一种基于SCT法检测狼疮抗凝物的试剂盒

技术领域

本申请属于生物技术领域，具体涉及一种基于SCT法检测狼疮抗凝物的试剂盒。

背景技术

狼疮抗凝物质(lupus anticoagulation，LA)是可在体内自然产生或因自身免疫而产生的异质性免疫球蛋白，是一种针对带阴电荷磷脂的自身抗体，主要通过结合β

狼疮抗凝物检测的适应证包括凝血筛查试验(APTT、PT、TT)时间非预期延长，对发生动静脉血栓或病态妊娠患者进行评估。根据凝血途径不同，LA的检测有三种途径：外源途径、内源途径、共同途径。内源途径的检测方法有APTT、SCT、KCT、CSCT；外源途径有dPT；共有途径有dRVVT、ECT、Textarin。为了提高LA的检测精度和检出率，通常选用两种不同途径的方法。LA的检测包括筛查试验、混合试验和确认试验，基本测试原理为：(1)磷脂依赖的凝血试验延长；(2)证实凝血时间延长不是由一种或多种凝血因子缺乏导致；(3)证实循环抑制物具有磷脂依赖性。LA的筛选试剂是含低浓度磷脂的试剂，确认试剂是含高浓度磷脂的试剂，通过各试剂得到凝固时间的比值来确认待测样本中LA的存在。在筛选试验阶段和确认试验阶段分别使用筛选试剂和确认试剂。混合试验是通过用健康正常血浆与待测血浆按一定比例(1:1或1:4)混合，来观察延长的筛选时间是否被纠正。若待测血浆缺少一种或多种凝血因子，则混合后延长的凝血时间将得到纠正；反之若待测血浆中存在LA等抗凝物质，则无法被纠正。

根据激活路径和试剂敏感性的不同，市场上用来检测LA的试剂盒多数为dRVVT和SCT两大类。相比于dRVVT法，SCT法具有更高的灵敏性，可以极大提高检测准确率，减少假阴性的结果。而且dRVVT法为了保持试剂长期的稳定性大多为冻干制剂，冻干粉制剂在使用时需要对制剂进行复溶的操作，该过程由于受到复溶水质、复溶操作过程等的影响，很容易造成检测结果的假阳性或假阴性。因此，SCT法在临床应用中具有广阔的前景。

依据CLSI H60-A指南推荐，LA监测应该在患者停服抗凝药后开展实验，然而有些患者由于其高凝状态需经常口服抗凝药或接受肝素/低分子肝素抗凝剂治疗，在检测LA的过程中导致待检测样本中往往存在抗凝剂的干扰，为了抵抗肝素/低分子肝素及口服抗凝药的干扰，现有的筛选试剂和确认试剂中均会添加有肝素中和剂。虽然通过在筛选试剂和确认试剂中添加肝素中和剂可以高效抵抗肝素/低分子肝素及口服抗凝药的干扰，但是申请人在进行相关实验时，通过在试剂中添加肝素中和剂发现，添加了肝素中和剂的SCT液体试剂往往存在不稳定的问题，主要表现在容易浑浊和产生沉淀，这将严重影响SCT试剂的推广和使用。

发明内容

针对现有SCT法液体试剂不稳定的缺陷，申请人旨在提供一种液体型SCT法试剂盒，该试剂盒稳定期长、阳性检出率高、可高效抵抗肝素/低分子肝素及口服抗凝药的干扰，可用于系统性红斑狼疮及抗磷脂综合征类疾病的筛查及确认检测。

申请人在以SCT法进行实验的过程中，意外发现了肝素中和剂影响SCT液体试剂的长期稳定性，为了克服该缺陷，进行了大量的有关试剂盒组分的单因素实验，最终发现影响试剂长期稳定的组分为二氧化硅和磷脂，将肝素中和剂与二氧化硅或磷脂在液态下混合会产生浑浊和沉降，这是因为肝素中和剂为具有吸附性的阳离子聚合物，二氧化硅和磷脂均是阴离子混合物，当肝素中和剂与二氧化硅和磷脂混合后，极易发生阴阳离子聚合反应，进而出现浑浊和沉降。为了延长SCT液体试剂的稳定性，申请人在筛选试剂和确认试剂中不添加肝素中和剂，同时为了使其具有较强的抗干扰能力，将肝素中和剂添加在了单独包装的氯化钙溶液中，将肝素中和剂与筛选试剂或确认试剂进行分离，从而延长其稳定性，且又保持了抗干扰能力。

为了达到本申请的技术目的，本申请具体通过以下技术方案实现：

本申请提供了一种基于SCT法检测狼疮抗凝物的试剂盒，所述试剂盒包括筛选试剂、确认试剂和氯化钙水溶液；

所述筛选试剂或确认试剂由二氧化硅、磷脂、缓冲剂、保护剂、离子强度调节剂、重金属离子螯合剂、防腐剂和水组成；所述筛选试剂中的磷脂含量低于所述确认试剂中的磷脂含量；所述氯化钙水溶液中含有肝素中和剂。

本申请试剂盒将肝素中和剂添加在氯化钙水溶液中，在储存时，避免了肝素中和剂直接与磷脂或二氧化硅混合发生阴阳离子聚合反应而产生浑浊和沉降，确保了试剂盒中筛选试剂和确认试剂的稳定性。本申请试剂盒在使用时，将待测样本与磷脂、二氧化硅混合，然后添加钙离子，在钙离子的参与下二氧化硅可以激活样本中的凝血因子，从而激发凝血过程，观察样本凝固所需的时间。筛选试剂用以检测含有少量磷脂的凝血实验，确认试剂用以检测含有过量磷脂的凝血实验，当存在狼疮抗凝物时，筛选凝血时间延长而确认凝血时间正常，其比值升高。

作为本申请的一个实施方案，为了确保氯化钙水溶液的均一性，以及检测试剂的准确度，所述氯化钙水溶液按重量含量由以下组分组成：二水氯化钙3‰～5‰、肝素中和剂1％～3％、防腐剂0.2‰～1‰，水补足余量。

在上述方案中，本申请试剂盒质控血浆的测试值可以落在质控范围内，并且阴/阳性质控测试值均接近靶值，表现出了极高的准确性。

优选的，为了进一步提高试剂盒的检测精度和稳定性，所述氯化钙水溶液按重量含量由以下组分组成：氯化钙(含二结晶水)3.6‰、肝素中和剂2.5％、防腐剂0.8‰，水补足余量。

作为本申请的一个实施方案，所述的筛选试剂按重量含量由以下组分组成：二氧化硅0.5‰～1.5‰、磷脂0.08‰～0.2‰、缓冲剂0.5％～3％、保护剂8％～12％、离子强度调节剂0.8‰～3‰、重金属离子螯合剂1.5‰～7.5‰、防腐剂0.2‰～1‰，水补足余量。

优选的，所述的筛选试剂按重量含量由以下组分组成：二氧化硅1‰、磷脂0.1‰、缓冲剂1.5％、保护剂10％、离子强度调节剂1.2‰、重金属离子螯合剂1.8‰、防腐剂0.8‰，水补足余量。

作为本申请的一个实施方案，所述确认试剂按重量含量由以下组分组成：二氧化硅0.5‰～1.5‰、磷脂0.1‰～8‰、缓冲剂0.5％～3％、保护剂8％～12％、离子强度调节剂0.8‰～3‰、重金属离子螯合剂1.5‰～7.5‰、防腐剂0.2‰～1‰，水补足余量。

优选的，所述确认试剂按重量含量由以下组分组成：二氧化硅1‰、磷脂6‰、缓冲剂1.5％、保护剂10％、离子强度调节剂1.2‰、重金属离子螯合剂1.8‰、防腐剂0.8‰，水补足余量。

在上述筛选试剂和确认试剂的方案中，通过保护剂和重金属离子螯合剂的使用可以在不影响反应体系敏感性的前提下，提高筛选试剂的稳定性。其中，保护剂可以抑制试剂溶液中的非特异性吸附和聚集，降低沉淀的发生。重金属离子螯合剂可以螯合试剂中带正电荷的重金属离子，减少溶液中重金属离子与有效成分的阴阳离子的聚合反应。保护剂和重金属离子螯合剂的联合协同作用，极大的提高了试剂的外观特性和功能稳定性。

作为本申请的一个实施方案，所述肝素中和剂选自聚丙烯酰胺、凝聚胺或鱼精蛋白中之一种。

作为本申请的一个实施方案，所述磷脂选自兔脑磷脂、卵磷脂、猪脑磷脂、牛脑磷脂、大豆磷脂、花生磷脂或合成磷脂等中之一种。

作为本申请的一个实施方案，所述缓冲剂选自Tris缓冲液、Hepes缓冲液、PBS缓冲液、MES缓冲液、咪唑缓冲液、MOPS缓冲液或柠檬酸缓冲液中之一种。

作为本申请的一个实施方案，所述筛选试剂和确认试剂通过所述缓冲剂调节pH值为7.4～7.6。

作为本申请的一个实施方案，所述保护剂为甘氨酸，甘氨酸为非极性氨基酸，不与阴离子混合物(二氧化硅、磷脂)发生聚合反应，保证有效成分的效能，且避免沉淀的发生。

作为本申请的一个实施方案，所述离子强度调节剂选自NaCl、KCl或MgCl

作为本申请的一个实施方案，所述重金属离子螯合剂为氯化铝。

作为本申请的一个实施方案，所述防腐剂选自叠氮钠、苯甲酸钠、硫柳汞钠、PC950、山梨酸钾、庆大霉素、乳酸钠或亚硝酸盐中之一种。

本申请的有益效果为：

本申请提供了一种基于SCT法检测狼疮抗凝物的试剂盒，通过将肝素中和剂添加在氯化钙水溶液中，避免了肝素中和剂与磷脂和二氧化硅发生阴阳离子聚合反应而产生浑浊和沉降，以提高试剂盒的储存稳定性。同时在筛选试剂和确认试剂中添加了保护剂和重金属离子螯合剂，通过其协同作用进一步提高筛选试剂和确认试剂的稳定性。最终本申请试剂盒具有优良的稳定性，效期稳定性、开瓶稳定性、在机稳定性均优于同类品试剂盒。

另外，建立了以氯化钙水溶液添加肝素中和剂的试剂体系，保证了试剂盒的抗干扰性能，经试验证明本申请试剂盒抗普通肝素的浓度可达到1.2U/mL、抗低分子肝素的浓度可达到2.0U/mL、抗利伐沙班的浓度可达到160ng/mL、抗达比加群的浓度可达到140ng/mL，抗干扰性能优于同类品试剂盒。

因此，本申请为临床诊断治疗系统性红斑狼疮及抗磷脂综合征类疾病提供可靠的检测方法，可实现进口替代，有利于在市场上进一步推广使用。

附图说明

图1是本发明试剂与市售同类试剂效期、开瓶和在机稳定性相关曲线示意图；

图2是本发明试剂与市售同类试剂抗普通肝素、低分子肝素、利伐沙班和达比加群干扰相关曲线示意图。

具体实施方式

下面将结合本申请具体的实施例，对本申请技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请的保护的范围。

本申请提供了一种基于SCT法检测狼疮抗凝物的试剂盒，所述试剂盒包括筛选试剂、确认试剂和氯化钙水溶液。为了克服现有SCT试剂存在稳定性差的情况，该试剂盒的筛选试剂和确认试剂体系中未添加肝素中和剂，避免了肝素中和剂与二氧化硅和磷脂发生阴阳离子聚合反应，使得筛选试剂和确认试剂可以稳定的长时间存储。同时为了使得该试剂盒同样具有较强的抗干扰能力，申请人将肝素中和剂添加于氯化钙水溶液中，形成了一种基于SCT法检测狼疮抗凝物的新体系。

在本申请的一个具体实施例中，所述筛选试剂由二氧化硅、磷脂、缓冲剂、保护剂、重金属离子螯合剂和水组成，将待测样本和筛选试剂混合后，然后添加氯化钙水溶液，筛选试剂中的磷脂与二氧化硅可以激活待测样本的内源性凝血系统凝血因子，然后在钙离子存在的条件下触发凝血过程，从而检测到待测样本的凝血时间，由于筛选试剂中含少量的磷脂，当待测样本中存在狼疮抗凝物时，作为免疫球蛋白的狼疮抗凝物，可以结合磷脂复合物，从而抑制磷脂表面凝血机制干扰依赖磷脂的凝血过程，造成筛选凝血时间的延长。

其中，在筛选试剂中添加保护剂，可以抑制试剂溶液中的非特异性吸附和聚集，减慢反应、保持化学平衡、降低表面张力、防止光热分解或氧化分解等，增加溶液的稳定性能，从而使得筛选试剂体系的性能长时间稳定，提高检测的准确性。重金属离子螯合剂则可以螯合试剂体系中存在的重金属离子，减少水溶液中重金属离子与有效成分的阴阳离子的聚合反应，也能减少重金属离子造成酶等蛋白的变性，提高了试剂体系的稳定性。

优选的，所述磷脂可以是兔脑磷脂、卵磷脂、猪脑磷脂、牛脑磷脂、大豆磷脂、花生磷脂或合成磷脂等中之一种。更优选的，在本实施例中，所述磷脂为兔脑磷脂，申请人发现兔脑磷脂有助于增强筛选试剂的稳定性，和延长保质期。

优选的，所述保护剂为甘氨酸，甘氨酸为非极性氨基酸，不与阴离子混合物(二氧化硅、磷脂)发生聚合反应，保证有效成分的效能，且避免沉淀的发生。相比其它保护剂，比如聚乙二醇2000、Span－80、BSA、HSA、明胶、吐温－20、海藻糖、葡萄糖、β－环糊精或甘露醇等表现出了良好的稳定性。

优选的，选用氯化铝作为重金属离子螯合剂，在筛选试剂和确认试剂中添加氯化铝可以螯合试剂中的重金属离子，减少了试剂中含有的重金属离子与二氧化硅和磷脂产生聚合反应，从而进一步提高筛选试剂和确认试剂的稳定性。而且选用氯化铝作为螯合剂可以避免螯合剂对溶液中存在的离子强度调节剂产生螯合或络合作用，从而不会影响试剂的活性，有助于提高检测的准确性。

在本实施例中，所述确认试剂体系与所述筛选试剂相同，不同之处在于所述筛选试剂中的磷脂含量低于所述确认试剂中的磷脂含量。

优选的，所述筛选试剂中所述磷脂的重量百分含量为0.08‰～0.2‰，所述确认试剂中所述磷脂的重量百分含量为0.1‰～8‰。更优选的，所述筛选试剂中所述磷脂的重量百分含量为0.1‰，所述确认试剂中所述磷脂的重量百分含量为6‰。通过筛选试剂与确认试剂磷脂含量设置，极大的提高了阳性样本的检出率，降低了假阴性的检测结果，有助于临床的推广和应用。

在本实施例中，所述氯化钙水溶液中含有肝素中和剂，所述肝素中和剂的浓度为1％～3％，建立了氯化钙水溶液中添加肝素中和剂的检测体系，在该浓度下，本申请试剂盒对抗肝素/低分子肝素干扰、抗利伐沙班干扰、抗达比加群干扰性能好，表现出了卓越的抗干扰能力。

优选的，所述肝素中和剂可以是聚丙烯酰胺、凝聚胺或鱼精蛋白中之一种。

在本实施例中，进一步的，所述筛选试剂和确认试剂中还添加了缓冲剂、离子强度调节剂和防腐剂。所述氯化钙水溶液中添加了防腐剂。

其中，所述缓冲剂可以是Tris缓冲液、Hepes缓冲液、PBS缓冲液、MES缓冲液、咪唑缓冲液、MOPS缓冲液或柠檬酸缓冲液中之一种。在本实施例中，所述缓冲液为咪唑缓冲液，利用咪唑缓冲液将筛选试剂或确认试剂调节至pH值为7.4～7.6，试剂体系保持了有较好的外观特性和性能稳定特性。

所述离子强度调节剂可以是NaCl、KCl或MgCl

所述防腐剂可以是叠氮钠、苯甲酸钠、硫柳汞钠、PC950、山梨酸钾、庆大霉素、乳酸钠或亚硝酸盐中之一种。在本实施例中，所述防腐剂为PC950，通过防腐剂的添加实现对试剂体系防腐效果，防止随着试剂的多次开盖使用，造成微生物对试剂的污染，有利于延长试剂盒的储存有效期，同时对试剂的稳定性也具有一定的作用。

本实施例中筛选试剂和确认试剂的组分功能单元精简，并且每种功能单元只包括单一组分，即缓冲剂、保护剂、离子强度调节剂、重金属离子螯合剂、防腐剂。而其他同类品试剂，组分功能单元多包括缓冲剂、防冻剂、稳定剂、保护剂、凝血因子保护剂、表面活性剂、离子调节剂、抗氧化剂、防腐剂及溶菌酶类等，并且每种功能单元常包含多种组分。本发明试剂盒精简功能单元及相应组分，简化了配制工艺，降低了生产成本。

在本实施例中，优选的，所述筛选试剂按重量含量由以下组分组成：二氧化硅0.5‰～1.5‰、磷脂0.08‰～0.2‰、缓冲剂0.5％～3％、保护剂8％～12％、离子强度调节剂0.8‰～3‰、重金属离子螯合剂1.5‰～7.5‰、防腐剂0.2‰～1‰，水补足余量。更优选，所述筛选试剂按重量含量由以下组分组成：二氧化硅1‰、磷脂0.1‰、缓冲剂1.5％、保护剂10％、离子强度调节剂1.2‰、重金属离子螯合剂1.8‰、防腐剂0.8‰，水补足余量。最优选的，所述筛选试剂按重量含量由以下组分组成：二氧化硅1‰，磷脂0.1‰，咪唑1.5％，甘氨酸10％，氯化钠1.2‰，氯化铝1.8‰，PC950 0.8‰，pH为7.4～7.6，余量为水。

优选的，所述确认试剂按重量含量由以下组分组成：二氧化硅0.5‰～1.5‰、磷脂0.1‰～8‰、缓冲剂0.5％～3％、保护剂8％～12％、离子强度调节剂0.8‰～3‰、重金属离子螯合剂1.5‰～7.5‰、防腐剂0.2‰～1‰，水补足余量。更优选的，所述确认试剂按重量含量由以下组分组成：二氧化硅1‰、磷脂6‰、缓冲剂1.5％、保护剂10％、离子强度调节剂1.2‰、重金属离子螯合剂1.8‰、防腐剂0.8‰，水补足余量。最优选的，所述确认试剂按重量含量由以下组分组成：二氧化硅1‰，磷脂0.6％，咪唑1.5％，甘氨酸10％，氯化钠1.2‰，氯化铝1.8‰，PC950 0.8‰，pH为7.4～7.6，余量为水。

优选的，所述氯化钙水溶液按重量含量由以下组分组成：氯化钙(含二结晶水)3‰～5‰、肝素中和剂1％～3％、防腐剂0.2‰～1‰，水补足余量。更优选的，所述氯化钙水溶液按重量含量由以下组分组成：氯化钙(含二结晶水)3.6‰、肝素中和剂2.5％、防腐剂0.8‰，水补足余量。最优选的，所述氯化钙水溶液按重量含量由以下组分组成：氯化钙(含二结晶水)3.6‰，肝素中和剂2.5％，PC950 0.8‰，余量为水。

作为本申请的另一个具体实施例，提供了上述试剂盒的检测狼疮抗凝物的方法，待测样本(待测成分的质量体积浓度为90％)与所述试剂制得的激活制剂(本发明提供的试剂的质量体积浓度为4.98％)的体积比为1:1，包括以下步骤：

①制备待测样本：样本1500g，离心10分钟，转移上清，重复1500g，离心10分钟，留上清待测；

②制备正常人混合血浆(NPP)：40例表观正常人(男女各半，年龄17－70岁)血浆，每个样本1500g×10分钟，离心2次，取上清，最后将这40例离心后的血浆样本混合。

③取所述待测样本与所述SCT筛选试剂按照1:1的体积比混合，于37℃预温180s，再与等体积的氯化钙溶液混合，检测待测样本筛选时间(S

④取所述待测样本与所述SCT确认试剂按照1:1的体积比混合，于37℃预温180s，再与等体积的氯化钙溶液混合，检测待测样本确认时间(C

⑤取所述NPP与所述SCT筛选试剂按照1:1的体积比混合，于37℃预温180s，再与等体积的氯化钙溶液混合，检测NPP筛选时间(S

⑥取所述NPP与所述SCT确认试剂按照1:1的体积比混合，于37℃预温180s，再与等体积的氯化钙溶液混合，检测NPP确认时间(C

⑦计算：

筛选比值(SR)＝待测样本筛选时间(S

确认比值(CR)＝待测样本确认时间(C

标准化比值(NR)＝筛选比值(SR)/确认比值(CR)。

下面结合具体的试剂盒和实验对本申请技术方案和效果进行进一步的说明。

实施例1～6

二氧化硅溶液加入磷脂、保护剂、离子强度调节剂、重金属离子螯合剂、防腐剂搅拌均匀，再加入缓冲剂调节pH至7.4～7.6后定容即得筛选试剂或确认试剂。称取二水氯化钙、肝素中和剂和防腐剂于水中混合搅拌定容即得氯化钙水溶液。分别将定量的筛选试剂、确认试剂和氯化钙水溶液单独包装，组装制得试剂盒。

表1试剂盒中筛选试剂、确认试剂和氯化钙水溶液的组成

对以上不同浓度配比的实施例1～6试剂体系静置72h后，分别用质控血浆检测对应的标准化比值，每个实施例的试剂分别检测三次后取平均值，对比不同实施例试剂体系的NR情况。本实验选用的阴性质控为HemosIL LA Negative Control，靶值及范围是0.98(＜1.16)，选用的阳性质控为HemosIL LA Positive Control，靶值及范围是3.20(≥1.16)。相关实验数据如下表2所示。

表2实施例1～6不同浓度配比试剂盒检测质控血样的NR情况

结合表1和表2可知，实施例1～6的试剂盒体系静置一段时间后，试剂的外观均呈现为均一溶液，说明试剂盒的试剂体系具有优良的稳定性。通过对质控血浆的检测显示，实施例1～6的试剂盒体系质控测试值均处于质控范围内，且阴/阳性质控测试值均接近靶值，说明了本申请试剂盒具有较好的准确性，同时也间接证明了具有良好的稳定性。其中以实施例1试剂体系的测试值与靶值的偏差最小，说明实施例1试剂配比是本申请的最佳实施方案。

实施例7不同浓度甘氨酸和氯化铝的添加对试剂体系稳定性的影响以实施例1试剂体系为基础，分别设置不添加甘氨酸和/或氯化铝、添加不同浓度的甘氨酸和/或氯化铝的实验组，每个实验组设置三个平行对照组，静置72h后，用质控血浆检测不同甘氨酸和/或氯化铝浓度配比下试剂体系对应的标准化比值，取平均值，对比不同甘氨酸和/或氯化铝浓度条件下试剂的NR情况。本实验选用的阴性质控为HemosIL LA Negative Control，靶值及范围是0.98(＜1.16)，选用的阳性质控为HemosIL LA Positive Control，靶值及范围是3.20(≥1.16)。实验结果数据如下表3所示。

表3不同浓度甘氨酸和氯化铝的添加对试剂体系稳定性的影响

由表3数据可知，实验组1试剂中由于未添加甘氨酸和氯化铝，经72h后均外观产生了不同程度的沉淀，且利用该试剂对质控血浆进行检测时，测试值超出了质控血浆的范围，严重影响检测试剂的准确性。而同时添加了(8％～12％)甘氨酸和(1.5‰～7.5‰)氯化铝的实验组2和3经72h静置后，外观依然保持良好，对质控血浆进行检测后显示，测试值落在质控范围内，并且阴/阳性质控测试值均接近靶值。实验组4只添加了氨基酸，而未添加氯化铝，72h静置后外观产生稍微的浑浊，说明添加氯化铝有助于提高试剂的稳定性，这是由于氯化铝可以螯合试剂中存在的少量带正电荷的重金属离子，由于氯化铝的强螯合作用，减少了重金属阳离子与二氧化硅和磷脂聚合反应，从而实现稳定试剂的目的。实验组4对质控血浆进行检测后显示，其与靶值的偏差小于实施例1，而大于实施例2和3，也间接证明了氯化铝对试剂体系的稳定作用。

实施例8肝素中和剂对筛选试剂和确认试剂稳定性的影响

以实施例1试剂体系为基础，设置在筛选试剂、确认试剂和氯化钙溶液中分别添加不同浓度肝素中和剂的实验组，每个实验组设置三个平行对照组，静置72h后，用质控血浆检测不同甘氨酸和/或氯化铝浓度配比下试剂体系对应的标准化比值，取平均值，对比不同甘氨酸和/或氯化铝浓度条件下试剂的NR情况。本实验选用的阴性质控为HemosIL LANegative Control，靶值及范围是0.98(＜1.16)，选用的阳性质控为HemosIL LA PositiveControl，靶值及范围是3.20(≥1.16)。实验结果数据如下表4所示。

表4肝素中和剂对筛选试剂和确认试剂稳定性的影响

由表4数据可知，将肝素中和剂加入到筛选试剂和确认试剂中，会发生阴阳离子聚合反应产生沉淀，并且其质控血浆的测试值不在质控范围内。而将(1％～3％)肝素中和剂加入到氯化钙溶液中后，筛选试剂和确认试剂的外观均保持为均一状态，说明肝素中和剂是造成筛选试剂和确认试剂产生沉淀的主要原因，这是由于肝素中和剂为具有吸附性的阳离子聚合物，二氧化硅和磷脂为阴离子混合物，如在筛选试剂和确认试剂中将以上三种物质混合，极易发生阴阳离子聚合反应，进而出现浑浊和沉降。

同时实验组6和7在氯化钙溶液中添加了不同含量的肝素中和剂，证明在重量含量1％～3％内，试剂盒的质控检测结果均保持在质控范围内，并且阴/阳性质控测试值均接近靶值。

实施例9本申请试剂盒的稳定性测试

根据临床检测的实际情况，测试实施例1试剂和市售试剂盒37℃加速29天稳定性、开瓶后2℃～8℃冷藏130天稳定性、开瓶后16℃在机15天稳定性，测试方法为利用阴性质控血浆检测凝血时间，本实验选用的阴性质控为HemosIL LA Negative Control，每个检测重复三次取平均值，进而比较施例1试剂和市售同类试剂的稳定性能。企业标准要求试剂在监测期内的测试值偏差不超过±2s，可判定为合格。

1)37℃加速试验模拟试剂效期的稳定性情况

表5试剂置于37℃/29天的测试值

由表5可知，本申请试剂盒的试剂在37℃条件下，第1～23天期间内的凝血时间与第一天凝血时间的偏差均保持在1s以内，29天内的最大偏差为1.6s；而市售筛选试剂在第三天的偏差即超过了1s，在第23天偏差达到了15.6，29天内的最大偏差为32.7s。结合图1中A，证明本申请试剂盒在37℃条件下的稳定性远远好于市售试剂盒。

2)模拟试剂开瓶后2～8℃冷藏的稳定性情况

表6试剂开瓶后置于2～8℃/130天的测试值

由表6可知，本申请试剂盒的试剂开瓶后在2～8℃条件下储存，第130天期间内的凝血时间与第一天凝血时间的偏差均保持在1s以内，最大偏差为0.7s；而市售筛选试剂在第30天的偏差即超过了1s，130天内的最大偏差为6.4s。结合图1中B，证明本申请试剂盒在2～8℃条件下的稳定性远远好于市售试剂盒。

3)模拟试剂开瓶后16℃在机的稳定性情况

表7试剂开瓶后置于16℃/15天的测试值

由表7可知，本申请试剂盒的试剂开瓶后在机16℃条件下，第15天期间内的凝血时间与第一天凝血时间的偏差均保持在1s以内，最大偏差为0.6s；而市售筛选试剂在第7天的偏差即超过了1s，15天内的最大偏差为6.6s。结合图1中C，证明本申请试剂盒在16℃在机条件下的稳定性远远好于市售试剂盒。

综上，本申请试剂在监测期内的检测结果均达到企业标准要求(检测值前后不超过2.0s)，综合判定为合格，并且本申请试剂37℃加速29天稳定性、开瓶后2℃～8℃冷藏130天稳定性、开瓶后16℃在机15天稳定性的检测值偏差均远远小于市售试剂的检测值偏差，即本申请试剂的稳定性优于市售同类试剂。

实施例10本申请试剂盒与市售试剂盒的阳性样本检出率比较将实施例1试剂与市售同类试剂对狼疮抗凝物阳性临床样本进行对比分析，评估对应试剂体系对狼疮抗凝物的响应情况。本实验分为市售试剂组和实施例1试剂组，分别对30个狼疮抗凝物阳性临床样本进行相关检测，每个样本重复检测两次，分别记录每组检测的均值。

表8实施例1与市售同类品试剂盒的狼疮抗凝物阳性检出率

由表8可知，实施例1试剂对临床上狼疮抗凝物阳性样本的检出率为96.7％，与临床原值的相关性(r)可达到0.99， 比市售同类试剂的检测值更接近于临床检测原值，说明本发明试剂体系对狼疮抗凝物的响应好，可用于临床狼疮抗凝物检测。

实施例11 本申请试剂的抗干扰能力

本实验分组为市售试剂和实施例1试剂组，每组随机选取2个试剂对含有不同浓度干扰物的阴性质控血浆进行检测，对比不同浓度干扰物含量对试剂的NR影响，其中，阴性质控为HemosIL LA Negative Control，靶值及范围是0.98(＜1.16)，每个试剂重复检测两次，分别计算每组检测值的均值、每组均值与未用药组的偏差，进而评估对抗凝药的抗干扰能力。

表9 实施例1与市售试剂的对抗凝药的抗干扰能力

由表9可知，实施例1试剂对肝素的抗干扰能力达到1.0U/mL，对低分子肝素的抗干扰能力达到2.0U/mL，对利伐沙班的抗干扰能力达到160ng/mL，对达比加群的抗干扰能力达到140ng/mL。结合图2，可以证明本申请试剂盒相比市售试剂盒对普通肝素、低分子肝素、利伐沙班、达比加群具有卓越的抗干扰能力。