一种液相下循环肿瘤细胞分离仪质控品及其制备方法

技术领域

本发明属于生物领域，具体涉及一种液相下循环肿瘤细胞分离仪质控品的制备方法，同时，还涉及该制备方法制备的液相下循环肿瘤细胞分离仪质控品。

背景技术

临床检验通常需要采用一个对照方法与待评价的方法同时进行检测，然后对结果进行分析，来保证检验的准确性，从而保证检验的质量。质控物质需要具备的基本要素是稳定、均匀和没有基质效应。基质效应是指样品中被分析物以外的组分，由于基质常常对分析物的分析过程有显著的干扰，并影响分析结果的准确性，这些影响和干扰被称为基质效应。目前循环肿瘤细胞鉴定及分析有很多种不同的方法，但缺乏相应的质控品来保证检验的准确性。

中国专利CN202111139287.2公开了一种用于制备循环肿瘤细胞质控品的试剂盒及循环肿瘤细胞质控品的制备方法，该方法中使用了DMSO，且制得的质控品长期保存在-20℃。该方法中DMSO存在一定的毒性作用，长期-20℃保存后会使得细胞处于休眠状态，降低细胞活性，冻融后使用前需进行处理以去除DMSO，操作繁琐。

中国专利CN201811307835.6公开了一种用于制备干式肿瘤细胞质控品的细胞冷冻液及其应用，该方法中加入了5-25％的蛋白，3-15％的细胞稳定剂A，1-10％的细胞稳定剂B，蛋白为乳清蛋白或血清白蛋白，稳定剂A为血清，稳定剂B为葡萄糖等，蛋白及血清属于蛋白质类物质且血清成分复杂，会对后面的肿瘤细胞免疫分析产生干扰。另外该方法为冻干制剂，冻干及解冻的步骤繁琐且成本增加。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种液相下循环肿瘤细胞分离仪质控品的制备方法，方法易行，操作简便，用于保证循环肿瘤细胞检测中的质量保证，从而确保了检测质量。

本发明的另一目的提供了一种液相下循环肿瘤细胞分离仪质控品，该质控品包含质控试剂1(即阳性质控品)和质控试剂2(即阴性质控品)，与样本同时进行运行及分析，来判断设备及检测方法在正常运行中，质量可控范围内。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种液相下循环肿瘤细胞分离仪质控品的制备方法，其步骤如下：

质控试剂1：

(1)打开洁净工作台，放入培养基、胰酶消化液、1xPBS溶液、15ml离心管、无菌枪头，开紫外照射30min。

(2)关闭紫外灯开启照明和排风，取培养好的肿瘤细胞1瓶放入洁净工作台，吸弃培养基，加入3ml 1xPBS溶液轻轻晃动洗涤，吸弃，加入0.5ml胰酶消化液，盖紧盖子，放入二氧化碳培养箱中，30秒后取出，拍打培养瓶侧面使细胞悬浮，此时瓶内溶液呈白色浑浊，迅速加入2ml培养基终止酶反应，并将瓶内细胞吹打重悬后转移到15ml离心管中，1500rpm离心3min收集细胞，弃上清，用2ml 1xPBS重悬，得到单细胞悬液。

注意：上述洁净工作台中的操作均应在酒精灯火焰周围完成。

(3)将上述肿瘤单细胞悬液静置5min，吸弃上层1ml液体(含漂浮的死细胞及碎片)。

(4)震荡混匀，吸取2ul液体至干净的载玻片上，于显微镜下计数并计算单细胞悬液浓度。

(5)取1.5ml EP管，加入1ml 1xPBS溶液，吸取适量细胞悬液(含约5000个细胞)加入其中。

(6)取出EpCAM磁珠置于冰盒上，用涡旋振荡器涡旋振荡30s-1min，吸取5ul至1.5ml EP管中，并盖紧盖子，于3D摇床上7rpm混合反应30min。

(7)取下1.5ml EP管，放入掌式离心机中瞬时离心，吸弃500ul上清(含未结合磁珠的裸细胞)，再离心10s，吸弃上清至剩余50ul体积，加入500ul固定液，轻弹EP管底部使细胞重悬，静置15min，放入掌式离心机中离心10s，小心吸弃上清至剩余100ul体积，加入1ml1xPBS溶液，颠倒4～5次混匀，备用。

(8)将上述制备好的磁珠-细胞溶液转移至质控试剂1管中，再用1ml 1xPBS清洗原EP管并将清洗的溶液一并转入质控试剂1管中，旋紧瓶盖。

质控试剂2：

(1)取新鲜的健康人外周血4ml，转移至15ml离心管中，加入3倍于血样体积的红细胞裂解液，颠倒4～5次混匀，放到3D摇床上混合8～10min，直至溶液变成透明的樱桃红；

(2)1900rpm离心10min收集细胞，吸弃大部分上清，再瞬时离心，吸弃所有上清，加入2ml 1xPBS重悬细胞；

(3)将上述制备好的WBC细胞悬液转移至质控试剂2管中，并旋紧瓶盖。

一种由前述的制备方法制备的液相下循环肿瘤细胞分离仪质控品，包括：

由上，质控试剂1在与样本同时进行处理时可以显示阳性质控细胞特异标志物荧光(DAPI及CK阳性)，不显示阴性细胞特异标志物荧光(CD45阴性)；质控试剂2在与样本进行处理鉴定时，可显示阴性质控细胞特异标志物荧光(DAPI及CD45阳性)，不显示阳性质控细胞特异标志物荧光(CK阴性)。本发明主要创新性的解决了以下几个问题，(1)利用该方法制备的质控品易于辨认，质控试剂1中的磁珠作为阳性质控细胞的特有标记物，可以在显微镜下清晰的观察到，有利于从大量细胞中分离出所需要的细胞，如从血液中几十亿个大量的红细胞、白细胞中分离出极其稀少的目的异常细胞；另外，该方法还可以扩展为标记其他特定标记物，从而分离不同目的的细胞。(2)不同于常规免疫荧光法盖片后观察，该方法中的阳性质量控制细胞可在液相下显示为DAPI及CK阳性，不显示CD45；该方法中阴性质量控制细胞可在液相下显示为DAPI及CD45，不显示CK，通过阳性及阴性质量控制细胞的特定的生物标记物，从而进行鉴别；(3)该质控品全程在液相缓冲液环境中，无冻融过程且缓冲液成分单一，可进行药敏试验、基因分析及基因测序等多种下游应用，且不会对下游分析造成干扰。该方法获得的质控品对细胞形态无损伤，不会对细胞的完整性、蛋白标志物及核酸造成损坏，最大程度的保证细胞的完整性，可继续进行下一步细胞、蛋白及基因分析。

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：本发明方法中主要为液相下来制备及保存质控品，保证细胞的形态最大程度保持原貌，不被损坏且可以保护细胞靶点不受干扰。另外，该方法制备的质控品易于保存，2-8℃即可，且可长期存放。

附图说明

图1为实施例1中质控试剂1的镜下观察到的阳性质控细胞图；

图2为实施例1中质控试剂1，液相下阳性质控细胞的免疫荧光鉴定图；

图3为实施例1中质控试剂2，液相下阴性质控细胞的免疫荧光鉴定图；

图4为实施例2中质控试剂1的镜下观察到的阳性质控细胞图；

图5为实施例2中质控试剂1，液相下阳性质控细胞的免疫荧光鉴定图；

图6为实施例2中质控试剂2，液相下阴性质控细胞的免疫荧光鉴定图。

具体实施方式

下面通过具体的实施案例进一步的描述本发明的内容，但并不限制本发明。

实施例1：

一种液相下乳腺癌肿瘤细胞MCF7质控品的制备方法，其步骤是：

质控试剂1：

(1)打开洁净工作台，放入培养基、胰酶消化液、1xPBS溶液、15ml离心管、无菌枪头，开紫外照射30min。

(2)关闭紫外灯开启照明和排风，取培养好的MCF-7细胞1瓶放入洁净工作台，吸弃培养基，加入3ml 1xPBS溶液轻轻晃动洗涤，吸弃，加入0.5ml胰酶消化液，盖紧盖子，放入二氧化碳培养箱中，30秒后取出，拍打培养瓶侧面使细胞悬浮，此时瓶内溶液呈白色浑浊，迅速加入2ml培养基终止酶反应，并将瓶内细胞吹打全悬后转移到15ml离心管中，1500rpm离心3min收集细胞，弃上清，用2ml 1xPBS重悬，得到单细胞悬液。

注意：上述洁净工作台中的操作均应在酒精灯火焰周围完成。

(3)将上述肿瘤单细胞悬液静置5min，吸弃上层1ml液体(含漂浮的死细胞及碎片)。

(4)震荡混匀，吸取2ul液体至干净的载玻片上，于显微镜下计数并计算单细胞悬液浓度。

(5)取1.5ml EP管，加入1ml 1xPBS溶液，吸取适量细胞悬液(含约5000个细胞)加入其中。

(6)取出EpCAM磁珠置于冰盒上，用涡旋振荡器涡旋振荡30s-1min，吸取5ul至1.5ml EP管中，并盖紧盖子，于3D摇床上7rpm混合反应30min。

(7)取下1.5ml EP管，放入掌式离心机中瞬时离心，吸弃500ul上清(含未结合磁珠的裸细胞)，再离心10s，吸弃上清至剩余50ul体积，加入500ul固定液，轻弹EP管底部使细胞重悬，静置15min，放入掌式离心机中离心10s，小心吸弃上清至剩余100ul体积，加入1ml1xPBS溶液，颠倒4～5次混匀，备用。

(8)将上述制备好的磁珠-细胞溶液转移至质控试剂1管中，再用1ml 1xPBS清洗原EP管并将清洗的溶液一并转入质控试剂1管中，旋紧瓶盖。

(9)质控试剂1在2-8℃液相保存，且可在液相下进行免疫荧光法鉴定及观察分析。

质控试剂2：

(1)取新鲜的健康人外周血4ml，转移至15ml离心管中，加入3倍于血样体积的红细胞裂解液，颠倒4～5次混匀，放到3D摇床上混合8～10min，直至溶液变成透明的樱桃红；

(2)1900rpm离心10min收集细胞，吸弃大部分上清，再瞬时离心，吸弃所有上清，加入2ml 1xPBS重悬细胞；

(3)将上述制备好的WBC细胞悬液转移至质控试剂2管中，并旋紧瓶盖。

(4)液相下对质控试剂2进行免疫荧光鉴定并观察。

图1为实施例1中质控试剂1的镜下观察到的阳性质控细胞图。显微镜明场下观察到有2个粘附磁珠的阳性质量控制细胞，该细胞在明场下表现为细胞表面粘附磁珠，形成细胞-磁珠复合物，便于观察。

图2为实施例1中质控试剂1，液相下阳性质控细胞的免疫荧光鉴定图。阳性质控细胞的免疫荧光鉴定图：此两个细胞在明场下显示与磁珠粘附形成细胞-磁珠复合物；在荧光通道下显示阳性质控细胞特异标志物荧光(DAPI及CK阳性)，不显示阴性细胞特异标志物荧光(CD45阴性)。

图3为实施例1中质控试剂2，液相下阴性质控细胞的免疫荧光鉴定图。阴性质控细胞的免疫荧光鉴定图：此细胞在明场下可见不与磁珠粘附形成细胞-磁珠复合物；在荧光通道下显示阴性质控细胞特异标志物荧光(DAPI及CD45阳性)，不显示阳性质控细胞特异标志物荧光(CK阴性)。

实施例2：

一种肝癌的肿瘤细胞HepG2质控品的制备方法，其步骤是：

质控试剂1：

(1)打开洁净工作台，放入培养基、胰酶消化液、1xPBS溶液、15ml离心管、无菌枪头，开紫外照射30min。

(2)关闭紫外灯开启照明和排风，取培养好的HepG2细胞1瓶放入洁净工作台，吸弃培养基，加入3ml 1xPBS溶液轻轻晃动洗涤，吸弃，加入0.5ml胰酶消化液，盖紧盖子，放入二氧化碳培养箱中，30秒后取出，拍打培养瓶侧面使细胞悬浮，此时瓶内溶液呈白色浑浊，迅速加入2ml培养基终止酶反应，并将瓶内细胞吹打全悬后转移到15ml离心管中，1500rpm离心3min收集细胞，弃上清，用2ml 1xPBS重悬，得到单细胞悬液。

注意：上述洁净工作台中的操作均应在酒精灯火焰周围完成。

(3)将上述肿瘤单细胞悬液静置5min，吸弃上层1ml液体(含漂浮的死细胞及碎片)。

(4)震荡混匀，吸取2ul液体至干净的载玻片上，于显微镜下计数并计算单细胞悬液浓度。

(5)取1.5ml EP管，加入1ml 1xPBS溶液，吸取适量细胞悬液(含约5000个细胞)加入其中。

(6)取出EpCAM磁珠置于冰盒上，用涡旋振荡器涡旋振荡30s-1min，吸取5ul至1.5ml EP管中，并盖紧盖子，于3D摇床上7rpm混合反应30min。

(7)取下1.5ml EP管，放入掌式离心机中瞬时离心，吸弃500ul上清(含未结合磁珠的裸细胞)，再离心10s，吸弃上清至剩余50ul体积，加入500ul固定液，轻弹EP管底部使细胞重悬，静置15min，放入掌式离心机中离心10s，小心吸弃上清至剩余100ul体积，加入1ml1xPBS溶液，颠倒4～5次混匀，备用。

(8)将上述制备好的磁珠-细胞溶液转移至质控试剂1管中，再用1ml 1xPBS清洗原EP管并将清洗的溶液一并转入质控试剂1管中，旋紧瓶盖。

(9)质控试剂1在2-8℃液相保存，且可在液相下进行免疫荧光法鉴定及观察分析。

质控试剂2：

(1)取新鲜的健康人外周血4ml，转移至15ml离心管中，加入3倍于血样体积的红细胞裂解液，颠倒4～5次混匀，放到3D摇床上混合8～10min，直至溶液变成透明的樱桃红；

(2)1900rpm离心10min收集细胞，吸弃大部分上清，再瞬时离心，吸弃所有上清，加入2ml 1xPBS重悬细胞；

(3)将上述制备好的WBC细胞悬液转移至质控试剂2管中，并旋紧瓶盖。

(4)液相下对质控试剂2进行免疫荧光鉴定并观察。

图4为实施例2中质控试剂1的镜下观察到的阳性质控细胞图。显微镜明场下观察到有1个粘附磁珠的阳性质量控制细胞，该细胞在明场下表现为细胞表面粘附磁珠，形成细胞-磁珠复合物，便于观察。

图5为实施例2中质控试剂1，液相下阳性质控细胞的免疫荧光鉴定图。阳性质控细胞的免疫荧光鉴定图：此两个细胞在明场下显示与磁珠粘附形成细胞-磁珠复合物；在荧光通道下显示阳性质控细胞特异标志物荧光(DAPI及CK阳性)，不显示阴性细胞特异标志物荧光(CD45阴性)。

图6为实施例2中质控试剂2，液相下阴性质控细胞的免疫荧光鉴定图。阴性质控细胞的免疫荧光鉴定图：此细胞在明场下可见不与磁珠粘附形成细胞-磁珠复合物；在荧光通道下显示阴性质控细胞特异标志物荧光(DAPI及CD45阳性)，不显示阳性质控细胞特异标志物荧光(CK阴性)。

以上所述，仅为本发明中的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉该技术的人在本发明所揭露的技术范围内，可理解得到的变换或者替换，都应该涵盖在本发明的包含范围之内。