一种细胞色素P450 46A1酶的特异性抑制剂及其应用

技术领域

本发明属医药技术领域，具体涉及一种细胞色素P450 46A1酶的高选择性抑制剂及其应用。

背景技术

细胞色素P450(Cytochrome P450,CYP)超家族包含了机体内最重要的药物代谢酶，属于单氧酶的一类。细胞色素P450 46A1酶(CYP46A1)是一种神经元专属的细胞色素P450酶，它主要分布于正常脑组织的神经元和星形胶质细胞中，少量分布于神经视网膜上(Proc Natl Acad Sci U S A,1999；96:7238)。CYP46A1参与脑内胆固醇氧化反应，将大脑内的胆固醇代谢为24-羟基胆固醇(24-OHC)，24-OHC在正常生理条件下进入体循环，是胆固醇消除和稳态稳定的主要途径(Current opinion in lipidology,2001；12:105)，CYP46A1酶被认为是脑胆固醇转化为24-OHC这一过程的限速酶。胆固醇在维持中枢神经系统的结构和功能中发挥着重要作用，正常情况下胆固醇不易透过血脑屏障，脑内胆固醇为原位生物合成，脑内胆固醇增加可导致淀粉样蛋白水平增加，因此，胆固醇的氧化代谢是保证脑内外转运动态平衡的重要保障(Molecular psychiatry,2003；8:635)。截至目前为止，CYP46A1介导的代谢反应除了胆固醇-24-羟化反应外，还有睾酮-16β羟化反应(Front MolNeurosci.2020；13:568641.)。

越来越多的研究表明，CYP46A1酶与各种神经退行性疾病如阿尔兹海默病(AD)、帕金森病(PD)和亨廷顿氏病(HD)等密切相关。已有报道表明，与正常人相比，神经退行性疾病患者血浆中的24-羟化胆固醇水平明显升高，因此，24-羟化胆固醇也被认为是神经退行性病变的潜在生物标记物(Neuroreport,2000；11:1959)。然而，需要强调的是，24-羟基胆固醇升高的程度在不同的患者中可能随时间而改变。因此，需要在更多的AD人群中进行进一步的纵向研究，以评估24-羟基胆固醇是否是早期检测AD及其进展的合适生化标志物(Journal of lipid research,2000；41:195)。有关实验结果证实了AD患者血浆24-羟基胆固醇水平取决于疾病的严重程度，轻度痴呆患者血浆24-羟基胆固醇水平升高，重度痴呆患者血浆24-羟基胆固醇水平降低(Neuroreport,2000；11:1959)。一方面，诱导CYP46A1过度表达时，可以减少淀粉样沉积，从而减轻AD模型动物的认知功能障碍症状(Humanmolecular genetics,2015；24:5965)。通过用低剂量的抗艾滋病毒药物依法韦伦治疗快速淀粉样变性模型5XFAD小鼠，低剂量的依法韦伦增强了CYP46A1的活性,降低了5XFAD小鼠大脑皮层和下丘的淀粉样蛋白负荷和小胶质细胞活化，以及淀粉样前体蛋白的蛋白水平，改善了小鼠的空间记忆(EMBO molecular medicine,2020；12:e10924)。另一方面，抑制CYP46A1活性则可以减少癫痫发作频率(The Neuroscientist 2016；2:132)，武田制药公司开发的TAK-935药物评估对CYP46A1的抑制作用，旨在评估TAK-935作为一种辅助疗法在儿童发育性或癫痫性脑病患者中的疗效、安全性和耐受性(Neurotherapeutics 2019；16:635)。

因此无论是激活或是抑制CYP46A1酶活性都具有潜在的临床治疗价值，CYP46A1无疑将成为一个新的研究靶点，开发CYP46A1酶的激活剂或抑制剂也将产生深远的临床意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种细胞色素P450 46A1酶的高选择性抑制剂，即枸杞亚精胺J，其可用于细胞色素P450 46A1的表型研究，包括鉴定细胞色素P450 46A1在药物代谢反应中的参与情况和贡献率。

一种新型细胞色素P450 46A1(CYP 46A1)酶特异性抑制剂，该抑制剂为枸杞亚精胺J(Lycibarbarspermidine J)，可以特异性的抑制CYP46A1酶的活性，其结构如下所示：

本发明还提供了所述细胞色素P450 46A1的特异性抑制剂的应用，其特征在于：所述特异性抑制剂用于选择性抑制细胞色素P450 46A1介导的内源性底物的代谢反应，其抑制细胞色素P450 46A1介导胆固醇24-羟化反应的IC

本发明所述细胞色素P450 46A1的特异性抑制剂的应用，其特征在于：所述特异性抑制剂可用于细胞色素P450酶系的代谢表型研究，主要用于鉴定细胞色素P450 46A1是否参与内源性类固醇物质的代谢反应及其贡献率。

本发明提供的细胞色素P450 46A1酶高选择性抑制剂的优点如下：

(1)高特异性：枸杞亚精胺J可高特异性地抑制细胞色素P450 46A1介导的胆固醇羟化反应。枸杞亚精胺J抑制细胞色素P450 46A1的IC

(2)来源于中药枸杞子、简单易得：枸杞亚精胺J是中药枸杞子含有的天然化学成分，可通过分离纯化获得。

附图说明

图1.枸杞亚精胺J的化学结构式；

图2.枸杞亚精胺J对CYP各亚型酶的抑制作用；

图3.枸杞亚精胺J对CYP46A1介导的胆固醇24-羟化反应抑制效应图；

图4.枸杞亚精胺J对CYP46A1介导的胆固醇24-羟化反应的抑制曲线；

图5.枸杞亚精胺J对CYP46A1介导的胆固醇24-羟化反应的抑制动力学；A为双倒数作图，B为Dixon作图；

图6.枸杞亚精胺J对小鼠脑微粒体介导的睾酮16β-羟化反应的抑制效应图；

图7.枸杞亚精胺J对人源神经组织细胞介导的睾酮16β-羟化反应的抑制效应图。

具体实施方式

下列实施例是为了进一步说明本发明，而不是要限制其范围。

实施例1

枸杞亚精胺J用于人重组CYP46A1酶的抑制活性评价

枸杞亚精胺J对人重组CYP46A1酶活性的抑制作用，具体步骤如下：

(1)100微升体外代谢反应体系中，包含4mM MgCl

(2)于反应体系中加入10μl NADPH(终浓度1mM)起始反应；

(3)反应10分钟后，加入100μl包含24-羟化胆固醇-d4(内标)冰乙腈，剧烈震荡后，终止反应；

(4)采用高速冷冻离心机，在20,000×g的条件下，高速离心上述体系20分钟后，取上清，进行LC-MS/MS检测分析；

枸杞亚精胺J对人重组CYP各亚型酶的抑制作用如图2所示；枸杞亚精胺J对人重组CYP46A1酶介导的胆固醇24-羟化反应抑制效应如图3所示，抑制曲线和抑制动力学分别如图4和图5所示。

实施例2

枸杞亚精胺J对小鼠脑微粒体中CYP46A1酶活性的抑制作用评价

枸杞亚精胺J对鼠脑微粒体中CYP46A1酶的活性抑制作用，具体步骤如下：

(1)200微升体外代谢反应体系中，包含4mM MgCl

(2)于反应体系中加入20μl NADPH(终浓度1mM)起始反应；

(3)反应20分钟后，加入200μl包含双氯芬酸(内标)冰乙腈，剧烈震荡后，终止反应；

(4)采用高速冷冻离心机，在20,000×g的条件下，高速离心上述体系20分钟后，取上清，进行LC-MS/MS检测分析；

枸杞亚精胺J对小鼠脑微粒体介导的睾酮16β-羟化反应的抑制效应图如图6所示。

实施例3

枸杞亚精胺J对人源神经组织细胞中CYP46A1酶的抑制活性评价

枸杞亚精胺J对人源神经组织细胞中CYP46A1酶的抑制活性作用，具体步骤如下：

(1)采用标准方法复苏各组织来源的细胞系，包括：CYP46A1转染细胞、SH-SY5Y(神经母细胞瘤细胞)和U87(人脑胶质瘤细胞)培养3天后，进行传代，并接种于12孔板中继续培养，细胞接种密度为1×10

(2)细胞继续培养24小时后，加入睾酮(终浓度10μM)进行CYP46A1酶活性测试，同时加入枸杞亚精胺J终浓度为1,10,100μM(二甲基亚砜终体积小于0.1％，v/v)，于37℃的二氧化碳培养箱反应60分钟；

(3)反应60分钟后，取出500微升细胞培养上清液，加入等体积包含双氯芬酸(内标)的冰乙腈后充分涡旋混匀，采用高速冷冻离心机，在20,000×g的条件下，高速离心上述体系20分钟后，取上清，进行LC-MS/MS检测分析；

(4)吸除剩余培养基，加入200微升细胞裂解液裂解并收集细胞，采用Lowry方法进行细胞蛋白定量。

枸杞亚精胺J对人源神经组织细胞介导的睾酮16β-羟化反应的抑制效应图如图7所示。

实施例4

不同种系来源的小鼠脑微粒体中细胞色素CYP 46A1对睾酮的代谢贡献率测定

购买BALB/C、C57BR和昆明三个种系小鼠的脑微粒体，以睾酮的16β-羟化反应为探针反应，利用枸杞亚精胺J测定小鼠脑组织中CYP46A1的总催化活性，具体实验流程如下：

(1)200μl体外代谢反应体系中，4mM MgCl

(2)于反应体系中加入20μl NADPH(终浓度1mM)起始反应；

(3)15分钟后，加入200μl甲醇(含内标双氯芬酸)，剧烈震荡后，终止反应；

(4)采用高速冷冻离心机，在20,000×g的条件下，高速离心上述体系10分钟后，取上清，进行LC-MS/MS检测分析；

对睾酮的16β-羟化产物的生成量进行定量检测。测定结果表明，根据对照组与枸杞亚精胺J抑制组睾酮的16β-羟化产物的生成速度的差值，不同种系小鼠来源的脑微粒体中CYP 46A1的催化能力相差较大，最高活性与最低活性差距近10倍。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。