一种外科用修复补片及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种外科用修复补片及其制备方法与应用，属于再生医学材料领域。

背景技术

外科用修复补片主要用于外科手术后的创面保护，其主要作用有两个，一是通过物理屏障作用，将创面或组织缺损部位与周围组织相隔离并形成一定的组织生存空间，阻止周围组织侵入缺损区；二是促进手术创面的愈合，引导缺损组织的修复。要达到上述目的，外科用修复补片应具有如下特征：首先，其需要具有良好的生物相容性，降解过程和产物不妨碍创面的愈合，降解产物可被机体吸收，不会产生明显的刺激性；其次，其要具有一定的柔软度和适宜的厚度，便于临床操作。最后，其需要具有良好的耐降解性，创面的愈合和组织的修复需要时间和过程，若所用的修复补片提前降解会导致创面修复不彻底、组织被侵入等不良临床下效果。

现有技术生产的外科用修复补片无法兼顾产品厚度可控、产品降解周期满足临床需求、产品可完全降解且被机体吸收等三方面的需求，通常的做法是：为提高产品的降解性能会增加戊二醛等化学交联的工艺步骤，而采用交联工艺所生产的修复补片是无法完全降解且被机体吸收的；为控制产品厚度、优化产品的生物相容性会采用胶原蛋白优化重组的工艺，该工艺生产的修复补片降解速度快，无法满足临床需求，且胶原蛋白的双螺旋微观结构被破坏，导致修复效果差。为保留胶原蛋白的天然结构现有技术中采用手工刮除的原料处理方法，目的是只去除表面无用组织，不破坏真皮层天然结构，但此工艺方法效率比较低，而且刮除后膜厚度不可控，进而影响生产效率和产品质量。

此外，保留了胶原蛋白天然结构的外科用修复补片，其降解时间与自身厚度之间还存在一定的正相关，通常厚度越大，降解时间越长，所以亟需一种如何在制备过程中控制膜的厚度，并且制备出一种厚度适中、耐降解性能佳的外科用修复补片的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种外科用修复补片及其制备方法与应用。

本发明通过对机械上刀片的调节，控制真皮层的厚度并保证厚度的均一性；同时采用热交联的方法，使胶原分子内部自脱水形成氢键，提高修复膜的稳定性，进而延长降解时间。

本发明提供的一种外科用修复补片的制备方法，包括如下步骤：

(1)取离体的原料皮，去除外表层的毛组织后通过机械切割的方法去除表皮层和皮下组织层，得到真皮层；

(2)步骤(1)中得到的所述真皮层在非离子表面活性剂溶液中浸泡处理，得到经脱脂处理后的真皮层；

(3)步骤(2)中所述脱脂处理后的真皮层在碱溶液中浸泡处理，得到经脱细胞处理后的真皮层；

(4)步骤(3)中所述脱细胞处理后的真皮层采用平衡缓冲液浸泡处理，得到pH为中性的真皮层；

(5)将步骤(4)中所述pH为中性的真皮层干燥后进行热交联，即得到外科用修复补片。

上述的制备方法步骤(5)中，所述热交联的条件：

压强可为0～1MPa，温度可为50～120℃，时间可为20～200小时。

上述的制备方法步骤(1)中，所述去除表皮层和皮下组织层的机械切割方法是通过片皮机来实现的。

上述的制备方法步骤(1)中，所述机械切割的方法按照如下步骤进行：通过调整所述片皮机上刀片位置进行切割，控制所述真皮层的厚度，后续的处理过程不会对产品厚度产生明显影响。

上述的制备方法步骤(1)中，所述真皮层的厚度具体可为0.1～2mm，具体可为0.2～0.6mm或0.6～2mm，更具体根据产品制备的需求在上述范围内进行精确的加工。

上述的制备方法所述步骤(2)中浸泡处理温度为0～30℃，具体可为0～20℃或10～30℃，时间可为6～72小时，具体可为12小时、24小时、12～24小时；

所述非离子表面活性剂溶液为Tween或Triton溶液，其质量浓度可为1％～10％。

上述的制备方法所述步骤(3)中浸泡处理温度可为0～30℃，具体可为10℃、15℃或10～15℃，时间可为1～12小时，具体可为2小时、4小时、2～4小时、2～12小时、4～12小时或1～8小时；

所述碱溶液为NaOH或KOH溶液，其质量浓度可为1％～10％。

上述的制备方法所述步骤(4)中浸泡处理温度可为0～30℃，时间可为6～72小时；

所述平衡缓冲液为磷酸盐或碳酸盐缓冲液，其质量浓度可为1％～10％。

上述的制备方法中，所述原料皮选自牛皮、羊皮和猪皮中的至少一种。

上述的制备方法步骤(5)中，所述热交联是胶原蛋白受热脱掉分子间水分形成了氢键维系的分子间弱链接，不属于化学交联。

上述的制备方法中，步骤(5)中，所述干燥采用冷冻干燥的方法。

所述方法中，步骤(5)中还包括将所述外科用修复补片进行环氧乙烷灭菌处理，保存处理的步骤。

本发明还提供了上述的制备方法制备得到的所述外科用修复补片。

所述外科用修复补片的厚度为0.1～2mm，厚度可控；

所述外科用修复补片的降解时间为10～150天。

本发明所述外科用修复补片应用于制备用于如下1)～4)中任一领域的外科手术修复补片中：

1)口腔科；

2)神经外科；

3)腹壁外科；

4)妇科。

本发明具有以下优点：

(1)本发明选用机械刮除的方法来除去原料皮上的无用组织层(表皮层、皮下组织层)，替代了传统的手工刮除方法，提高了生产效率，同时使所得到的真皮层厚度均一，保证了产品质量；

(2)通过调节机械(具体为片皮机)上刀片的位置，能控制真皮层的厚度，解决了临床中由于修复补片过厚不利于操作的问题；

(3)采用物理的热交联方法，减少了化学试剂对机体的伤害，同时交联条件比较温和，可在真空干燥箱中继冷冻干燥之后进行，无需更换设备，保证了无菌操作。并且热交联属于弱交联，当温度适宜时，胶原还可变回初始的状态，不会影响后期修复补片的降解和吸收过程。

(4)本发明采用环氧乙烷灭菌的方法，防止灭菌过程中胶原结构遭到破坏，维持了胶原自身属性，保证产品质量。

附图说明

图1为对比例1中修复补片裁剪得到的1′在a位置处的HE染色效果图(40×、100×、400×分别表示在40、100、400倍电镜下的效果图)；

图2为对比例2中修复补片裁剪得到的2′在b位置处的HE染色效果图(40×、100×、400×分别表示在40、100、400倍电镜下的效果图)；

图3为本发明实施例2中修复补片裁剪得到的3′在c位置处的HE染色效果图(40×、100×、400×分别表示在40、100、400倍电镜下的效果图)；

图4为对比例1中修复补片裁剪得到的1′在d位置处的HE染色效果图100×表示在100倍电镜下的效果图)；

图5为对比例2中修复补片裁剪得到的2′在a位置处的HE染色效果图(40×、100×、400×分别表示在40、100、400倍电镜下的效果图)；

图6为本发明实施例2中修复补片裁剪得到的3′在b位置处的HE染色效果图(40×、100×、400×分别表示在40、100、400倍电镜下的效果图)；

图7为对比例1中修复补片裁剪得到的1′在c位置处的HE染色效果图100×表示在100倍电镜下的效果图)；

图8为对比例2中修复补片裁剪得到的2′在d位置处的HE染色效果图(40×、100×、400×分别表示在40、100、400倍电镜下的效果图)；

图9为本发明实施例2中修复补片裁剪得到的3′在a位置处的HE染色效果图(40×、100×、400×分别表示在40、100、400倍电镜下的效果图)；

图10为对比例1中修复补片裁剪得到的1′在b位置处的HE染色效果图(100×表示在100倍电镜下的效果图)；

图11为对比例2中修复补片裁剪得到的2′在c位置处的HE染色效果图(40×、100×、400×分别表示在40、100、400倍电镜下的效果图)；

图12为本发明实施例2中修复补片裁剪得到的3′在d位置处的HE染色效果图(40×、100×、400×分别表示在40、100、400倍电镜下的效果图)；

图13为对比例2中修复补片裁剪得到的样品植入体内10周后的HE染色效果图；

图14本发明实施例2中修复补片裁剪得到的样品植入体内10周后的HE染色效果图；

图15为对比例2中修复补片裁剪得到的样品植入体内13周后的HE染色效果图；

图16本发明实施例2中修复补片裁剪得到的样品植入体内13周后的HE染色效果图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

(1)选料：选取离体后的新鲜牛皮，尽量避免接触污染物，收集后立即冷冻保存；

(2)预处理：将离体后的牛皮解冻并充分清洗，先后使用去毛机和片皮机通过机械刮除和切割的方法去除牛皮内表层的脂肪和外表层的鬃毛等不适宜加工的部分，再用纯化水将剩余部分冲洗干净，得到预处理后的产品，产品厚度为0.2～0.6mm(具体厚度在临床试验时会根据患者情况确定采用的厚度范围值，并将产品厚度设置成一个范围，以增大使用范围和操作便利性)；

(3)Tween80溶液处理：将预处理后得到的产品置于质量浓度为1％的Tween80溶液中，0～20℃下浸泡12小时，然后用纯化水洗涤干净；

(4)NaOH溶液处理：将步骤(3)中得到的产品置于质量浓度为2％的NaOH溶液中，10℃下浸泡4小时，然后用纯化水洗涤干净；

(5)碳酸盐缓冲处理：将经碳酸钠和碳酸氢钠配制的缓冲液处理后产品置于质量百分浓度为2％的碳酸盐缓冲液中，0℃下浸泡6小时，然后用纯化水洗涤干净；

(6)冷冻干燥：在压强0MPa，温度-40℃条件下，用冷冻干燥机对缓冲液处理后的产品进行冻干10小时，得到冷冻干燥处理后的产品；

(7)热交联：冷冻干燥结束后，将冻干机温度升温至60℃，压强控制在0.1MPa，继续对产品处理24小时，得到热交联后的产品；

(8)灭菌：热交联后，对产品进行环氧乙烷灭菌，得到修复补片，并进行保存处理。

实施例2

(1)选料：选取离体后的新鲜羊皮，尽量避免接触污染物，收集后立即冷冻保存；

(2)预处理：将离体后的牛皮解冻并充分清洗，先后使用去毛机和片皮机通过机械刮除和切割的方法去除牛皮内表层的脂肪和外表层的鬃毛等不适宜加工的部分，再用纯化水将剩余部分冲洗干净，得到预处理后的产品，产品厚度为0.6～2mm；

(3)TritonX-100溶液处理：将预处理后得到的产品置于质量浓度为5％的TritonX-100溶液中，10～30℃下浸泡24小时，然后用纯化水洗涤干净；

(4)KOH溶液处理：将步骤(3)中得到的产品置于质量浓度为5％的KOH溶液中，15℃下浸泡2小时，然后用纯化水洗涤干净；

(5)磷酸盐缓冲处理：将经磷酸氢钠和磷酸二氢钠配制的缓冲液处理后产品置于质量浓度为5％的碳酸盐缓冲液中，10℃下浸泡4小时，然后用纯化水洗涤干净；

(6)冷冻干燥：在压强0MPa，温度-40℃条件下，用冷冻干燥机对缓冲液处理后的产品进行冻干12小时，得到冷冻干燥处理后的产品；

(7)热交联：冷冻干燥结束后，将冻干机温度升温至80℃，压强控制在0.1MPa，继续对产品处理12小时，得到热交联后的产品；

(8)灭菌：热交联后，对产品进行环氧乙烷灭菌，得到修复补片，并进行保存处理。

对比例1、

与本发明实施例1不同之处在于：产品经冷冻干燥后，直接进行辐照灭菌；其他的实验步骤及条件与本发明实施例1完全相同。

对比例2、

与本发明实施例1不同之处在于：产品经冷冻干燥后，直接进行环氧乙烷灭菌；其他的实验步骤及条件与本发明实施例1完全相同。

对上述实施例1-2及对比例1-2制备得到的产品进行性能检测，结果如下：

1、撕裂力检测

检测方法：对上述对比例1、对比例2和实施例1-2的方法制备得到的修复补片样品分别进行如下操作，进行检验。将样品剪成规格为1cm×3cm的长条状，在离短边的缘3～5mm处用4-0号缝合线穿过样品，对折缝合线，在距离穿孔处约5cm处将缝合线打结，防止缝合线脱落。然后将未穿线的一端固定在拉力试验机的下部，最后将穿线一端通过挂钩固定于拉力试验机的上部。固定好材料后开始检测，直至试样被撕裂，读取拉伸负荷力的最大值，即为样品的撕裂力。检测结果如表1所示。

2、体内降解能力检测

检测方法：对上述对比例1、对比例2和实施例2的方法制备得到的修复补片样品分别进行如下操作，进行检验。将修复补片样品裁剪成相同尺寸并依次编号为1′、2′和3′，将上述制备的修复补片分别植入3组健康的大兔体内，植入方法如下：在大兔身上分别取4个试验位点，分别标号为：a、b、c和d，a、b、c、d按照左前、左后、右前和右后的位置依次进行排列，然后将1′、2′、3′这三个试验样分别置于a、b、c位置处，并按照a(1′)、b(2′)、c(3′)、d(1′)、a(2′)、b(3′)……的规律依次进行循环四次(每个样品循环四次，排除点位对测试结果的影响)。植入6周、10周和13周后，对植入部位进行组织切片，观察修复补片的降解情况。植入6周之后的检测结果如图1-12所示；植入10周之后的检测结果如图13-14所示；植入13周之后的检测结果如图15-16。

检测结果如下：

表1实施例和对比例样品的撕裂力比较

从表1测试结果可以看出，相对于无热交联和环氧乙烷灭菌的对比例1、对比例2，本发明实施例1和实施例2中所制备的修复补片撕裂力均有提升，原因可能是热交联之后胶原分子之间会形成氢键，对胶原分子有一定的拉紧作用，所以本发明产品的撕裂性能增强。

图1-12为修复补片植入体内6周后的组织切片图，图1、图5中可见上皮样细胞、多核巨细胞和大量淋巴细胞，并且植入体内的修复补片较为少见；图2中大部分修复补片可见，局部见单核细胞(淋巴细胞、巨噬细胞)密集浸润；图3中大部分修复补片可见，边缘部位见单核细胞(淋巴细胞、巨噬细胞)密集浸润；图4、图7、图10中不能确定修复补片的植入部位；图6、图8中可见上皮样细胞和大量淋巴细胞，并且部分区域修复补片多见；图9、图11中修复补片是完整的，修复补片内可见少量成纤维细胞或纤维细胞，少量炎性细胞；图12中修复补片是完整的，修复补片内可见少量炎性细胞，并且局部表现为纤维增生(图中箭头方向)；图13中修复补片只有少量可见，而图14中修复补片基本保持完整。

表2实施例和对比例样品的降解时间比较

由图1-16和表2测试结果可知，对比例1中的产品降解时间最短，6周可全部降解结束并被体内组织所吸收，从组织切片上已完全看不到补片植入部位。对比例2中的产品采用环氧乙烷灭菌的工艺，降解时间相对于对比例1略有延长，植入体内6周后，部分发生降解；植入10周后，大部分降解只剩少量可见；植入13周后，材料完全降解。而采用本发明实施例2中的方案所制备的产品植入体内10周后，植入部位处的补片仍然是完整的；植入13周后，材料仍部分可见。说明本发明通过环氧乙烷灭菌和热交联相互配合，能明显提高产品的抗降解性能，更符合目前的临床需求。