液体介质，可以使用反应液用水溶液代替蒸馏水等。反应液用水溶液的制备方法例如可参考硫酸还原微生物等绝对厌氧性微生物用培养液制备方法(Pfennig,N.et al，(1981):The dissimilatory sulfate-reducing bacteria,In TheProkaryotes,A Handbook on Habitats,Isolation and Identification of BacteriaEd.By Starr,M.P.et al.，p.926-940,Berlin,Springer Verlag.)、“农艺化学实验书第三卷，京都大学农学部农艺化学教室编，1990年第26次印刷，产业图书株式会社出版”等，得到期望的还原条件下的水溶液。

具体而言，通过对蒸馏水等进行加热处理、减压处理而除去溶解气体，从而可得到还原条件的反应液用水溶液。此时，通过在约10mmHg以下、优选约5mmHg以下、更优选约3mmHg以下的减压下，将蒸馏水等处理约1～60分钟左右、优选约5～40分钟左右，从而可除去溶解气体，特别是溶解氧而制成还原条件下的反应液用水溶液。

另外，也可添加适当的还原剂(例如巯基乙酸(Thioglycolic acid)、抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、巯基乙酸(Mercapto acetic acid)、巯基乙酸(Thioacetic acid)、谷胱甘肽或硫化钠等)而制备还原条件的反应液用水溶液。

适当组合这些方法也是有效的还原条件的反应液用水溶液的制备方法。

在维持反应中途的还原条件的情况下，优选尽可能防止来自反应体系外的氧的混入，具体可举出利用氮气等不活泼气体、二氧化碳等封入反应体系的方法。作为更高效防止氧混入的方法，为了在反应中途使本发明的棒状细菌转化体的菌体内的代谢功能高效发挥功能，有时需要添加反应体系的pH维持调整液，适当添加各种营养素溶解液，但上述情况下，预先从添加溶液除去氧是有效的。

在反应中途维持微有氧条件的情况下，可在使通气量为0.5vvm等低值或其以下，使搅拌速度为500rpm等低值或其以下的条件下进行反应。根据情况，也可在反应开始后以适当的时间阻断通气，在搅拌速度为100rpm或其以下的条件下与提高厌氧度的状态组合而进行反应。

2-苯基乙醇的回收

如此进行培养，由此在反应液中生产2-苯基乙醇。通过回收反应液，从而可回收2-苯基乙醇，此外，也可通过公知的方法将2-苯基乙醇从反应液分离。作为上述公知的方法，可举出蒸馏法、膜透过法、树脂吸附法、有机溶剂提取法等。

在一个或多个实施方式中，本发明涉及以下内容；

＜1＞一种棒状细菌转化体，其经过莽草酸途径的活化，并且编码具有苯丙酮酸脱羧酶活性的酶的基因以能够表达的方式被导入了所述棒状细菌转化体。

＜2＞根据＜1＞记载的棒状细菌转化体，其中，上述编码具有苯丙酮酸脱羧酶活性的酶的基因为阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)的ipdC基因。

＜3＞根据＜1＞或＜2＞记载的棒状细菌转化体，其中，上述编码具有苯丙酮酸脱羧酶活性的酶的基因包含以下任一个基因：(a)具有序列号1的碱基序列的基因，(b)具有在序列号1的碱基序列中缺失、替换或增添1个或多个碱基而得到的碱基序列且具有相对于序列号1的碱基序列为45％以上的一致性的碱基序列的基因，以及(c)在严格的条件下与具有以下碱基序列的基因杂交的基因：上述碱基序列为与具有序列号1记载的碱基序列的基因互补的碱基序列。

＜4＞根据＜1＞～＜3＞中任一项记载的棒状细菌转化体，其中，莽草酸途径的活化包括：将选自以下基因中的至少1种基因导入到作为宿主的棒状细菌中，编码具有3-脱氧-D-阿拉伯庚糖酮酸-7-磷酸(DAHP)合酶活性的酶的基因、编码具有分支酸变位酶活性和预苯酸脱水酶活性中的至少一者的酶的基因、以及编码具有莽草酸激酶活性的酶的基因。

＜5＞根据＜4＞记载的棒状细菌转化体，其中，编码具有3-脱氧-D-阿拉伯庚糖酮酸-7-磷酸(DAHP)合酶活性的酶的基因、以及编码具有分支酸变位酶活性和预苯酸脱水酶活性中的至少一者的酶的基因为抗反馈抑制性。

＜6＞根据＜4＞或＜5＞记载的棒状细菌转化体，其中，编码具有3-脱氧-D-阿拉伯庚糖酮酸-7-磷酸(DAHP)合酶活性的酶的基因、编码具有分支酸变位酶活性和预苯酸脱水酶活性中的至少一者的酶的基因、以及编码具有莽草酸激酶活性的酶的基因源自大肠杆菌。

＜7＞根据＜1＞～＜6＞中任一项记载的棒状细菌转化体，其中，选自乳酸脱氢酶基因、3-脱氢莽草酸脱水酶基因、二羟基丙酮磷酸酶基因和苯丙氨酸摄取转运蛋白基因中的至少1种基因被破坏。

＜8＞根据＜1＞～＜7＞中任一项记载的棒状细菌转化体，其中，作为宿主的棒状细菌为谷氨酸棒状杆菌。

＜9＞根据＜1＞～＜8＞中任一项记载的棒状细菌转化体，其中，作为宿主的棒状细菌为谷氨酸棒状杆菌R(FERM BP-18976)、ATCC13032或ATCC13869(DSM1412)。

＜10＞一种棒状细菌转化体，其为谷氨酸棒状杆菌2PE97株(保藏号：NITE BP-02830)。

＜11＞2-苯基乙醇的制造方法，其包括使＜1＞～＜10＞中任一项记载的棒状细菌转化体在包含糖类的水中反应的工序。

＜12＞根据＜11＞记载的2-苯基乙醇的制造方法，其中，糖类选自葡萄糖、果糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、纤维二糖、木二糖、海藻糖和甘露醇。

实施例

以下，通过实施例详细说明本发明，但本发明并不限于这些实施例。

[实施例1]

2-苯基乙醇生产株的构建

(1)染色体DNA的制备·获取

Corynebacterium glutamicum R(FERM BP-18976)、Azospirillum brasilenseNBRC 102289、Beijerinckia indica subsp.indica DSM1715、Bifidobacterium animalissubsp.lactis JCM 10602、Bradyrhizobium diazoefficiens JCM 10833、Bradyrhizobiumelkanii JCM 10832、Bradyrhizobium japonicum JCM 20679、Bradyrhizobium lablabiNBRC 108826、Burkholderia multivorans NBRC 102086、Caldilinea aerophila DSM14535、Chromohalobacter salexigens ATCC BAA-138、Comamonas testosteroni NBRC14951、Corynebacterium aurimucosum JCM 11766、Corynebacterium kroppenstedtiiJCM 11950、Debaryomyces hansenii JCM 1990、Delftia acidovorans JCM 5833、Desulfovibrio magneticus DSM 13731、Enterobacter cloacae NBRC 13535、Enterobacter hormaechei ATCC 49162、Erwinia herbicola NBRC 102470、Escherichiacoli K-12MG1655、Kluyveromyces lactis JCM 22014、Komagataella phaffii ATCC20864、Lachancea thermotolerans JCM 19085、Lactococcus lactis NBRC 100933、Mycobacterium smegmatis MC(2)155ATCC 700084、Nostoc sp.PCC 73102 ATCC29133、Pandoraea vervacti NBRC 106088、Polaromonas naphthalenivorans ATCC BAA-779、Providencia rustigianii JCM 3953、Providencia stuartii ATCC 25827、Pseudomonasputida NBRC 14164、Ralstonia eutropha IAM 12368、Rhodococcus jostii JCM 11615、Rhodopseudomonas palustris ATCC BAA-98、Rhodospirillum rubrum ATCC 11170、Saccharomyces cerevisiae NBRC 2376、Saccharopolyspora erythraea JCM 4748、Staphylococcus epidermidis NBRC 12993、Staphylococcus haemolyticus JCSC 1435、Staphylococcus saprophyticus ATCC 15305和Streptomyceslividans NBRC 15675的染色体DNA根据菌株获得机构的信息进行培养后，使用DNA基因组提取试剂盒(商品名：illustra bacteria genomicPrep Mini Spin Kit，GE Healthcare Japan株式会社)制备。另外，Prunus persica和Rosa hybrid cultivar的pdc基因通过GeneArt人工基因合成(Thermo Fisher Scientific株式会社)获取。

(2)2-苯基乙醇生产相关基因表达质粒的构建

将用于分离目标酶基因的基因和引物序列示于表1。PCR使用Veriti热循环仪(Thermo Fisher Scientific株式会社)，使用PrimeSTAR HS DNA Polymerase(Takara Bio株式会社)作为反应试剂。

将得到的DNA片段导入到含有PgapA启动子的克隆载体(pCRB207[Appl EnvironMicrobiol.78(3):865-875(2012)]、pCRB209[WO2012/033112]、pCRB210[WO2012/033112])中。另外，在pheA基因中，通过使用磷酸化引物将扩增的PCR片段连结，进行向基因内的突变导入。将导入的克隆载体和得到的质粒名称示于表2。

[表1]

2-苯基乙醇生产相关基因分离用引物

*：磷酸化引物

[表2]

2-苯基乙醇生产相关基因表达质粒

(3)2-苯基乙醇生产相关基因染色体导入用质粒的构建

基于已报道谷氨酸棒状杆菌R菌株的增殖并非必需的序列[Appl.Environ.Microbiol.71：3369-3372(2005)](SSI区域)，确定为了将2-苯基乙醇生产相关基因无标记导入到谷氨酸棒状杆菌R菌株的染色体中而需要的DNA区域。通过PCR法扩增该DNA区域。将得到的DNA片段导入到无标记基因导入用质粒pCRA725[J.Mol.Microbiol.Biotechnol.8：243-254(2004)，日本特开2007-295809]中。应予说明，pCRG40通过反向PCR法导入了用于在SSI区域整合基因的限制酶位点(独特位点)。将SSI区域的分离和反向PCR中使用的引物序列以及得到的染色体导入用载体示于表3。

[表3]

用于分离SSI区域的引物序列以及得到的染色体导入用载体

*：反向PCR法中使用的引物

从上述表2中构建的2-苯基乙醇生产相关基因表达质粒中获得PgapA启动子融合酶基因片段并将其导入到上述染色体导入用质粒中。另外，也使用tkt-tal基因表达质粒pSKM8[WO2016/027870]、SSI8-1区域导入用质粒pCRB278[WO2017/169399]、SSI5-1区域导入用质粒pCRB276[WO2017/169399]和SSI2-2区域导入用质粒pCRB259[WO2017/146241]。将得到的2-苯基乙醇生产相关基因染色体导入用质粒示于表4。

[表4]

2-苯基乙醇生产相关基因染色体导入用质粒

(4)谷氨酸棒状杆菌R菌株染色体基因破坏用质粒的构建

通过PCR法扩增将为了以无标记方式破坏谷氨酸棒状杆菌R菌株的染色体基因而需要的DNA区域。各PCR片段可通过重叠区域连结。将得到的DNA片段导入到无标记基因破坏用质粒pCRA725[J.Mol.Microbiol.Biotechnol.8：243-254(2004)，日本特开2007-295809]中。将得到的染色体基因破坏用质粒示于表5。

[表5]

谷氨酸棒状杆菌R菌株染色体基因破坏用质粒

*：包含重叠区域的引物

(5)基于染色体基因重组的2-苯基乙醇生产株的构建

无标记染色体基因导入用载体pCRA725是在谷氨酸棒状杆菌R内不能复制的质粒。在与导入到质粒pCRA725中的染色体上的同源区域的单交叉株的情况下，显示基于pCRA725上的卡那霉素抗性基因的表达的卡那霉素抗性、以及基于枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的sacR-sacB基因的表达的含蔗糖培养基中的致命性，与此相对，在双交叉株的情况下，显示基于pCRA725上的卡那霉素抗性基因的脱落的卡那霉素敏感性、以及基于sacR-sacB基因的脱落的含蔗糖培养基中的增殖性。因此，无标记染色体基因导入株显示卡那霉素敏感性和含蔗糖培养基增殖性。

通过上述方法，使用上述2-苯基乙醇生产相关基因染色体导入用质粒和染色体基因破坏用质粒构建基因重组株。作为宿主菌株，使用谷氨酸棒状杆菌R菌株和ldhA破坏菌株CRZ1[Biotechnol Bioeng.Nov；110(11)：2938-2948(2013)]。另外，也使用aroG(S180F)基因染色体导入用质粒pCRB285[WO2017/169399]、aroD基因染色体导入用质粒pCRB292[WO2017/169399]、aroE基因染色体导入用质粒pCRB294[WO2017/169399]、aroA基因染色体导入用质粒pCRB289[WO2017/169399]、aroCKB基因染色体导入用质粒pCRB287[WO2017/169399]、gapA基因染色体导入用质粒pCRB294[Appl Environ Microbiol.78(12)：4447-4457(2012)]、iolT1基因染色体导入用质粒pSKM14[WO2016/027870]、qsuB基因破坏用质粒pSKM26[WO2016/027870]、hdpA基因破坏用质粒pSKM28[WO2016/027870]和ptsH基因破坏用质粒pCRC809[Microbiology.155(Pt11)：3652-3660(2009)]。应予说明，将该染色体基因重组的概要汇总示于表6和表7。

[表6]

基于染色体基因重组的2-苯基乙醇生产株的构建

[表7]

基于染色体基因重组的2-苯基乙醇生产株的概要

x3：表示导入到染色体中的基因的个数。

(6)2-苯基乙醇生产基因表达质粒导入株的构建

通过在上述染色体基因重组株中导入pdc基因、ipdC基因构建2-苯基乙醇生产株。将该生产株的概要汇总示于表8。

[表8]

2-苯基乙醇生产株的概要

对这些菌株进行试管培养，对在33℃48小时后生产38mM以上的2-苯基乙醇的2PE97和2PE143～2PE147株进行以下基于罐培养的生产试验。

[基于编码具有苯丙酮酸脱羧酶活性的酶的基因导入株从葡萄糖生产2-苯基乙醇的试验]

将2-苯基乙醇生产基因导入株(2PE97，143-147株)涂布于包含卡那霉素50μg/ml的A琼脂培养基[将(NH

将一铂环上述板中增殖的2-苯基乙醇生产基因导入株(2PE97，143-147株)接种于加入有包含卡那霉素50μg/ml的A液体培养基[将(NH

将如此得到的培养液转移至100mL的罐发酵装置，使得初始的OD610成为0.8，在A培养基中添加葡萄糖(初始浓度100g/L)作为基质，在33℃、使用2.5N的氨水调节培养反应液的pH，使其不低于7.0，在通气的条件下进行培养。在葡萄糖浓度降低的时刻适当追加。

对取样的培养液进行离心分离(4℃，10000×g，5分钟)，使用得到的上清液进行产物的分析。培养液中的葡萄糖浓度通过葡萄糖传感器(OSI BF-5D)测量。2-苯基乙醇的浓度使用岛津制作所制造的HPLC系统，分离柱使用Nacalai Tesque公司的Cosmosil C18-AR-II。基于HPLC的分离条件为：流动相使用40％甲醇和0.069％高氯酸，流速为1.0ml/min，柱温为40℃。

如上述所示，对编码具有苯丙酮酸脱羧酶活性的酶的基因进行克隆，导入到棒状细菌2-苯基乙醇生产宿主LHglc1449株中进行研究。表9表示本次的宿主、培养以及在反应条件下培养48小时后显示2-苯基乙醇浓度25mM以上的生产率的重组株。2PE97株生产最高浓度的2-苯基乙醇。

[表9]

各种具有Pdc活性的酶基因的导入生产株的2-苯基乙醇生产浓度的比较

谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)2PE97株保藏于日本千叶县木更津市KAZUSA镰足2-5-8 122号室(邮政编码292-0818)的国家技术评估学会专利微生物保藏中心(NPMD)(保藏日：2018年11月22日，保藏号：NITE BP-02830)。

[实施例2]

<导入有2-苯基乙醇生产基因的谷氨酸棒状杆菌株的2-苯基乙醇生产实验＞

将谷氨酸棒状杆菌2-苯基乙醇生产基因导入株(2PE97株)涂布于包含卡那霉素50μg/ml的A琼脂培养基(同上)，在33℃静置培养18小时。

将一铂环上述板中增殖的2PE97株接种于加入有包含卡那霉素50μg/ml的A液体培养基(同上)10ml的试管中，在33℃有氧振荡培养18小时。

将如此得到的培养液转移至100mL的罐发酵装置中，使得初始的OD610成为0.8，在A培养基中添加葡萄糖(初始浓度100g/L)作为基质，在33℃使用2.5N的氨水调节培养液的pH，使其不低于7.0，在通气的条件下进行培养。在葡萄糖浓度降低的时刻适当追加。

将取样的培养液离心分离(4℃，10000×g，5分钟)，使用得到的上清液进行产物的分析。培养液中的葡萄糖浓度通过葡萄糖传感器(OSI BF-5D)测量。2-苯基乙醇的浓度使用岛津制作所制的HPLC系统，分离柱使用nacalai tesque公司的Cosmosil C18-AR-II。对于基于HPLC的分离条件，流动相使用40％甲醇和0.069％高氯酸，流速设为1.0ml/min，柱温设为40℃。反应48小时，结果2-苯基乙醇的收量为6.5g/L(图1)。另一方面，作为对照使用的未导入苯丙酮酸脱羧酶基因的基因重组体完全不生产2-苯基乙醇。

将实施例1中制作的2PE97株涂布于包含卡那霉素50μg/ml的A琼脂培养基(同上)，在33℃静置16小时。

将一铂环上述板中增殖的2PE97株接种于加入有包含卡那霉素50μg/ml的A液体培养基(同上)10ml的试管中，在33℃下有氧地进行16小时振荡培养。

将在上述条件下增殖的2PE97株接种到加入有500ml包含卡那霉素50μg/ml的A液体培养基(同上)的容量2L的锥形瓶中，在33℃下有氧地进行16小时振荡培养。

对于如此培养增殖的菌体，通过离心分离(4℃，5000×g，10分钟)回收菌体。将得到的菌体以终菌体浓度达到5％的方式悬浮于BT(-脲)液体培养基[0.7％(NH

将取样的反应液离心分离(4℃，10000×g，5分钟)，使用得到的上清液进行产物的分析。培养液中的葡萄糖浓度通过葡萄糖传感器(OSI BF-5D)测量。2-苯基乙醇的浓度使用岛津制作所制造的HPLC系统，分离柱使用Nacalai tesque公司的Cosmosil C18-AR-II。基于HPLC的分离条件为：流动相使用40％甲醇和0.069％高氯酸，流速为1.0ml/min，柱温为40℃。吸附于XAD2的2-苯基乙醇在利用丙酮洗脱后同样进行HPLC分析。

转化体实质上不增殖的生产反应的结果为，观察到2-苯基乙醇的蓄积(图2左表示残留于培养液中的2-苯基乙醇浓度的经时变化)。在反应53.5小时的时刻合并树脂吸附成分而生产合计12.8g/L(105mM)的2-苯基乙醇，其详细是树脂吸附成分为78mM、培养液中残留成分为27mM(图2右)。

[实施例3]

作为2-苯基乙醇生产宿主的适应性试验

2-苯基乙醇对有氧增殖的影响

对谷氨酸棒状杆菌、大肠杆菌、恶臭假单胞菌和马克斯克鲁维酵母，进行有氧培养中的2-苯基乙醇的增殖抑制试验。

将谷氨酸棒状杆菌R涂布于A琼脂培养基(同上)，在33℃、暗处静置15小时。

将一铂环上述板中增殖的谷氨酸棒状杆菌R接种于加入有A液体培养基(同上)10ml的试管中，在33℃有氧振荡培养13小时。

将在上述条件下增殖的谷氨酸棒状杆菌R接种于A液体培养基(同上)100ml，使初始菌体浓度成为OD610＝0.05，同时添加使2-苯基乙醇的终浓度成为0、10、20、30、40、50mM，在33℃有氧振荡培养。菌体的增殖通过测定OD610的吸光度进行。

将大肠杆菌MG1655涂布于LB琼脂培养基〔1％多聚蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％氯化钠和1.5％琼脂〕，在37℃、暗处静置15小时。

将一铂环上述板中增殖的大肠杆菌MG1655接种于加入有LB液体培养基〔1％多聚蛋白胨、0.5％酵母提取物和0.5％氯化钠〕10ml的试管中，在37℃有氧振荡培养13小时。

将在上述条件下增殖的大肠杆菌MG1655接种于LB液体培养基100ml中，使初始菌体浓度成为OD610＝0.05，同时添加使2-苯基乙醇浓度的终浓度成为0、10、20、30、40、50mM，在33℃进行有氧振荡培养。菌体的增殖通过测定OD610的吸光度进行。

将恶臭假单胞菌S12涂布于LB琼脂培养基〔1％多聚蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％氯化钠和1.5％琼脂〕，在30℃、暗处静置15小时。

将一铂环上述板中增殖的恶臭假单胞菌S12接种于加入有LB(+葡萄糖)液体培养基〔1％多聚蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％氯化钠和0.4％葡萄糖〕10ml的试管中，在33℃有氧振荡培养13小时。

将在上述条件下增殖的恶臭假单胞菌S12株以初始菌体浓度OD610＝0.05接种于LB(+葡萄糖)液体培养基100ml中，同时添加使2-苯基乙醇浓度的终浓度成为0、10、20、30、40、50mM，在30℃进行有氧振荡培养。菌体的增殖通过测定OD610的吸光度进行。

将马克斯克鲁维酵母涂布于YPD琼脂培养基[2％多聚蛋白胨、1％酵母提取物、2％葡萄糖和1.5％琼脂]，在30℃、暗处静置15小时。

将一铂环上述板中增殖的马克斯克鲁维酵母接种于加入有YPD液体培养基[2％多聚蛋白胨、1％酵母提取物和2％葡萄糖]10ml的试管中，在40℃有氧振荡培养13小时。

将在上述条件下增殖的马克斯克鲁维酵母接种于YPD液体培养基100ml中，使初始菌体浓度成为OD610＝0.05，同时添加使2-苯基乙醇的终浓度成为0、10、20、30、40、50mM，在40℃下有氧地进行振荡培养。菌体的增殖通过测定OD610的吸光度来进行。

将在培养基中添加2-苯基乙醇对有氧增殖的影响的分析结果示于图3。大肠杆菌在20mM的2-苯基乙醇存在下显著受到增殖抑制，如果为30mM的2-苯基乙醇，则增殖几乎完全被抑制。

作为耐溶剂菌报道的恶臭假单胞菌S12显示类似的趋势，如果为30mM的2-苯基乙醇，则增殖完全被抑制。

与此相对，在大肠杆菌、恶臭假单胞菌、马克斯克鲁维酵母中被强烈抑制的20mM的浓度下，谷氨酸棒状杆菌完全不影响增殖。另外，在大肠杆菌、恶臭假单胞菌、马克斯克鲁维酵母中，即使在几乎完全抑制增殖的30mM的2-苯基乙醇存在下，谷氨酸棒状杆菌的增殖也延迟，但是24小时后显示良好的增殖。

根据以上结果可知，与大肠杆菌、恶臭假单胞菌和马克斯克鲁维酵母相比，谷氨酸棒状杆菌对2-苯基乙醇具有高抗性，作为生产2-苯基乙醇的宿主具有高的适应性。

产业上的可利用性

根据本发明，能够以实用的效率由糖原料制造2-苯基乙醇。

SEQUENCE LISTING

<110> 公益财团法人地球环境产业技术研究机构

住友电木株式会社

<120> 棒状细菌转化体以及使用其的2-苯基乙醇的制造方法

<130> H4698

<150> 2018-238497

<151> 2018-12-20

<160> 39

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1638

<212> DNA

<213> 巴西固氮螺菌

<400> 1

atgaagctgg ccgaagcctt gctgcgcgcg ctgaaggatc gcggcgcaca ggccatgttc 60

gggattccgg gcgatttcgc cttgcccttc ttcaaggtgg cggaggaaac gcagatcctg 120

ccgctccaca cgctgagcca cgagccggcg gtgggcttcg cggcggacgc ggcggcgcgc 180

tacagctcca ctctaggggt ggcggcggtc acctacgggg cgggcgcctt caacatggtg 240

aatgcggtgg ccggcgccta cgccgagaag tcgccggtcg tcgtcatctc cggcgcgccg 300

ggcacgacgg agggcaacgc cggcctgctg ctgcaccacc agggccgcac gctggacacg 360

cagttccagg tgttcaagga gatcaccgtg gcccaggccc ggctggacga cccggccaag 420

gccccggcgg agatcgcccg cgtgctgggg gccgcccgcg ccctgtcgcg cccggtctat 480

ctggaaatcc cccgcaacat ggtcaacgcc gaggtcgagc cggtgggcga cgaccccgcc 540

tggccggtgg accgcgacgc gctggccgcc tgcgcggacg aggtgctggc ggccatgcgc 600

tcggccacgt ccccggtgct gatggtctgc gtcgaggtcc gccgctacgg gctggaggcc 660

aaggtggcgg agctggcgca gcggctgggc gtgccggtgg tcaccacctt catggggcgc 720

ggcctgctgg ccgacgcgcc gaccccgccg ctcggcacct acatcggcgt tgccggcgac 780

gcggagatca cccggctggt cgaggagtcg gacgggctgt tcctgctcgg cgccatcctc 840

agcgacacaa acttcgcggt gtcccagcgc aagatcgacc tgcgcaagac catccacgcc 900

ttcgaccggg cggtgacgct gggctatcac acctacgccg acatcccgct ggacgggctg 960

gtggacgcgc tgctggagcg gctgccgccg tccgaccgca cgacgcgcgg caaggaaccc 1020

cacgcctacc cgaccggcct tcaggccgac gacggcccca tcgcaccgat ggacatcgcc 1080

cgcgccgtca acgaccgcgt gcgcgccggg caggagccgc tgctgatcgc ggcggacatg 1140

ggcgactgcc tgttcaccgc catggacatg atcgacgccg ggctgatggc gccgggctat 1200

tacgcgggca tgggcttcgg cgtgccggcg ggcatcgggg cgcagtgcgt gtcgggcggc 1260

aagcgcatcc tgacggtggt cggcgacggc gccttccaga tgaccgggtg ggagcttggc 1320

aactgccgac ggctgggcat cgaccccatc gtgatcctgt tcaacaacgc cagttgggag 1380

atgctgcgca ccttccagcc cgaatccgcc ttcaatgacc tggacgactg gcgcttcgcc 1440

gagatggcgg cgggcatggg cggcgacggt gtgcgtgtgc gcacgcgggc ggagctgaag 1500

gcggcgctgg acaaggcctt cgccacgcgc gggcgcttcc agctgatcga ggcgatgatc 1560

ccccgcggcg tgctgtccga cacgctggcc cgcttcgtcc aggggcagaa gcgcctgcac 1620

gccgcgcccc gggaataa 1638

<210> 2

<211> 1674

<212> DNA

<213> 金色黏液棒杆菌

<400> 2

atgcagacca ccattggtga tttcatcctg gaccgcctca aggccatcgg cattactgaa 60

atcatcggcg tgcccggtga cttcaacctg agcttcctcg agcagattga ggcctccgag 120

ggaatccgct tcgtcggcgc ctgcaacgag ctcaacgctg cctatgccgc tgatggctat 180

gcccgccaga aaggtgtggg ctgcctgctc accacctacg gcgtgggcga gctttccgcc 240

ctcaacggca tcgcgggtgc acgtgccgag cacgtcccgc tggtgtcgct ggcgggcgcg 300

ccgccgcagt atgcgaccga attccgctgg aacctgcacc actcgcttgc cgacggcgac 360

tttgccaaca tgctggattc ctttgcaccc ttcaccgagg tggccacgcg tgtgtccccc 420

atgaacgtag tcgaggaatt cgaccgcgcc ctgcacacct gcctgcgcga gaagcgcccg 480

gtgcacatcc agattccttc cgatatcact cacctgacca tcgaggtccc cgacgaacct 540

ttctccaccg agctggcacc ctccgatcca gagcgcctga acgccgctgc ggactacgtg 600

ctggagcacc tcgctaaggc caaggacccg atcatcctca tcgaccagga caccaaccgc 660

cacggtttca cggagaaatt ccgcgccatc atcgacaagg cccagctgcc ctactcccag 720

ctctcctccg gcaaggccat cctgtctgag cgccacccgc tgttcatcgg cacctataac 780

ggcgcggcct ctgccccggg cgtgcaggag cgcatcgaaa aatccgactt cctggtcacc 840

accaaccccc gcttcatcga ggtcaactcc ggttccttca cccacaacct ggccgatgcc 900

cgcgtctaca acttcggcga ccagcacctc aacgccgacg gcgaatactt cgtgggcatc 960

aatacgctgg agcttctcga cgtcctcctc gaccgcatcc cggaagccgg ggcatcgaca 1020

agcgcggctt tcgaacccga gcccttcgag ccgaacccgg atgccccgct gacccaggaa 1080

cgcatctggc cgcagatgct cggcttcatc caagaagatg acgtggtcat cgccgaagcc 1140

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tccaccatct ggggttccat cggctttacc ctgccgtgcg tgctcggctc gcagctggcc 1260

aacccggagc gccgccacgt cctcttcatc ggtgatggct ccttccagct caccgcccag 1320

gagctgtcca ccatcctgcg ccaggacctc aagcccatca tcgtgctggt caataacgat 1380

ggctacacca tcgagcgcta catcttgggc atggagcgcg agtacaacga gatccagatg 1440

tgggattaca cgtctctgcc gaaggtcttc atgaaggaca ccacgatgga atcctacgtg 1500

gcctcaaccg aaggcgagct ggcgaaggcc ctagacgaca tcgctgccca cccagagcgc 1560

ggcgccttcc tcgaggttcg cctcgacgct ttcgacgcgc cgaagggcct tcaggccttc 1620

ggcccgcaga ccgctgattt cgacttcggc cctcgcggcc cccgcaacgc ctaa 1674

<210> 3

<211> 1659

<212> DNA

<213> 阴沟肠杆菌

<400> 3

atgcgaaccc catactgcgt cgccgattac ctgctggacc gtcttacaga ttgtggtgcc 60

gatcatctgt ttggcgtgcc gggcgactat aacctgcagt ttctcgatca tgtcatcgac 120

agcccggata tctgttgggt gggctgtgcc aatgagctaa acgcatctta tgccgctgac 180

ggatatgccc gatgtaaggg ctttgccgcg ctgctgacaa catttggcgt aggggaatta 240

agtgccatga acggcatggc cggcagcttt gccgagcatg ttccggtgtt acacattgtg 300

ggggcaccgg gtacggcctc acagcaaaaa ggtgagctgc tgcaccacac gctgggtgat 360

ggtgagttcc gtcacttcta ccatatgagt gaaccgatca cggtcgcgca ggcgatcctg 420

accgaacaaa acgcctgcta cgaaatcgac agagtgttaa caaccatgct gcgggagcga 480

cgtccaggct acctgatgct gcctgctgat gtggctaaaa aatcagccac gccgcctgta 540

aacgctctca cgttaaagac agcgcatgcc gataacgcct gcctgaaagc gttccgagac 600

gccgccgaga gcagactgaa aacaagcaag cgtaccgcgc tgttggccga tttcctggtc 660

ctgcgccacg gcatgaaaca tgccctgcag aaatgggtga aagaggtgcc cattgcccac 720

gccaccatgc tgatgggcaa gggcattttt gacgaacgcc agcccggttt ttatggcacg 780

tacagtggtt cggcaagcgt cggggcggta aaagaggcca tcgaaggggc ggatacggta 840

ctgtgcattg gcacgcgttt tactgatact ctgacggcgg ggtttaccca tcagctgacg 900

caggcgcaaa cgatagaagt gcagccccat gccgcacggg tgggggatgt ctggtttacc 960

ggtatcccta tgtctgacgc gatcgagacg ctggtggctc tctgcaaaca gtatgtccat 1020

gataccctgg cgccagtctc tcacagcggt atcgccttcc cgcaatccga gggctcgctc 1080

actcaggaga atttctggag caccctgcaa acctttattc gcccgggtga cattattctt 1140

gccgaccagg ggacgtcagc ctttggtgcg atcgatttgc gtctaccggc agatgtgaat 1200

tttatcgtcc agccgctgtg gggctccatt ggctacaccc tggccgcggc gtatggtgcc 1260

caaaccgcct gtccagaccg gcgcgtcatt gtgctcacgg gggatggcgc cgcgcagttg 1320

accattcagg aactgggctc gatgctgcgt gataaacagc accccattat cctggtgctc 1380

aacaatgaag ggtacaccgt agagagggcc attcatggac cggaacagcg ctataacgac 1440

attgccttat ggaactggac gcaaattccg caggcactga gcctggatcc tcaggcacag 1500

tgctggcggg tcagtgaagc ggaacagctg gcggaggtgc tcgaaaaagt ggcacaccac 1560

gagcgactaa cattgattga agtgatgcta cccaaagcgg atatcccgcc gctgttaggg 1620

gcgattacca aagcgctgga agcgtgtaat aacgcctga 1659

<210> 4

<211> 1632

<212> DNA

<213> 沼泽红假单胞菌

<400> 4

atgccgacac ttgcgaccgc gctgctcgac gccctcaagg atcatggtgc ccgagagatt 60

ttcggcattc ccggcgattt cgtgctgccg tttttcaagg tgatcgaaga gagcggcacg 120

ctgccgtatt tcaccatgag ccacgagccg gcggtcggct tcgcggccga tgcggcgtcg 180

cgctatcgcg gcagcatcgg cgtcgcggtg gtgacctacg gggccggcgc gttcaacctc 240

gtcaactcga ttgccggcgc ctatgcggag cgctcgccgg tggtggtgat cgccggcgcg 300

ccgggcgcgc gcgagcgcac cagcggctat ctgctgcatc atcaggtccg caccgtcgat 360

tcccaactcg cggtattcaa ggaagtcact tgcgatcagg ccgtgctgag cgatccggcg 420

accgcgcccg cggagatcgc gcgggtgctg cggagcgcgc tcgaattgtc gctgccggtg 480

tacatcgaat ttccccgcga catggtcgac gccaaggtcg acccggtgcc gaagctgccg 540

cggcgcgagg ccgatatcgg cgcgcgggac gagtgtgccg aagaaatcct ggatcggatc 600

gccagggcaa agtcgccggt gatggtggtg gacgtcgaaa tccgccgcta cggcgtcgag 660

cagcaggtcg ccgcgctggc ccgcaagctc ggcctgccgg tggtgacgac gttcatgggc 720

cgcggcctgc tcgaaggcga cgacgacgtg gtggctggca cctatctcgg cgcggctggt 780

gatccggacc tgtcggcgct ggtcgagggc gccgatctgg tgctgatgtt cggtgtcatc 840

ctgtccgata ccaacttcgc gctgtcctcg aacatgaccg atccgcgccg caccgtgctg 900

gcgactgggc gcgaggtgca gatcggccac cacgtctatc gcgacctgcc gctggctgac 960

ctgatcgccg gtctcgatgc ccacgcctcg cagcatccac cgcggccgcg caatgtcggt 1020

aaggggatgg cctatccgcg tgggctgacg ctcgacgcgt cgccgatcgc accgtcggat 1080

atcgccaccg cgatcaacga tctgttcgac cgccacggca agatgccgat gaccgccgat 1140

atcggcgatt gcctgttcac cgcgatggag atcgacaaca ctgcgctggc ggccccggga 1200

tactacgcag gcatggggtt cggcgtgccc gccggcgtcg gcgttgccgc gaccggcctg 1260

cggccgctgg tgctggtggg cgacggtgcg tttcagatga ccggctggga gctcggcaac 1320

tgcaagcgct acgggctcga tccgatcgtg gtgctgttca acaattgcag ctgggaaatg 1380

ctgcgggtgt tccagccgga atccaagttc aacgatctgg acgactggca ctttgccgac 1440

atcgcgcatt cgatcggcgg cttcggcgag cgggtgacga cgcgcgccga actcgccgcg 1500

gcgctgcagc gcgcggtcga gcggcgcggg gtgttctcac tgatcgaagt gatgttgccg 1560

cgtggcgtta cctcgcacac gctggcgcgg ttcgtcaccg gcttcaaggc ggcgcgtgaa 1620

cggatgaagt ga 1632

<210> 5

<211> 1662

<212> DNA

<213> 深红红螺菌

<400> 5

atgcccacca tcgccacggc cttgcttgac gcgttgaagg cccatggggc gacccggatc 60

ttcggcattc ccggcgattt cgccctgccg ttcttccggg tggccgaaca aagcgccctc 120

ttgccgctgt acaccctgag ccacgaaccc ggagtcggct tcgccgccga cgcctgcgcc 180

cgcatggggc gcggcctcgg ggtggcggcg gtcacttacg gcgccggggc cttgaacatg 240

gtcaatccgg tggccggggc ttggtcggag aaatcacccc tggtggtgat ttccggcgcc 300

cccggcgtcg ccgaatccgc cggcggcctg ctgctccacc atcaggccaa aaccctcgac 360

agccagtggc ggatctttga agagatcacc tgcgcccgca cccgccttga tgacccgctg 420

accgcccccg gggaaatcgc ccgggtgttg cgggcctgcc ttgaacactc ccgccccgtc 480

tatatcgaaa tcccccgcga catcgtcgat gcgccctgcg ccgccgtgga ccgcctgccg 540

cccaccccgg tcgatggcga agcggtcgaa gccgccgccg gcgagatcat ggcccgcttg 600

gctgcggcca gcgccccggc gctgctgctg ggggtcgagg tccgtcgcca cggcatcgaa 660

gccgatgtcg ccgaactggc ccgccgcctg ggcctgccca tcgccaccac cttcatgggc 720

cggggtctgt tatccgagga gggcgcggcc ggcggcgcgc ccgacagcct gatgggcacc 780

tatctggggc tggccggccg ccccgaggtg cgcgccgtca tcgaagactc cgatggcctg 840

ctgatgctcg gcgtcatctt gtccgacacc aatttcggcg tttcgggcaa gcgcatcgac 900

ctgcgccgcg ccatgctcgc cgccgaccgt caggtcgccc tgggctttca tacctataac 960

gatatcccgc tggccgatct ggtcgccgcc ctgctgcgtc aggccgaggg cttcgcccgc 1020

caggacgcca aggccctacc caagccgacc gccctgcccc gggacatgat cgccgatggg 1080

gcgccgatcg gcccgatgga tatcgccgcg gccatcaacg atctattctc ggcccatggg 1140

gtgatgccga tcgcctcgga tatgggcgat tgcctgttca ccgcccttga taccacccat 1200

gcgccgctgg tcgccccggg ctattacgcc accatgggct ttggcgtgcc ggcgggattg 1260

ggcgttcagg ccagctgtgg ccgccggccg ctgatcctgg tcggcgacgg cgcctttcag 1320

atgaccggtt gggagttggg caattgcgcc cgctacggct gggacccgat cgtcatcgtc 1380

ttcaacaacg ccagttggga gatgctgcgc accttccaac ccgacaccgc ctataacgat 1440

ctggccgatt ggcgattcgc cgatctggcc gccggcctgg gcggcgttgg tcaccgttgc 1500

caaacccgcg ccgatctggc ccgggccctg gatcgggcgg cccgcgaacc ggggcgcttt 1560

cacctgatcg aggcggttct ggcgcgcggg gcgatctcgg acaccctcca gcgcttcgtc 1620

accacgatga aaggccgcca cgccgcggcg gccgatgcct ga 1662

<210> 6

<211> 525

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<400> 6

atgacacaac ctctttttct gatcgggcct cggggctgtg gtaaaacaac ggtcggaatg 60

gcccttgccg attcgcttaa ccgtcggttt gtcgataccg atcagtggtt gcaatcacag 120

ctcaatatga cggtcgcgga gatcgtcgaa agggaagagt gggcgggatt tcgcgccaga 180

gaaacggcgg cgctggaagc ggtaactgcg ccatccaccg ttatcgctac aggcggcggc 240

attattctga cggaatttaa tcgtcacttc atgcaaaata acgggatcgt ggtttatttg 300

tgtgcgccag tatcagtcct ggttaaccga ctgcaagctg caccggaaga agatttacgg 360

ccaaccttaa cgggaaaacc gctgagcgaa gaagttcagg aagtgctgga agaacgcgat 420

gcgctatatc gcgaagttgc gcatattatc atcgacgcaa caaacgaacc cagccaggtg 480

atttctgaaa ttcgcagcgc cctggcacag acgatcaatt gttga 525

<210> 7

<211> 1155

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<400> 7

atgacatcgg aaaacccgtt actggcgctg cgagagaaaa tcagcgcgct ggatgaaaaa 60

ttattagcgt tactggcaga acggcgcgaa ctggccgtcg aggtgggaaa agccaaactg 120

ctctcgcatc gcccggtacg tgatattgat cgtgaacgcg atttgctgga aagattaatt 180

acgctcggta aagcgcacca tctggacgcc cattacatta ctcgcctgtt ccagctcatc 240

attgaagatt ccgtattaac tcagcaggct ttgctccaac aacatctcaa taaaattaat 300

ccgcactcag cacgcatcgc ttttctcggc cccaaaggtt cttattccca tcttgcggcg 360

cgccagtatg ctgcccgtca ctttgagcaa ttcattgaaa gtggctgcgc caaatttgcc 420

gatattttta atcaggtgga aaccggccag gccgactatg ccgtcgtacc gattgaaaat 480

accagctccg gtgccataaa cgacgtttac gatctgctgc aacataccag cttgtcgatt 540

gttggcgaga tgacgttaac tatcgaccat tgtttgttgg tctccggcac tactgattta 600

tccaccatca atacggtcta cagccatccg cagccattcc agcaatgcag caaattcctt 660

aatcgttatc cgcactggaa gattgaatat accgaaagta cgtctgcggc aatggaaaag 720

gttgcacagg caaaatcacc gcatgttgct gcgttgggaa gcgaagctgg cggcactttg 780

tacggtttgc aggtactgga gcgtattgaa gcaaatcagc gacaaaactt cacccgattt 840

gtggtgttgg cgcgtaaagc cattaacgtg tctgatcagg ttccggcgaa aaccacgttg 900

ttaatggcga agcaagccgg tgcgctggtt gaagcgttgc tggtactgcg caaccacaat 960

ctgattatga cccgtctgga atcacgcccg attcacggta atccatggga agagatgttc 1020

tatctggata ttcaggccaa tcttgaatca gcggaaatgc aaaaagcatt gaaagagtta 1080

ggggaaatca cccgttcaat gaaggtattg ggctgttacc caagtgagaa cgtagtgcct 1140

gttgatccaa cctga 1155

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 8

ggaattccat atgaagctgg ccgaagcc 28

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 9

ggaattccat atgttattcc cggggcgcgg 30

<210> 10

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 10

ctctcatatg cagaccacca ttggtg 26

<210> 11

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 11

ctctcatatg tctccacctt aggcgttg 28

<210> 12

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 12

ctcttcgcga atgcgaaccc catactgcgt 30

<210> 13

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 13

ctcttcgcga tcaggcgtta ttacacgctt c 31

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 14

ctctcatatg ccgacacttg cgac 24

<210> 15

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 15

ctctcatatg tcacttcatc cgttcacgc 29

<210> 16

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 16

ggaattccat atgcccacca tcgccacg 28

<210> 17

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 17

ggaattccat atgcccgtcc ttgatcgaag gg 32

<210> 18

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 18

ctctcatatg acacaacctc tttttctgat cg 32

<210> 19

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 19

ctctcatatg acgttaagta taggcgctcg 30

<210> 20

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 20

ggaattccat atgacatcgg aaaacccgtt ac 32

<210> 21

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 21

cgccattaac aacgtggttt tc 22

<210> 22

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 22

aagcaagccg gtgcgctgg 19

<210> 23

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 23

ggaattccat atgtcaggtt ggatcaacag gcac 34

<210> 24

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 24

ctctgtcgac gagaccatat gcacgttgtc 30

<210> 25

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 25

ctctgtcgac gctgaatcta agggtgttgc 30

<210> 26

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 26

ctctcctgca ggggattgga tgactgagca c 31

<210> 27

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 27

ctctcctgca ggctccatca ttaagcgacg ag 32

<210> 28

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 28

ctctgtcgac atggcgtcat cgacattggt 30

<210> 29

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 29

ctctgtcgac accttgcgag caactcaatc 30

<210> 30

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 30

ctctagatct gaaaggtaag acactagtta ccg 33

<210> 31

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 31

ctctagatct atctgcatgg tttcagacaa cc 32

<210> 32

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 32

ctctgcatgc ctgaattact gagctcacct tg 32

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 33

agatcaatgg tggcgatctc 20

<210> 34

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 34

gagatcgcca ccattgatct gctggaacac atcaatgatg c 41

<210> 35

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 35

ctcttctaga cccaactctg ttcttcgcag 30

<210> 36

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 36

ctctgcatgc gctagaccaa caacatcctg 30

<210> 37

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 37

cgatgaagtg aatgtgtcga g 21

<210> 38

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 38

ctcgacacat tcacttcatc ggacaactac cacctgccac 40

<210> 39

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 39

ctcttctaga tcaactgcag agacagtcag 30

PCT/RO/134表