治疗方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年10月29日提交的美国临时申请号62/752,288、2019年1月4日提交的美国临时申请号62/788,313以及2019年5月31日提交的美国临时申请号62/855,332的权益，所述临时申请各自的内容特此以引用的方式整体并入本文。

背景技术

癌症的特征在于异常细胞的增殖。许多治疗包括昂贵且痛苦的外科手术和化学疗法。尽管对使用患者的自身免疫系统靶向癌性细胞的癌症疗法越来越感兴趣，但是此类疗法的成效有限。

发明内容

本发明的特征尤其是鉴定和/或选择用于起始、继续、修改和/或中止癌症疗法的癌症受试者的方法。

因此，本公开的一个方面的特征是一种将受试者鉴定为癌症疗法的候选者的方法，所述方法包括：a)获得、提供或产生包含细菌细胞或珠粒的文库，所述细菌细胞或珠粒包含多种肿瘤抗原，其中所述文库的每个细菌细胞或珠粒包含不同的肿瘤抗原；b)使所述细菌细胞或珠粒与来自所述受试者的抗原呈递细胞(APC)接触，其中所述APC使所述细菌细胞或珠粒内化；c)在适于通过由一种或多种APC呈递的肿瘤抗原激活淋巴细胞的条件下，使所述APC与来自所述受试者的淋巴细胞接触；d)例如通过评估(例如，检测或测量)一种或多种免疫介质的表达和/或分泌水平(例如，相对于对照增加或降低的水平)来确定一种或多种淋巴细胞是被由一种或多种APC呈递的一种或多种肿瘤抗原激活还是对由一种或多种APC呈递的一种或多种肿瘤抗原没有应答；e)将一种或多种肿瘤抗原鉴定为刺激性抗原和/或抑制性抗原；以及f)产生代表所述受试者应答谱的刺激性抗原与抑制性抗原的数量的比率；以及g)将所述受试者应答谱与目标应答谱进行比较，以选择所述受试者作为用于起始、继续、修改、中止或不起始癌症疗法的候选受试者。

在一些实施方案中，所述方法还包括通过包括以下的方法产生所述目标应答谱：h)使所述细菌细胞或珠粒与来自目标受试者的抗原呈递细胞(APC)接触，其中所述APC使所述细菌细胞或珠粒内化；i)在适于通过由一种或多种APC呈递的肿瘤抗原激活淋巴细胞的条件下，使所述APC与来自所述目标受试者的淋巴细胞接触；j)例如通过评估(例如，检测或测量)一种或多种免疫介质的表达和/或分泌水平(例如，相对于对照增加或降低的水平)来确定一种或多种淋巴细胞是被由一种或多种APC呈递的一种或多种肿瘤抗原激活还是对由一种或多种APC呈递的一种或多种肿瘤抗原没有应答；k)将一种或多种肿瘤抗原鉴定为刺激性抗原和/或抑制性抗原；以及l)产生代表所述目标应答谱的刺激性抗原与抑制性抗原的数量的比率。

在一些实施方案中，所述目标应答谱来自表现出或先前表现出对癌症的至少一种有益应答的一个或多个目标受试者。在一些实施方案中，所述目标应答谱包括刺激性抗原的数量与抑制性抗原的数量的比率为至少100:1、50:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1.5:1、1.4:1、1.2:1、1.1:1、0.9:1、0.8:1、0.7:1、0.6:1或0.5:1。在一些实施方案中，所述有益应答包括对癌症疗法或疗法组合的阳性临床应答。在一些实施方案中，所述有益应答包括对癌症的自发应答。在一些实施方案中，所述有益应答包括癌症的清除，例如与癌症的清除相关的一种或多种临床测量的水平。在一些实施方案中，所述有益应答包括例如在限定的时间段(例如，至少1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周，或至少1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月，或至少1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、11年、12年)内不存在癌症的复发、重现和/或转移。在一些实施方案中，所述有益应答包括阳性癌症预后。在一些实施方案中，所述有益应答包括不存在对癌症疗法或疗法组合的一种或多种毒性应答和/或副作用(例如，一种或多种可测量的毒性应答和/或副作用)。

在一些实施方案中，所述目标应答谱来自表现出或先前表现出对癌症的一种或多种有害和/或无益应答的一个或多个目标受试者。在一些实施方案中，所述目标应答谱包括刺激性抗原的数量与抑制性抗原的数量的比率小于5:1、2:1、1.5:1、1.4:1、1.2:1、1.1:1、0.9:1、0.8:1、0.7:1、0.6:1、0.5:1、0.25:1、0.125:1、0.01:1或0.001:1。在一些实施方案中，所述有害和/或无益应答包括对癌症疗法或疗法组合的阴性临床应答和/或未能应答。在一些实施方案中，所述有害和/或无益应答包括缺乏癌症的清除，例如与缺乏癌症的清除相关的一种或多种临床测量的水平。在一些实施方案中，所述有害和/或无益应答包括癌症的至少一种复发、重现和/或转移。在一些实施方案中，所述有害和/或无益应答包括阴性癌症预后。在一些实施方案中，所述有害和/或无益应答包括对癌症疗法或疗法组合的一种或多种毒性应答和/或副作用(例如，一种或多种可测量的毒性应答和/或副作用)。

在一些实施方案中，所述方法还包括选择用于起始癌症疗法或癌症疗法组合的候选受试者。在一些实施方案中，所述方法还包括选择用于继续癌症疗法或癌症疗法组合的候选受试者。在一些实施方案中，所述方法还包括如果所述受试者应答谱包括刺激性抗原的数量与抑制性抗原的数量的比率为至少100:1、50:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1.5:1、1.4:1、1.2:1、1.1:1、0.9:1、0.8:1、0.7:1、0.6:1或0.5:1，则选择所述受试者作为候选受试者。

在一些实施方案中，所述方法还包括选择用于修改癌症疗法的候选受试者。在一些实施方案中，所述方法还包括选择用于中止或不起始癌症疗法的候选受试者。在一些实施方案中，所述方法还包括如果所述受试者应答谱包括刺激性抗原的数量与抑制性抗原的数量的比率小于5:1、2:1、1.5:1、1.4:1、1.2:1、1.1:1、0.9:1、0.8:1、0.7:1、0.6:1、0.5:1、0.25:1、0.125:1、0.01:1或0.001:1，则选择所述受试者作为用于修改、中止和/或不起始癌症疗法的候选受试者。

在一些实施方案中，所述方法还包括向所述候选受试者施用所述癌症疗法或癌症疗法的组合。在一些实施方案中，所述方法还包括修改施用于所述候选受试者的癌症疗法。在一些实施方案中，所述方法还包括对所述候选受试者中止或不起始所述癌症疗法。

本公开的另一个方面包括一种将受试者鉴定为癌症疗法的候选者的方法，所述方法包括：a)获得、提供或产生包含细菌细胞或珠粒的文库，所述细菌细胞或珠粒包含多种肿瘤抗原，其中所述文库的每个细菌细胞或珠粒包含不同的肿瘤抗原；b)使所述细菌细胞或珠粒与来自所述受试者的抗原呈递细胞(APC)接触，其中所述APC使所述细菌细胞或珠粒内化；c)在适于通过由一种或多种APC呈递的肿瘤抗原激活淋巴细胞的条件下，使所述APC与来自所述受试者的淋巴细胞接触；d)例如通过评估(例如，检测或测量)一种或多种免疫介质的表达和/或分泌水平(例如，相对于对照增加或降低的水平)来确定一种或多种淋巴细胞是被由一种或多种APC呈递的一种或多种肿瘤抗原激活还是对由一种或多种APC呈递的一种或多种肿瘤抗原没有应答；e)将一种或多种肿瘤抗原鉴定为刺激性抗原和/或抑制性抗原；以及f)将刺激性抗原的数量与抑制性抗原的数量进行比较；以及g)选择所述受试者作为用于起始、继续、修改、中止或不起始癌症疗法的候选受试者。

在一些实施方案中，所述方法还包括选择用于起始癌症疗法或癌症疗法组合的候选受试者。在一些实施方案中，所述方法还包括选择用于继续癌症疗法或癌症疗法组合的候选受试者。在一些实施方案中，所述方法还包括如果刺激性抗原的数量为至少1个(例如，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)并且抑制性抗原的数量为零个，则选择所述受试者作为候选受试者。

在一些实施方案中，所述方法还包括选择用于修改癌症疗法的候选受试者。在一些实施方案中，所述方法还包括选择用于中止或不起始癌症疗法的候选受试者。在一些实施方案中，所述方法还包括如果刺激性抗原的数量为零个并且抑制性抗原的数量为至少1个(例如，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)，则选择所述受试者作为候选受试者。

在一些实施方案中，所述方法还包括向所述候选受试者施用所述癌症疗法或癌症疗法的组合。在一些实施方案中，所述方法还包括修改施用于所述候选受试者的癌症疗法。在一些实施方案中，所述方法还包括对所述候选受试者中止或不起始所述癌症疗法。

附图说明

当与附图一起阅读时，通过以下各种说明性实施方案的描述，将更全面地理解本文所述的本教导。应理解，下文描述的附图仅是出于说明目的，并且不意图以任何方式限制本教导的范围。

图1是示出上清液中由来自代表性样品NEO-031的CD8+T细胞(图A)和CD4+T细胞(图B)分泌的IFNγ的浓度的图。

图2是示出上清液中由来自代表性样品NEO-KCC的CD8+T细胞(图A)和CD4+T细胞(图B)分泌的IFNγ的浓度的图。

图3是示出上清液中由来自代表性样品NEO-041的CD8+T细胞(图A)和CD4+T细胞(图B)分泌的IFNγ的浓度的图。

图4是示出上清液中由来自代表性样品NEO-027的CD8+T细胞(图A)和CD4+T细胞(图B)分泌的IFNγ的浓度的图。

图5是示出上清液中由来自代表性样品NEO-028的CD8+T细胞(图A)和CD4+T细胞(图B)分泌的IFNγ的浓度的图。

图6是示出来自对免疫疗法治疗表现出有益应答(白色圆圈)或表现出无益或有害应答(黑色圆圈)的患者的T细胞的引发刺激性应答(y轴)和抑制性应答(x轴)的新抗原的相对比例的图。圆圈大小指示肿瘤突变负荷(TMB)。

图7是示出相对于通过ATLAS筛选的候选抗原的总数，引发刺激性应答(y轴)和抑制性应答(x轴)的ATLAS鉴定的患者特异性抗原的比例的图。

图8是示出来自图6和图7的合并患者数据的图。所述图示出引发刺激性应答(y轴)和抑制性应答(x轴)的ATLAS鉴定的患者特异性抗原的相对比例。

图9是条形图，其示出引发刺激性应答(黑色)、抑制性应答(白色)或无应答(灰色)的ATLAS鉴定的患者特异性抗原的比例。图A示出CD4

图10是示出来自图6和五名另外患者的合并患者数据的图。每个圆圈描绘来自对免疫疗法治疗表现出有益应答(白色圆圈)或表现出无益或有害应答(黑色圆圈)的个体患者的T细胞的引发刺激性应答(y轴)和抑制性应答(x轴)的新抗原的相对比例。圆圈大小指示肿瘤突变负荷(TMB)。

激活：如本文所用，在允许发生抗原特异性识别的条件下，如果在暴露于由抗原呈递细胞(APC)呈递的肽之后，淋巴细胞的活性可检测地调节，则认为由所述APC呈递的所述肽“激活”淋巴细胞。可评估淋巴细胞活性的任何指标以确定淋巴细胞是否被激活，所述指标为例如，T细胞的增殖、受体的磷酸化或去磷酸化、钙通量、细胞骨架重排、免疫介质(如细胞因子或可溶性介质)的表达和/或分泌升高或降低、一种或多种细胞表面标志物的表达升高或降低。

施用：如本文所用，术语“施用”通常是指将组合物施用于受试者或系统。本领域普通技术人员将意识到在适当的情况下可用于向受试者(例如人)施用的各种途径。例如，在一些实施方案中，施用可以是全身性的或局部的。在一些实施方案中，施用可以是肠内或肠胃外的。在一些实施方案中，可通过注射(例如，肌肉内、静脉内或皮下注射)进行施用。在一些实施方案中，注射可包括推注、滴注、灌注或输注。在一些实施方案中，施用可以是局部的。本领域技术人员应将意识到用于本文所述的特定疗法的适当施用途径，例如在www.fda.gov中列出的施用途径中的施用途径，其包括耳穴(耳部)、颊部、结膜、皮肤、牙部、宫颈内膜、内窦、气管内、肠内、硬膜外、羊膜外、体外(extracorporeal)、间质、腹腔内、羊膜腔内、动脉内、关节内、胆管内、支气管内、囊内(intrabursal)、心内、软骨内、尾部内、海绵体内、腔内、脑内、脑池内、角膜内、冠状动脉内、阴茎海绵体内(intracorporuscavernosum)、皮内、结内、椎间盘内、管内、十二指肠内、硬膜内、表皮内、食道内、胃内、牙龈内、病灶内、管腔内、淋巴内、髓内、脑膜内、肌肉内、眼内、卵巢内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、鼻窦内、脊柱内、滑膜内、腱内、睾丸内、鞘内、胸腔内、管内、肿瘤内、鼓室内、子宫内、血管内、静脉内、静脉推注、静脉滴注、心室内、玻璃体内、喉部、鼻腔、鼻胃管、眼部、口腔、口咽部、肠胃外、经皮、关节周围、硬膜外、神经周围、牙周、直肠、呼吸(例如，吸入)、眼球后部、软组织、蛛网膜下腔、结膜下、皮下、舌下、粘膜下、局部、透皮、经粘膜、经胎盘、经气管、输尿管、尿道或阴道施用。在一些实施方案中，施用可涉及电渗透、血液透析、渗透、离子电渗疗法、冲洗和/或封闭敷料。在一些实施方案中，施用可涉及间歇给药(例如，在时间上分开的多个剂量)和/或定期(例如，以相同的时间段分开的个体剂量)给药。在一些实施方案中，施用可涉及连续给药。

抗原：如本文所用，术语“抗原”是指引发特异性免疫应答的分子(例如，多肽)。抗原特异性免疫应答，也称为适应性免疫应答，由表达抗原受体(例如，T细胞受体、B细胞受体)的淋巴细胞(例如，T细胞、B细胞、NK细胞)介导。在某些实施方案中，抗原是T细胞抗原，并且引发细胞免疫应答。在某些实施方案中，抗原是B细胞抗原，并且引发体液(即，抗体)应答。在某些实施方案中，抗原既是T细胞抗原又是B细胞抗原。如本文所用，术语“抗原”涵盖全长多肽以及所述多肽的部分或免疫原性片段，以及所述多肽内的肽表位(例如，与主要组织相容性复合物(MHC)分子(例如，MHC I类或MHC II类)结合的肽表位)。在一些实施方案中，抗原是肿瘤抗原(例如，肿瘤特异性抗原[TSA或新抗原]、肿瘤相关抗原[TAA]或癌症/睾丸抗原[CTA])。在一些实施方案中，抗原是全长多肽或其片段或肽。

抗原呈递细胞：“抗原呈递细胞”或“APC”是指呈递MHC I类和/或MHC II类分子上的肽以供T细胞识别的细胞。APC包括具有刺激初始淋巴细胞能力的专职APC(例如，树突状细胞、巨噬细胞、B细胞)，以及非专职APC(例如，成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞、神经胶质细胞)。在某些实施方案中，APC能够内化(例如，内吞)表达有充当候选抗原的异源多肽的文库的成员(例如，细菌细胞文库的细胞)。

自溶素多肽：“自溶素多肽”是促进或介导已被真核细胞内化的细胞(例如，细菌细胞)的自溶的多肽。在一些实施方案中，自溶素多肽是细菌自溶素多肽。自溶素多肽包括并且不限于序列在

癌症：如本文所用，术语“癌症”是指疾病、病症或疾患，在所述疾病、病症或疾患中细胞表现出相对异常的、不受控制的和/或自主的生长，使得它们显示出异常升高的增殖率和/或以细胞增殖显著失控为特征的异常生长表型。在一些实施方案中，癌症可以一种或多种肿瘤为特征。本领域技术人员知晓多种类型的癌症，包括，例如，肾上腺皮质癌、星形细胞瘤、基底细胞癌、类癌、心脏(cardiac)癌、胆管癌、脊索瘤、慢性骨髓增生性肿瘤、颅咽管瘤、原位导管癌、室管膜瘤、眼内黑素瘤、胃肠道类癌、胃肠道间质瘤(GIST)、妊娠滋养细胞疾病、胶质瘤、组织细胞增生症、白血病(例如，急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性髓细胞性白血病(CML)、毛细胞白血病、髓细胞性白血病、骨髓性白血病)、淋巴瘤(例如，伯基特淋巴瘤[非霍奇金淋巴瘤]、皮肤T细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、蕈样真菌病、塞扎里综合征(Sezary syndrome)、AIDS相关淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤)、黑素瘤、梅克尔细胞癌、间皮瘤、骨髓瘤(例如，多发性骨髓瘤)、骨髓增生异常综合征、乳头状瘤病、副神经节瘤、嗜铬细胞瘤、胸膜肺母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、肉瘤(例如，尤文肉瘤、卡波西肉瘤、骨肉瘤、横纹肌肉瘤、子宫肉瘤、血管肉瘤)、威尔姆氏瘤，和/或以下部位的癌症：肾上腺皮质、肛门、阑尾、胆管、膀胱、骨、脑、乳腺、支气管、中枢神经系统、子宫颈、结肠、子宫内膜、食道、眼、输卵管、胆囊、胃肠道、生殖细胞、头颈部、心脏、肠、肾(例如，威尔姆氏瘤)、喉、肝、肺(例如，非小细胞肺癌、小细胞肺癌)、嘴、鼻腔、口腔、卵巢、胰腺、直肠、皮肤、胃、睾丸、喉咙、甲状腺、阴茎、咽、腹膜、垂体、前列腺、直肠、唾液腺、输尿管、尿道、子宫、阴道或外阴。

溶细胞素多肽：“溶细胞素多肽”是具有在真核细胞的膜中形成孔的能力的多肽。当在已被真核细胞内化的宿主细胞(例如，细菌细胞)中表达时，溶细胞素多肽能促进将宿主细胞组分(例如，宿主细胞大分子如宿主细胞多肽)释放到所述具有内化作用的胞质溶胶中。在一些实施方案中，溶细胞素多肽是细菌溶细胞素多肽。在一些实施方案中，溶细胞素多肽是细胞质溶细胞素多肽。溶细胞素多肽包括并且不限于序列在美国专利号6,004,815中以及在

细胞质溶细胞素多肽：“细胞质溶细胞素多肽”是具有在真核细胞的膜中形成孔的能力并且在细菌细胞中被表达成细胞质多肽的溶细胞素多肽。细菌细胞不会显著分泌细胞质溶细胞素多肽。细胞质溶细胞素多肽可通过多种方式提供。在一些实施方案中，细胞质溶细胞素多肽是以编码所述细胞质溶细胞素多肽的核酸提供。在一些实施方案中，提供的细胞质溶细胞素多肽附着于珠粒。在一些实施方案中，细胞质溶细胞素多肽具有相对于分泌的溶细胞素多肽的序列改变的序列(例如，通过信号序列的缺失或变化而发生改变，从而使其无功能)。在一些实施方案中，细胞质溶细胞素多肽是细胞质的，因为它在无分泌能力的细胞中表达。在一些实施方案中，细胞质溶细胞素多肽是细胞质的，因为其表达所在的细胞不识别与溶细胞素多肽连接的信号序列，也不介导其分泌。在一些实施方案中，细胞质溶细胞素多肽是细菌溶细胞素多肽。

异源：本文中提及基因或多肽而使用的术语“异源”是指这样的基因或多肽：在其存在的和/或表达其的生物体中其不是天然存在的，和/或其已经被人为引入了生物体中。在一些实施方案中，异源多肽是本文所述的肿瘤抗原。

免疫介质：如本文所用，术语“免疫介质”是指影响免疫应答中涉及的细胞和过程的任何分子。免疫介质包括细胞因子、趋化因子、可溶性蛋白质、转录因子、代谢因子和细胞表面标志物。

改善、增加、抑制、刺激、遏制、减少：如本文所用，术语“改善”、“提高”、“抑制”、“刺激”、“遏制”、“减少”或其语法等同物指示相对于基线或其他参考测量的值。在一些实施方案中，适当的参考测量可以是或者包括在除了不存在特定试剂或处理(例如，在其之前和/或之后)外其他都相当的条件下，或者在存在适当的相当的参考试剂的条件下，在特定系统中(例如，在单个个体中)的测量。特定试剂或处理的效应可以是直接的或间接的。在一些实施方案中，适当的参考测量可以是或者可包括在相当的系统中的测量，所述系统已知或预期在存在相关试剂或处理的条件下以特定方式进行应答。在一些实施方案中，如果在允许发生抗原特异性识别的条件下，淋巴细胞在暴露于由抗原呈递细胞(APC)呈递的肽后被激活至与有益应答相关的表型，则由所述APC呈递的所述肽“刺激”所述淋巴细胞或对所述淋巴细胞是“刺激性的”，所述表型通过例如相对于对照的T细胞的增殖、受体的磷酸化或去磷酸化、钙通量、细胞骨架重排、免疫介质(如细胞因子或可溶性介质)的表达和/或分泌的增加或减少、一种或多种细胞表面标志物的表达的增加或减少观察得到。在一些实施方案中，如果在允许发生抗原特异性识别的条件下，淋巴细胞在暴露于由抗原呈递细胞(APC)呈递的肽后被激活至与有害或无益应答相关的表型，则由所述APC呈递的所述肽“遏制”、“抑制”所述淋巴细胞或对所述淋巴细胞是“抑制性的”，所述表型通过例如相对于对照的T细胞的增殖、受体的磷酸化或去磷酸化、钙通量、细胞骨架重排、免疫介质(如细胞因子或可溶性介质)的表达和/或分泌的增加或减少、一种或多种细胞表面标志物的表达的增加或减少观察得到。

抑制性抗原：“抑制性抗原”是抑制、遏制、削弱和/或降低对肿瘤或癌症的免疫控制的抗原。在一些实施方案中，抑制性抗原促进肿瘤生长，促成肿瘤生长，改善肿瘤生长，激活肿瘤生长，加速肿瘤生长，和/或增加和/或促成肿瘤转移，和/或加速肿瘤生长。在一些实施方案中，抑制性抗原刺激一种或多种对受试者有害或无益的淋巴细胞应答；并且/或者抑制和/或遏制一种或多种对受试者有益的淋巴细胞应答。在一些实施方案中，抑制性抗原是一种或多种对受试者有害或无益的淋巴细胞应答的靶标；并且/或者抑制和/或遏制一种或多种对受试者有益的淋巴细胞应答。

在一些实施方案中，所述抑制性抗原是肿瘤抗原(例如，肿瘤特异性抗原[TSA或新抗原]、肿瘤相关抗原[TAA]或癌症/睾丸抗原[CTA])。在一些实施方案中，所述抑制性抗原是全长多肽或其片段或肽。

侵袭素多肽：“侵袭素多肽”是促进或介导真核细胞摄取细胞(例如，细菌细胞)的多肽。侵袭素多肽在非侵入性细菌细胞中的表达赋予所述细胞进入真核细胞的能力。在一些实施方案中，侵袭素多肽是细菌侵袭素多肽。在一些实施方案中，侵袭素多肽是耶尔森氏菌侵袭素多肽(例如，包含在

李斯特菌溶血素O(LLO)：术语“李斯特菌溶血素O”或“LLO”是指单核细胞增多性李斯特菌的李斯特菌溶血素O多肽及其保留了成孔能力的截短形式(例如，LLO的细胞质形式、包括缺乏信号序列的截短形式)。在一些实施方案中，LLO是细胞质LLO。示例性LLO序列示于下面的表1中。

多肽：如本文所用，术语“多肽”通常具有其在本领域公认的具有至少三个氨基酸的聚合物的含义。然而，本领域普通技术人员应当理解，术语“多肽”应当足够通用至不仅涵盖具有本文(或在本文中具体提及的参考文献或数据库中)所列出的完整序列的多肽，而且还涵盖代表此类完整多肽的功能型片段(即保留至少一种活性的片段)和免疫原性片段的多肽。此外，本领域普通技术人员理解，蛋白质序列通常能耐受一些取代而不破坏活性。因此，保留活性并且与相同类别的另一种多肽共有至少约30％-40％总序列同一性，常常大于约50％、60％、70％或80％，并且进一步通常在一个或多个高度保守区中包括至少一个具有更高同一性，常常大于90％或甚至95％、96％、97％、98％或99％的区，通常涵盖至少3-4个并且常常高达20个或更多个氨基酸的任何多肽涵盖在如本文所使用的相关术语“多肽”之内。通过分析各种多肽的序列，本领域普通技术人员可确定具有相似性和/或同一性的其他区域。

原代细胞：如本文所用，“原代细胞”是指来自生物体的在体外尚未永生化的细胞。在一些实施方案中，原代细胞是直接取自受试者(例如，人)的细胞。在一些实施方案中，原代细胞是取自受试者的细胞的后代(例如，已经在体外传代的细胞)。原代细胞包括在培养过程中已被刺激增殖的细胞。

应答：如在受试者(患者或实验生物体)的情形下使用的“应答”、“应答的”或“应答性”是指由治疗导致或与治疗相关的受试者的疾患的改变。在某些实施方案中，应答是有益应答。在某些实施方案中，有益应答可包括稳定受试者的疾患(例如，防止或延迟预期或通常在没有治疗的情况下被观察到发生的恶化)，缓解(例如，频率和/或强度的降低)疾患的一种或多种症状，和/或改善疾患治愈前景等。在某些实施方案中，对于患有癌症的受试者，有益应答可包括：所述受试者对癌症疗法或疗法组合具有阳性临床应答；所述受试者对癌症有自发的应答；所述受试者的癌症部分或完全缓解；所述受试者已经清除了癌症；所述受试者未发生过癌症的复发、重现或转移；所述受试者具有阳性癌症预后；所述受试者未经历过对癌症疗法或疗法组合的毒性应答或副作用。在某些实施方案中，对于患有癌症的受试者，过去有过有益应答，或者有益应答正在进行中。

在某些实施方案中，应答是有害或无益的应答。在某些实施方案中，有害或无益的应答可包括受试者疾患的恶化、疾患的一种或多种症状没有改善(例如，频率和/或强度没有降低)、和/或疾患的治愈前景退化等。在某些实施方案中，对于患有癌症的受试者，有害或无益的应答可包括：所述受试者对癌症疗法或疗法的组合具有阴性临床应答；所述受试者的癌症没有缓解；所述受试者尚未清除癌症；所述受试者发生过癌症的复发、重现或转移；所述受试者具有阴性癌症预后；所述受试者经历过对癌症疗法或疗法组合的毒性应答或副作用。在某些实施方案中，对于患有癌症的受试者，过去有过有害或无益的应答，或者有害或无益的应答正在进行中。

如本文中在细胞、器官、组织或细胞组分(例如，淋巴细胞)的情形下使用的“应答”、“应答的”或“应答性”是指细胞活性的改变，所述改变的发生是由施用或暴露于试剂(例如肿瘤抗原)导致或与施用或暴露于试剂(例如肿瘤抗原)相关。在某些实施方案中，有益应答可包括与受试者中的阳性临床应答或结果相关的免疫介质表达和/或分泌的增加。在某些实施方案中，有益应答可包括与受试者中的阴性临床应答或结果相关的免疫介质表达和/或分泌的减少。在某些实施方案中，有害或无益的应答可包括与受试者中的阴性临床应答或结果相关的免疫介质表达和/或分泌的增加。在某些实施方案中，有害或无益的应答可包括与受试者中的阳性临床应答或结果相关的免疫介质表达和/或分泌的减少。在某些实施方案中，应答是临床应答。在某些实施方案中，应答是细胞应答。在某些实施方案中，应答是直接应答。在某些实施方案中，应答是间接应答。在某些实施方案中，“无应答”、“无应答的”或“无应答性”是指最小应答或没有可测得的应答。在某些实施方案中，“最小应答”包括没有可测得的应答。在某些实施方案中，可根据特定标准测量和/或表征应答的存在情况、程度和/或性质。在某些实施方案中，此类标准可包括临床标准和/或客观标准。在某些实施方案中，用于评估应答的技术可包括但不限于临床检查、正电子发射断层扫描、胸部X射线、CT扫描、MRI、超声、内窥镜检查、腹腔镜检查、样品中特定标志物的存在情况或水平、细胞学和/或组织学。当目标应答是肿瘤对疗法的应答时，本领域技术人员应当知晓用于评估此类应答(包括例如用于确定肿瘤负荷、肿瘤大小、肿瘤阶段等)的各种已建立的技术。在Therasse等人,J.Natl.Cancer Inst.,2000,92(3):205-216；和Seymour等人,LancetOncol.,2017,18:e143-52中讨论了用于评估对治疗的应答的方法和指南。可任何适当的方式选择确切的应答标准，条件是当比较肿瘤、患者或实验生物体，和/或细胞、器官、组织或细胞组分的组别时，要基于相同或相当的应答率确定标准来评估待比较的组。本领域普通技术人员应能够选择适当的标准。

刺激性抗原：“刺激性抗原”是增强、改善、提高和/或刺激对肿瘤或癌症的免疫控制的抗原。在一些实施方案中，刺激性抗原是减少、杀灭、缩小、消溶和/或根除肿瘤生长的免疫应答的靶标；不促进、促成、改善、激活和/或加速肿瘤生长；减少肿瘤转移；并且/或者减缓肿瘤生长。在一些实施方案中，刺激性抗原抑制和/或遏制一种或多种对受试者有害或无益的淋巴细胞应答；并且/或者刺激一种或多种对受试者有益的淋巴细胞应答。

肿瘤：如本文所用，术语“肿瘤”是指细胞或组织的异常生长。在一些实施方案中，肿瘤可包括癌前(例如，良性)的、恶性的、转移前的、转移的和/或非转移的细胞。在一些实施方案中，肿瘤与癌症相关或是癌症的表现。在一些实施方案中，肿瘤可以是分散肿瘤或液体肿瘤。在一些实施方案中，肿瘤可以是实体瘤。

具体实施方式

免疫检查点抑制剂疗法(如用于癌症免疫疗法的伊匹单抗、纳武单抗和派姆单抗)的最新进展显示，已经在患有NSCLC以及其他适应症的受试者中产生了显著的功效。美国食品药品管理局(FDA)和欧洲药品管理局(EMA)已经批准将纳武单抗和派姆单抗用于先前接受过化学疗法的晚期NSCLC患者。它们证实了T细胞应答在控制肿瘤中的重要性。新抗原，即，在正常人类基因组中完全不存在的潜在的癌症排斥抗原，被认为与肿瘤的控制有关；但是，由于缺乏可用的工具来以生物学相关且无偏倚的方式确定新抗原，所以很难确定它们以及它们在肿瘤清除中的作用(Schumacher和Schreiber,2015Science 348:69-74；Gilchuk等人.,2015Curr Opin Immunol 34:43-51)。

以非小细胞肺癌(NSCLC)为例，来自用派姆单抗治疗的患者的NSCLC肿瘤的全外显子组测序显示，肿瘤中较高的非同义突变负荷与改善的客观应答、持久的临床益处和无进展生存期相关(Rizvi等人,(2015)Science 348(6230):124-8)。在这项研究中，该发现队列的中位非同义突变负荷为209，验证队列的为200。但是，由于突变是通过测序鉴定的，并不意味着它所产生的表位能够被T细胞识别或充当T细胞应答的保护性抗原(Gilchuk等人,2015Curr Opin Immunol 34:43-51)，这使得对新抗原这个词的使用有些不太恰当。在NSCLC中具有200个或更多个T细胞的潜在靶标，不可能对每个预测的表位都进行测试以确定哪些突变充当新抗原，以及哪些新抗原与肿瘤控制的临床证据相关。最近，McGranahan等人的一项研究表明，原发性肺腺癌的克隆性新抗原负荷与总生存期相关。但是，即使对克隆性新抗原进行富集化，仍然得到50个至约400个范围的潜在抗原靶标(McGranahan等人,2016Science 351:1463-69)。在对伊匹单抗疗法有应答的黑素瘤患者(Snyder等人,2015NEJM；Van Allen等人,2015Science)和用派姆单抗治疗的错配修复缺陷性结肠直肠癌患者(Le等人,2015NEJM)中也描述了类似的发现。

本公开提供用于快速鉴定引发T细胞应答、并且特别是引发人T细胞应答的肿瘤抗原(例如，肿瘤特异性抗原(TSA，或新抗原)、肿瘤相关抗原(TAA)或癌症/睾丸抗原(CTA))，以及可能是潜在的肿瘤抗原的多肽的方法和系统。出于本公开的目的，“肿瘤抗原”包括肿瘤抗原和潜在的肿瘤抗原。如本文所述，本公开的方法鉴定出了已知算法未鉴定出的刺激性肿瘤抗原。此外，本公开的方法鉴定出了已知算法无法鉴定的遏制性和/或抑制性肿瘤抗原。本公开所述的方法还鉴定出了可能是潜在肿瘤抗原的多肽，即，激活非癌症受试者的T细胞但不激活癌症受试者的T细胞的多肽。本公开还提供了选择肿瘤抗原和潜在肿瘤抗原的方法、使用所选的肿瘤抗原和潜在肿瘤抗原的方法、包含所选的肿瘤抗原和潜在肿瘤抗原的免疫原性组合物、以及制备免疫原性组合物的方法。本公开还提供了评价癌症受试者中的免疫应答，例如以用于鉴定或选择癌症疗法的起始、继续、修改和/或中止的受试者的方法。

文库的产生

文库是成员(例如，细胞或非细胞颗粒，如病毒颗粒、脂质体或珠粒(例如，用多肽(如体外翻译的多肽)包被的珠粒，例如亲和珠粒，例如抗体包被的珠粒，或结合目标多肽的NTA-Ni珠粒))的集合。根据本公开，文库的成员包括(例如，内部表达或携带)本文所述的目标多肽。在一些实施方案中，文库成员是内部表达本文所述目标多肽的细胞。在一些实施方案中，文库成员是携带目标多肽，和/或与目标多肽结合的颗粒。在测定系统中使用文库可在体外同时评估对多个候选抗原的细胞应答。根据本公开，将文库设计成被人抗原呈递细胞内化，使得来自文库成员的肽(包括来自内部表达的目标多肽的肽)被呈递在所述抗原呈递细胞的MHC分子上以供T细胞识别。

文库可用于检测由人MHC I类和MHC II类分子呈递的肽的测定中。由内化的文库成员表达的多肽在人细胞的细胞内内吞区室(例如，吞噬体、内体、溶酶体)中被消化，并呈递在MHC II类分子上，其被人CD4

一旦被人细胞内化，溶细胞素多肽便穿透所述人细胞中的细胞内区室，从而允许由文库成员表达的多肽进入所述人细胞的胞质溶胶。释放到胞质溶胶中的多肽被呈递在MHC I类分子上，其被CD8

文库可包括任何类型的细胞或颗粒，所述细胞或颗粒能被抗原呈递细胞内化并将目标多肽(和在需要溶细胞素多肽的应用中的溶细胞素多肽)递送给抗原呈递细胞以用于本文所述的方法。虽然在本说明书中通篇使用术语“细胞”来指代文库成员，但是应当理解，在一些实施方案中，所述文库成员是非细胞颗粒，如病毒颗粒、脂质体或珠粒。在一些实施方案中，文库的成员包括编码目标多肽(和溶细胞素多肽)的多核苷酸，并且可在被抗原呈递细胞内化之前和/或期间被诱导以表达目标多肽(和溶细胞素多肽)。

在一些实施方案中，所述溶细胞素多肽对于表达它的文库细胞来说是异源的，并且有助于将由所述文库细胞表达的多肽递送到已经内化了所述文库细胞的人细胞的胞质溶胶中。溶细胞素多肽包括细菌溶细胞素多肽，如李斯特菌溶血素O(LLO)、链球菌溶血素O(SLO)和产气荚膜梭菌溶血素(perfringolysin)O(PFO)。其他的溶细胞素多肽描述于美国专利号6,004,815中。在某些实施方案中，文库成员表达LLO。在一些实施方案中，溶细胞素多肽不被文库细胞显著分泌(例如，细胞产生的溶细胞素多肽的少于20％、10％、5％或1％被分泌)。例如，溶细胞素多肽是细胞质溶细胞素多肽，如细胞质LLO多肽(例如，缺乏N末端信号序列的LLO形式，如Higgins等人,Mol.Microbiol.31(6):1631-1641,1999中描述的)。示例性的溶细胞素多肽序列示于表1中。表1第二行中所示的李斯特菌溶血素O(Δ3-25)序列与表1第一行中所示的LLO序列相比缺失第3-25位残基，并且是细胞质LLO多肽。在一些实施方案中，溶细胞素在文库宿主细胞中组成型表达。在其他实施方案中，溶细胞素在诱导型启动子的控制下表达。溶细胞素多肽可由与目标多肽相同的载体或不同的载体在文库细胞中表达。

表1.示例性溶细胞素多肽

在一些实施方案中，文库成员(例如，是细菌细胞的文库成员)包括促进被抗原呈递细胞摄取的侵袭素。在一些实施方案中，文库成员包括促进抗原呈递细胞内文库成员自溶的自溶素。在一些实施方案中，文库成员包括侵袭素和自溶素两者。在一些实施方案中，文库成员是大肠杆菌细胞，其包括侵袭素和/或自溶素。在各种实施方案中，在也利用非专职抗原呈递细胞或来自细胞系的抗原呈递细胞的方法中，使用表达侵袭素和/或自溶素的文库细胞。Isberg等人(Cell,1987,50:769-778)、Sizemore等人(Science,1995,270:299-302)和Courvalin等人(C.R.Acad.Sci.Paris,1995,318:1207-12)描述了侵袭素的表达以实现靶细胞对细菌的内吞作用。以下文献描述了自溶素：Cao等人,Infect.Immun.1998,66(6):2984-2986；Margot等人,J.Bacteriol.1998,180(3):749-752；Buist等人,Appl.Environ.Microbiol.,1997,63(7):2722-2728；Yamanaka等人,FEMSMicrobiol.Lett.,1997,150(2):269-275；Romero等人,FEMS Microbiol.Lett.,1993,108(1):87-92；Betzner和Keck,Mol.Gen.Genet.,1989,219(3):489-491；Lubitz等人,J.Bacteriol.,1984,159(1):385-387；以及Tomasz等人,J.Bacteriol.,1988,170(12):5931-5934。在一些实施方案中，自溶素具有允许延迟裂解的特征，例如，自溶素是温度敏感的或时间敏感的(参见例如，Chang等人,1995,J.Bact.177,3283-3294；Raab等人,1985,J.Mol.Biol.19,95-105；Gerds等人,1995,Mol.Microbiol.17,205-210)。可用的溶细胞素还包括成瘾(毒药/解毒剂)自溶素(参见，例如，Magnuson R,等人,1996,J.Biol.Chem.271(31),18705-18710；Smith A S,等人,1997,Mol.Microbiol.26(5),961-970)。

在一些实施方案中，文库的成员包括细菌细胞。在某些实施方案中，文库包括非致病性的、非毒性细菌细胞。用作文库成员的细菌的实例包括大肠杆菌、分枝杆菌、单核细胞增生性李斯特氏菌、弗氏志贺氏菌、枯草芽孢杆菌或沙门氏菌。

在一些实施方案中，文库的成员包括真核细胞(例如，酵母细胞)。在一些实施方案中，文库的成员包括病毒(例如噬菌体)。在一些实施方案中，文库的成员包括脂质体。制备包含溶细胞素的脂质体的方法和其他试剂描述于Kyung-Dall等人的美国专利号5,643,599中。在一些实施方案中，文库的成员包括珠粒。制备由珠粒组成的文库的方法描述于例如Lam等人,Nature 354:82-84,1991、美国专利号5,510,240和7,262,269，以及本文引用的参考文献中。

在某些实施方案中，通过将编码目标多肽或其部分的多核苷酸克隆到载体中来构建文库，所述载体在所述文库的细胞中表达目标多肽。可以合成的方式合成多核苷酸。可通过设计扩增多核苷酸的引物来克隆多核苷酸。可使用可用的软件来设计引物，所述软件例如Primer3Plus(可从以下URL获取：bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi；参见Rozen和Skaletsky，于：Krawetz S,Misener S(编辑)Bioinformatics Methods and Protocols:Methods in Molecular Biology.HumanaPress,Totowa,NJ,第365-386页,2000)。用于设计引物的其他方法是本领域技术人员已知的。在一些实施方案中，构建引物以产生截短的、和/或缺乏疏水区(例如，信号序列或跨膜区)的多肽以促进有效表达。可使用可用的软件(参见，例如，

引物也可被设计成包括便于后续克隆步骤的序列。ORF可直接从基因组DNA(例如，肿瘤细胞的基因组DNA)扩增得到，或者从由通过肿瘤细胞表达的mRNA的逆转录(RT-PCR)产生的多核苷酸扩增得到。例如当目标基因组序列含有内含子区域时，mRNA的RT-PCR是有用的。将PCR扩增得到的ORF克隆到合适的载体中，并且可在用于免疫学测定之前验证ORF的大小、序列和表达。

在一些实施方案中，将编码目标多肽的多核苷酸与编码标签(例如，N末端或C末端表位标签)或报告蛋白(例如，荧光蛋白)的序列连接。表位标签和报告蛋白促进所表达多肽的纯化，并且可允许人们验证给定多肽在文库宿主细胞中的正确表达(例如，在将所述细胞用于筛选之前进行验证)。可用的表位标签包括，例如，多组氨酸(His)标签、来自副粘病毒的P和V蛋白的V5表位标签、血凝素(HA)标签、myc标签等。在一些实施方案中，将编码目标多肽的多核苷酸与编码标签的序列融合，所述标签是已知的抗原表位(例如，模式抗原(如卵清蛋白)的MHC I类和/或MHC II类限制性T细胞表位)，并且其可用于验证目标多肽是否被表达以及多肽-标签融合蛋白是否在抗原呈递测定中被加工和呈递。在一些实施方案中，标签包括鼠T细胞(例如鼠T细胞系)的T细胞表位。在一些实施方案中，将编码目标多肽的多核苷酸与促进纯化的标签和是已知的抗原表位的标签连接。可用的报告蛋白包括天然存在的荧光蛋白及其衍生物，例如绿色荧光蛋白(维多利亚多管发光水母(Aequorea Victoria))和Neon Green(普通文昌鱼(Branchiostoma lanceolatum))。也可从商业来源获得以合成的方式衍生的荧光和生色蛋白质组。

将编码目标多肽的多核苷酸克隆到表达载体中以引入文库宿主细胞中。各种载体系统都可用于促进多核苷酸的克隆和操作(如

在一些实施方案中，文库宿主细胞表达(组成型地表达或在诱导下表达，取决于所选择的表达系统)的目标多肽占总细胞蛋白质的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％。在一些实施方案中，在文库成员(例如，细胞、病毒颗粒、脂质体、珠粒)中或文库成员上可得的多肽水平是这样的水平：其使得暴露于足够量的文库成员的抗原呈递细胞呈递在MHC分子的多肽表位的密度与由用纯化的肽诱导的抗原呈递细胞呈递的密度相当。

已有一些有效地、大规模地生产文库的方法。例如，位点特异性重组酶或稀有切割限制酶可用于在正确方向上的表达载体和阅读框架之间转移多核苷酸(Walhout等人,Meth.Enzymol.328:575–592,2000；Marsischky等人,Genome Res.14:2020–202,2004；Blommel等人,Protein Expr.Purif.47:562–570,2006)。

对于产生脂质体文库，可将表达的多肽(例如，纯化的或部分纯化的多肽)包埋在脂质体膜中，例如，如Wassef等人的美国专利号4,863,874；Wheatley等人的美国专利号4,921,757；Huang等人的美国专利号4,925,661；或Martin等人的美国专利号5,225,212中所述。

可将文库设计成包括全长多肽和/或多肽的一部分。全长多肽的表达使得可用于由人抗原呈递细胞呈递的表位最大化，从而提高鉴定抗原的可能性。但是，在一些实施方案中，为了实现有效表达，表达多肽的一部分或以其他方式改变的多肽是有用的。例如，在一些实施方案中，对编码大(例如，大于1,000个氨基酸)的多肽且具有扩展的疏水区、信号肽、跨膜结构域或引起细胞毒性的结构域的多肽的多核苷酸进行修饰(例如，通过C末端截短、N末端截短或内部缺失进行修饰)以降低细胞毒性并允许文库细胞的有效表达，这反过来有助于在人细胞上呈递被编码的多肽。其他类型的修饰如点突变或密码子优化，也可用于增强表达。

包含在文库中的多肽的数量是可变化的。例如，在一些实施方案中，可将文库设计成从靶细胞(例如肿瘤细胞)的ORF的至少5％、10％、15％、20％、25％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或更多表达多肽。在一些实施方案中，文库表达至少10、15、20、25、30、40、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、2500、5000、10,000种或更多种不同的目标多肽，每种可代表由单个全长多核苷酸或其部分编码的多肽。

在一些实施方案中，测定可专注于鉴定分泌多肽、细胞表面表达的多肽或毒力决定簇等抗原，以鉴定可能是体液和细胞两者介导的免疫应答的靶标的抗原。

除目标多肽外，文库可包括标签或报告蛋白，其允许人们容易地纯化、分析或评估目标多肽的MHC呈递情况。在一些实施方案中，由文库表达的多肽包括C末端标签，其包括来自模式抗原(如鸡卵清蛋白(OVA))的MHC I类和MHC II类限制性T细胞表位。使用这些表位验证文库蛋白的表达和MHC呈递。在一些实施方案中，表位分别是OVA

可在阵列上(例如，在固体支持物如96孔板上)提供多组文库成员(例如，细菌细胞)并分离，使得每个位置上的成员表达不同的目标多肽，或一组不同的目标多肽。

下文详细描述了使用文库成员鉴定T细胞抗原的方法。除这些方法外，文库成员还可用于鉴定B细胞抗原的测定中。例如，从包含目标多肽的文库成员制得的裂解物可用于筛选包含来自受试者(例如，已暴露于目标感染物的受试者，患有癌症的受试者和/或对照受试者)的抗体(例如，血清样品)的样品，以确定存在于所述受试者中的抗体是否与目标多肽反应。用于评估抗体反应性的合适的方法是已知的并且包括例如ELISA测定。

目标多肽

在一些实施方案中，本文所述的方法和组合物可用于鉴定和/或检测对目标多肽的免疫应答。在一些实施方案中，目标多肽由来自靶肿瘤细胞的ORF编码，并且文库成员包括(例如，内部表达或携带)来自靶肿瘤细胞的ORF。在一些这样的实施方案中，文库可用于本文所述的方法中，以评估对由一种或多种ORF编码的一种或多种目标多肽的免疫应答。在一些实施方案中，本公开的方法将一种或多种目标多肽鉴定为刺激性抗原(例如，刺激免疫应答，例如T细胞应答，例如一种或多种免疫介质的表达和/或分泌)。在一些实施方案中，本公开的方法将一种或多种目标多肽鉴定为对免疫应答(例如，一种或多种免疫介质的表达和/或分泌)具有最小效应或没有效应的抗原或潜在抗原。在一些实施方案中，本公开的方法将一种或多种目标多肽鉴定为抑制性和/或遏制性抗原(例如，抑制、遏制、下调、削弱和/或阻止免疫应答，例如T细胞应答，例如一种或多种免疫介质的表达和/或分泌)。在一些实施方案中，本公开的方法将一种或多种目标多肽鉴定为肿瘤抗原或潜在的肿瘤抗原，例如肿瘤特异性抗原(TSA，或新抗原)、肿瘤相关抗原(TAA)或癌症/睾丸抗原(CTA)。

在一些实施方案中，目标多肽是推定的肿瘤抗原，并且本文所述的方法和组合物可用于鉴定和/或检测对一种或多种推定的肿瘤抗原的免疫应答。例如，文库的成员包括(例如，内部表达或携带)推定的肿瘤抗原(例如，先前被鉴定(例如，通过第三方鉴定)为肿瘤抗原的多肽，例如，使用不同于本公开方法的方法鉴定为肿瘤抗原的多肽)。在一些实施方案中，推定的肿瘤抗原是本文所述的肿瘤抗原。在一些这样的实施方案中，此类文库可用于评估此类推定的肿瘤抗原是否和/或以何种程度介导免疫应答。在一些实施方案中，本公开的方法将一种或多种推定的肿瘤抗原鉴定为刺激性抗原。在一些实施方案中，本公开的方法将一种或多种推定的肿瘤抗原鉴定为对免疫应答具有最小效应或没有效应的抗原。在一些实施方案中，本公开的方法将一种或多种推定的肿瘤抗原鉴定为抑制性和/或遏制性抗原。

在一些实施方案中，目标多肽是预先选择的肿瘤抗原，并且本文所述的方法和组合物可用于鉴定和/或检测对一种或多种预先选择的肿瘤抗原的免疫应答。例如，在一些实施方案中，文库的成员包括(例如，内部表达或携带)使用本公开方法和/或使用不同于本公开方法的方法鉴定为肿瘤抗原的一种或多种多肽。在一些这样的实施方案中，此类文库可用于评估此类肿瘤抗原是否和/或以何种程度介导由来自一个或多个受试者(例如，患有癌症的受试者和/或对照受试者)的免疫细胞产生的免疫应答，以获得本文所述的一个或多个应答谱。在一些实施方案中，本公开的方法将一种或多种预先选择的肿瘤抗原鉴定为对一个或多个受试者的刺激性抗原。在一些实施方案中，本公开的方法将一种或多种预先选择的肿瘤抗原鉴定为对一个或多个受试者的免疫应答具有最小效应或没有效应的抗原。在一些实施方案中，本公开的方法将一种或多种预先选择的肿瘤抗原鉴定为对一个或多个受试者的抑制性和/或遏制性抗原。

在一些实施方案中，目标多肽是已知的肿瘤抗原，并且本文所述的方法和组合物可用于鉴定和/或检测对一种或多种已知肿瘤抗原的免疫应答。例如，在一些实施方案中，文库的成员包括(例如，内部表达或携带)使用本公开方法和/或使用不同于本公开方法的方法鉴定为肿瘤抗原的一种或多种多肽。在一些这样的实施方案中，此类文库可用于评估此类肿瘤抗原是否和/或以何种程度介导由来自一个或多个受试者(例如，患有癌症的受试者和/或对照受试者)的免疫细胞产生的免疫应答，以获得本文所述的一个或多个应答谱。在一些实施方案中，本公开的方法将一种或多种已知的肿瘤抗原鉴定为对一个或多个受试者的刺激性抗原。在一些实施方案中，本公开的方法将一种或多种已知的肿瘤抗原鉴定为对一个或多个受试者的免疫应答具有最小效应或没有效应的抗原。在一些实施方案中，本公开的方法将一种或多种已知的肿瘤抗原鉴定为对一个或多个受试者的抑制性和/或遏制性抗原。

在一些实施方案中，目标多肽是潜在的肿瘤抗原，并且本文所述的方法和组合物可用于鉴定和/或检测对一种或多种潜在肿瘤抗原的免疫应答。例如，在一些实施方案中，文库的成员包括(例如，内部表达或携带)使用本公开方法和/或使用不同于本公开方法的方法鉴定为目标多肽的一种或多种多肽，例如，编码与肿瘤相关的突变的多肽。在一些这样的实施方案中，此类文库可用于评估此类多肽是否和/或以何种程度介导由来自一个或多个受试者(例如，患有癌症的受试者和/或对照受试者)的免疫细胞产生的免疫应答，以获得本文所述的一个或多个应答谱。在一些实施方案中，本公开的方法将一种或多种多肽鉴定为对一个或多个受试者的刺激性抗原。在一些实施方案中，本公开的方法将一种或多种多肽鉴定为对一个或多个受试者的免疫应答具有最小效应或没有效应的抗原。在一些实施方案中，本公开的方法将一种或多种多肽鉴定为对一个或多个受试者的抑制性和/或遏制性抗原。

肿瘤抗原

本文所述的方法和系统中使用的目标多肽包括肿瘤抗原和潜在的肿瘤抗原，例如肿瘤特异性抗原(TSA，或新抗原)、肿瘤相关抗原(TAA)和/或癌症/睾丸抗原(CTA)。示例性肿瘤抗原包括例如MART-1/MelanA(MART-I或MLANA)、gp100(Pmel 17或SILV)、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、MAGE-1、MAGE-3(也称为HIP8)、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15、降钙素、钙视网膜蛋白、癌胚抗原(CEA)、嗜铬粒蛋白、细胞角蛋白、结蛋白、上皮细胞膜蛋白(EMA)、因子VIII、胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)、Gross囊性疾病液蛋白(GCDFP-15)、HMB-45、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、抑制素、淋巴细胞标志物、MART-1(Melan-A)、Myo D1、肌肉特异性肌动蛋白(MSA)、神经丝、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胎盘碱性磷酸酶(PLAP)、前列腺特异性抗原、PTPRC(CD45)、S100蛋白、平滑肌肌动蛋白(SMA)、突触素、甲状腺球蛋白、甲状腺转录因子1、肿瘤M2-PK、波形蛋白、p53、Ras、HER-2/neu、BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、爱泼斯坦巴尔病毒抗原(例如，EBNA1)、人乳头瘤病毒(HPV)抗原E6或E7(HPV_E6或HPV_E7)、TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO-1(也称为CTAG1B)、erbB、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、PSA、TAG-72、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β-连环蛋白、CDK4、Mum-1、p 15、p 16、43-9F、5T4、791Tgp72、甲胎蛋白(AFP)、β-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3\CA 27.29\BCAA、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68\P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733\EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90\Mac-2结合蛋白\亲环蛋白C相关蛋白、TAAL6、TAG72、TLP、MUC16、IL13Rα2、FRα、VEGFR2、Lewis Y、FAP、EphA2、CEACAM5、EGFR、CA6、CA9、GPNMB、EGP1、FOLR1、内皮受体、STEAP1、SLC44A4、Nectin-4、AGS-16、鸟苷酸环化酶C、MUC-1、CFC1B、整合素α3链(a3b1的、一种层粘连蛋白受体链)、TPS、CD19、CD20、CD22、CD30、CD31、CD72、CD180、CD171(L1CAM)、CD123、CD133、CD138、CD37、CD70、CD79a、CD79b、CD56、CD74、CD166、CD71、CD34、CD99、CD117、CD80、CD28、CD13、CD15、CD25、CD10、CLL-1/CLEC12A、ROR1、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(Glypican3，GPC3)、间皮素、CD33/IL3Ra、c-Met、PSCA、PSMA、糖脂F77、EGFRvIII、BCMA、GD-2、PSAP、Prostein(也称为P501S)、PSMA、存活蛋白(Survivin)(也称为BIRC5)，以及MAGE-A3、MAGEA2、MAGEA4、MAGEA6、MAGEA9、MAGEA10、MAGEA12、BIRC5、CDH3、CEACAM3、CGB_同种型2、ELK4、ERBB2、HPSE1、HPSE2、KRAS_同种型1、KRAS_同种型2、MUC1、SMAD4、TERT,2.TERT.3、TGFBR2、EGAG9_同种型1、TP53、CGB_同种型1、IMPDH2、LCK、血管生成素1(Ang1)(也称为ANGPT1)、XIAP(也称为BIRC4)、半乳糖凝集素3(也称为LGALS3)、VEGF-A(也称为VEGF)、ATP6S1(也称为ATP6AP1)、MAGE-A1、cIAP-1(也称为BIRC2)、巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)、半乳糖凝集素9(也称为LGALS9)、颗粒蛋白前体PGRN(也称为颗粒蛋白)、OGFR、MLIAP(也称为BIRC7)、TBX4(也称为ICPPS、SPS或T-Box4)、分泌性白细胞蛋白抑制因子(Slpi)(也称为抗白细胞蛋白酶)、Ang2(也称为ANGPT2)、半乳糖凝集素1(也称为LGALS1)、TRP-2(也称为DCT)、hTERT(端粒酶逆转录酶)酪氨酸酶相关蛋白1(TRP-1、TYRP1)、NOR-90/UBF-2(也称为UBTF)、LGMN、SPA17、PRTN3、TRRAP_1、TRRAP_2、TRRAP_3、TRRAP_4、MAGEC2、PRAME、SOX10、RAC1、HRAS、GAGE4、AR、CYP1B1、MMP8、TYR、PDGFRB、KLK3、PAX3、PAX5、ST3GAL5、PLAC1、RhoC、MYCN、REG3A、CSAG2、CTAG2-1a、CTAG2-1b、PAGE4、BRAF、GRM3、ERBB4、KIT、MAPK1、MFI2、SART3、ST8SIA1、WDR46、AKAP-4、RGS5、FOSL1、PRM2、ACRBP、CTCFL、CSPG4、CCNB1、MSLN、WT1、SSX2、KDR、ANKRD30A、MAGED1、MAP3K9、XAGE1B、PREX2、CD276、TEK、AIM1、ALK、FOLH1、GRIN2AMAP3K5以及任何前述肿瘤抗原的一种或多种同种型。示例性肿瘤抗原提供在随附的序列表中。

肿瘤特异性抗原(TSA，或新抗原)是在正常宿主基因组中不被编码的肿瘤抗原(参见，，Yarchoan等人,Nat.Rev.Cancer.2017年2月24日.doi:10.1038/nrc.2016.154；Gubin等人,J.Clin.Invest.125:3413-3421(2015))。在一些实施方案中，TSA起因于体细胞突变和/或其他遗传改变。在一些实施方案中，TSA起因于错义或框内(in-frame)突变。在一些实施方案中，TSA起因于移码突变或终止密码子缺失突变。在一些实施方案中，TSA起因于插入或缺失突变。在一些实施方案中，TSA起因于复制或重复扩增突变。在一些实施方案中，TSA起因于剪接变体或不正确的剪接。在一些实施方案中，TSA起因于基因融合。在一些实施方案中，TSA起因于易位。在一些实施方案中，TSA包括致癌病毒蛋白。例如，就像与Merkel细胞多瘤病毒(MCPyV)相关的Merkel细胞癌(MCC)以及与人乳头瘤病毒(HPV)相关的宫颈癌、口咽癌和其他部位的癌症一样，TSA包括由病毒开放阅读框编码的蛋白质。出于本公开的目的，术语“突变”包括可产生抗原的所有突变和遗传改变，所述抗原在受试者的癌症或肿瘤细胞的基因组中被编码但在同一受试者的正常细胞或非癌细胞中不被编码。在一些实施方案中，TSA对受试者是特异性的(个体的)。在一些实施方案中，超过一个受试者(例如，患有癌症的受试者中有少于1％、1％-3％、1％-5％、1％-10％或更多的受试者)共享TSA。在一些实施方案中，由超过一个受试者共享的TSA可以是已知的或预先选择的。

在一些实施方案中，TSA由来自病毒的开放阅读框编码。例如，可将文库设计成表达来自以下病毒之一的多肽：免疫缺陷病毒(例如，人免疫缺陷病毒(HIV)，例如HIV-1、HIV-2)、肝炎病毒(例如，乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、甲型肝炎病毒、非甲型肝炎病毒和非乙型肝炎病毒)、疱疹病毒(例如，单纯疱疹病毒I型(HSV-1)、HSV-2、水痘带状疱疹病毒、爱泼斯坦巴尔病毒、人巨细胞病毒、人疱疹病毒6型(HHV-6)、HHV-7、HHV-8)、痘病毒(例如，天花、牛痘、猴痘、传染性软疣病毒)、流感病毒、人乳头瘤病毒、腺病毒、鼻病毒、冠状病毒、呼吸道合胞病毒、狂犬病病毒、柯萨奇病毒、人T细胞白血病病毒(I型、II型和III型)、副流感病毒、副粘病毒、脊髓灰质炎病毒、轮状病毒、鼻病毒、风疹病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、腺病毒、黄热病病毒、诺沃克病毒、西尼罗河病毒、登革热病毒、严重急性呼吸系统综合症冠状病毒(SARS-CoV)、布尼亚病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、东部马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、日本脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、胡宁病毒、拉沙病毒和淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒。还可根据本文所述的方法生产和使用其他病毒的文库。

肿瘤特异性抗原在本领域中是已知的，其中任何抗原都可用于本文所述的方法中。在一些实施方案中，通过使用下一代测序技术对来自患有癌症的受试者的肿瘤组织和健康组织的基因组和/或外显子组进行测序来确定编码作为潜在或推定的新抗原的多肽的基因序列。在一些实施方案中，使用下一代测序技术对基于突变频率和编码潜在或推定的新抗原的能力所选择的基因进行测序。下一代测序适用于基因组测序、基因组重新测序、转录组分析(RNA-Seq)、DNA-蛋白质相互作用(ChIP-测序)和表观基因组表征(de Magalhaes等人(2010)Ageing Research Reviews 9(3):315-323；Hall N(2007)J.Exp.Biol.209(Pt9):1518-1525；Church(2006)Sci.Am.294(1):46-54；ten Bosch等人(2008)Journal ofMolecular Diagnostics 10(6):484-492；Tucker T等人(2009)The American Journal ofHuman Genetics 85(2):142-154)。下一代测序可用于快速揭示离散突变的存在情况，例如单个肿瘤中的编码突变，例如单个氨基酸变化(如错义突变、框内突变)或由移码突变产生的新的氨基酸延伸、缺失、基因融合、终止密码子中的通读突变、复制或重复扩增突变、剪接变体或不正确剪接的内含子的翻译、以及易位(例如，“neoORF”)。

用于鉴定潜在或推定的新抗原的另一种方法是直接蛋白质测序。使用多维MS技术(MSn)(包括串联质谱法(MS/MS))对酶促消化物进行的蛋白质测序也可用于鉴定新抗原。这种蛋白质组学方法可用于快速、高度自动化的分析(参见，例如，Gevaert等人,Electrophoresis21:1145-1154(2000))。用于对未知蛋白质进行从头测序的高通量方法也可用来分析受试者肿瘤的蛋白质组以鉴定表达的潜在或推定的新抗原。例如，元鸟枪蛋白质测序(meta shotgun protein sequencing)可用于鉴定表达的潜在或推定的新抗原(参见，例如，Guthals等人(2012)Molecular and Cellular Proteomics 11(10):1084-96)。

还可使用MHC多聚体鉴定潜在或推定的新抗原，以鉴定新抗原特异性T细胞应答。例如，可通过使用基于MHC四聚体的筛选技术对患者样品中的新抗原特异性T细胞应答进行高通量分析(参见，例如，Hombrink等人(2011)PLoS One；6(8):e22523；Hadrup等人(2009)Nature Methods,6(7):520-26；van Rooij等人(2013)Journal of Clinical Oncology,31:1-4；以及Heemskerk等人(2013)EMBO Journal,32(2):194-203)。

在一些实施方案中，本文所述的文库可包括通过使用这些方法中的一种鉴定的一种或多种已知或预先选择的肿瘤特异性抗原，或一种或多种潜在或推定的肿瘤特异性抗原。

肿瘤相关抗原(TAA)包括在正常基因组中编码的蛋白质(参见例如，Ward等人,Adv.Immunol.130:25-74(2016))。在一些实施方案中，TAA是正常分化抗原或异常表达的正常蛋白质。过表达的具有生长/存活促进功能的正常蛋白质如威尔姆氏瘤1(WT1)(Ohminami等人,Blood 95:286-293(2000))或Her2/neu(Kawashima等人,Cancer Res.59:431-435(1999))是直接参与致癌过程的TAA。蛋白质的翻译后修饰(如磷酸化)也可导致TAA的形成(Doyle,J.Biol.Chem.281:32676-32683(2006)；Cobbold,Sci.Transl.Med.5:203ra125(2013))。通常超过一个受试者(例如，患有癌症的受试者中有少于1％、1％-3％、1％-5％、1％-10％、1％-20％或更多的受试者)共享TAA。在一些实施方案中，TAA是已知的或预先选择的肿瘤抗原。在一些实施方案中，对于个体受试者来说，TAA是潜在的或推定的肿瘤抗原。癌症/睾丸抗原(CTA)由各种肿瘤类型和生殖组织(例如，睾丸、胎儿卵巢和滋养细胞)表达但是在成人的其他正常组织中表达有限或者检测不到表达，并且通常不在正常生殖细胞上呈递，因为这些组织不表达MHC I类分子(参见例如，Coulie等人,Nat.Rev.Cancer 14:135-146(2014)；Simpson等人,Nat.Rev.Cancer 5:615-625(2005)；Scanlan等人,Immunol.Rev.188:22-32(2002))。文库筛选

本发明尤其提供了用于鉴定由人免疫细胞识别的肿瘤抗原的组合物和方法。人抗原呈递细胞表达人淋巴细胞上的抗原受体和其他免疫激活分子的配体。鉴于物种间在MHC肽结合特异性和抗原加工酶方面的差异，由人细胞加工和呈递的抗原比在非人系统中鉴定的抗原更可能是在体内生理学相关的人抗原。因此，这些抗原的鉴定方法利用人细胞来呈递候选的肿瘤抗原多肽。根据本公开，能内化文库成员并将由所述文库成员表达的多肽呈递在MHC分子上的任何人细胞都可用作抗原呈递细胞。在一些实施方案中，用于抗原呈递的人细胞是原代人细胞。细胞可包括人的外周血单核细胞(PBMC)。在一些实施方案中，在用于抗原呈递测定之前，将外周血细胞分成亚群(例如，包括树突状细胞、巨噬细胞、单核细胞、B细胞或它们的组合的亚群)。在一些实施方案中，表达MHC II类的细胞亚群选自外周血。在一个实例中，包括树突状细胞的细胞群体分离自外周血。在一些实施方案中，分离树突状细胞的亚群(例如，浆细胞样、骨髓性或其亚群)。人树突状细胞标志物包括CD1c、CD1a、CD303、CD304、CD141和CD209。可基于这些标志物中的一种或多种的表达来选择细胞(例如，表达CD303、CD1c和CD141的细胞)。

可使用市售试剂盒(例如，Miltenyi Biotec Inc.的试剂盒)通过阳性选择从外周血分离树突状细胞。在一些实施方案中，所述树突状细胞在用于测定之前进行离体扩增。也可通过在体外将外周血细胞在促进单核细胞前体分化成树突状细胞的条件下进行培养来产生树突状细胞。这些条件通常包括在细胞因子如GM-CSF和IL-4存在下培养细胞(参见例如，Inaba等人,Isolation of dendritic cells,Curr.Protoc.Immunol.5月；第3章:单元3.7,2001)。用于在体外扩增造血干细胞和祖细胞(例如，取自骨髓或外周血)以及在体外将这些细胞分化成树突状细胞的方法描述于美国专利号5,199,942和美国专利公开号20030077263中。简单地说，从外周血或骨髓中分离CD34

在一些实施方案中，将表达人MHC分子的永生化细胞(例如，人细胞，或被工程化成表达人MHC分子的非人细胞)用于抗原呈递。例如，测定可利用转染有人MHC分子的COS细胞或HeLa细胞。

在一些实施方案中，所述方法中使用的抗原呈递细胞和免疫细胞均来源于相同的受试者(例如，使用自体T细胞和APC)。在这些实施方案中，从受试者的外周血中依次分离细胞亚群是有利的，以使得可用于测定的细胞的产量最大化。例如，可首先从外周血中分离出CD4

可从除外周血外的其他来源分离出抗原呈递细胞。例如，抗原呈递细胞可取自粘膜组织(例如，鼻、口、支气管组织、气管组织、胃肠道、生殖道(例如，阴道组织)或相关淋巴组织)、腹膜腔、淋巴节、脾、骨髓、胸腺、肺、肝、肾、神经元组织、内分泌组织或其他组织，以用于筛选测定。在一些实施方案中，细胞取自活跃免疫应答部位(例如溃疡、疮或脓肿)的组织。可经由灌洗或其他方式，从通过外科手术移除的组织分离出细胞。

可用于本文所述方法的抗原呈递细胞不限于“专职”抗原呈递细胞。在一些实施方案中，非专职抗原呈递细胞可有效地用于实施本公开的方法。非专职抗原呈递细胞包括成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞、神经元/神经胶质细胞、不是专职抗原呈递细胞的淋巴或骨髓细胞(例如，T细胞、中性粒细胞)、肌细胞、肝细胞和其他类型的细胞。

在抗原呈递细胞内化、加工由文库成员表达的多肽并将其呈递在MHC分子上的条件下，将所述抗原呈递细胞与表达目标多肽(和溶细胞素多肽(如果有需要))的文库成员一起培养。在一些实施方案中，文库成员在与抗原呈递细胞一起培养之前被杀死或灭活。可通过任何适当的试剂灭活(例如，用有机溶剂固定、辐照、冷冻)细胞或病毒。在一些实施方案中，文库成员是表达与标签(例如，包含一种或多种已知T细胞表位的标签)或报告蛋白连接的ORF的细胞，ORF的表达已在培养之前得到验证。

在一些实施方案中，将抗原呈递细胞与文库成员在37℃下孵育30分钟至5小时(例如，45分钟至1.5小时)。孵育后，可洗涤抗原呈递细胞以除去未被内化的文库成员。在某些实施方案中，所述抗原呈递细胞是非粘附的，并且洗涤需要离心细胞。洗后的抗原呈递细胞可在暴露于淋巴细胞之前在37℃下再孵育一段时间(例如，30分钟至2小时)，以允许抗原加工。在一些实施方案中，需要在暴露于淋巴细胞之前固定并杀死抗原呈递细胞(例如，通过用1％多聚甲醛处理细胞)。

抗原呈递细胞和文库成员的数量可以是变化的，只要文库成员提供的目标多肽的数量足以在MHC分子上呈递即可。在一些实施方案中，抗原呈递细胞以阵列的形式提供，并与多组文库细胞接触，每组文库细胞表达不同的目标多肽。在某些实施方案中，阵列中的每个位置包括1x10

在本文所述的任何实施方案中，在与文库细胞一起孵育之前或在与文库细胞一起孵育之后，抗原呈递细胞可以是新鲜分离的、维持在培养物中的、和/或从冷冻储存中解冻的。

在本公开的方法中，测试人淋巴细胞对抗原呈递细胞(例如已经与上述表达目标多肽的文库一起孵育过的抗原呈递细胞)的抗原特异性反应。本公开所述的方法允许通过使用从个体分离的淋巴细胞库或细胞后代快速鉴定人抗原。抗原特异性应答的检测不依赖于费力的实验程序来分离单个T细胞克隆。在一些实施方案中，人淋巴细胞是原代淋巴细胞。在一些实施方案中，人淋巴细胞是NKT细胞、γ-δT细胞或NK细胞。正如可在用于抗原呈递测定之前将抗原呈递细胞分离成亚群一样，可使用具有特定标志物或其他特征的淋巴细胞群体。在一些实施方案中，分离出T淋巴细胞群体。在一些实施方案中，分离出CD4

可通过本领域已知的任何方法分离和分开淋巴细胞(例如，使用基于抗体的方法如采用磁珠分离、淘选或流式细胞术的方法)。用于鉴定和分离人淋巴细胞及其亚群的试剂是众所周知的并且可商购获得。

用于本文所述方法的淋巴细胞可自人的外周血单核细胞或其他组织分离。在一些实施方案中，淋巴细胞取自肿瘤、淋巴结、粘膜组织(例如，鼻、口、支气管组织、气管组织、胃肠道、生殖道(例如，阴道组织)或相关的淋巴组织)、腹膜腔、脾、胸腺、肺、肝、肾、神经元组织、内分泌组织、腹膜腔、骨髓或其他组织。在一些实施方案中，细胞取自是活跃免疫应答部位(例如，溃疡、疮或脓肿)的组织。可经由灌洗或其他方式，从通过外科手术移除的组织分离出细胞。

可将取自个体的淋巴细胞保持在培养物中或冷冻直至用于抗原呈递测定。在一些实施方案中，可通过暴露于上述文库细胞的抗原呈递细胞在体外刺激新鲜分离的淋巴细胞。在一些实施方案中，这些淋巴细胞表现出可检测的刺激，而不需要在之前有非抗原特异性扩增。但是，当首次在体外被非特异性刺激时，原代淋巴细胞也会引发可检测的抗原特异性应答。因此，在一些实施方案中，在用于抗原呈递测定之前，以非抗原特异性的方式刺激淋巴细胞体外增殖。在用于抗原呈递测定之前，还可以抗原特异性的方式刺激淋巴细胞。在一些实施方案中，通过文库刺激细胞增殖(例如，在用于利用该文库的抗原呈递测定之前进行)。体外扩增细胞提供更多数量的细胞用于测定。可刺激原代T细胞进行扩增，例如通过暴露于多克隆T细胞有丝分裂原如植物血凝素或伴刀豆球蛋白，通过用刺激增殖的抗体处理，或通过用包被有抗体的颗粒处理进行刺激。在一些实施方案中，通过用抗CD2、抗CD3和抗CD28的抗体处理来使T细胞扩增。在一些实施方案中，通过用白介素2处理来使T细胞扩增。在一些实施方案中，将淋巴细胞从冷冻储存中解冻并在与抗原呈递细胞接触之前使其扩增(例如，以例如非抗原特异性方式或以抗原特异性的方式刺激其增殖)。在一些实施方案中，将淋巴细胞从冷冻储存中解冻，并且在与抗原呈递细胞接触之前不使其扩增。在一些实施方案中，将淋巴细胞新鲜分离并在与抗原呈递细胞接触之前使其扩增(例如，以例如非抗原特异性方式或以抗原特异性的方式刺激其增殖)。

在抗原呈递测定中，在允许T细胞识别由抗原呈递细胞上的MHC分子呈递的肽的条件下，将T细胞与根据上述方法制得的抗原呈递细胞一起培养。在一些实施方案中，将T细胞与抗原呈递细胞在37℃下孵育12-48小时(例如，24小时)。在一些实施方案中，将T细胞与抗原呈递细胞在37℃下孵育3、4、5、6、7或8天。抗原呈递细胞和T细胞的数量是可变化的。在一些实施方案中，在给定的测定中T细胞与抗原呈递细胞的比率为1:10、1:5、1:2、1:1、2:1、5:1、10:1、20:1、25:1、30:1、32:1、35:1或40:1。在一些实施方案中，以阵列形式(例如，在96孔板中)提供抗原呈递细胞，其中所述阵列的每个位置中的细胞已与多组文库细胞接触过，每组文库细胞包含不同的目标多肽。在某些实施方案中，阵列中的每个位置包括1x10

在T细胞与抗原呈递细胞一起孵育之后，测定培养物的激活。可通过本领域已知的任何方法检测淋巴细胞的激活，例如T细胞增殖、受体的磷酸化或去磷酸化、钙通量、细胞骨架重排、免疫介质(如细胞因子或可溶性介质)的表达和/或分泌增加或减少、一种或多种细胞表面标志物的表达增加或减少。在一些实施方案中，收获培养物上清液并测定与激活相关的一种或多种多肽的表达和/或分泌的增加和/或减少，例如细胞因子、可溶性介质、细胞表面标志物或其他免疫介质。在一些实施方案中，所述一种或多种细胞因子选自TRAIL、IFN-γ、IL-12p70、IL-2、TNF-α、MIP1-α、MIP1-β、CXCL9、CXCL10、MCP1、RANTES、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、CXCL11、IL-3、IL-5、IL-17、IL-18、IL-21、IL-22、IL-23A、IL-24、IL-27、IL-31、IL-32、TGF-β、CSF、GM-CSF、TRANCE(也称为RANKL)、MIP3-α和曲动蛋白(fractalkine)。在一些实施方案中，所述一种或多种可溶性介质选自颗粒酶A、颗粒酶B、sFas、sFasL、穿孔素和颗粒溶素。在一些实施方案中，所述一种或多种细胞表面标志物选自CD107a、CD107b、CD25、CD69、CD45RA、CD45RO、CD137(4-1BB)、CD44、CD62L、CD27、CCR7、CD154(CD40L)、KLRG-1、CD71、HLA-DR、CD122(IL-2RB)、CD28、IL7Ra(CD127)、CD38、CD26、CD134(OX-40)、CTLA-4(CD152)、LAG-3、TIM-3(CD366)、CD39、PD1(CD279)、FoxP3、TIGIT、CD160、BTLA、2B4(CD244)和KLRG1。在一些实施方案中，一种或多种其他免疫介质选自CXCR5、IDO、PD-L1、CD33、CD11b、LAG3、CXCR3、t-bet、GATA-3、GITR、CD39、CD73、CD57、TCF1、Akt、SLAMF6、BCL-6、FoxO1、TOX、IRF4和CD30。可例如通过ELISA、珠粒阵列，例如用

在一些实施方案中，所述方法中使用的抗原呈递细胞和淋巴细胞来自同一个体。在一些实施方案中，所述方法中使用的抗原呈递细胞和淋巴细胞来自不同的个体。

在一些实施方案中，使用来自同一个体的淋巴细胞重复抗原呈递测定，所述淋巴细胞先前已经在抗原呈递细胞下暴露了一轮或多轮，例如以增强对应答的检测，或增强微弱的初始应答。在一些实施方案中，使用来自同一个体的抗原呈递细胞重复抗原呈递测定，所述抗原呈递细胞已经先前在文库下暴露了一轮或多轮，例如以增强对应答的检测，或增强微弱的初始应答。在一些实施方案中，使用来自同一个体的淋巴细胞和来自同一个体的抗原呈递细胞重复抗原呈递测定，所述淋巴细胞先前已经在抗原呈递细胞下暴露了一轮或多轮，所述抗原呈递细胞先前已经在文库下暴露了一轮或多轮，例如以增强对应答的检测，或增强微弱的初始应答。在一些实施方案中，使用来自不同个体的抗原呈递细胞和淋巴细胞重复抗原呈递测定，例如以鉴定由多个个体识别的抗原，或比较个体之间不同的反应性。

鉴定肿瘤抗原的方法

本文所述方法的一个优点是它们具有鉴定临床相关的人抗原的能力。患有癌症的人可能具有特异性识别肿瘤抗原的淋巴细胞，这是由先前暴露引起的适应性免疫应答的产物。在一些实施方案中，这些细胞存在的频率比来自未患癌症的个体的细胞更高，并且/或者当再次暴露于适当的抗原刺激物时所述细胞容易再次激活(例如，所述细胞是“记忆”细胞)。因此，对于体外鉴定抗原，患有癌症或患过癌症的人是特别有用的细胞供体。个体可以是从癌症中恢复过来的人。在一些实施方案中，个体最近被诊断患有癌症(例如，个体被诊断的时间是在从个体分离淋巴细胞和/或抗原呈递细胞之前的一年以下、三个月以下、两个月以下、一个月以下或两周以下)。在一些实施方案中，个体首次被诊断患有癌症的时间是在分离淋巴细胞和/或抗原呈递细胞之前的三个月以上、六个月以上或一年以上。

在一些实施方案中，针对抗原呈递细胞筛选淋巴细胞，所述抗原呈递细胞已与细胞文库接触过，所述文库的成员表达或携带目标多肽，并且所述淋巴细胞来自未被诊断患有癌症的个体。在一些实施方案中，这种淋巴细胞用于确定背景(即，非抗原特异性)反应性。在一些实施方案中，此类淋巴细胞用于鉴定抗原，在非癌症个体中存在对所述抗原的反应性。

可收集来自多个供体(例如，患有癌症的多个受试者)的细胞，并在本文所述的方法中进行测定。在一些实施方案中，测定来自多个供体的细胞以确定给定的肿瘤抗原在大部分群体中是否具有反应性，或者以鉴定多种肿瘤抗原，其可随后进行组合以产生将在大部分群体中有效的免疫原性组合物。

抗原呈递测定法可用于感染性和非感染性疾病情形。本文描述的方法适用于能得益于人细胞免疫的快速评估的任何情形。在一些实施方案中，评估对由肿瘤性细胞(例如，肿瘤细胞)差异表达的多肽的抗原反应性。已经使用已建立的技术(如消减杂交)鉴定了由肿瘤性细胞差异表达的核酸组。本文所述的方法可用于鉴定在发生有抗肿瘤免疫应答的受试者中有功能性的抗原。在其他实施方案中，使用方法评估受试者是否具有对肿瘤抗原或肿瘤抗原组产生反应的淋巴细胞。

在一些实施方案中，抗原呈递测定用于检查个体(例如，易患或患有自身免疫性疾患的个体)的细胞中对自身抗原的反应性。此类方法可用于提供个体疾病状态的诊断或预后指标，或用于鉴定自身抗原。对于这些测定，在一些实施方案中，制备包括人多肽阵列的文库。在一些实施方案中，制备包括来自感染物的多肽的文库，所述感染物被怀疑引发对自身抗原的交叉反应性应答。有关来自被认为引发交叉反应性自身免疫应答的感染物的抗原的实例参见Barzilai等人,Curr Opin Rheumatol.,19(6):636-43,2007；Ayada等人,Ann NY Acad Sci.,1108:594-602,2007；Drouin等人,Mol Immunol.,45(1):180-9,2008；以及Bach,J Autoimmun.,25增刊:74-80,2005。

如所讨论的，本公开包括将目标多肽包括在文库中(例如，在文库细胞中表达或在颗粒或珠粒中或上携带)的方法。在文库成员被抗原呈递细胞内化后，目标多肽在抗原呈递细胞内被蛋白水解处理，并且所述多肽的肽片段被呈递到抗原呈递细胞中表达的MHC分子上。可通过检查提供给产生刺激的抗原呈递细胞的文库细胞组来确定在本文所述测定中刺激人淋巴细胞的多肽的身份。在一些实施方案中，一种有用的方式是在与MHC分子结合以产生观察到的刺激的多肽中标示出表位。该表位或衍生出它的较长多肽(在本文中都称为“抗原”)可构成免疫原性组合物的基础，或构成以后的抗原呈递测定中的抗原性刺激的基础。

用于鉴定与MHC分子结合的肽的方法是已知的。在一些实施方案中，通过产生目标多肽的缺失突变体并测试它们刺激淋巴细胞的能力来鉴定表位。当被抗原呈递细胞处理并呈递时，丧失刺激淋巴细胞能力的缺失突变体已经失去了肽表位。在一些实施方案中，通过合成对应于目标多肽的部分的肽并测试所述肽刺激淋巴细胞的能力来鉴定表位(例如，在抗原呈递细胞被所述肽诱导的抗原呈递测定中测试)。鉴定与MHC结合的肽的其他方法涉及裂解包括了抗原肽的抗原呈递细胞，从细胞裂解物中亲和纯化MHC分子，以及随后从MHC洗脱出肽并对其进行分析(Falk,K.等人Nature 351:290,1991，和美国专利号5,989,565)。

在其他实施方案中，一种有用的方式是鉴定已经在对抗原的应答中扩增了的克隆性T细胞受体。通过对T细胞受体库进行DNA测序来鉴定克隆性T细胞受体(Howie等人,2015Sci Trans Med 7:301)。通过鉴定TCR的特异性和功能，可将TCR转染到其他细胞类型中，并用于功能性研究或用于新型免疫疗法。在其他实施方案中，一种有用的方式是在受试者中鉴定和分离出对肿瘤抗原有应答的T细胞。可将分离的T细胞进行离体扩增并施用给受试者以进行癌症治疗或预防。

鉴定受试者的免疫应答的方法

本公开提供了鉴定受试者(例如，测试受试者或目标受试者)的一种或多种免疫应答的方法。在一些实施方案中，通过以下方式确定受试者(例如，测试受试者或目标受试者)的一种或多种免疫应答：a)提供本文所述的文库，所述文库包括一组肿瘤抗原(例如，已知的肿瘤抗原，本文所述的肿瘤抗原，或使用本文所述的方法鉴定的肿瘤抗原、潜在的肿瘤抗原和/或其他目标多肽)；b)使所述文库与来自所述受试者的抗原呈递细胞接触；c)使所述抗原呈递细胞与来自所述受试者的淋巴细胞接触；以及d)确定一种或多种淋巴细胞是否被由一种或多种抗原呈递细胞呈递的一种或多种肿瘤抗原刺激、抑制和/或遏制、激活，或者对一种或多种抗原呈递细胞呈递的一种或多种肿瘤抗原无应答。在一些实施方案中，所述文库包括约1、3、5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100种或更多种肿瘤抗原。

在一些实施方案中，测试受试者是(i)尚未接受癌症疗法的癌症受试者；(ii)在临床上对癌症疗法尚无应答和/或没有应答和/或产生阴性应答的癌症受试者；或(iii)尚未被诊断患有癌症的受试者。

在一些实施方案中，目标受试者是(i)在临床上对癌症疗法阳性应答或有过阳性应答的癌症受试者(“应答受试者”)；(ii)在临床上对癌症疗法尚无应答和/或没有应答和/或具有阴性应答的癌症受试者(“非应答受试者”)；(iii)对癌症具有或曾经具有自发应答的癌症受试者(“自发目标受试者”)；或(vi)尚未被诊断患有癌症的受试者(“正常受试者”)。

在一些实施方案中，通过评估本文所述的一种或多种表达或分泌的细胞因子或其他免疫介质的水平来确定淋巴细胞的刺激、非刺激、抑制和/或遏制、激活和/或无应答性。在一些实施方案中，一种或多种表达或分泌的细胞因子水平比对照水平高至少20％、40％、60％、80％、100％、120％、140％、160％、180％、200％或更高，表明淋巴细胞受到刺激。在一些实施方案中，一种或多种表达或分泌的细胞因子水平比对照水平的平均值高至少1、2、3、4或5个标准差，表明淋巴细胞受到刺激。在一些实施方案中，一种或多种表达或分泌的细胞因子水平比针对对照的中值应答水平高至少1、2、3、4或5个绝对中位差(MAD)，表明淋巴细胞受到刺激。在一些实施方案中，对照是阴性对照(例如，表达Neon Green(NG)的克隆)。在一些实施方案中，一种或多种表达或分泌的细胞因子水平比对照水平低至少20％、40％、60％、80％、100％、120％、140％、160％、180％、200％或更高，表明淋巴细胞受到抑制和/或遏制。在一些实施方案中，一种或多种表达或分泌的细胞因子水平比对照水平的平均值低至少1、2、3、4或5个标准差，表明淋巴细胞受到抑制和/或遏制。在一些实施方案中，一种或多种表达或分泌的细胞因子水平比针对对照的中值应答水平低至少1、2、3、4或5个绝对中位差(MAD)，表明淋巴细胞受到抑制和/或遏制。在一些实施方案中，对照是阴性对照(例如，表达Neon Green(NG)的克隆)。在一些实施方案中，一种或多种表达或分泌的细胞因子水平比对照水平高或低至少20％、40％、60％、80％、100％、120％、140％、160％、180％、200％或更高，表明淋巴细胞的激活。在一些实施方案中，一种或多种表达或分泌的细胞因子水平比对照水平的平均值高或低至少1、2、3、4或5个标准差，表明淋巴细胞的激活。在一些实施方案中，一种或多种表达或分泌的细胞因子水平比针对对照的中值应答水平高或低至少1、2、3、4或5个绝对中位差(MAD)，表明淋巴细胞的激活。在一些实施方案中，对照是阴性对照(例如，表达Neon Green(NG)的克隆)。在一些实施方案中，一种或多种表达或分泌的细胞因子水平在对照水平的约20％、15％、10％、5％或更少之内，表明淋巴细胞无应答性或未受刺激。在一些实施方案中，一种或多种表达或分泌的细胞因子水平比对照水平的平均值高或低1或2个标准差以下，表明淋巴细胞无应答性或未受刺激。在一些实施方案中，一种或多种表达或分泌的细胞因子水平比针对对照的中值应答水平高或低1或2个绝对中位差(MAD)以下，表明淋巴细胞无应答性或未受刺激。在一些实施方案中，受试者应答谱可包括对一组不同的细胞因子(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20种或更多种细胞因子)和肿瘤抗原总数(例如，文库中不同的肿瘤抗原的所有或部分)的定量、鉴定和/或展示，所述肿瘤抗原刺激、不刺激、抑制和/或遏制、激活所述细胞因子组中每个成员的产生、表达或分泌，或者对所述细胞因子组中每个成员的产生、表达或分泌没有影响或影响最小。

获得受试者应答谱的方法

本公开提供了用于从测试受试者获得受试者应答谱(“受试者应答谱”)的方法。

在一些实施方案中，通过以下方式获得测试受试者的受试者应答谱：a)提供本文所述的文库，所述文库包括一组肿瘤抗原(例如，已知肿瘤抗原，本文所述的肿瘤抗原，或使用本文所述的方法鉴定的肿瘤抗原、潜在肿瘤抗原和/或其他目标多肽)；b)使所述文库与来自所述测试受试者的抗原呈递细胞接触；c)使所述抗原呈递细胞与来自所述测试受试者的淋巴细胞接触；以及d)确定一种或多种淋巴细胞是被由一种或多种抗原呈递细胞呈递的一种或多种肿瘤抗原刺激、抑制和/或遏制、激活，还是对由一种或多种抗原呈递细胞呈递的一种或多种肿瘤抗原无应答，以获得所述受试者应答谱。在一些实施方案中，所述文库包括约1、3、5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、500、1000种或更多种肿瘤抗原。

受试者应答谱可包括对通过本公开的方法鉴定的所述组肿瘤抗原的所有或一部分的定量、鉴定和/或展示，所述肿瘤抗原刺激淋巴细胞、不刺激淋巴细胞、抑制和/或遏制淋巴细胞、激活淋巴细胞或淋巴细胞对其无应答。在一些实施方案中，受试者应答谱还包括对一种或多种免疫介质，例如一种或多种细胞因子、细胞表面标志物或其他免疫介质的表达或分泌水平的定量、鉴定和/或展示。

在一些实施方案中，受试者应答谱包括对通过本公开的方法鉴定的所述组肿瘤抗原的所有或一部分的定量、鉴定和/或展示，所述肿瘤抗原刺激一种或多种免疫介质的表达或分泌、抑制和/或遏制一种或多种免疫介质的表达或分泌和/或不影响或最小影响免疫介质的表达或分泌。在一些实施方案中，受试者应答谱还包括对一种或多种免疫介质，例如一种或多种细胞因子或细胞表面标志物的定量、鉴定和/或展示。

在一些实施方案中，受试者应答谱包括(i)刺激与至少一种有益应答相关的一种或多种免疫介质的表达和/或分泌水平(和/或降低与至少一种有害或无益应答相关的至少一种免疫介质的表达和/或分泌水平)的肿瘤抗原的数量与(ii)抑制和/或遏制与至少一种有益应答相关的一种或多种免疫介质的表达和/或分泌水平(和/或刺激与至少一种有害或无益应答相关的至少一种免疫介质的表达和/或分泌水平)的肿瘤抗原的数量的比率。

在一些实施方案中，受试者应答谱包括(i)刺激与至少一种有益应答相关的一种或多种免疫介质的表达和/或分泌水平(和/或降低与至少一种有害或无益应答相关的至少一种免疫介质的表达和/或分泌水平)的肿瘤抗原的绝对数量和/或(ii)抑制和/或遏制与至少一种有益应答相关的一种或多种免疫介质的表达和/或分泌水平(和/或刺激与至少一种有害或无益应答相关的至少一种免疫介质的表达和/或分泌水平)的肿瘤抗原的绝对数量。

获得目标应答谱的方法

在一些实施方案中，将受试者应答谱与来自目标受试者的相应应答谱进行比较，所述目标受试者例如在临床上对癌症疗法有应答和/或曾经有应答的癌症受试者；在临床上对癌症疗法没有应答和/或尚无应答的癌症受试者；对癌症具有或曾经具有自发应答的受试者；或尚未被诊断出患有癌症的受试者(目标受试者的“目标应答谱”)。

本公开提供了用于从目标受试者获得目标应答谱的方法。通过以下方式获得目标受试者的目标应答谱：a)提供本文所述的文库，所述文库包括用于产生所述受试者应答谱的相同组肿瘤抗原(例如，已知肿瘤抗原，本文所述的肿瘤抗原，或使用本文所述的方法鉴定的肿瘤抗原、潜在肿瘤抗原和/或其他目标多肽)的所有或一部分；b)使所述文库与来自所述靶标受试者的抗原呈递细胞接触；c)使所述抗原呈递细胞与来自所述靶标受试者的淋巴细胞接触；以及d)确定一种或多种淋巴细胞是被由一种或多种抗原呈递细胞呈递的一种或多种肿瘤抗原刺激、抑制和/或遏制、激活，还是对由一种或多种抗原呈递细胞呈递的一种或多种肿瘤抗原无应答，以获得所述目标应答谱。

目标应答谱包括对来自目标受试者的细胞对所述受试者应答谱中包括的相同组肿瘤抗原的免疫应答的定量、鉴定和/或展示。

在一些实施方案中，目标应答谱包括对所述组肿瘤抗原的所有或一部分的定量、鉴定和/或展示，所述肿瘤抗原刺激淋巴细胞、不刺激淋巴细胞、抑制和/或遏制淋巴细胞、激活淋巴细胞和/或淋巴细胞对其无应答。在一些实施方案中，受试者应答谱还包括对一种或多种免疫介质，例如一种或多种细胞因子、细胞表面标志物或其他免疫介质的表达或分泌水平的定量、鉴定和/或展示。

在一些实施方案中，目标应答谱包括对通过本公开的方法鉴定的所述组肿瘤抗原的所有或一部分的定量、鉴定和/或展示，所述肿瘤抗原刺激一种或多种免疫介质的表达和/或分泌、抑制和/或遏制一种或多种免疫介质的表达或分泌和/或不影响或最小影响免疫介质的表达和/或分泌。在一些实施方案中，受试者应答谱还包括对一种或多种免疫介质，例如一种或多种细胞因子、细胞表面标志物或其他免疫介质的表达或分泌水平的定量、鉴定和/或展示。

在一些实施方案中，目标应答谱包括(i)刺激与至少一种有益应答相关的一种或多种免疫介质的表达和/或分泌水平(和/或降低与至少一种有害或无益应答相关的至少一种免疫介质的表达和/或分泌水平)的肿瘤抗原的数量与(ii)抑制和/或遏制与至少一种有益应答相关的一种或多种免疫介质的表达和/或分泌水平(和/或刺激与至少一种有害或无益应答相关的至少一种免疫介质的表达和/或分泌水平)的肿瘤抗原的数量的比率。

在一些实施方案中，目标应答谱包括(i)刺激与至少一种有益应答相关的一种或多种免疫介质的表达和/或分泌水平(和/或降低与至少一种有害或无益应答相关的至少一种免疫介质的表达和/或分泌水平)的肿瘤抗原的绝对数量和/或(ii)抑制和/或遏制与至少一种有益应答相关的一种或多种免疫介质的表达和/或分泌水平(和/或刺激与至少一种有害或无益应答相关的至少一种免疫介质的表达和/或分泌水平)的肿瘤抗原的绝对数量。

受试者应答谱与目标应答谱的比较

在一些实施方案中，如果受试者应答谱中所鉴定的刺激淋巴细胞的肿瘤抗原与目标应答谱中所鉴定的刺激淋巴细胞的肿瘤抗原相差不超过1、2、3、4、5、10、15、20或25种；如果受试者应答谱中所鉴定的不刺激淋巴细胞的肿瘤抗原与目标应答谱中所鉴定的不刺激淋巴细胞的肿瘤抗原相差不超过1、2、3、4、5、10、15、20或25种；如果受试者应答谱中所鉴定的抑制和/或遏制淋巴细胞的肿瘤抗原与目标应答谱中所鉴定的抑制和/或遏制淋巴细胞的肿瘤抗原相差不超过1、2、3、4、5、10、15、20或25种；如果受试者应答谱中所鉴定的激活淋巴细胞的肿瘤抗原与目标应答谱中所鉴定的激活淋巴细胞的肿瘤抗原相差不超过1、2、3、4、5、10、15、20或25种；和/或如果受试者应答谱中所鉴定的不刺激淋巴细胞或淋巴细胞对其无应答的肿瘤抗原与目标应答谱中所鉴定的淋巴细胞对其无应答或最小应答的肿瘤抗原相差不超过1、2、3、4、5、10、15、20或25种，则受试者应答谱与目标应答谱相似。

在一些实施方案中，如果受试者应答谱中所鉴定的刺激淋巴细胞的肿瘤抗原与目标应答谱中所鉴定的刺激淋巴细胞的肿瘤抗原相差超过5、6、7、8、9、10、20种或更多种；如果受试者应答谱中所鉴定的不刺激淋巴细胞的肿瘤抗原与目标应答谱中所鉴定的不刺激淋巴细胞的肿瘤抗原相差相差超过5、6、7、8、9、10、20种或更多种；如果受试者应答谱中所鉴定的抑制和/或遏制淋巴细胞的肿瘤抗原与目标应答谱中所鉴定的抑制和/或遏制淋巴细胞的肿瘤抗原相差超过5、6、7、8、9、10、20种或更多种；如果受试者应答谱中所鉴定的激活淋巴细胞的肿瘤抗原与目标应答谱中所鉴定的激活淋巴细胞的肿瘤抗原相差超过5、6、7、8、9、10、20种或更多种；和/或如果受试者应答谱中所鉴定的不刺激淋巴细胞或淋巴细胞对其无应答的肿瘤抗原与目标应答谱中所鉴定的淋巴细胞对其无应答或最小应答的肿瘤抗原相差超过5、6、7、8、9、10、20种或更多种，则受试者应答谱与目标应答谱不同。

在一些实施方案中，如果受试者应答谱中所鉴定的刺激淋巴细胞的肿瘤抗原与目标应答谱中所鉴定的刺激淋巴细胞的肿瘤抗原相差不超过1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％或25％；如果受试者应答谱中所鉴定的不刺激淋巴细胞的肿瘤抗原与目标应答谱中所鉴定的不刺激淋巴细胞的肿瘤抗原相差不超过1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％或25％；如果受试者应答谱中所鉴定的抑制和/或遏制淋巴细胞的肿瘤抗原与目标应答谱中所鉴定的抑制和/或遏制淋巴细胞的肿瘤抗原相差不超过1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％或25％；如果受试者应答谱中所鉴定的激活淋巴细胞的肿瘤抗原与目标应答谱中所鉴定的激活淋巴细胞的肿瘤抗原相差不超过1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％或25％；和/或如果受试者应答谱中所鉴定的不刺激淋巴细胞或淋巴细胞对其无应答的肿瘤抗原与目标应答谱中所鉴定的淋巴细胞对其无应答或最小应答的肿瘤抗原相差不超过1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％或25％，则受试者应答谱与目标应答谱相似。

在一些实施方案中，如果受试者应答谱中所鉴定的刺激淋巴细胞的肿瘤抗原与目标应答谱中所鉴定的刺激淋巴细胞的肿瘤抗原相差超过5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％或更多；如果受试者应答谱中所鉴定的不刺激淋巴细胞的肿瘤抗原与目标应答谱中所鉴定的不刺激淋巴细胞的肿瘤抗原相差超过5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％或更多；和/或如果受试者应答谱中所鉴定的抑制和/或遏制淋巴细胞的肿瘤抗原与目标应答谱中所鉴定的抑制和/或遏制淋巴细胞的肿瘤抗原相差超过5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％或更多；如果受试者应答谱中所鉴定的激活淋巴细胞的肿瘤抗原与目标应答谱中所鉴定的激活淋巴细胞的肿瘤抗原相差超过5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％或更多；和/或如果受试者应答谱中所鉴定的不刺激淋巴细胞或淋巴细胞对其无应答的肿瘤抗原与目标应答谱中所鉴定的淋巴细胞对其无应答或最小应答的肿瘤抗原相差超过5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％或更多，则受试者应答谱与目标应答谱不同。

在一些实施方案中，本文所述的方法包括将(a)包括(i)刺激与至少一种有益应答相关的一种或多种免疫介质的表达和/或分泌水平的肿瘤抗原的数量(和/或抑制和/或遏制与至少一种有害或无益应答相关的至少一种免疫介质的表达和/或分泌水平的肿瘤抗原的数量)与(ii)抑制和/或遏制与至少一种有益应答相关的一种或多种免疫介质的表达和/或分泌水平的肿瘤抗原的数量(和/或刺激与至少一种有害或无益应答相关的至少一种免疫介质的表达和/或分泌水平的肿瘤抗原的数量)的比率的受试者应答谱；与(b)包括(iii)刺激与有益应答相关的一种或多种免疫介质的表达和/或分泌水平的肿瘤抗原的数量(和/或抑制和/或遏制与至少一种有害或无益应答相关的抑制或多种免疫介质的表达和/或分泌水平的肿瘤抗原的数量)与(iv)抑制和/或遏制与至少一种有益应答相关的一种或多种免疫介质的表达和/或分泌水平的肿瘤抗原的数量(和/或刺激与至少一种有害或无益应答相关的至少一种免疫介质的表达和/或分泌水平的肿瘤抗原的数量)的比率的目标应答谱进行比较。

在一些实施方案中，将(a)受试者应答谱的刺激与至少一种有益应答相关的一种或多种免疫介质的表达和/或分泌水平的肿瘤抗原的绝对数量(和/或抑制和/或遏制与至少一种有害或无益应答相关的至少一种免疫介质的表达和/或分泌水平的肿瘤抗原的绝对数量)与(b)目标应答谱的抑制和/或遏制与至少一种有益应答相关的一种或多种免疫介质的表达和/或分泌水平的肿瘤抗原的绝对数量(和/或刺激与至少一种有害或无益应答相关的至少一种免疫介质的表达和/或分泌水平的肿瘤抗原的绝对数量)进行比较。

在一些实施方案中，目标应答谱可包括对一种或多种细胞因子、细胞表面标志物或其他免疫介质和肿瘤抗原(例如，受试者应答谱中包括的相同肿瘤抗原)的总数的定量、鉴定和/或展示，所述肿瘤抗原刺激、不刺激、抑制和/或抑制细胞因子产生、表达和/或分泌，或对细胞因子产生、表达和/或分泌没有影响或影响最小。在一些实施方案中，目标应答谱可包括对一组不同的细胞因子(例如，受试者应答谱中包括的细胞因子中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20种或更多种(例如，所有))和肿瘤抗原(例如，受试者应答谱中包括的相同肿瘤抗原)总数的定量、鉴定和/或展示，所述肿瘤抗原刺激、不刺激、抑制和/或遏制所述组细胞因子的产生、表达和/或分泌，或对所述组细胞因子的产生、表达和/或分泌没有影响或影响最小。

在一些实施方案中，如果受试者应答谱中包括的刺激一种或多种细胞因子、细胞表面标志物或其他免疫介质的表达和/或分泌的抗原的总数与目标应答谱中包括的刺激相同的一种或多种细胞因子、细胞表面标志物或其他免疫介质的抗原的总数相差不超过1、2、3、4、5、10、15、20或25个；如果受试者应答谱中包括的不刺激一种或多种细胞因子、细胞表面标志物或其他免疫介质的表达和/或分泌的抗原的总数与目标应答谱中包括的不刺激相同的一种或多种细胞因子、细胞表面标志物或其他免疫介质的抗原的总数相差不超过1、2、3、4、5、10、15、20或25个；如果受试者应答谱中包括的抑制和/或遏制一种或多种细胞因子、细胞表面标志物或其他免疫介质的抗原的总数与目标应答谱中包括的抑制和/或遏制相同的一种或多种细胞因子、细胞表面标志物或其他免疫介质的表达和/分泌的抗原的总数相差不超过1、2、3、4、5、10、15、20或25个；和/或如果受试者应答谱中包括的对一种或多种细胞因子、细胞表面标志物或其他免疫介质的表达和/或分泌没有影响或影响最小的抗原的总数与目标应答谱中包括的对相同的一种或多种细胞因子、细胞表面标志物或其他免疫介质没有影响或影响最小的抗原的总数相差不超过1、2、3、4、5、10、15、20或25个，则受试者应答谱与目标应答谱相似。

在一些实施方案中，如果受试者应答谱中包括的刺激一种或多种细胞因子、细胞表面标志物或其他免疫介质的表达和/或分泌的抗原的总数与目标应答谱中包括的刺激相同的一种或多种细胞因子、细胞表面标志物或其他免疫介质的抗原的总数相差超过5、6、7、8、9、10、20个或更多个；如果受试者应答谱中包括的不刺激一种或多种细胞因子、细胞表面标志物或其他免疫介质的表达和/或分泌的抗原的总数与目标应答谱中包括的不刺激相同的一种或多种细胞因子、细胞表面标志物或其他免疫介质的抗原的总数相差超过5、6、7、8、9、10、20个或更多个；如果受试者应答谱中包括的抑制和/或遏制一种或多种细胞因子、细胞表面标志物或其他免疫介质的表达和/分泌的抗原的总数与目标应答谱中包括的抑制和/或遏制相同的一种或多种细胞因子、细胞表面标志物或其他免疫介质的抗原的总数相差超过5、6、7、8、9、10、20个或更多个；和/或如果受试者应答谱中包括的对一种或多种细胞因子、细胞表面标志物或其他免疫介质的表达和/或分泌没有影响或影响最小的抗原的总数与目标应答谱中包括的对相同的一种或多种细胞因子、细胞表面标志物或其他免疫介质没有影响或影响最小的抗原的总数相差超过5、6、7、8、9、10、20个或更多个，则受试者应答谱与目标应答谱不同。

前述方法适用于用编码为潜在肿瘤抗原以及肿瘤抗原的多肽的文库获得的受试者应答谱和目标应答谱。

鉴定/选择癌症疗法的受试者的方法

本公开提供了鉴定癌症疗法(例如，本文所述的癌症疗法)的起始、继续、修改和/或终止或在一些情况下不起始的测试受试者(例如，癌症受试者)的方法。通常，此类方法包括将未接受癌症疗法(或在临床上对癌症疗法尚无应答和/或没有应答和/或具有阴性应答)的癌症受试者的一种或多种免疫应答与目标受试者的一种或多种免疫应答进行比较，所述目标受试者是(i)在临床上对癌症疗法阳性应答或有过阳性应答的癌症受试者(“应答受试者”)；(ii)在临床上对癌症疗法尚无应答和/或没有应答和/或具有阴性应答的癌症受试者(“非应答受试者”)；(iii)对癌症具有或曾经具有自发应答的癌症受试者(“自发目标受试者”)；或(vi)尚未被诊断患有癌症的受试者(“正常受试者”)。

测试受试者的与应答受试者的一种或多种免疫应答相同或相似和/或与非应答受试者的一种或多种免疫反应不同的一种或多种免疫应答表明，测试受试者应起始和/或继续和/或修改(例如，增加一种或多种其他方式和/或与一种或多种其他方式组合)癌症疗法。测试受试者的与应答受试者的一种或多种免疫应答不同和/或与非应答受试者的一种或多种免疫应答相似(或相同)的一种或多种免疫应答表明，癌症患者不应起始和/或应中止和/或应修改(例如减少一种或多种其他方式和/或与一种或多种其他方式组合)癌症疗法，和/或应起始替代癌症疗法，或者在一些情况下不起始癌症疗法。

在一些实施方案中，与(应答受试者的)目标应答谱相似的受试者应答谱表明测试受试者应起始和/或继续和/或修改(例如，增加一种或多种其他方式和/或与一种或多种其他方式组合)癌症疗法。在一些实施方案中，本文描述的方法包括如果测试受试者应答谱与(应答受试者的)目标应答谱相似，则选择所述受试者用于起始和/或继续和/或修改(例如，增加一种或多种其他方式和/或与一种或多种其他方式组合)癌症疗法。在一些实施方案中，本文所述的方法包括如果测试受试者应答谱与(应答受试者的)目标应答谱相似，则开始和/或继续和/或修改(例如，增加一种或多种其他方式和/或与一种或多种其他方式组合)对所述受试者的癌症疗法的施用。在一些实施方案中，本文所述的方法包括如果测试受试者应答谱与(应答受试者的)目标应答谱相似，则向所述受试者施用癌症疗法。在一些实施方案中，本文所述的方法包括如果测试受试者应答谱与(应答受试者的)目标应答谱相似，则修改对所述受试者的癌症疗法的施用(例如，增加一种或多种其他方式和/或与一种或多种其他方式组合)。

在一些实施方案中，与(应答受试者的)目标应答谱不同的受试者应答谱表明测试受试者不应起始癌症疗法和/或应修改癌症疗法(例如减少一种或多种其他方式和/或与一种或多种其他方式组合)和/或应中止癌症疗法，和/或应起始替代癌症疗法。在一些实施方案中，本文描述的方法包括如果测试受试者应答谱与(应答受试者的)目标应答谱不同，则不选择所述受试者用于起始癌症疗法，和/或选择测试受试者用于修改癌症疗法(例如，减少一种或多种其他方式和/或与一种或多种其他方式组合)和/或中止癌症疗法和/或起始替代癌症疗法。在一些实施方案中，本文描述的方法包括如果测试受试者应答谱与(应答受试者的)目标应答谱不同，则不起始和/或修改(例如，减少一种或多种其他方式和/或与一种或多种其他方式组合)和/或中止对所述受试者的癌症疗法的施用，和/或起始替代癌症疗法。在一些实施方案中，本文所述的方法包括如果测试受试者应答谱与(应答受试者的)目标应答谱不同，则不向所述受试者施用癌症疗法。在一些实施方案中，本文所述的方法包括如果测试受试者应答谱与(应答受试者的)目标应答谱不同，则修改对所述受试者的癌症疗法的施用(例如，减少一种或多种其他方式和/或与一种或多种其他方式组合)。在一些实施方案中，本文所述的方法包括如果测试受试者应答谱与(应答受试者的)目标应答谱不同，则向所述受试者施用替代癌症疗法。

在一些实施方案中，将受试者应答谱与临床上对癌症疗法尚无应答和/或没有应答和/或具有阴性应答的癌症受试者的相应应答谱(非应答受试者的“目标应答谱”)进行比较。在一些实施方案中，通过以下方式获得(非应答受试者的)目标应答谱：提供本文所述的文库，所述文库包括用于产生受试者应答谱的相同组肿瘤抗原(例如，已知肿瘤抗原，本文所述的或使用本文所述的方法鉴定的肿瘤抗原)的所有或一部分；使所述文库与来自所述非应答受试者的抗原呈递细胞接触；使所述抗原呈递细胞与来自所述非应答受试者的淋巴细胞接触；以及确定一种或多种淋巴细胞是被由一种或多种抗原呈递细胞呈递的一种或多种肿瘤抗原刺激、抑制和/或遏制，还是对由一种或多种抗原呈递细胞呈递的一种或多种肿瘤抗原无应答。(非应答受试者的)目标应答谱包括对来自非应答癌症受试者的细胞对所述受试者应答谱中包括的相同组肿瘤抗原的免疫应答的定量、鉴定和/或展示。

在本公开中提供了用于将受试者应答谱与目标应答谱进行比较的方法，以及用于确定受试者应答谱与目标应答谱的相似性和相异性的参数。

在一些实施方案中，(非应答受试者的)目标应答谱包括对所述组肿瘤抗原的所有或一部分的定量、鉴定和/或展示，所述肿瘤抗原刺激淋巴细胞、不刺激淋巴细胞、和/或抑制和/或遏制淋巴细胞。在一些实施方案中，如果受试者应答谱中所鉴定的刺激淋巴细胞的肿瘤抗原与(非应答受试者的)目标应答谱中所鉴定的刺激淋巴细胞的肿瘤抗原相差不超过1、2、3、4、5、10、15、20或25种；如果受试者应答谱中所鉴定的不刺激淋巴细胞的肿瘤抗原与(非应答受试者的)目标应答谱中所鉴定的不刺激淋巴细胞的肿瘤抗原相差不超过1、2、3、4、5、10、15、20或25种；和/或如果受试者应答谱中所鉴定的抑制和/或遏制淋巴细胞的肿瘤抗原与(非应答受试者的)目标应答谱中所鉴定的抑制和/或遏制淋巴细胞的肿瘤抗原相差不超过1、2、3、4、5、10、15、20或25种，则所述受试者应答谱与(非应答受试者的)目标应答谱相似。在一些实施方案中，如果受试者应答谱中所鉴定的刺激淋巴细胞的肿瘤抗原与(非应答受试者的)目标应答谱中所鉴定的刺激淋巴细胞的肿瘤抗原相差超过5、6、7、8、9、10、20种或更多种；如果受试者应答谱中所鉴定的不刺激淋巴细胞的肿瘤抗原与(非应答受试者的)目标应答谱中所鉴定的不刺激淋巴细胞的肿瘤抗原相差超过5、6、7、8、9、10、20种或更多种；和/或如果受试者应答谱中所鉴定的抑制和/或遏制淋巴细胞的肿瘤抗原与(非应答受试者的)目标应答谱中所鉴定的抑制和/或遏制淋巴细胞的肿瘤抗原相差超过5、6、7、8、9、10、20种或更多种，则所述受试者应答谱与所述目标应答谱不同。在一些实施方案中，如果受试者应答谱中所鉴定的刺激淋巴细胞的肿瘤抗原与(非应答受试者的)目标应答谱中所鉴定的刺激淋巴细胞的肿瘤抗原相差不超过1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％或25％；如果受试者应答谱中所鉴定的不刺激淋巴细胞的肿瘤抗原与(非应答受试者的)目标应答谱中所鉴定的不刺激淋巴细胞的肿瘤抗原相差不超过1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％或25％；和/或如果受试者应答谱中所鉴定的抑制和/或遏制淋巴细胞的肿瘤抗原与(非应答受试者的)目标应答谱中所鉴定的抑制和/或遏制淋巴细胞的肿瘤抗原相差不超过1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％或25％，则所述受试者应答谱与(非应答受试者的)目标应答谱相似。在一些实施方案中，如果受试者应答谱中所鉴定的刺激淋巴细胞的肿瘤抗原与(非应答受试者的)目标应答谱中所鉴定的刺激淋巴细胞的肿瘤抗原相差超过5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％或更多；如果受试者应答谱中所鉴定的不刺激淋巴细胞的肿瘤抗原与(非应答受试者的)目标应答谱中所鉴定的不刺激淋巴细胞的肿瘤抗原相差超过5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％或更多；和/或如果受试者应答谱中所鉴定的抑制和/或遏制淋巴细胞的肿瘤抗原与(非应答受试者的)目标应答谱中所鉴定的抑制和/或遏制淋巴细胞的肿瘤抗原相差超过5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％或更多，则所述受试者应答谱与(非应答受试者的)目标应答谱不同。

在一些实施方案中，(非应答受试者的)目标应答谱可包括对一种或多种细胞因子、细胞表面标志物或其他免疫介质和肿瘤抗原(例如，受试者应答谱中包括的相同肿瘤抗原)的总数的定量、鉴定和/或展示，所述肿瘤抗原刺激、不刺激和/或抑制和/或遏制所述一种或多种细胞因子、细胞表面标志物或其他免疫介质的产生、修饰、定位、表达和/或分泌。在一些实施方案中，(非应答受试者的)目标应答谱可包括对一组不同的细胞因子、细胞表面标志物或其他免疫介质(例如，受试者应答谱中包括的细胞因子、细胞表面标志物或其他免疫介质中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20种或更多种(例如，所有))和肿瘤抗原(例如，受试者应答谱中包括的相同肿瘤抗原)总数的定量、鉴定和/或展示，所述肿瘤抗原刺激、不刺激和/或抑制和/或遏制所述组细胞因子、细胞表面标志物或其他免疫介质的产生、修饰、定位、表达和/或分泌。在一些实施方案中，如果受试者应答谱中包括的刺激一种或多种细胞因子、细胞表面标志物或其他免疫介质的抗原的总数与(非应答受试者的)目标应答谱中包括的刺激相同的一种或多种细胞因子、细胞表面标志物或其他免疫介质的抗原的总数相差不超过1、2、3、4、5、10、15、20或25个；如果受试者应答谱中包括的不刺激一种或多种细胞因子、细胞表面标志物或其他免疫介质的抗原的总数与(非应答受试者的)目标应答谱中包括的不刺激相同的一种或多种细胞因子、细胞表面标志物或其他免疫介质的抗原的总数相差不超过1、2、3、4、5、10、15、20或25个；和/或如果受试者应答谱中包括的抑制和/或遏制一种或多种细胞因子、细胞表面标志物或其他免疫介质的抗原的总数与(非应答受试者的)目标应答谱中包括的抑制和/或遏制相同的一种或多种细胞因子、细胞表面标志物或其他免疫介质的抗原的总数相差不超过1、2、3、4、5、10、15、20或25个，则所述受试者应答谱与(非应答受试者的)目标应答谱相似。在一些实施方案中，如果受试者应答谱中包括的刺激一种或多种细胞因子、细胞表面标志物或其他免疫介质的抗原的总数与(非应答受试者的)目标应答谱中包括的刺激相同的一种或多种细胞因子、细胞表面标志物或其他免疫介质的抗原的总数相差超过5、6、7、8、9、10个或更多个；如果受试者应答谱中包括的不刺激一种或多种细胞因子、细胞表面标志物或其他免疫介质的抗原的总数与(非应答受试者的)目标应答谱中包括的不刺激相同的一种或多种细胞因子、细胞表面标志物或其他免疫介质的抗原的总数相差超过5、6、7、8、9、10个或更多个；和/或如果受试者应答谱中包括的抑制和/或遏制一种或多种细胞因子、细胞表面标志物或其他免疫介质的抗原的总数与(非应答受试者的)目标应答谱中包括的抑制和/或遏制相同的一种或多种细胞因子、细胞表面标志物或其他免疫介质的抗原的总数相差超过5、6、7、8、9、10、20个或更多个，则所述受试者应答谱与(非应答受试者的)目标应答谱不同。

在一些实施方案中，与(非应答受试者的)目标应答谱不同的受试者应答谱表明测试受试者应起始和/或继续和/或修改(例如，增加一种或多种其他方式和/或与一种或多种其他方式组合)癌症疗法。在一些实施方案中，本文描述的方法包括如果测试受试者应答谱与(非应答受试者的)目标应答谱不同，则选择所述受试者用于起始和/或继续和/或修改(例如，增加一种或多种其他方式和/或与一种或多种其他方式组合)癌症疗法。在一些实施方案中，本文所述的方法包括如果测试受试者应答谱与(非应答受试者的)目标应答谱不同，则开始和/或继续和/或修改(例如，增加一种或多种其他方式和/或与一种或多种其他方式组合)对所述受试者的癌症疗法的施用。在一些实施方案中，本文所述的方法包括如果测试受试者应答谱与(非应答受试者的)目标应答谱不同，则向所述受试者施用癌症疗法。在一些实施方案中，本文所述的方法包括如果测试受试者应答谱与(非应答受试者的)目标应答谱不同，则修改对所述受试者的癌症疗法的施用(例如，增加一种或多种其他方式和/或与一种或多种其他方式组合)。

在一些实施方案中，与(非应答受试者的)目标应答谱相似的受试者应答谱表明测试受试者不应起始癌症疗法和/或应修改癌症疗法(例如减少一种或多种其他方式和/或与一种或多种其他方式组合)和/或应中止癌症疗法，和/或应起始替代癌症疗法。在一些实施方案中，本文描述的方法包括如果测试受试者应答谱与(非应答受试者的)目标应答谱相似，则不选择所述受试者用于起始癌症疗法，和/或选择测试受试者用于修改癌症疗法(例如，减少一种或多种其他方式和/或与一种或多种其他方式组合)和/或中止癌症疗法和/或起始替代癌症疗法。在一些实施方案中，本文描述的方法包括如果测试受试者应答谱与(非应答受试者的)目标应答谱相似，则不起始和/或修改(例如，减少一种或多种其他方式和/或与一种或多种其他方式组合)和/或中止对所述受试者的癌症疗法的施用，和/或起始替代癌症疗法。在一些实施方案中，本文所述的方法包括如果测试受试者应答谱与(非应答受试者的)目标应答谱相似，则不向所述受试者施用癌症疗法。在一些实施方案中，本文所述的方法包括如果测试受试者应答谱与(非应答受试者的)目标应答谱相似，则修改对所述受试者的癌症疗法的施用(例如，减少一种或多种其他方式和/或与一种或多种其他方式组合)。在一些实施方案中，本文所述的方法包括如果测试受试者应答谱与(非应答受试者的)目标应答谱相似，则向所述受试者施用替代癌症疗法。

在一些实施方案中，将本文所述的受试者应答谱与一个或多个应答受试者和/或一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)非应答受试者的一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)目标应答谱进行比较。在一些实施方案中，本文描述的(例如，应答受试者或非应答受试者的)目标应答谱分别包括来自应答或非应答受试者群体的一种或多种免疫应答(本文所述)的平均值。在一些实施方案中，获得测试受试者的一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)受试者应答谱(例如，在起始、修改和/或中止癌症疗法的施用之前、期间和/或之前)。

在一些实施方案中，本文所述的方法包括将(a)包括(i)刺激与至少一种有益应答相关的一种或多种免疫介质的表达和/或分泌水平的肿瘤抗原的数量(和/或抑制和/或遏制与至少一种有害或无益应答相关的至少一种免疫介质的表达和/或分泌水平的肿瘤抗原的数量)与(ii)抑制和/或遏制与至少一种有益应答相关的一种或多种免疫介质的表达和/或分泌水平的肿瘤抗原的数量(和/或刺激与至少一种有害或无益应答相关的至少一种免疫介质的表达和/或分泌水平的肿瘤抗原的数量)的比率的受试者应答谱；与(b)包括(iii)刺激与有益应答相关的一种或多种免疫介质的表达和/或分泌水平的肿瘤抗原的数量(和/或抑制和/或遏制与至少一种有害或无益应答相关的抑制或多种免疫介质的表达和/或分泌水平的肿瘤抗原的数量)与(iv)抑制和/或遏制与至少一种有益应答相关的一种或多种免疫介质的表达和/或分泌水平的肿瘤抗原的数量(和/或刺激与至少一种有害或无益应答相关的至少一种免疫介质的表达和/或分泌水平的肿瘤抗原的数量)的比率(或比率范围)的目标应答谱进行比较，以及如果受试者比率与目标比率(或目标比率范围)相差不超过10、5、4、3、2、1.5或1倍，则选择受试者。

在一些实施方案中，如果受试者应答谱的(i)刺激与至少一种有益应答相关的一种或多种免疫介质的表达和/或分泌水平的肿瘤抗原的数量(和/或抑制和/或遏制与至少一种有害或无益应答相关的至少一种免疫介质的表达和/或分泌水平的肿瘤抗原的数量)与(ii)抑制和/或遏制与至少一种有益应答相关的一种或多种免疫介质的表达和/或分泌水平的肿瘤抗原的数量(和/或刺激与至少一种有害或无益应答相关的至少一种免疫介质的表达和/或分泌水平的肿瘤抗原的绝对数量)的比率是至少100:1、50:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1.5:1、1.4:1、1.2:1、1.1:1 0.9:1、0.8:1、0.7:1、0.6:1、0.5:1、0.2:1或0.1:1，则选择受试者。在一些实施方案中，这种比率是用于选择受试者进行治疗的指数。在一些实施方案中，所述比率与其他数据一起用于计算用于选择受试者进行治疗的指数。

在一些实施方案中，如果受试者应答谱不包括抑制和/或遏制与至少一种有益应答相关的一种或多种免疫介质的表达和/或分泌水平的任何肿瘤抗原(和/或刺激与至少一种有害或无益应答相关的至少一种免疫介质的表达和/或分泌水平的肿瘤抗原的数量)，并且包括至少一种(例如，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种)刺激与至少一种有益应答相关的一种或多种免疫介质的表达和/或分泌水平肿瘤抗原(和/或与抑制和/或遏制与至少一种有害或无益应答相关的至少一种免疫介质的表达和/或分泌水平的肿瘤抗原的数量)，则选择受试者。在一些实施方案中，(i)刺激与至少一种有益应答相关的一种或多种免疫介质的表达和/或分泌水平的肿瘤抗原的数量(和/或抑制和/或遏制与至少一种有害或无益应答相关的至少一种免疫介质的表达和/或分泌水平的肿瘤抗原的数量)和(ii)抑制和/或遏制与至少一种有益应答相关的一种或多种免疫介质的表达和/或分泌水平的肿瘤抗原的数量(和/或刺激与至少一种有害或无益应答相关的至少一种免疫介质的表达和/或分泌水平的肿瘤抗原的数量)的此类值是用于选择受试者进行治疗的指数。在一些实施方案中，所述值与其他数据一起用于计算用于选择受试者进行治疗的指数。

在一些实施方案中，本文所述的方法包括将(a)包括(i)刺激与至少一种有益应答相关的一种或多种免疫介质的表达和/或分泌水平的肿瘤抗原的数量(和/或抑制和/或遏制与至少一种有害或无益应答相关的至少一种免疫介质的表达和/或分泌水平的肿瘤抗原的数量)与(ii)抑制和/或遏制与至少一种有益应答相关的一种或多种免疫介质的表达和/或分泌水平的肿瘤抗原的数量(和/或刺激与至少一种有害或无益应答相关的至少一种免疫介质的表达和/或分泌水平的肿瘤抗原的数量)的比率的受试者应答谱；与(b)包括(iii)刺激与有益应答相关的一种或多种免疫介质的表达和/或分泌水平的肿瘤抗原的数量(和/或抑制和/或遏制与至少一种有害或无益应答相关的抑制或多种免疫介质的表达和/或分泌水平的肿瘤抗原的数量)与(iv)抑制和/或遏制与至少一种有益应答相关的一种或多种免疫介质的表达和/或分泌水平的肿瘤抗原的数量(和/或刺激与至少一种有害或无益应答相关的至少一种免疫介质的表达和/或分泌水平的肿瘤抗原的数量)的比率(或比率范围)的目标应答谱进行比较，以及如果受试者比率与目标比率(或目标比率范围)相差超过5、6、7、8、9、10、15、20或更多倍，则不选择受试者。

在一些实施方案中，如果受试者应答谱的(i)刺激与至少一种有益应答相关的一种或多种免疫介质的表达和/或分泌水平的肿瘤抗原的数量(和/或抑制和/或遏制与至少一种有害或无益应答相关的至少一种免疫介质的表达和/或分泌水平的肿瘤抗原的数量)与(ii)抑制和/或遏制与至少一种有益应答相关的一种或多种免疫介质的表达和/或分泌水平的肿瘤抗原的数量(和/或刺激与至少一种有害或无益应答相关的至少一种免疫介质的表达和/或分泌水平的肿瘤抗原的绝对数量)的比率小于5:1、2:1、1.5:1、1.4:1、1.2:1、1.1:1 0.9:1、0.8:1、0.7:1、0.6:1、0.5:1、0.25:1、0.125:1、0.01:1或0.001:1，则不选择受试者。

在一些实施方案中，如果受试者应答谱不包括刺激与至少一种有益应答相关的一种或多种免疫介质的表达和/或分泌水平的任何肿瘤抗原(和/或抑制和/或遏制与至少一种有害或无益应答相关的至少一种免疫介质的表达和/或分泌水平的肿瘤抗原的数量)，并且包括至少一种(例如，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种)刺激与至少一种有益应答相关的一种或多种免疫介质的表达和/或分泌水平肿瘤抗原(和/或与抑制和/或遏制与至少一种有害或无益应答相关的至少一种免疫介质的表达和/或分泌水平的肿瘤抗原的数量)，则不选择受试者。

在一些实施方案中，可确定/计算/测量刺激性抗原的频率和/或抑制性抗原的频率。例如，可确定刺激性抗原的百分比(例如，相对于所测试/测定的抗原的总数)和/或抑制性抗原的百分比(例如，相对于所测试/测定的抗原的总数)。在一些实施方案中，可从许多受试者(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30个或更多个受试者)确定刺激性抗原的频率与肿瘤突变负荷(TMB)的关系和/或抑制性抗原的频率与TMB的关系，例如以得出每个受试者的“应答分数”。在一些实施方案中，“应答指数”可从此类应答分数(如来自表现出有益应答的受试者的应答分数和/或来自表现出无益或有害应答的受试者的应答分数)中得出。在一些实施方案中，这种应答指数可用于确定受试者(例如，测试受试者)是否将表现出有益应答和/或无益或有害应答。在一些实施方案中，可确定受试者(例如，测试受试者)的应答分数并将其与这种应答指数进行比较。在一些实施方案中，测试受试者的应答分数高于表明测试受试者将表现出有益应答的应答指数。在一些实施方案中，测试受试者的应答分数低于表明测试受试者将表现出无益或有害应答的应答指数。

选择肿瘤抗原的方法和在受试者中诱导免疫应答的方法

一般来讲，可在其整体的功能性终末效应方面来对免疫应答进行有效定义。Dhabar等人(2014)提出，可将免疫应答分为免疫保护性、免疫病理性和免疫调控/抑制性。虽然这些类别提供了有用的构架来组织思想，但总体上的体内免疫应答可能由几种类型的应答组成，每种类别的比重(dominance)各不相同。免疫保护性的或有益的应答被定义成是促进有效伤口愈合、消除感染和癌症并介导疫苗诱导的免疫记忆的应答。这些应答与如IFN-γ、IL-12、IL-2、颗粒酶B、CD107等细胞因子和介质相关。免疫病理性的或有害的应答被定义成是针对自身(自身免疫性疾病如多发性硬化症、关节炎、狼疮)或无害抗原(哮喘、过敏)的应答和涉及慢性、非可控性(non-resolving)炎症的应答。这些应答还可与参与免疫保护性应答的分子相关，但也包括免疫介质如TNF-α、IL-10、IL-13、IL-17、IL-4、IgE、组胺等。免疫调控性应答被定义成是涉及调控(主要是下调)其他免疫细胞功能的免疫细胞和因子。最近的研究表明，免疫系统的一部分可抑制免疫应答。例如，调控性CD4

表2：免疫介质

ID＝感染性疾病

IA＝自身免疫性疾病

在一些实施方案中，肿瘤抗原刺激对受试者有益的一种或多种淋巴细胞应答。在一些实施方案中，肿瘤抗原抑制和/或遏制对受试者有害或无益的一种或多种淋巴细胞应答。可能导致有益抗肿瘤应答的免疫应答的实例包括但不限于1)细胞毒性CD8

在一些实施方案中，肿瘤抗原刺激对受试者有害或无益的一种或多种淋巴细胞应答。在一些实施方案中，肿瘤抗原抑制和/或遏制对受试者有益的一种或多种淋巴细胞应答。可能导致有害或无益抗肿瘤应答的免疫应答的实例包括但不限于1)T调控性细胞，其是T细胞群体，所述T细胞可遏制免疫应答并分泌免疫抑制性细胞因子(如TGF-β和IL-10)并表达CD25和FoxP3分子；和2)Th2细胞，其靶向针对过敏原的应答，但不能产生抗癌作用。它们由增加的IL-4和IL-10诱导且可分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-9和IL-13。

本公开提供了用于鉴定和选择肿瘤抗原的方法和系统。在一些实施方案中，本文所述的方法和系统可鉴定和选择在未接受癌症疗法(或临床上对癌症疗法尚无应答和/或没有应答)的癌症受试者中刺激一种或多种免疫应答的一种或多种肿瘤抗原。在一些实施方案中，本文所述的方法和系统可鉴定和选择在未接受癌症疗法(或临床上对癌症疗法尚无应答和/或没有应答)的癌症受试者中不刺激一种或多种免疫应答的一种或多种肿瘤抗原。在一些实施方案中，本文所述的方法和系统可鉴定和选择在未接受癌症疗法(或临床上对癌症疗法尚无应答和/或没有应答)的癌症受试者中抑制和/或遏制一种或多种免疫应答的一种或多种肿瘤抗原。在一些实施方案中，本文所述的方法和系统可鉴定和选择在未接受癌症疗法(或临床上对癌症疗法尚无应答和/或没有应答)的癌症受试者中不引发免疫应答或引发最小免疫应答的一种或多种肿瘤抗原。

在一些实施方案中，在施用癌症疗法之前、期间和/或之后，向癌症受试者施用包含一种或多种选择的肿瘤抗原的组合物。

本公开提供了基于受试者应答谱与目标应答谱的比较来选择通过本文的方法鉴定的肿瘤抗原的方法。本公开还提供了基于与期望的或有益的应答的关联来选择(或不选择)通过本文的方法鉴定的肿瘤抗原的方法。本公开还提供了基于与不期望的、有害的或无益的应答的关联来选择(或不选择)通过本文的方法鉴定的肿瘤抗原的方法。在一些实施方案中，对选择肿瘤抗原的方法进行组合。所述方法可以任何顺序组合，例如可通过将受试者应答谱与目标应答谱进行比较来进行选择，然后基于与期望的(或不期望的)应答的关联进行选择；或者，可基于与期望的(或不期望的)应答的关联来进行选择，然后将受试者应答谱与目标应答谱进行比较。

本文提供了用于鉴定肿瘤抗原和潜在肿瘤抗原的方法。本文提供了用于产生或获得受试者应答谱的方法。本文提供了用于产生或获得目标应答谱的方法，例如基于群体的或复合的目标应答谱。本文提供了用于将受试者应答谱与目标应答谱进行比较的方法。本文提供了用于确定受试者应答谱是否与目标应答谱相似的方法。

在一些实施方案中，使用相同的多种目标多肽来产生或获得受试者应答谱和目标应答谱。在一些实施方案中，使用相同的多种肿瘤抗原来产生或获得受试者应答谱和目标应答谱。

目标应答谱包括对一种或多种肿瘤抗原的定量、鉴定和/或展示，所述肿瘤抗原刺激淋巴细胞、不刺激淋巴细胞、抑制和/或遏制淋巴细胞、激活淋巴细胞和/或淋巴细胞对其无应答。

在一些实施方案中，一种或多种肿瘤抗原被鉴定为抑制和/或遏制测试受试者中的淋巴细胞(例如，从受试者应答谱中鉴定)，并且相同的一种或多种肿瘤抗原被鉴定为刺激目标受试者中的淋巴细胞(例如，从目标应答谱中鉴定)。在一些实施方案中，一种或多种肿瘤抗原被鉴定为刺激测试受试者中的淋巴细胞(例如，从受试者应答谱中鉴定)，并且相同的一种或多种肿瘤抗原被鉴定为抑制和/或遏制目标受试者中的淋巴细胞(例如，从目标应答谱中鉴定)。在一些实施方案中，一种或多种肿瘤抗原或潜在肿瘤抗原被鉴定为在测试受试者中引发来自淋巴细胞的最小应答或不引发来自淋巴细胞的应答(例如，从受试者应答谱中鉴定)，并且相同的一种或多种肿瘤抗原被鉴定为刺激或抑制和/或遏制目标受试者中的淋巴细胞(例如，从目标应答谱中鉴定)。在一些实施方案中，一种或多种肿瘤抗原被鉴定为刺激或抑制和/或遏制测试受试者中的淋巴细胞(例如，从受试者应答谱中鉴定)，并且相同的一种或多种肿瘤抗原被鉴定为在目标受试者中引发来自淋巴细胞的最小应答或不引发来自淋巴细胞的应答(例如，从目标应答谱中鉴定)。

可基于受试者应答谱与目标应答谱的相似性或相异性来鉴定和/或选择肿瘤抗原。可基于与期望的或有益的应答的关联来鉴定和/或选择(或不选择)肿瘤抗原。可基于与不期望的、有害的或无益应答的关联来鉴定和/或选择(或不选择)肿瘤抗原。可基于前述方法的组合来鉴定和/或选择(或不选择)肿瘤抗原，所述方法以任何顺序进行应用。

在一些实施方案中，将受试者应答谱与来自在临床上对癌症疗法具有应答和/或曾经具有应答的癌症受试者的相应应答谱(本文所述的应答受试者的“目标应答谱”)进行比较。在一些实施方案中，将受试者应答谱与来自尚未被诊断出患有癌症的目标受试者的目标应答谱进行比较。在一些实施方案中，将受试者应答谱与来自对癌症具有(或曾经具有)有益应答的目标受试者的目标应答谱进行比较。在一些实施方案中，所述受试者对癌症疗法或疗法组合具有(或曾经具有)阳性临床应答。在一些实施方案中，所述受试者对癌症曾经具有自发应答。在一些实施方案中，所述受试者的癌症部分缓解或完全缓解。在一些实施方案中，所述受试者已经清除了癌症。在一些实施方案中，所述受试者未发生过癌症的复发、重现或转移。在一些实施方案中，所述受试者具有阳性癌症预后。在一些实施方案中，所述受试者未经历过对癌症疗法或疗法组合的毒性应答或副作用。

在一些实施方案中，选择受试者应答谱的一种或多种肿瘤抗原，所述一种或多种肿瘤抗原引发与由目标应答谱的相同肿瘤抗原引发的应答不同或不相似的应答。在一些实施方案中，基于与期望的或有益的免疫应答的关联来选择(或不选择)一种或多种肿瘤抗原。在一些实施方案中，基于与不期望的、有害的或无益的免疫应答的关联来选择(或不选择)一种或多种肿瘤抗原。

将以下应答称为“有益应答”：通过所述应答，肿瘤抗原或其免疫原性片段(i)刺激对受试者有益的淋巴细胞应答，(ii)刺激对受试者有益的细胞因子表达，(iii)抑制和/或遏制对受试者有害或无益的淋巴细胞应答，或(iv)抑制和/或遏制对受试者有害或无益的细胞因子表达。

在一些实施方案中，选择的肿瘤抗原刺激对受试者有益的一种或多种淋巴细胞应答。在一些实施方案中，选择的肿瘤抗原抑制和/或遏制对受试者有害或无益的一种或多种淋巴细胞应答。

在一些实施方案中，选择的肿瘤抗原提高对受试者有益的细胞因子表达和/或分泌。在一些实施方案中，选择的肿瘤抗原抑制和/或遏制对受试者有害或无益的细胞因子表达。

在一些实施方案中，向受试者施用一种或多种选择的肿瘤抗原引发所述受试者的免疫应答。在一些实施方案中，向受试者施用一种或多种选择的肿瘤抗原引发所述受试者的有益免疫应答。在一些实施方案中，向受试者施用一种或多种选择的肿瘤抗原引发所述受试者的有益应答。在一些实施方案中，向受试者施用一种或多种选择的肿瘤抗原提高所述受试者对肿瘤疗法的临床应答。

在一些实施方案中，将受试者应答谱与来自在临床上对癌症疗法没有应答和/或尚无应答的癌症受试者的相应应答谱(本文所述的非应答受试者的“目标应答谱”)进行比较。在一些实施方案中，将受试者应答谱与来自对癌症具有(或曾经具有)有害或无益应答的目标受试者的目标应答谱进行比较。在一些实施方案中，所述受试者对癌症疗法或疗法组合具有(或曾经具有)阴性临床应答。在一些实施方案中，所述受试者尚未清除癌症。在一些实施方案中，所述受试者已经发生过癌症的复发、重现或转移。在一些实施方案中，所述受试者具有阴性癌症预后。在一些实施方案中，所述受试者经历过对癌症疗法或疗法组合的毒性应答或副作用。

将以下应答称为“有害或无益应答”：通过所述应答，肿瘤抗原或其免疫原性片段(i)刺激对受试者有害或无益的淋巴细胞应答，(ii)刺激对受试者有害或无益的细胞因子表达，(iii)抑制和/或遏制对受试者有益的淋巴细胞应答，或(iv)抑制和/或遏制对受试者有益的细胞因子表达。

在一些实施方案中，选择受试者应答谱的一种或多种肿瘤抗原，所述一种或多种肿瘤抗原引发与由目标应答谱的相同肿瘤抗原引法发的应答相同或相似的应答。在一些实施方案中，基于与期望的或有益的免疫应答的关联来选择(或不选择)一种或多种肿瘤抗原。在一些实施方案中，基于与不期望的、有害的或无益的免疫应答的关联来选择(或不选择)一种或多种肿瘤抗原。

在一些实施方案中，选择的肿瘤抗原刺激对受试者有害或无益的一种或多种淋巴细胞应答。在一些实施方案中，选择的肿瘤抗原抑制和/或遏制对受试者有益的一种或多种淋巴细胞应答。

在一些实施方案中，选择的肿瘤抗原提高对受试者有害或无益的细胞因子表达和/或分泌。在一些实施方案中，选择的肿瘤抗原抑制和/或遏制对受试者有益的细胞因子表达。

在一些实施方案中，通过本文所述的方法不选择一种或多种肿瘤抗原。

在一些实施方案中，不向受试者施用一种或多种选择的肿瘤抗原。

选择潜在的肿瘤抗原的方法

在充分发展(well-established)的肿瘤中，内源性抗肿瘤T细胞应答的激活通常不足以导致肿瘤完全消退。而且，已经在肿瘤微环境的情形下被训练的T细胞有时并未被最优地激活，亲合力(avidity)低，并且最终不能识别表达抗原的肿瘤细胞。另外，肿瘤很复杂，并且包括许多细胞类型，这些细胞类型具有不同程度的突变基因表达，使得难以产生足以控制肿瘤生长的多克隆T细胞应答。因此，该领域的研究人员提出，在癌症受试者中，除了在癌症受试者中被确认能被T细胞识别的突变外，鉴定是“潜在的肿瘤抗原”的突变也很重要。

目前还没有可靠的方法能以全面的方式鉴定潜在的肿瘤抗原。虽然已经开发出了计算方法来试图预测哪个是抗原，但是这些方法存在许多局限性。首先，对表位的预测和呈递进行建模需要考虑到超过12,000个编码MHC分子的HLA等位基因，每个受试者表达其中的多达14个，所有HLA等位基因都具有不同的表位亲和力。其次，当使用质谱法评估时，绝大多数的预测表位都没有被肿瘤呈递。第三，预测性算法未考虑T细胞对抗原的识别，而且对于大多数预测表位来说，即使它们被呈递，也无法引发T细胞应答。最终，细胞免疫的第二个分支，即CD4+T细胞亚群常常被忽视；大多数计算机软件工具都集中在MHC I类结合因子上。用于预测MHC II类表位的工具尚不完善，而且变化更大。

本公开提供了以下方法：a)在本公开的抗原呈递测定中鉴定可能是潜在的肿瘤抗原的多肽，以及b)基于多肽的抗原潜力对多肽进行选择。在执行这些方法时无需预测哪个可能是T细胞应答的靶标或被MHC呈递，也无需进行反褶积(deconvolution)。可扩展这些方法，以探索具有与受试者相同的MHC等位基因的健康受试者中的抗原潜力，以鉴定最适合包含在免疫原性组合物或疫苗制剂中的潜在的肿瘤抗原。所述方法确保潜在的肿瘤抗原在受试者MHC分子的环境中被加工和呈递，并且确保T细胞在适当条件下(例如，在带有来自佐剂或递送系统的强烈危险信号的疫苗情形下)暴露于所述潜在的肿瘤抗原时，能对所述潜在的肿瘤抗原做出应答。

前述用于选择肿瘤抗原的方法可用于选择潜在的肿瘤抗原(即，编码存在于或表达于受试者癌症或肿瘤细胞中的一种或多种突变的多肽)。

免疫原性组合物及其用途

本公开提供了组合物，所述组合物包含通过本文所述的方法鉴定或选择的一种或多种肿瘤抗原、编码所述肿瘤抗原的核酸；以及使用所述组合物的方法。在一些实施方案中，组合物包含肿瘤抗原，所述肿瘤抗原是长度为8-40个氨基酸、8-60个氨基酸、8-100个、8-150个或8-200个氨基酸的肽(例如，MHC结合肽，例如，长度为23-29、24-28、25-27、8-30、8-29、8-28、8-27、8-26、8-25、8-24、8-23、8-22、8-21、8-20、8-15、8-12个氨基酸的肽)。在一些实施方案中，组合物包含一种或多种肿瘤抗原，所述一种或多种肿瘤抗原为全长多肽的长度的约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在一些实施方案中，组合物包含一种或多种肿瘤抗原，所述一种或多种肿瘤抗原相对于全长多肽截短约1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50个或更多个氨基酸。所述组合物可包含肿瘤抗原，所述肿瘤抗原为或包含MHC I类结合肽、MHC II类结合肽或MHC I类结合肽和MHC II类结合肽两者。组合物可包含单一肿瘤抗原或多种肿瘤抗原。在一些实施方案中，组合物包含一组两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多种肿瘤抗原。在一些实施方案中，组合物包含十种、十五种、二十种、二十五种、三十种或更多种肿瘤抗原。在一些实施方案中，所述肿瘤抗原或肽作为一种或多种融合蛋白提供。在一些实施方案中，组合物包含编码肿瘤抗原或肽的核酸。在一些实施方案中，编码肿瘤抗原或肽的核酸作为一种或多种融合构建体提供。

本公开提供了包含两种或三种TAA的任何组合的免疫原性组合物：HPSE1(SEQ IDNO:6)、HPSE2(SEQ ID NO:7)和/或SMAD4(SEQ ID NO:8)。

HPSE编码肝素酶，肝素酶是可将硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)裂解为硫酸乙酰肝素侧链和核心蛋白聚糖的内切糖苷酶。HPSE参与细胞外基质(ECM)降解和重塑。存在单一功能性肝素酶：HPSE亚型1(HPSE1)，其是一种543个氨基酸的蛋白质。剪接变体HPSE同种型2(HPSE2)没有酶活性，但可调控HPSE1活性。HPSE1的活性蛋白形式是非共价连接的8和50kDa亚基的异二聚体。TIM桶折叠结构域含有活性位点，并且蛋白质的C末端结构域参与非酶信号传导和分泌功能。已经描述了HPSE内的潜在T细胞表位(Tang.In vitro and ex vivoevaluation of a multi-epitope heparinase vaccine for variousmalignancies.Cancer Sci 105(2014)9–17)。HPSE1和HPSE2的蛋白质序列可通过在公共数据库UniProt(分别在万维网上，http://www.uniprot.org/uniprot/Q9Y251和http://www.uniprot.org/uniprot/Q8WWQ2)中进行搜索来找到。HPSE1和HPSE2的DNA序列可通过在公共数据库Entrez(分别在万维网https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/10855和https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/60495)中进行搜索来找到。

SMAD4编码针对体节极性序列的母体同源物4(一种信号转导蛋白和肿瘤遏制基因)，其是TGFb信号传导途径中下游转录输出的中心介质。SMAD4是552个氨基酸的60.4KDa蛋白质。SMAD4在不存在TGF-β激活的情况下以单体形式存在，并且在TGF-β激活时以异二聚体形式存在。SMAD4由C末端磷酸化的R-SMAD分子的两个分子SMAD2或SMAD3以及一个SMAD4分子组成，以形成转录活性SMAD2/SMAD3-SMAD4复合物。SMAD4通过与DNA结合来调控许多靶基因的转录，从而识别称为Smad结合元件(SBE)的8bp回文序列(GTCTAGAC)。所述蛋白质充当肿瘤遏制因子并抑制上皮细胞增殖。SMAD4的蛋白质和DNA序列可通过在公共数据库UniProt和Entrez(分别在万维网上，http://www.uniprot.org/uniprot/Q13485和https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/4089)中进行搜索来找到。

本公开还提供了编码肿瘤抗原的核酸。所述核酸可用于产生表达载体，例如以用于重组产生肿瘤抗原，或用于体内基于核酸的施用(例如，DNA疫苗接种)。

在一些实施方案中，肿瘤抗原用于诊断测定中。对于这些测定，可在试剂盒中提供包含肿瘤抗原的组合物，例如用于检测来自个体的样品中的抗体反应性或细胞反应性。

在一些实施方案中，肿瘤抗原组合物用于在受试者中诱导免疫应答。在一些实施方案中，受试者是人。在一些实施方案中，受试者是非人类动物。肿瘤抗原组合物可用于产生抗体(例如在非人动物，如小鼠、大鼠、仓鼠或山羊中)，例如以用于诊断测定和治疗应用中。对于治疗用途的实例，通过本文描述的方法发现的肿瘤抗原可以是有效的T细胞和/或B细胞抗原。可通过用肿瘤抗原对受试者进行免疫并从受试者中分离抗血清来制备抗体的制剂。用于引发高亲和力的抗原特异性抗体的高效价以及用于从抗血清中分离肿瘤抗原特异性抗体的方法是本领域已知的。在一些实施方案中，肿瘤抗原组合物用于产生单克隆抗体，例如人单克隆抗体。

在一些实施方案中，肿瘤抗原组合物用于在人受试者中诱导免疫应答以提供治疗应答。在一些实施方案中，肿瘤抗原组合物用于在人受试者中诱导免疫应答，所述免疫应答使不期望的免疫应答重定向。在一些实施方案中，例如与未曾施用肿瘤抗原组合物的受试者相比，所述肿瘤抗原组合物引发免疫应答，所述免疫应答引起受试者具有本文所述的阳性临床应答。在一些实施方案中，例如与未曾施用肿瘤抗原组合物的受试者相比，所述肿瘤抗原组合物引发免疫应答，所述免疫应答引起受试者具有改善的临床应答。在一些实施方案中，肿瘤抗原组合物用于在人受试者中诱导免疫应答以获得姑息效应。应答可以是完全或部分治疗。

在一些实施方案中，肿瘤抗原组合物用于在人受试者中诱导免疫应答以提供预防性应答。应答可以是完全或部分保护。

在一些实施方案中，在体内评估肿瘤抗原的免疫原性。在一些实施方案中，评估对肿瘤抗原的体液应答(例如，通过检测针对所施用的肿瘤抗原的抗体效价)。在一些实施方案中，例如通过检测来自受试者的样品中抗原特异性细胞的频率(例如，通过用含有抗原肽的MHC/肽四聚体对来自受试者的T细胞进行染色以检测抗原特异性T细胞，或通过使用抗原呈递测定，如本文所述的检测测定检测抗原特异性细胞)来评估对肿瘤抗原的细胞免疫应答。在一些实施方案中，在动物模型中评估一种或多种肿瘤抗原引发保护性或治疗性免疫的能力。在一些实施方案中，在动物模型中评估一种或多种肿瘤抗原刺激或抑制和/或遏制免疫的能力。

在一个实施方案中，所述组合物还包含药学上可接受的载体或赋形剂。免疫原性组合物还可包含用于增强制剂的免疫原性的佐剂(例如，水包油、弗氏不完全佐剂、磷酸铝、氢氧化铝、皂苷佐剂、toll样受体激动剂或鼠李二肽)。其他佐剂是本领域中已知的。

在一些实施方案中，免疫原性组合物包含与载体蛋白连接的肿瘤抗原。载体蛋白的实例包括例如可以是或可以不是突变体的毒素和类毒素(化学或遗传)，如炭疽毒素、PA和DNI(PharmAthene,Inc.)、白喉类毒素(Massachusetts State Biological Labs；SerumInstitute of India,Ltd.)或CRM 197、破伤风毒素、破伤风类毒素(Massachusetts StateBiological Labs；Serum Institute of India,Ltd.)、破伤风毒素片段Z、外毒素A或铜绿假单胞菌外毒素A的突变体、细菌鞭毛蛋白、肺炎球菌溶血素、脑膜炎奈瑟氏球菌的外膜蛋白(可从ATCC(美国典型培养物保藏中心，Manassas,Va.)获得)、铜绿假单胞菌Hcp1蛋白、大肠杆菌热不稳定肠毒素、志贺样毒素、人LTB蛋白(一种来自完整细菌细胞的蛋白质提取物)以及可通过接头交联的任何其他蛋白质。其他有用的载体蛋白包括高密度脂蛋白(HDL)、牛血清白蛋白(BSA)、P40和鸡核黄素。许多载体蛋白是可商购的(例如，购自Sigma Aldrich)。

在一些实施方案中，将包含通过本文所述的方法鉴定的肿瘤抗原的免疫原性组合物与可用的疫苗结合使用。例如，如本文所述鉴定的抗原可用作疫苗制剂的补充组分，或用作疫苗接种方案中的加强抗原。

在一些实施方案中，用于皮下注射的免疫原性组合物的体积为约0.5mL，用于皮内注射的免疫原性组合物的体积为约0.1mL，或用于经皮施用的免疫原性组合物的体积为0.002-0.02mL。0.5ml剂量的组合物可含有大约2-500ug的肿瘤抗原。

在一些实施方案中，免疫原性组合物经肠胃外施用(例如，通过皮下、肌肉内、静脉内或皮内注射)。在一些实施方案中，使用通过物理上穿透真皮层的方式进行递送(例如，针、气枪或擦伤)。

在一些实施方案中，例如通过肌肉内注射、皮内注射或用适当的免疫佐剂经皮免疫来将免疫原性组合物施用于受试者。组合物可施用一次或多次，通常包括被设计用于加强受试者的免疫应答的第二次施用。组合物的剂量的频率和量可根据组合物的比活性和受试者的临床应答而变化，并且可通过常规实验确定。

免疫原性组合物的制剂可被提供于单位剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿和小瓶，并且可储存于冷冻干燥(冻干)的条件下，仅需在使用前即刻添加无菌液体载体。

肿瘤抗原的产生

适用于本公开的任何方法或组合物的肿瘤抗原可通过任何可用的方式，例如重组或合成的方式产生(参见，例如，Jaradat Amino Acids50:39-68(2018)；Behrendt等人,J.Pept.Sci.22:4-27(2016))。例如，可通过利用经工程化成表达编码肿瘤抗原的核酸的宿主细胞系统重组产生肿瘤抗原。可替代地或另外地，可通过激活内源基因来产生肿瘤抗原。可替代地或另外地，可通过化学合成来部分地或完全地制备肿瘤抗原。

当以重组的方式产生蛋白质时，可使用任何表达系统。仅举几个例子，已知的表达系统包括例如大肠杆菌、卵、杆状病毒、植物、酵母或哺乳动物细胞。

在一些实施方案中，在哺乳动物细胞中产生适于本发明的重组肿瘤抗原。根据本发明可使用的哺乳动物细胞的非限制性实例包括BALB/c小鼠骨髓瘤细胞系(NSO/l，ECACC号：85110503)；人成视网膜细胞(PER.C6，CruCell,Leiden,The Netherlands)；转化有SV40的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚胎肾细胞系(HEK293或293细胞，其进行了亚克隆以在悬浮培养基中生长，Graham等人,J.Gen Virol.,36:59,1977)；人纤维肉瘤细胞系(例如，HT1080)；幼仓鼠肾细胞(BHK21，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞+/-DHFR(CHO,Urlaub和Chasin,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216,1980)；小鼠塞尔托利氏细胞(TM4,Mather,Biol.Reprod.,23:243-251,1980)；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1 587)；人宫颈癌细胞(HeLa，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCCCCL34)；水牛大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等人,Annals N.Y.Acad.Sci.,383:44-68,1982)；MRC 5细胞；FS4细胞；和人肝癌细胞系(HepG2)。

在一些实施方案中，本发明提供了从人细胞产生的重组肿瘤抗原。在一些实施方案中，本发明提供了从CHO细胞或HT1080细胞产生的重组肿瘤抗原。

通常，被工程化成表达重组肿瘤抗原的细胞可包含编码本文所述的重组肿瘤抗原的转基因。应当理解，编码重组肿瘤抗原的核酸可包含调控序列、基因控制序列、启动子、非编码序列和/或用于表达重组肿瘤抗原的其他适当的序列。通常，编码区与这些核酸组分中的一种或多种可操作地连接。

转基因的编码区可包括一个或多个沉默突变，以针对特定细胞类型优化密码子的使用。例如，可优化肿瘤抗原转基因的密码子以用于在脊椎动物细胞中表达。在一些实施方案中，可优化肿瘤抗原转基因的密码子以用于在哺乳动物细胞中表达。在一些实施方案中，可优化肿瘤抗原转基因的密码子以用于在人细胞中表达。

制造免疫原性组合物的方法

在一些实施方案中，本公开提供了制造用于向有需要的受试者施用的免疫原性组合物的方法，所述方法包括：a)提供、制备或获得包含含有多种抗原的多种抗原组合物，每种组合物包含不同的抗原；b)提供、制备或获得目标标应答谱，其中所述目标应答谱包括与所述多种抗原相关(例如确定、测量、观察到)的一种或多种免疫介质的表达和/或分泌水平的展示；c)提供、制备或获得受试者应答谱，其中所述受试者应答谱包括与所述多种抗原相关(例如确定、测量、观察到)的一种或多种免疫介质的表达和/或分泌水平的展示；d)将所述目标应答谱与所述受试者应答谱进行比较；e)基于所述比较选择一种或多种抗原；以及f)配制包含所述一种或多种选择的抗原的一种或多种抗原组合物的至少一部分作为药物组合物。

在一些情况下，提供、制备或获得约1、2、5、10、20、40、60、80、100、150、200种或更多种抗原组合物。例如，可使用本文所述的方法(例如重组或合成)产生多种抗原。所述抗原可以适合的组合物，如溶液或冻干组合物的形式提供。在一些情况下，所述抗原是合成产生的。在一些情况下，合成产生的抗原保持附着在固体载体上。在一些情况下，配制抗原包括将所述抗原组合物的一部分等分，重构冻干抗原组合物的至少一部分，和/或从固体载体释放合成产生的抗原。

可制备或获得抗原组合物并以多种形式(如以悬浮液、溶液或冻干的形式)储存。抗原组合物可储存在低于-80℃至约室温范围内的温度下，例如约-80℃、约-20℃、约-15℃、约-10℃、约4℃或约室温下。在一些实施方案中，抗原组合物可包含载体、赋形剂、稳定剂、防腐剂和/或佐剂。

多种抗原可源自目标应答谱，其中目标应答谱包括与多种抗原相关(例如，确定、测量、观察到)的一种或多种免疫介质的表达和/或分泌水平的展示。

多种抗原可源自受试者应答谱，其中受试者应答谱包括与多种抗原相关(例如，确定、测量、观察到)的一种或多种免疫介质的表达和/或分泌水平的展示。

在一些实施方案中，将目标应答谱和受试者应答谱进行比较，并且基于所述比较选择一种或多种抗原。在一些实施方案中，选择一种或多种增加与对癌症的有益应答相关的免疫介质的表达或分泌的抗原，和/或一种或多种抑制和/或遏制与对癌症的有害或无益应答相关的免疫介质的表达或分泌的抗原。所选择的抗原或所选择的抗原的一部分可被配制为药物组合物。

癌症和癌症疗法

本公开提供了与患有或被诊断出癌症(如肿瘤)的受试者相关的方法和系统。在一些实施方案中，肿瘤是或包括血液恶性肿瘤，包括但不限于急性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓性白血病、多毛细胞白血病、AIDS相关的淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、朗格汉斯细胞组织细胞增多症、多发性骨髓瘤或骨髓增生性赘生物。

在一些实施方案中，肿瘤是或包括实体瘤，包括但不限于乳腺癌、鳞状细胞癌、结肠癌、头颈癌、卵巢癌、肺癌、间皮瘤、生殖泌尿癌症、直肠癌、胃癌或食道癌。

在一些特定实施方案中，肿瘤是或包括晚期肿瘤和/或难治性肿瘤。在一些实施方案中，当在肿瘤中(例如，在从肿瘤获得的组织样品如活检样品中)观察到某些病理时和/或当患有此类肿瘤的癌症患者通常不被考虑成是常规化疗的候选者时，将肿瘤表征为晚期。在一些实施方案中，将肿瘤表征为晚期的病理学可包括肿瘤大小、遗传标记物的表达改变、肿瘤细胞对邻近器官和/或淋巴结的侵入。在一些实施方案中，当患有肿瘤的患者对一种或多种已知的治疗方式(例如，一种或多种常规化学疗法方案)具有抗性和/或当特定患者已针对此类已知治疗方式中的一种或多种已显示出抗性(例如，缺乏应答性)时，将这种肿瘤表征为难治性。

在一些实施方案中，本公开提供了与癌症疗法有关的方法和系统。本公开不限于任何特定的癌症疗法，并且本公开涵盖任何已知的或开发的癌症疗法。已知的癌症疗法包括，例如，施用化学治疗剂、放射疗法、手术切除、肿瘤手术切除后的化学疗法、辅助疗法、局部低温或高温、抗肿瘤抗体和抗血管生成剂。在一些实施方案中，癌症和/或辅助疗法包括TLR激动剂(例如，CpG、Poly I:C等，参见例如，Wittig等人,Crit.Rev.Oncol.Hematol.94:31-44(2015)；Huen等人,Curr.Opin.Oncol.26:237-44(2014)；Kaczanowska等人,J.Leukoc.Biol.93:847-863(2013))、STING激动剂(参见例如，US20160362441；US20140329889；Fu等人,Sci.Transl.Med.7:283ra52(2015)；和WO2014189805)、先天性免疫和/或树突状细胞的非特异性刺激物或施用GM-CSF、白介素-12、白介素-7、Flt-3或其他细胞因子。在一些实施方案中，癌症疗法是或者包括溶瘤病毒疗法，例如talimogeneleherparepvec。(参见，例如，Fukuhara等人,Cancer Sci.107:1373-1379(2016))。在一些实施方案中，癌症疗法是或者包括双特异性抗体疗法(例如，Choi等人2011Expert OpinBiol Ther；Huehls等人,2015,Immunol and Cell Biol)。在一些实施方案中，癌症疗法是或者包括细胞疗法，如嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞、TCR转导的T细胞、树突状细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)或自然杀伤(NK)细胞(例如，如Sharpe和Mount,2015,Dis Model Mech 8:337-50中所综述)。

抗肿瘤抗体疗法(即，涉及施用一种或多种抗肿瘤抗体剂的治疗方案)正迅速成为许多肿瘤治疗的护理标准。已经设计或选择了抗体试剂以结合肿瘤抗原，特别是在肿瘤细胞表面上表达的抗原。已经公布了描述了可用的抗肿瘤抗体剂的各种综述文章(参见，例如Adler等人,Hematol.Oncol.Clin.North Am.26:447-81(2012)；Li等人,DrugDiscov.Ther.7:178-84(2013)；Scott等人,Cancer Immun.12:14(2012)；以及Sliwkowski等人,Science 341:1192-1198(2013))。下文表3呈现了由已知的可用抗体剂靶向的某些人抗原的非综合性列表，并且说明了已提出这些抗体剂对其有用的某些癌症适应症：

表3：

在一些实施方案中，癌症疗法是或包括免疫检查点阻断疗法(参见例如，Martin-Liberal等人,Cancer Treat.Rev.54:74-86(2017)；Menon等人,Cancers(Basel)8:106(2016))或免疫遏制阻断疗法。某些癌细胞通过将免疫检查点通路用作免疫抵抗的主要机制而得以壮大，特别是对于特异性针对肿瘤抗原的T细胞而言更是如此。例如，某些癌细胞可能过表达一种或多种负责抑制细胞毒性T细胞应答的免疫检查点蛋白。因此，可施用免疫检查点阻断疗法以克服抑制性信号并允许和/或增强针对癌细胞的免疫攻击。免疫检查点阻断疗法可通过减少、抑制或废除通过免疫应答的负调控因子(例如CTLA-4)进行的信号传导来促进免疫细胞针对癌细胞的应答。在一些实施方案中，癌症疗法可刺激或增强免疫应答的正调控因子(例如，CD28)的信号传导。

免疫检查点阻断物和免疫遏制阻断疗法的实例包括靶向以下一项或多项的试剂：A2AR、B7-H4、BTLA、CTLA-4、CD28、CD40、CD137、GITR、IDO、KIR、LAG-3、PD-1、PD-L1、OX40、TIM-3和VISTA。免疫检查点阻断剂的具体实例包括以下单克隆抗体：伊匹单抗(靶向CTLA-4)；替西木单抗(tremelimumab)(靶向CTLA-4)；阿特珠单抗(atezolizumab)(靶向PD-L1)；派姆单抗(靶向PD-1)；纳武单抗(靶向PD-1)；阿维鲁单抗；德瓦鲁单抗；和西米普利单抗(cemiplimab)。

免疫遏制阻断剂的具体实例包括：Vista(B7-H5，T细胞激活的v结构域Ig抑制剂)抑制剂；Lag-3(淋巴细胞激活基因3，CD223)抑制剂；IDO(吲哚胺-吡咯-2,3,-双加氧酶-1,2)抑制剂；KIR受体家族(杀伤细胞免疫球蛋白样受体)抑制剂；CD47抑制剂；和Tigit(具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体)抑制剂。

在一些实施方案中，癌症疗法是或者包括免疫激活疗法。免疫激活剂的具体实例包括：CD40激动剂；GITR(糖皮质激素诱导的TNF-R相关蛋白，CD357)激动剂；OX40(CD134)激动剂；4-1BB(CD137)激动剂；ICOS(诱导型T细胞刺激剂)；CD278激动剂；IL-2(白介素2)激动剂；和干扰素激动剂。

在一些实施方案中，癌症疗法是或者包括一种或多种免疫检查点阻断剂、免疫遏制阻断剂和/或免疫激活剂的组合，或一种或多种免疫检查点阻断剂、免疫遏制阻断剂的组合和/或免疫激活剂以及其他癌症疗法的组合。

如本文所讨论的，在一些实施方案中，本公开提供了与对癌症疗法没有应答和/或尚无应答；或具有应答和/或曾经具有应答(例如，临床应答，例如临床阳性应答或临床阴性应答)的受试者相关的方法和系统。在一些实施方案中，受试者在临床上对癌症疗法具有阳性应答和/或曾经具有阳性应答。在一些实施方案中，受试者在临床上对癌症疗法具有阴性应答和/或曾经具有阴性应答。在一些实施方案中，受试者对癌症疗法没有应答和/或尚无应答(例如，临床上非应答)。

可根据特定标准来测量和/或表征受试者是否对癌症疗法阳性应答、阴性应答和/或未能应答。在某些实施方案中，此类标准可包括临床标准和/或客观标准。在某些实施方案中，用于评估应答的技术可包括但不限于临床检查、正电子发射断层扫描、胸部X射线、CT扫描、MRI、超声、内窥镜检查、腹腔镜检查、样品中特定标志物的存在情况或水平、细胞学和/或组织学。本领域技术人员可使用各种已建立的用于评估此类应答(包括例如用于确定肿瘤负荷、肿瘤大小、肿瘤阶段等)的技术来评估肿瘤对疗法的阳性应答、阴性应答和/或无应答。在Therasse等人,J.Natl.Cancer Inst.,2000,92(3):205-216；和Seymour等人,Lancet Oncol.,2017,18:e143-52中论述了用于评估对治疗的应答的方法和指南。

在一些实施方案中，在施用癌症疗法后，应答受试者表现出肿瘤负荷、肿瘤大小和/或肿瘤阶段的减少。在一些实施方案中，在施用癌症疗法后，非应答受试者没有表现出肿瘤负荷、肿瘤大小或肿瘤阶段的减少。在一些实施方案中，在施用癌症疗法后，非应答受试者表现出肿瘤负荷、肿瘤大小或肿瘤阶段的增加。

在一些实施方案中，鉴定和/或选择癌症受试者以施用如本文所述的癌症疗法。在一些实施方案中，将癌症疗法施用于受试者。在一些实施方案中，在施用癌症疗法后，受试者对癌症疗法表现出阳性临床应答，例如，基于一种或多种临床和/或客观标准表现出改善(例如，表现出肿瘤负荷、肿瘤大小和/或肿瘤阶段的减少)。在一些实施方案中，临床应答比对施用于癌症受试者的癌症疗法的临床应答阳性程度更高，所述癌症受试者被鉴定(使用本文所述的方法)为不应起始和/或应修改(例如，减少一种或多种其他方式和/或与一种或多种其他方式组合)和/或应中止癌症疗法，和/或应起始替代癌症疗法。

本文所述的方法可包括准备和/或提供报告，如电子、基于网络的或纸质形式的报告。所述报告可包括来自本文所述的方法的一个或多个输出(例如，本文所述的受试者应答谱)。在一些实施方案中，例如以纸质或电子形式生成报告，所述报告鉴定癌症患者中一种或多种肿瘤抗原(例如，本文所述的一种或多种刺激性和/或抑制性和/或遏制性肿瘤抗原，或淋巴细胞对其具无应答性的肿瘤抗原)存在或不存在的情况，以及任选地，推荐的癌症疗法疗程。在一些实施方案中，所述报告包括用于癌症患者的标识符。在一个实施方案中，所述报告是基于网络的形式。

在一些实施方案中，另外地或可替代地，报告包括有关预后、抗性或潜在的或建议的治疗选项的信息。报告可包括有关以下方面的信息：治疗选项的可能有效性、治疗选项的可接受性，或将治疗选项应用于癌症患者(例如，报告中标识的癌症患者)的可取性。例如，报告可包括有关癌症疗法施用的信息或建议，例如，向患者施用预先选择的剂量或以预先选择的治疗方案(例如，与一种或多种替代癌症疗法组合)进行施用。报告可自执行本文所述方法之后的7、14、21、30或45天内被递送至例如本文所述的实体。在一些实施方案中，所述报告是个性化的癌症治疗报告。

在一些实施方案中，每次使用本文所述的方法测试癌症患者时，都会生成报告以记录。可每隔一段时间(例如，每月、每两个月、每六个月或每年，或者更频繁或更不频繁地)重新评估癌症受试者，以监测受试者对癌症疗法的应答性和/或一种或多种癌症症状(例如，本文所述的症状)的改善。在一些实施方案中，所述报告可至少记录癌症受试者的治疗历史。

在一个实施方案中，所述方法还包括向另一方提供报告。另一方可以是例如癌症受试者、护理人员、医师、肿瘤科医生、医院、诊所、第三方付款人、保险公司或政府机关。

本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献均以引用方式整体并入。另外，材料、方法和实例仅是说明性的，并不是限制性的。除非另外定义，在此所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。虽然本文描述了合适的方法和材料，然而与本文所述的方法和材料类似或等同的方法和材料可用于本发明的实践或测试中。

通过以下实施例进一步说明本公开。仅出于说明性目的提供实施例。所述实施例不应解释为以任何方式限制本公开的范围或内容。

实施例1.在NSCLC患者中使用ATLAS

ATLAS

将ATLAS

NSCLC患者样品的表

ATLAS

从每位患者收集外周血样品。通过密度梯度离心富集外周血单核细胞(PBMC)。使用抗体缀合的磁珠对CD4+和CD8+T细胞进行分选，并通过抗CD3和抗CD28刺激进行非特异性扩增。单核细胞分化为树突状细胞(MDDC)。

针对ATLAS

数据分析

对于NEO-KCC，应答性新抗原被定义为平均观察到的细胞因子应答大于对照蛋白Neon Green的中值细胞因子应答的两个中值绝对偏差的抗原的那些。对于NEO-027和NEO-028，应答性新抗原被定义为平均观察到的细胞因子应答大于文库中所有抗原的中值细胞因子应答的两个中值绝对偏差的那些。对于NEO-031和NEO-041，拟合了混合效应模型，所述模型产生背景对照蛋白(Neon Green)细胞因子应答的平均值和标准偏差的估计值。应答性新抗原被定义为平均观察到的细胞因子应答大于对照蛋白Neon Green的基于模型的平均估计应答的两个残余标准偏差的那些。对于所有图，顶部虚线上方的点表示如通过细胞因子应答测量的刺激T细胞应答的新抗原。虚线下方的点表示如通过细胞因子应答所测量的遏制和/或抑制T细胞应答的新抗原。

图1示出从样品NEO-031获得的CD8+和CD4+T细胞(分别上图和下图)针对对照归一化的每种新抗原的IFNγ浓度。表A总结如通过IFNγ或IFNγ+TNFα浓度测量的引发刺激性应答和抑制性应答的新抗原的数量，以及刺激性新抗原与抑制性新抗原的比率。

表A：样品NEO-031(对放射和CPI的有害或无益应答)

图2示出从样品NEO-KCC获得的CD8+和CD4+T细胞(分别上图和下图)针对对照归一化的每种新抗原的IFNγ浓度。表B总结如通过IFNγ或IFNγ+TNFα浓度测量的引发刺激性应答和抑制性应答的新抗原的数量，以及刺激性新抗原与抑制性新抗原的比率。

表B：样品NEO-KCC(对化学疗法的有害或无益应答，CPI超应答者)

图3示出从样品NEO-041获得的CD8+和CD4+T细胞(分别上图和下图)针对对照归一化的每种新抗原的IFNγ浓度。表C总结如通过IFNγ或IFNγ+TNFα浓度测量的引发刺激性应答和抑制性应答的新抗原的数量，以及在适用的情况下刺激性新抗原与抑制性新抗原的比率。

表C：样品NEO-041(对CPI的有害或无益应答)

图4示出从样品NEO-027获得的CD8+和CD4+T细胞(分别上图和下图)针对对照归一化的每种新抗原的IFNγ浓度。表D总结如通过IFNγ或IFNγ+TNFα浓度测量的引发刺激性应答和抑制性应答的新抗原的数量，以及在适用的情况下刺激性新抗原与抑制性新抗原的比率。

表D：样品NEO-027(对化学疗法的有害或无益应答)

图5示出从样品NEO-028获得的CD8+和CD4+T细胞(分别上图和下图)针对对照归一化的每种新抗原的IFNγ浓度。表E总结如通过IFNγ或IFNγ+TNFα浓度测量的引发刺激性应答和抑制性应答的新抗原的数量，以及刺激性新抗原与抑制性新抗原的比率。

表E：样品NEO-028(对化学疗法的有害或无益应答)

表F、G和H中呈现代表性样品的比较结果。

表F：样品NEO-031(对放射和CPI的有害或无益应答)与NEO-KCC(对化学疗法的有害或无益应答，CPI超应答者)的比较

表G：样品NEO-031(对放射和CPI的有害或无益应答)和NEO-028(对化学疗法的有害或无益应答)的比较

表H：样品NEO-041(对CPI的有害或无益应答)与NEO-027(对化学疗法的有害或无益应答)的比较

实施例2.患者中刺激性抗原与抑制性抗原比率的比较

在免疫疗法治疗之前，从九名受试者中富集了外周血单核细胞。从相同的患者收集了肿瘤活检和唾液，并且对外显子组进行了测序，以鉴定肿瘤中的新突变。对于每个受试者，产生独特的ATLAS文库，所述文库表达来自其肿瘤的每种鉴定的突变，然后使用其抗原呈递细胞和T细胞进行查询。将数据针对每个ATLAS板中的阴性对照归一化，并确定引发刺激性应答(y轴)和抑制性应答(x轴)的新抗原的相对比例，并在图6中表示(圆圈大小表示肿瘤突变负荷(TMB))。在疗法后对患者进行随访，以确定他们是表现出有益的应答(完全应答、CR或部分应答，PR或稳定疾病，SD)还是表现出无益或有害应答(进行性疾病)。表现出有益应答的患者用白色圆圈表示，并且表现出无益或有害应答的患者用黑色圆圈表示。这些数据表明每位患者内的抑制性与刺激性新抗原特异性T细胞应答的相对比例(如图6中的对角线所示)可预测对免疫疗法的有益应答(或无益或有害应答)。出人意料地，抑制性与刺激性新抗原特异性T细胞应答的相对比例似乎是比TMB更好的预测因子，因为突变较少的患者(图6中的小圆圈)表现出有益应答，而肿瘤突变负荷较大的一些患者(图6中的较大圆圈)则未表现出有益应答。

实施例3.患者群组II中刺激性抗原与抑制性抗原比率的比较

在针对GEN-009的1/2a期临床试验的评估部分中，从每位患者收集外周血单核细胞(PBMC)，GEN-009是正在开发中用于治疗实体瘤的个人化佐剂疫苗。患者已完成针对其疾病(皮肤黑素瘤、NSCLC、SCCHN或尿路上皮癌)的根治性目的治疗，并且在开始GEN-009试验的评估后没有疾病迹象(NED)。还从每位患者收集了肿瘤活检和唾液，并对外显子组进行了测序，以鉴定肿瘤中的新突变。产生了独特的ATLAS文库，所述文库表达来自每位患者的肿瘤的每种鉴定的突变，然后使用所述患者的抗原呈递细胞和T细胞进行查询。简言之，从每位患者的PBMC中分选出单核细胞CD4+和CD8+T细胞。使单核细胞衍生为树突状细胞(MDDC)，并且对T细胞进行非特异性扩增。将MDDC在有序阵列中用表达患者的肿瘤特异性突变中的每一者的大肠杆菌一式两份脉冲，然后洗涤。将分选的T细胞添加至孔中并孵育过夜。第二天，使用Meso-Scale Discovery测定来测量上清液中的细胞因子(IFNγ和TNF-α)水平。将数据针对每个ATLAS板中的阴性对照归一化。在评估阶段(大约16周)期间对患者进行随访，以确定他们是继续对其先前治疗表现出有益应答(即维持NED)，还是表现出无益或有害应答(疾病进展)。表4总结肿瘤突变负荷(TMB；DNA的突变/Mb)、通过ATLAS筛选的候选抗原(新抗原)的总数、通过IFNγ和/或TNF-α分泌测量的引发刺激性应答或抑制应答的ATLAS鉴定的患者特异性新抗原的数量、刺激性抗原与抑制性抗原的比率以及评估阶段结束时每位患者的临床状态。

表4：患者群组II

图7示出相对于通过ATLAS筛选的候选新抗原总数，引发刺激性应答和抑制性应答的ATLAS鉴定的患者特异性抗原的比例。每位患者用圆圈表示。引发刺激性应答的候选抗原(刺激性抗原)的相对比例由y轴上的圆圈的位置指示。引发抑制性应答的候选抗原(抑制性抗原)的相对比例由x轴上的圆圈的位置指示。圆圈大小表示肿瘤突变负荷(TMB)。表现出有益临床应答(或待确定的应答)的患者用空心圆圈表示；表现出无益或有害临床应答的患者用实心圆圈表示。

图8示出来自图6和图7的合并患者数据。如图6和7所示，每位患者用圆圈表示。引发刺激性应答的ATLAS鉴定的患者特异性抗原的相对比例由y轴上圆圈的位置表示。引发抑制性应答的ATLAS鉴定的患者特异性抗原的相对比例由x轴上圆圈的位置表示。圆圈大小表示肿瘤突变负荷(TMB)。在评估时表现出有益临床应答(例如，完全应答、部分应答、稳定疾病或无疾病迹象)(或待确定的应答)的患者用空心圆圈表示。表现出无益或有害临床应答(疾病进展)的患者用实心圆圈表示。

图9是以条柱形式示出引发刺激性应答(黑色)、抑制性应答(白色)或无应答(灰色)的ATLAS鉴定的患者特异性抗原的比例。每位患者用条柱表示。图A示出CD4+T细胞的结果。图B示出CD8

图10是示出以下表5中所示的来自图6和五名另外患者的合并患者数据的图。每个圆圈描绘来自对免疫疗法治疗表现出有益应答(空心圆圈)或表现出无益或有害应答(黑色圆圈)的个体患者的T细胞的引发刺激性应答(y轴)和抑制性应答(x轴)的新抗原的相对比例。灰色圆圈表示未知结果。圆圈大小指示肿瘤突变负荷(TMB)。

表5：患者群组III

数据表明，患者中高比例的刺激性与抑制性抗原特异性T细胞应答(图6-8和10中对角线上方的圆圈)与对癌症疗法(包括免疫疗法)的有益临床应答相关。相比之下，低比例的刺激性与抑制性抗原特异性T细胞应答或不存在刺激性抗原与无益或有害临床应答相关。出人意料地，与TMB相比，刺激性与抑制性抗原特异性T细胞应答的相对比例似乎是与临床应答更好的相关性，因为TMB相对较低的患者(图6-8和10中的小圆圈)表现出有益应答，而TMB较大的一些患者(图6-8和10中的较大圆圈)则未表现出有益应答。

序列表

肝素酶同种型1，前原蛋白，NP_001092010.1，NP_006656.2(SEQ ID NO:6)

肝素酶同种型2，前原蛋白，NP_001159970.1(SEQ ID NO:7)

SMAD家族成员4，针对体节极性序列的母体同源物4，NP_005350.1(SEQ ID NO:8)

钙粘蛋白3，同种型1前原蛋白，NP_001784.2

钙粘蛋白3，同种型2前体，NP_001304124.1

钙粘蛋白3，同种型3，NP_001304125.1

绒毛膜促性腺激素β亚基3，前体，NP_000728.1

绒毛膜促性腺激素β亚基5，前体，NP_149032.1

细胞色素c氧化酶组装因子1同系物，同种型a，NP_001308126.1，NP_001308127.1，NP_001308128.1，NP_001308129.1，NP_001337853.1，NP_001337854.1，NP_001337855.1，NP_001337856.1，NP_060694.2

细胞色素c氧化酶组装因子1同系物，同种型b，NP_001308130.1

细胞色素c氧化酶组装因子1同系物，同种型c，NP_001308131.1，NP_001308132.1，NP_001308133.1，NP_001308134.1

细胞色素c氧化酶组装因子1同系物，同种型d，NP_001337857.1

雌激素受体结合位点相关的抗原，9，NP_001265867.1，NP_004206.1，NP_936056.1，NP_001308129.1，

ETS转录因子，同种型a，NP_001964.2

ETS转录因子，同种型b，NP_068567.1

受体酪氨酸蛋白激酶erbB-2，同种型a前体，NP_004439.2

受体酪氨酸蛋白激酶erbB-2，同种型b，NP_001005862.1

受体酪氨酸蛋白激酶erbB-2，同种型c，NP_001276865.1

受体酪氨酸蛋白激酶erbB-2，同种型d前体，NP_001276866.1

受体酪氨酸蛋白激酶erbB-2，同种型e，NP_001276867.1

肌苷一磷酸脱氢酶2，NP_000875.2

KRAS原癌基因，GTP酶，同种型a，NP_203524.1

KRAS原癌基因，GTP酶，同种型b，NP_004976.2

转化生长因子β受体2，同种型A前体，NP_001020018.1

转化生长因子β受体2，同种型B前体，NP_003233.4

辅肌动蛋白α4，同种型1，NP_004915.2

辅肌动蛋白α4，同种型2，NP_001308962.1

激活素A受体类1型，NP_001096.1，NP_001104537.1，NP_001334592.1，NP_001334593.1，NP_001334594.1，NP_001334595.1，NP_001334596.1

乙醇脱氢酶1C(I类)，γ多肽，NP_000660.1

腺苷A2a受体，NP_000666.2，NP_001265426.1，NP_001265427.1，NP_001265428.1，NP_001265429.1

Rho鸟嘌呤核苷酸交换因子16，NP_055263.2

B细胞接头蛋白，同种型1，NP_037446.1

B细胞接头蛋白，同种型2，NP_001107566.1

B细胞接头蛋白，同种型3，NP_001245369.1

B细胞接头蛋白，同种型4，NP_001245370.1

B细胞接头蛋白，同种型5，NP_001245371.1

碱核蛋白1，同种型a，NP_001708.3

碱核蛋白1，同种型b，NP_001288135.1

含A家族成员1的BPI折叠，前体，NP_001230122.1，NP_057667.1，NP_570913.1

钙电压门控通道辅助亚基β3，同种型1，NP_000716.2

钙电压门控通道辅助亚基β3，同种型2，NP_001193844.1

钙电压门控通道辅助亚基β3，同种型3，NP_001193845.1

钙电压门控通道辅助亚基β3，同种型4，NP_001193846.1

半胱天冬酶3，前原蛋白，NP_001341706.1，NP_001341707.1，NP_004346.3，NP_116786.1

半胱天冬酶3，同种型b，NP_001341708.1，NP001341709.1

半胱天冬酶3，同种型c，NP_001341710.1，NP001341711.1

半胱天冬酶3，同种型d，NP_001341712.1

半胱天冬酶3，同种型e，NP_001341713.1

小窝蛋白1，同种型α，NP_001744.2

小窝蛋白1，同种型β，NP_001166366.1，NP_001166367.1，NP_001166368.1

钙粘蛋白1，同种型1前原蛋白，NP_004351.1

钙粘蛋白1，同种型2前体，NP_001304113.1

钙粘蛋白1，同种型3，NP_001304114.1

钙粘蛋白1，同种型4，NP_001304115.1

细胞色素c氧化酶亚基8C，NP_892016.1

肉毒碱棕榈酰转移酶1A，同种型1，NP_001867.2

肉毒碱棕榈酰转移酶1A，同种型2，NP_001027017.1

癌症/睾丸抗原1A，NP_640343.1

C-X-C基序趋化因子配体13，NP_006410.1

二酰基甘油激酶η，同种型1，NP_001191433.1，NP_690874.2

二酰基甘油激酶η，同种型2，NP_821077.1

二酰基甘油激酶η，同种型3，NP_001191434.1

二酰基甘油激酶η，同种型4，NP_001191435.1

二酰基甘油激酶η，同种型5，NP_001284358.1

真核翻译延伸因子2，NP_001952.1

真核翻译起始因子5A，同种型A，NP_001137232.1

真核翻译起始因子5A，同种型B，NP_001137233.1，NP_001137234.1，NP_001961.1

纤粘蛋白1，同种型1前体，NP_997647.1

纤粘蛋白1，同种型3前体，NP_002017.1

纤粘蛋白1，同种型4前体，NP_997643.1

纤粘蛋白1，同种型5前体，NP_997641.1

纤粘蛋白1，同种型6前体，NP_997639.1

纤粘蛋白1，同种型7前体，NP_473375.2

纤粘蛋白1，同种型8前体，NP_001293058.1

纤粘蛋白1，同种型9前体，NP_001293059.1

纤粘蛋白1，同种型10前体，NP_001293060.1

纤粘蛋白1，同种型11前体，NP_001293061.1

主要组织相容性复合物，II类，DRβ1，前体，NP_001230894.1

主要组织相容性复合物，II类，DRβ1，前体，NP_001346122.1

主要组织相容性复合物，II类，DRβ1，前体，NP_001346123.1

主要组织相容性复合物，II类，DRβ1，前体，NP_002115.2

主要组织相容性复合物，II类，DRβ5，前体，NP_002116.2

羟基类固醇17-β脱氢酶3，NP_000188.1

胰岛素降解酶，同种型1，NP_004960.2

胰岛素降解酶，同种型2，NP_001159418.1

胰岛素降解酶，同种型3，NP_001309722.1

胰岛素降解酶，同种型4，NP_001309723.1

胰岛素降解酶，同种型5，NP_001309724.1，NP_001309725.1

胰岛素降解酶，同种型6，NP_001309726.1

吲哚胺2,3-双加氧酶1，NP_002155.1

胰岛素样生长因子结合蛋白5，前体，NP_000590.1

胰岛素样生长因子结合蛋白7，同种型1前体，NP_001544.1

胰岛素样生长因子结合蛋白7，同种型2前体，NP_001240764.1

钾两孔结构域通道亚族K成员1，NP_002236.1

溶酶体相关膜蛋白3，前体，NP_055213.2

MAGE家族成员B2，NP_002355.2

有丝分裂原激活蛋白激酶13，NP_002745.1

具有胶原结构的巨噬细胞受体，NP_006761.1

苹果酸酶1，NADP依赖性苹果酸酶，NP_002386.1

迁移和侵袭抑制蛋白，NP_068752.2

基质金属肽酶12，巨噬细胞金属弹性蛋白酶前原蛋白，NP_002417.2

基质金属肽酶7，基质裂解蛋白前原蛋白，NP_002414.1

髓磷脂蛋白零样蛋白1，髓磷脂蛋白零样蛋白1同种型a前体，NP_003944.1

髓磷脂蛋白零样蛋白1，髓磷脂蛋白零样蛋白1同种型b前体，NP_078845.3

髓磷脂蛋白零样蛋白1，髓磷脂蛋白零样蛋白1同种型c前体，NP_001139663.1

巨噬细胞清道夫受体1，巨噬细胞清道夫受体I型和II型同种型1，NP_619729.1

巨噬细胞清道夫受体1，巨噬细胞清道夫受体I型和II型同种型2，NP_002436.1

巨噬细胞清道夫受体1，巨噬细胞清道夫受体I型和II型同种型3，NP_619730.1

肌神经蛋白，同种型A，NP_001172047.1，NP_061127.1

肌神经蛋白，同种型B，NP_001172048.1

N-乙酰基葡糖胺激酶，同种型1，NP_060037.3

N-乙酰基葡糖胺激酶，同种型2，NP_001317354.1，NP_001317355.1

新天冬氨酸蛋白酶A天冬氨酸肽酶，前原蛋白，NP_004842.1

核转录因子Y亚基γ，同种型1，NP_001136060.1

核转录因子Y亚基γ，同种型2，NP_055038.2

核转录因子Y亚基γ，同种型3，NP_001136059.1

核转录因子Y亚基γ，同种型4，NP_001136061.1

核转录因子Y亚基γ，同种型5，NP_001136062.1

核转录因子Y亚基γ，同种型6，NP_001295043.1

核转录因子Y亚基γ，同种型7，NP_001295044.1

NFKB阻遏因子，同种型1，NP_001166958.1

NFKB阻遏因子，同种型2，NP_001166959.1，NP_060014.2

纤溶酶原激活物，尿激酶，尿激酶型纤溶酶原激活物同种型1前原蛋白，NP_002649.1

纤溶酶原激活物，尿激酶，尿激酶型纤溶酶原激活物同种型2，NP_001138503.1

纤溶酶原激活物，尿激酶，尿激酶型纤溶酶原激活物同种型3，NP_001306120.1

受体酪氨酸激酶样孤儿受体1，非活性酪氨酸蛋白激酶跨膜受体ROR1同种型1前体，NP_005003.2

受体酪氨酸激酶样孤儿受体1，非活性酪氨酸蛋白激酶跨膜受体ROR1同种型2前体，NP_001077061.1

Runt相关转录因子1，runt相关转录因子1同种型AML1a，NP_001116079.1

Runt相关转录因子1，runt相关转录因子1同种型AML1b，NP_001001890.1

Runt相关转录因子1，runt相关转录因子1同种型AML1c，NP_001745.2

表面活性物质蛋白A1，肺表面活性物质相关蛋白A1同种型1前体，NP_001158116.1，NP_001158119.1，NP_005402.3

表面活性物质蛋白A1，肺表面活性物质相关蛋白A1同种型2前体，NP_001087239.2

表面活性物质蛋白A1，肺表面活性物质相关蛋白A1同种型3前体，NP_001158117.1

表面活性物质蛋白A1，肺表面活性物质相关蛋白A1同种型4前体，NP_001158118.1

表面活性物质蛋白A2，肺表面活性物质相关蛋白A2同种型1前体，NP_001092138.1，NP_001307742.1

表面活性物质蛋白A2，肺表面活性物质相关蛋白A2同种型2前体，NP_001307743.1

表面活性物质蛋白B，肺表面活性物质相关蛋白B前体，NP_000533.3，NP_942140.2

表面活性物质蛋白C，肺表面活性物质相关蛋白C同种型1前体，NP_001165881.1，NP_003009.2

表面活性物质蛋白C，肺表面活性物质相关蛋白C同种型2前体，NP_001165828.1，NP_001304707.1，NP_001304709.1

表面活性物质蛋白C，肺表面活性物质相关蛋白C同种型3前体，NP_001304708.1

表面活性物质蛋白D，肺表面活性物质相关蛋白D前体，NP_003010.4

溶质运载蛋白家族2成员5，溶质运载蛋白家族2，促葡萄糖转运蛋白成员5同种型1，NP_001315548.1，NP_003030.1

溶质运载蛋白家族2成员5，溶质运载蛋白家族2，促葡萄糖转运蛋白成员5同种型2，NP_001129057.1

溶质运载蛋白家族2成员5，溶质运载蛋白家族2，促葡萄糖转运蛋白成员5同种型3，NP_001315549.1

溶质运载蛋白家族2成员5，溶质运载蛋白家族2，促葡萄糖转运蛋白成员5同种型4，NP_001315550.1

精子相关抗原9，C-Jun-氨基末端激酶相互作用蛋白4同种型1，NP_001124000.1

精子相关抗原9，C-Jun-氨基末端激酶相互作用蛋白4同种型2，NP_001123999.1

精子相关抗原9，C-Jun-氨基末端激酶相互作用蛋白4同种型3，NP_003962.3

精子相关抗原9，C-Jun-氨基末端激酶相互作用蛋白4同种型4，NP_001238900.1

SGT1同系物，MIS12动粒复合物组装伴侣蛋白，蛋白SGT1同系物同种型A，NP_006695.1

SGT1同系物，MIS12动粒复合物组装伴侣蛋白，蛋白SGT1同系物同种型B，NP_001124384.1

SGT1同系物，MIS12动粒复合物组装伴侣蛋白，蛋白SGT1同系物同种型C，NP_001307760.1

磺基转移酶家族1C成员2，磺基转移酶1C2同种型a，NP_001047.1

磺基转移酶家族1C成员2，磺基转移酶1C2同种型b，NP_789795.1

跨膜蛋白52B，同种型1，NP_694567.1

跨膜蛋白52B，同种型2前体，NP_001073283.1

输出蛋白7，NP_055839.3

YES原癌基因1，Src家族酪氨酸激酶，酪氨酸蛋白激酶Yes，NP_005424.1

含卷曲螺旋结构域的蛋白质80，含卷曲螺旋结构域的蛋白质80前体，NP_955805.1，NP_955806.1

顶体蛋白结合蛋白前体NP_115878.2

甲胎蛋白，同种型1 NP_001125.1

甲胎蛋白，同种型2 NP_001341646.1

缺乏于黑素瘤1蛋白NP_001615.2

A激酶锚定蛋白4，同种型1 NP_003877.2

A激酶锚定蛋白4，同种型2 NP_647450.1

ALK酪氨酸激酶受体，同种型1 NP_004295.2

ALK酪氨酸激酶受体，同种型2 NP_001340694.1

血管生成素2，同种型a NP_001138.1

血管生成素2，同种型b NP_001112359.1

血管生成素2，同种型c NP_001112360.1

血管生成素1，同种型1前体NP_001137.2

血管生成素1，同种型2前体NP_001186788.1

血管生成素1，同种型3前体NP_001300980.1

含锚定蛋白重复序列结构域的蛋白30A NP_443723.2

雄性激素受体，同种型1 NP_000035.2

雄性激素受体，同种型2 NP_001011645.1

雄性激素受体，同种型3 NP_001334990.1

雄性激素受体，同种型4 NP_001334992.1

雄性激素受体，同种型5 NP_001334993.1

ATP酶H+转运辅助蛋白1 NP_001174.2

B黑素瘤抗原1前体NP_001178.1

BCR/ABL融合蛋白e14ab NG_050673.1

丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B-raf，同种型1 NP_004324.2

丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B-raf，同种型2 NP_001341538.1

碳酸酐酶9前体NP_001207.2

G/有丝分裂特异性细胞周期蛋白B1，同种型1 NP_114172.1

G/有丝分裂特异性细胞周期蛋白B1，同种型2 NP_001341773.1

G/有丝分裂特异性细胞周期蛋白B1，同种型3 NP_001341774.1

CD276，同种型a前体NP_001019907.1

CD276，同种型b前体NP_001316557.1，NP_079516.1

CD276，同种型c NP_001316558.1

癌胚抗原相关细胞粘附分子3，同种型1前体NP_001806.2

癌胚抗原相关细胞粘附分子3，同种型2前体NP_001264092.1

癌胚抗原相关细胞粘附分子5，同种型1前蛋白NP_001278413.1，NP_004354.3

癌胚抗原相关细胞粘附分子5，同种型2前蛋白NP_001295327.1

含杆状病毒IAP重复序列的蛋白质2，同种型1 NP_001157.1，NP_001243092.1

含杆状病毒IAP重复序列的蛋白质2，同种型2，NP_001243095.1

软骨肉瘤相关基因2/3蛋白，同种型X1 XP_006724920.1

软骨肉瘤相关基因2/3蛋白，同种型X2 XP_016885512.1

硫酸软骨素蛋白聚糖4前体NP_001888.2

癌症/睾丸抗原2同种型LAGE-1aNP_758965.2

癌症/睾丸抗原2同种型LAGE-1bNP_066274.2

转录阻遏因子CTCFL，同种型1 NP_001255969.1，NP_001255970.1，NP_542185.2

转录阻遏因子CTCFL，同种型2 NP_001255971.1

转录阻遏因子CTCFL，同种型3 NP_001255972.1

转录阻遏因子CTCFL，同种型4 NP_001255973.1

转录阻遏因子CTCFL，同种型5 NP_001255974.1

转录阻遏因子CTCFL，同种型6 NP_001255975.1

转录阻遏因子CTCFL，同种型7 NP_001255976.1

转录阻遏因子CTCFL，同种型8 NP_001255977.1

转录阻遏因子CTCFL，同种型9 NP_001255978.1

转录阻遏因子CTCFL，同种型10 NP_001255979.1

转录阻遏因子CTCFL，同种型11 NP_001255980.1，NP_001255981.1

转录阻遏因子CTCFL，同种型12 NP_001255983.1

转录阻遏因子CTCFL，同种型13 NP_001255984.1

细胞色素P450 1B1 NP_000095.2

表皮生长因子受体，同种型a前体NP_005219.2

表皮生长因子受体，同种型b前体NP_958439.1

表皮生长因子受体，同种型c前体NP_958440.1

表皮生长因子受体，同种型d前体NP_958441.1

表皮生长因子受体，同种型e前体NP_001333826.1

表皮生长因子受体，同种型f前体NP_001333827.1

表皮生长因子受体，同种型g前体NP_001333828.1

表皮生长因子受体，同种型h NP_001333829.1

表皮生长因子受体，同种型i前体NP_001333870.1

上皮细胞粘附分子NP_002345.2

肝配蛋白A型受体2，同种型1前体NP_004422.2

肝配蛋白A型受体2，同种型2 NP_001316019.1

受体酪氨酸蛋白激酶erbB-2，同种型a前体NP_004439.2

受体酪氨酸蛋白激酶erbB-2，同种型b NP_001005862.1

受体酪氨酸蛋白激酶erbB-2，同种型c NP_001276865.1

受体酪氨酸蛋白激酶erbB-2，同种型d，NP_001276866.1

受体酪氨酸蛋白激酶erbB-2，同种型e NP_001276867.1

受体酪氨酸蛋白激酶erbB-4，同种型JM-a/CVT-1前体NP_005226.1

受体酪氨酸蛋白激酶erbB-4，同种型JM-a/CVT-2前体NP_001036064.1

脯氨酰肽链内切酶FAP，同种型1 NP_004451.2

脯氨酰肽链内切酶FAP，同种型2 NP_001278736.1

谷氨酸羧肽酶2，同种型1 NP_004467.1

谷氨酸羧肽酶2，同种型2 NP_001014986.1

谷氨酸羧肽酶2，同种型3 NP_001180400.1

谷氨酸羧肽酶2，同种型4 NP_001180401.1

谷氨酸羧肽酶2，同种型5 NP_001180402.1

谷氨酸羧肽酶2，同种型6 NP_001338165.1

Fos相关抗原1，同种型1 NP_005429.1

Fos相关抗原1，同种型2 NP_001287773.1

Fos相关抗原1，同种型3NP_001287784.1

Fos相关抗原1，同种型4NP_001287785.1

Fos相关抗原1，同种型5NP_001287786.1

G抗原1NP_001035753.1

G抗原12I NP_001465.1

半乳糖凝集素-1NP_002296.1

半乳糖凝集素-3同种型1NP_002297.2

半乳糖凝集素-3，同种型3 NP_001344607.1

半乳糖凝集素-9短NP_002299.2

半乳糖凝集素-9长NP_033665.1

半乳糖凝集素-9同种型3 NP_001317092.1

前黑素体蛋白，同种型1前蛋白NP_001186983.1

前黑素体蛋白，同种型2前体NP_001186982.1

前黑素体蛋白，同种型3前蛋白NP_008859.1

前黑素体蛋白，同种型4前蛋白NP_001307050.1

前黑素体蛋白，同种型5前蛋白NP_001307051.1

离子型谷氨酸受体，NMDA 2A，同种型1前体NP_000824.1，NP_001127879.1

离子型谷氨酸受体，NMDA 2A，同种型2前体NP_001127880.1

代谢型谷氨酸受体3前体NP_000831.2

HPV E6癌蛋白，NP_041325.1

HPV E7癌蛋白，NP_041326.1

GTP酶HRas，同种型1NP_001123914.1，NP_005334.1

GTP酶HRas，同种型3NP_001304983.1

GTP酶HRas，同种型2NP_789765.1

血管内皮生长因子受体2前体NP_002244.1

肥大/干细胞生长因子受体KIT，同种型1前体NP_000213.1

肥大/干细胞生长因子受体KIT，同种型2前体NP_001087241.1

血浆激肽释放酶同种型1前蛋白NP_001639.1

血浆激肽释放酶同种型3前蛋白NP_001025218.1

血浆激肽释放酶同种型4前蛋白NP_001025219.1

酪氨酸蛋白激酶LCK，同种型a NP_001036236.1，NP_005347.3

酪氨酸蛋白激酶LCK，同种型b NP_001317397.1

豆荚蛋白前蛋白NP_001008530.1、NP_005597.3

巨噬细胞迁移抑制因子NP_002406.1

MAGE家族成员A1 NP_004979.3

黑素瘤相关抗原10 NP_001011543.2，NP_001238757.1，NP_066386.2

黑素瘤相关抗原12 NP_001159858.1，NP_001159859.1，NP_005358.2

黑素瘤相关抗原2 NP_001269430.1，NP_001269431.1，NP_001269433.1，NP_001269434.1，NP_005352.1，NP_786884.1，NP_786885.1

MAGE家族成员A3 NP_005353.1

黑素瘤相关抗原4 NP_001011548.1，NP_001011549.1，NP_001011550.1，NP_002353.3

黑素瘤相关抗原6 NP_005354.1，NP_787064.1

黑素瘤相关抗原9 NP_005356.1

黑素瘤相关抗原C2 NP_057333.1

黑素瘤相关抗原D1，同种型a NP_001005333.1

黑素瘤相关抗原D1，同种型b NP_001005332.1，NP_008917.3

有丝分裂原激活蛋白激酶激酶激酶5 NP_005914.1

有丝分裂原激活蛋白激酶激酶激酶9，同种型1 NP_149132.2

有丝分裂原激活蛋白激酶激酶激酶9，同种型2 NP_001271159.1

有丝分裂原激活蛋白激酶激酶激酶9，同种型3 NP_001271160.1

有丝分裂原激活蛋白激酶激酶激酶9，同种型4 NP_001271161.1

有丝分裂原激活蛋白激酶1 NP_002736.3，NP_620407.1

Melan-A NP_005502.1

黑素转铁蛋白，同种型1前蛋白NP_005920.2

黑素转铁蛋白，同种型2前体NP_201573.1

含杆状病毒IAP重复序列的蛋白质7，同种型αNP_647478.1

含杆状病毒IAP重复序列的蛋白质7，同种型βNP_071444.1

中性粒细胞胶原酶，同种型1前蛋白NP_002415.1

中性粒细胞胶原酶，同种型2 NP_001291370.1，NP_001291371.1

间皮素，同种型1前蛋白NP_001170826.1，NP_005814.2

间皮素，同种型2前蛋白NP_037536.2

粘蛋白1，同种型1前体NP_002447.4

粘蛋白2，同种型1前体NP_001018016.1

粘蛋白3，同种型1前体NP_001018017.1

粘蛋白5，同种型1前体NP_001037855.1

粘蛋白6，同种型1前体NP_001037856.1

粘蛋白7，同种型1前体NP_001037857.1

粘蛋白-1，同种型8前体NP_001037858.1

粘蛋白-1，同种型9前体NP_001191214.1

粘蛋白-1，同种型10前体NP_001191215.1

粘蛋白-1，同种型11前体NP_001191216.1

粘蛋白-1，同种型12前体NP_001191217.1

粘蛋白-1，同种型13前体NP_001191218.1

粘蛋白-1，同种型14前体NP_001191219.1

粘蛋白-1，同种型15前体NP_001191220.1

粘蛋白-1，同种型16前体NP_001191221.1

粘蛋白-1，同种型17前体NP_001191222.1

粘蛋白-1，同种型18前体NP_001191223.1

粘蛋白-1，同种型19前体NP_001191224.1

粘蛋白-1，同种型20前体NP_001191225.1

粘蛋白-1，同种型21前体NP_001191226.1

N-myc原癌基因蛋白，同种型1 NP_001280157.1，NP_005369.2

N-myc原癌基因蛋白，同种型2 NP_001280160.1

N-myc原癌基因蛋白，同种型3 NP_001280162.1

癌症/睾丸抗原1B NP_001318.1

阿片类生长因子受体NP_031372.2

P抗原家族成员4 NP_001305806.1，NP_008934.1

配对盒蛋白Pax-3，同种型PAX3a NP_000429.2

配对盒蛋白Pax-3，同种型PAX3i NP_001120838.1

配对盒蛋白Pax-3，同种型PAX3b NP_039230.1

配对盒蛋白Pax-3，同种型PAX3 NP_852122.1

配对盒蛋白Pax-3，同种型PAX3d NP_852123.1

配对盒蛋白Pax-3，同种型PAX3e NP_852124.1

配对盒蛋白Pax-3，同种型PAX3h NP_852125.1

配对盒蛋白Pax-3，同种型PAX3g NP_852126.1

配对盒蛋白Pax-5，同种型1 NP_057953.1

配对盒蛋白Pax-5，同种型2 NP_001267476.1

配对盒蛋白Pax-5，同种型3 NP_001267477.1

配对盒蛋白Pax-5，同种型4 NP_001267478.1

配对盒蛋白Pax-5，同种型5 NP_001267479.1

配对盒蛋白Pax-5，同种型6 NP_001267480.1

配对盒蛋白Pax-5，同种型7 NP_001267481.1

配对盒蛋白Pax-5，同种型8 NP_001267482.1

配对盒蛋白Pax-5，同种型9 NP_001267483.1

配对盒蛋白Pax-5，同种型10 NP_001267484.1

配对盒蛋白Pax-5，同种型11 NP_001267485.1

血小板源性生长因子受体β，同种型1 NP_002600.1

血小板源性生长因子受体β，同种型2 NP_001341945.1

血小板源性生长因子受体β，同种型3 NP_001341946.1

胎盘特异性蛋白1前体NP_001303816.1，NP_001303817.1，NP_001303818.1，NP_068568.1

优先在肿瘤中表达的黑素瘤抗原，同种型a NP_001278644.1，NP_001278645.1，NP_006106.1，NP_996836.1，NP_996837.1，NP_996838.1，NP_996839.1

优先在肿瘤中表达的黑素瘤抗原，同种型b NP_001278646.1，NP_001278648.1，NP_001305055.1，NP_001305056.1

磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸依赖性Rac交换因子蛋白2，同种型NP_079146.2

磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸依赖性Rac交换因子蛋白2，同种型b NP_079446.3

鱼精蛋白-2，同种型1 NP_002753.2

鱼精蛋白-2，同种型2 NP_001273285.1

鱼精蛋白-2，同种型3 NP_001273286.1

鱼精蛋白-2，同种型4 NP_001273287.1

鱼精蛋白-2，同种型5 NP_001273288.1

颗粒蛋白前体NP_002078.1

成髓细胞素前体NP_002768.3

前列腺干细胞抗原前蛋白NP_005663.2

Ras相关的C3肉毒毒素底物1同种型Rac1b NP_061485.1

再生胰岛衍生蛋白3-α前体NP_002571.1，NP_620354.1，NP_620355.1

G蛋白信号传导调控因子5，同种型1 NP_003608.1

G蛋白信号传导调控因子5，同种型2 NP_001182232.1，NP_001241677.1

G蛋白信号传导调控因子5，同种型3 NP_001241678.1

Rho相关GTP结合蛋白RhoC前体NP_001036143.1，NP_001036144.1，NP_786886.1

肉瘤抗原1 NP_061136.2

T细胞识别的鳞状细胞癌抗原3 NP_055521.1

分泌性白细胞蛋白抑制剂NP_003055.1

转录因子SOX-10NP_008872.1

精子表面蛋白Sp17 NP_059121.1

蛋白SSX2，同种型a NP_003138.3

蛋白SSX2，同种型b NP_783629.1

蛋白质SSX2，同种型c NP_001265626.1

乳糖基神经酰胺α-2,3-唾液酸转移酶，同种型1 NP_003887.3

乳糖基神经酰胺α-2,3-唾液酸转移酶，同种型2 NP_001035902.1

乳糖基神经酰胺α-2,3-唾液酸转移酶，同种型3 NP_001341152.1，NP_001341153.1，NP_001341155.1，NP_001341162.1，NP_001341163.1，NP_001341177.1

乳糖基神经酰胺α-2,3-唾液酸转移酶，同种型4 NP_001341156.1，NP_001341158.1，NP_001341167.1

乳糖基神经酰胺α-2,3-唾液酸转移酶，同种型5 NP_001341176.1

α-N-乙酰基神经氨酸苷α-2,8-唾液酸转移酶，同种型1NP_003025.1

α-N-乙酰基神经氨酸苷α-2,8-唾液酸转移酶，同种型2NP_001291379.1

存活蛋白，同种型1 NP_001159.2

存活蛋白，同种型2 NP_001012270.1

存活蛋白，同种型3 NP_001012271.1

T-盒4，同种型1 NP_001308049.1

T-盒4，同种型2 NP_060958.2

血管生成素-1受体，同种型1 NP_000450.2

血管生成素-1受体，同种型2 NP_001277006.1

血管生成素-1受体，同种型3 NP_001277007.1

端粒酶逆转录酶，同种型1 NP_937983.2

端粒酶逆转录酶，同种型2 NP_001180305.1

细胞肿瘤抗原p53，同种型a NP_000537.3，NP_001119584.1

细胞肿瘤抗原p53，同种型b NP_001119586.1

细胞肿瘤抗原p53，同种型c NP_001119585.1

细胞肿瘤抗原p53，同种型d NP_001119587.1

细胞肿瘤抗原p53，同种型e NP_001119588.1

细胞肿瘤抗原p53，同种型f NP_001119589.1

细胞肿瘤抗原p53，同种型g NP_001119590.1，NP_001263689.1，NP_001263690.1

细胞肿瘤抗原p53，同种型h NP_001263624.1

细胞肿瘤抗原p53，同种型i NP_001263625.1

细胞肿瘤抗原p53，同种型j NP_001263626.1

细胞肿瘤抗原p53，同种型k NP_001263627.1

细胞肿瘤抗原p53，同种型l NP_001263628.1

多巴色素互变异构酶，同种型1 NP_001913.2

多巴色素互变异构酶，同种型2 NP_001123361.1

多巴色素互变异构酶，同种型3 NP_001309111.1，NP_001309112.1，NP_001309113.1，NP_001309114.1

多巴色素互变异构酶，同种型4，NP_001309115.1

转化/转录结构域相关蛋白，同种型1 NP_001231509.1

转化/转录结构域相关蛋白，同种型2 NP_003487.1

酪氨酸酶前体NP_000363.1

血管内皮生长因子A，同种型a NP_001020537.2

血管内皮生长因子A，同种型b NP_003367.4

血管内皮生长因子A，同种型c NP_001020538.2

血管内皮生长因子A，同种型d NP_001020539.2

血管内皮生长因子A，同种型e NP_001020540.2

血管内皮生长因子A，同种型f NP_001020541.2

血管内皮生长因子A，同种型g NP_001028928.1

血管内皮生长因子A，同种型h NP_001165093.1

血管内皮生长因子A，同种型i NP_001165094.1

血管内皮生长因子A，同种型j NP_001165095.1

血管内皮生长因子A，同种型k NP_001165096.1

血管内皮生长因子A，同种型l NP_001165097.1

血管内皮生长因子A，同种型m NP_001165098.1

血管内皮生长因子A，同种型n NP_001165099.1

血管内皮生长因子A，同种型o NP_001165100.1

血管内皮生长因子A，同种型p NP_001165101.1

血管内皮生长因子A，同种型q NP_001191313.1

血管内皮生长因子A，同种型r NP_001191314.1

血管内皮生长因子A，同种型s NP_001273973.1

血管内皮生长因子A，同种型VEGF-Ax前体NP_001303939.1

含WD重复序列的蛋白46，同种型1 NP_005443.3

含WD重复序列的蛋白46，同种型2 NP_001157739.1

威尔姆氏瘤蛋白，同种型A NP_000369.4

威尔姆氏瘤蛋白，同种型B NP_077742.3

威尔姆氏瘤蛋白，同种型D NP_077744.4

威尔姆氏瘤蛋白，同种型E NP_001185480.1

威尔姆氏瘤蛋白，同种型F NP_001185481.1

X抗原家族成员1，同种型a NP_001091063.2

X抗原家族成员1，同种型d NP_001091065.1

X连锁凋亡抑制因子NP_001158.2，NP_001191330.1

应理解，虽然本公开已结合其具体实施方式进行了描述，但前述描述意图说明且并非限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求书来限定。其他方面、优点和修改均在权利要求书的范围之内。