利用海水诱导雨生红球藻细胞类型转换及积累虾青素的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及利用海水诱导雨生红球藻细胞类型转换及积累虾青素的方法。

背景技术

虾青素，又名虾黄质、龙虾壳色素，是一种类胡萝卜素，也是类胡萝卜素合成的最高级别产物，呈深粉红色，化学结构类似于β-胡萝卜素。而β-胡萝卜素、叶黄素、角黄素、番茄红素等都是类胡萝卜素合成的中间产物，因此在自然界，虾青素具有最强的抗氧化性。广泛存在于生物界，特别是虾、蟹、鱼、藻体、酵母和鸟类的羽毛中含量较高，是海洋生物体内主要的类胡萝卜素之一，虾青素可以跨越从血液到大脑的屏障，所以虾青素对大脑、中枢神经系统及双眼都可起到保护作用。虾青素还有其他功效：提高身体耐力，降低肌肉受损的风险；缓解眼疲劳症状，提高视觉灵敏度；通过内部补充减少皱纹；缓解色素过度沉积的症状(即通常所说的老年斑)；调节细胞因子，抑制炎症细胞因子和化学因子的基因显现；改善胃部健康，缓解幽门螺杆菌引发的感染或炎症。

就目前的虾青素积累工艺，对虾青素最后的产量会受很多因素影响，并且对转换条件把控的不到位，误差比较大也会影响虾青素产量，比如诱导条件的选择，光源的选择、自身条件因素的测定等。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种利用海水诱导雨生红球藻细胞类型转换及积累虾青素的工艺，解决了采用海水诱导雨生红球藻细胞积累虾青素，以光照强度5500xl～5500xl、转换时间8day和温度30℃，达到并使雨生红球藻细胞转换效率最高，虾青素含量最大达到12～15mol/L。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了利用海水诱导雨生红球藻细胞类型转换及积累虾青素的方法，包括如下步骤：

步骤1：取硼和钼配置溶液，再与水混合形成母液；将过滤后的海水添加到培养基中，再与所述母液混合，制得混合培养基；

步骤2：将步骤1所述混合培养基的pH调至7～10，以接种量8～10％，在温度22～25℃，光照强度为2000lx～2500lx，光周期12:12的条件下培养8d；

步骤3：在pH为7～11，温度为28～35℃，光照强度为5000lx～8000lx的条件下培养8～14d，收集孢子态藻体，提取虾青素。

在本发明的一些具体实施方案中，步骤1具体为：取5mg/L硼和50～60ug/L钼配置溶液，再按照1:4与水混合形成母液。

在本发明的一些具体实施方案中，步骤3中所述光照强度为5000lx～5000lx。

在本发明的一些具体实施方案中，步骤3中所述温度为30℃。

在本发明的一些具体实施方案中，步骤3中所述培养的时间为8d。

在本发明的一些具体实施方案中，步骤3中所述pH为8。

在本发明的一些具体实施方案中，步骤3中所述收集孢子态藻体，提取虾青素具体包括：取5mL孢子态藻体，4000r/min离心，加入2mL甲醇溶液振荡，于50℃恒温水浴保持15min离心，沉淀加蒸馏水洗涤去除碱液，离心，提取上清液；测定所述上清液在波长为560nm处的吸光度值，按照Davies的计算公式计算获得虾青素含量。

本发明提供了一种利用海水诱导雨生红球藻细胞类型转换及积累虾青素的工艺。包括但不限于以下有益效果：

1、本发明通过海水诱导雨生红球藻积累虾青素，海水中具有微量元素，相当于在盐胁迫的作用下硝酸还原酶和1,5二磷酸核酮糖羧化酶活性迅速下降，硝酸还原酶的活性被抑制，雨生红球藻细胞内的氮源供应不足，并且抑制了1,5二磷酸核酮糖羧化酶的合成，导致CO

2、本发明通过对雨生红球藻的转换条件分别采用了单因素试验和多因素试验，两者结合对比，鉴定出光照强度5500xl-5000xl、转换时间8day和温度30℃的最优组合，转换条件更有利积累虾青素，因此虾青素积累含量越高，避免了盲目调节转换所需要的温度、转换时间和光照强度影响最后虾青素的含量，避免使用相同的材料而不能利益最大化，导致浪费资源和成本，也耗费了人力。

本发明通过采用混合光照，由于5500-6000xl红光和蓝光均有利于虾青素的积累，以LED等作为光源，红光和白光的混合光照比只有红光或者只用白光更有利于雨生红球藻的生长，同理，蓝光和白光的混合光照也有利于雨生红球藻的积累，因此采用混合光照培养和诱导雨生红球藻更有益。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示本发明的流程示意图。

具体实施方式

本发明公开了利用海水诱导雨生红球藻细胞类型转换及积累虾青素的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明通过以下技术方案予以实现：一种利用海水诱导雨生红球藻细胞类型转换及积累虾青素的工艺，包括如下步骤：

Sp1：材料和试剂准备：所述材料和试剂准备使用一定量比例的微量元素配置溶液，再按照一定比例与水溶液混合形成母液，将过滤后的海水添加到培养基中和母液混合；

Sp2：影响虾青素转换和积累的单因素试验：所述影响虾青素转换和积累的单因素试验包括光照强度、温度、pH值和转换时间；

Sp3：影响虾青素转换和积累的多因素组合试验：所述影响虾青素转换和积累的多因素组合试验，以pH值一定，按照响应面法，对不同因素的组合试验，检验光照强度、温度和转换时间对虾青素积累的影响；

Sp4：雨生红球藻的生长检测：所述雨生红球藻的生长检测包括对培养基中培养物细胞形态的观察、培养物细胞密度的测定、培养物吸光度(OD值)的测定和培养物pH值的测定；

Sp5：虾青素积累工艺的优化与验证：所述虾青素积累工艺的优化与验证是将多因素组合试验结果和预测值对比，根据得到的虾青素含量优化参数；

Sp6：虾青素含量的测定。

优选的，所述材料和试剂准备将培养基内pH至调至8，以接种量10％，在温度22℃，光照强度为2000lx-2500lx，光周期12:12的条件下培养8day；

优选的，所述影响虾青素转换和积累的单因素试验Sp2-1：所述影响虾青素转换和积累的光照强度分别采用5000lx-5500lx、5500lx-6000lx、6000lx-7000lx、7000lx-8000lx的混合光照强度梯度、pH值为8，转换时间为8day，温度为30℃；

Sp2-2：所述影响虾青素转换和积累的温度分别采用28℃、30℃、32℃、35℃的温度梯度，光照强度为5000lx-5500lx的混合光照，pH值为8，转换时间为8day；

Sp2-3：所述影响虾青素转换和积累的pH值分别采用7、8、9、10、11的pH值梯度，光照强度为5000lx-5500lx的混合光照，温度为30℃，转换时间为8day；

Sp2-4：所述影响虾青素转换和积累的转换时间分别为8d、10d、12d、14d的时间梯度，光照强度为5000lx-5500lx的混合光照，pH值为8，温度为30℃；

优选的，所述雨生红球藻细胞类型转换及积累虾青素使用的一起和设备包括数字pH计、超声波细胞破碎器、722型分光光度计和光学显微镜。

优选的，所述雨生红球藻的生长检测中培养物细胞形态使用显微镜放大160倍观察，细胞密度的测定是按照显微镜直接计数法-血球板计数法，培养物吸光度值采用722型光栅分光光度计在560nm波长下测定，。

优选的，所述虾青素积累工艺的优化与验证是鉴于单因素试验结果，选取一定的pH值，运用SAS8.0软件响应面分析法，每组试验设置三个平行，获取三维响应面曲线，得出虾青素通过雨生红球藻的最优转换条件和虾青素的积累含量。

优选的，所述虾青素含量的测定时取5mL孢子态藻体，4000r/min离心，加入2mL甲醇溶液振荡，于50℃恒温水浴保持15min离心，沉淀加蒸馏水洗涤去除碱液，再向含有藻体的配置溶液离心，提取上清液。测定在波长为560nm处的吸光度值，按照Davies的计算公式计算虾青素含量。

本发明提供的利用海水诱导雨生红球藻细胞类型转换及积累虾青素的方法中，所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

利用海水诱导雨生红球藻细胞类型转换及积累虾青素的工艺，包括如下步骤：

Sp1：材料和试剂准备使用5mg/L硼和50～60ug/L钼配置溶液，再按照1:4与水混合形成母液，将过滤后的海水添加到培养基中和母液混合，将制得的混合培养基内pH调至8，以接种量10％，在温度22℃，光照强度为2000lx-2500lx，光周期12:12的条件下培养8day；

Sp2：影响虾青素转换和积累的单因素试验：影响虾青素转换和积累的单因素试验包括光照强度、温度、pH值和转换时间；

Sp2-1：影响虾青素转换和积累的光照强度分别采用5000lx-5500lx、5500lx-6000lx、6000lx-7000lx、7000lx-8000lx的混合光照强度梯度、pH值为8，转换时间为8day，温度为30℃；

Sp2-2：影响虾青素转换和积累的温度分别采用28℃、30℃、32℃、35℃的温度梯度，光照强度为5000lx-5500lx的混合光照，pH值为8，转换时间为8day；

Sp2-3：影响虾青素转换和积累的pH值分别采用7、8、9、10、11的pH值梯度，光照强度为5000lx-5500lx的混合光照，温度为30℃，转换时间为8day；

Sp2-4：影响虾青素转换和积累的转换时间分别为8d、10d、12d、14d的时间梯度，光照强度为5000lx-5500lx的混合光照，pH值为8，温度为30℃；

通过采用混合光照，由于红光和蓝光均有利于虾青素的积累，以LED等作为光源，红光和白光的混合光照比只有红光或者只用白光更有利于雨生红球藻的生长，同理，蓝光和白光的混合光照也有利于雨生红球藻的积累，因此采用混合光照培养和诱导雨生红球藻更有益。

Sp3：影响虾青素转换和积累的多因素组合试验，以pH值一定，按照响应面法，对不同因素的组合试验，检验光照强度、温度和转换时间对虾青素积累的影响。

Sp4：雨生红球藻的生长检测包括对培养基中培养物细胞形态的观察、培养物细胞密度的测定、培养物吸光度(OD值)的测定和培养物pH值的测定，所述雨生红球藻的生长检测中培养物细胞形态使用显微镜放大160倍观察，细胞密度的测定是按照显微镜直接计数法-血球板计数法，培养物吸光度值采用722型光栅分光光度计在560nm波长下测定。

通过细胞形态的观察可以判断出雨生红球藻处于生活周期的何种时期，确定诱导雨生红球藻积累虾青素的最佳时期，同时还可以观察培养物中是否染有杂菌。

Sp5：虾青素积累工艺的优化与验证是将多因素组合试验结果和预测值对比，根据得到的虾青素含量优化参数，所述虾青素积累工艺的优化与验证是鉴于单因素试验结果，选取一定的pH值，运用SAS 8.0软件响应面分析法，每组试验设置三个平行，获取三维响应面曲线，得出虾青素通过雨生红球藻的最优转换条件和虾青素的积累含量。

通过对雨生红球藻的转换条件分别采用了单因素试验和多因素试验，两者结合对比，鉴定出光照强度、转换时间和温度的最优组合，转换条件更有利积累虾青素，因此虾青素积累含量越高，避免了盲目调节转换所需要的参数影响最后虾青素的含量，避免使用相同的材料而不能利益最大化，导致浪费资源和成本，也耗费了人力。

Sp6：所述虾青素含量的测定时取5mL孢子态藻体，4000r/min离心，加入2mL甲醇溶液振荡，于50℃恒温水浴保持15min离心，沉淀加蒸馏水洗涤去除碱液，再向含有藻体的配置溶液离心，提取上清液。测定在波长为560nm处的吸光度值，按照Davies的计算公式计算虾青素含量。

雨生红球藻细胞类型转换及积累虾青素使用的一起和设备包括数字pH计、超声波细胞破碎器、722型分光光度计和光学显微镜。通过海水诱导雨生红球藻积累虾青素，海水中具有微量元素，相当于在盐胁迫的作用下硝酸还原酶和1,5二磷酸核酮糖羧化酶活性迅速下降，硝酸还原酶的活性被抑制，雨生红球藻细胞内的氮源供应不足，并且抑制了1,5二磷酸核酮糖羧化酶的合成，导致CO

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。