基于小卫星DNA标记Trip-yark01的叶尔羌高原鳅基因型检测方法

技术领域

本发明属于叶尔羌高原鳅（

背景技术

叶尔羌高原鳅（

小卫星DNA (Minisatellite DNA)是一种重复DNA小序列，核心序列为10到几百核苷酸的重复，拷贝数10~1000不等。因此，小卫星DNA又称作数目可变串联重复序列(Variable Number of Tandem Repeats，VNTR )。虽然同工酶标记、RAPD标记及AFLP标记技术也可以用于研究叶尔羌高原鳅的遗传结构及其遗传多样性，然而由于这些标记都属于显性遗传标记，检测效率不如小卫星DNA标记等共显性标记高。另外，同工酶标记的缺点是多态性低， RAPD标记的稳定性不好，AFLP标记操作繁琐，这些都大大限制了它们的应用。而小卫星DNA序列广泛分布于真核生物基因组中，其特点是种类多，等位基因数目多，多态性高，共显性，孟德尔遗传方式，并随机分布于基因组中，而且小卫星DNA标记检测效率高，结果稳定。但由于缺乏叶尔羌高原鳅小卫星DNA标记，限制了其分子遗传学研究的发展，所以迫切需要获取小卫星DNA标记以进行叶尔羌高原鳅遗传多样性、个体识别和系谱认证等方面的研究和应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种高多态性的叶尔羌高原鳅DNA分子遗传标记技术，即叶尔羌高原鳅小卫星DNA标记Trip-yark01的快速检测方法，以弥补已有技术的不足。

本发明的基本构思主要是利用叶尔羌高原鳅DNA序列中含有的小卫星DNA核心序列，在其两端设计特异性引物并进行PCR检测，从而快速地检测叶尔羌高原鳅每个个体在此小卫星DNA区的遗传变异，获得该引物（小卫星DNA标记Trip-yark01）对叶尔羌高原鳅的多态性图谱，通过图谱直观地检测出每个个体的基因型。基于上述背景现状和实际要求，本发明从叶尔羌高原鳅DNA序列中获取了一个小卫星DNA标记，命名为Trip-yark01，该小卫星DNA标记Trip-yark01可用于叶尔羌高原鳅遗传多样性分析和系谱认证。

本发明是按照以下操作技术方案完成的：首先提取叶尔羌高原鳅肌肉中的基因组DNA并稀释备用；再利用叶尔羌高原鳅基因组DNA序列中含有的小卫星DNA核心序列，在其序列两端设计特异性引物；然后使用该引物对叶尔羌高原鳅不同地理群或叶尔羌高原鳅群内个体的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，从而确定每个个体的基因型，获得叶尔羌高原鳅的遗传多态性图谱。

提取叶尔羌高原鳅基因组DNA，将其稀释为100ng/μl，每个PCR反应中加入1μl，反应总体积为25μl。

含有小卫星DNA序列的DNA序列为：

aaagggtgtttgactatttatgtacaatagatttacaattgaggagtttagggttcctgcatccggcacactggggttgtcccaaaaccctcccgcacttgattagcgccccatttagctggttaattgttatagcatagtattattatcagccttaactttggtcccgtctctagcagcattcagggcattagctattcagggcattagctattcagggcattagctattcagggcattagctattcagggcattagctattcagggcattagctattcagggcattagctattcagggcattagctattcagggcattagctattcagggcattagctattcagggcattagctattcagggcattagctattcagggcattagctattcagggcattagctattcagggcattagctattcagggcattagctattcagggcattagctattcagggcattagctattcagggcattagctattcagggcattagctctggtggtcgtcaacaaagaacctgtccaaaggcatgcggatgaaacgggtgaagctcaagctgaaggttgttagacagagctgctgctgctgctgctgctgctgctgctgaatacatgatctttcgcctgacgactactctgttccctggggcactgccagcctttagccgctgctgca

其中小卫星DNA核心序列为：ATTCAGGGCATTAGCTATTCAGGGCATTAGCTATTCAGGGCATTAGCTATTCAGGGCATTAGCTATTCAGGGCATTAGCTATTCAGGGCATTAGCTATTCAGGGCATTAGCTATTCAGGGCATTAGCTATTCAGGGCATTAGCTATTCAGGGCATTAGCTATTCAGGGCATTAGCTATTCAGGGCATTAGCTATTCAGGGCATTAGCTATTCAGGGCATTAGCTATTCAGGGCATTAGCTATTCAGGGCATTAGCTATTCAGGGCATTAGCTATTCAGGGCATTAGCTATTCAGGGCATTAGCTATTCAGGGCATTAGCT。

Trip-yark01小卫星DNA引物序列为：

正链5’- atcagccttaactttggtcccgt -3’，

负链5’- atccgcatgcctttggacaggt -3’，使用该引物时的退火温度为55℃。

小卫星DNA核心序列和引物序列是本发明的核心，在叶尔羌高原鳅遗传多样性检测中呈现高度多态性。

PCR扩增的加样参数为：每个PCR反应总体积为25μl，包括100ng叶尔羌高原鳅基因组DNA；10×PCR Buffer，2.5μl；Mg

PCR产物的检测步骤：将PCR产物在8％的变性聚丙烯酰胺凝胶中以15W恒功率电泳1.5小时进行分离。电泳结束后，首先用10％的冰醋酸溶液浸泡30min，然后蒸馏水冲洗5min，再以0.1％的硝酸银溶液浸泡30min，用3％的碳酸钠溶液显色5min，最后用10％的冰醋酸溶液浸泡5min，即可得到叶尔羌高原鳅小卫星DNA标记Trip-yark01的多态性图谱。

因此, 本发明的特点是可快捷的获得叶尔羌高原鳅的Trip-yark01小卫星DNA标记的遗传变异图谱，方法简便。而且，相对于其它分子遗传标记技术而言，小卫星DNA标记符合孟德尔遗传模式，呈共显性遗传，所得结果可直观地检测出叶尔羌高原鳅每个个体的基因型；而应用于不同地理群或叶尔羌高原鳅群内个体间遗传标记、系谱认证和遗传图谱的构建等。

附图说明

图1是本发明小卫星DNA标记Trip-yark01对叶尔羌高原鳅26个个体的检测图谱(编号1—26是叶尔羌高原鳅的26个个体)。

具体实施方式

下面通过实施例详细叙述本发明在叶尔羌高原鳅Trip-yark01小卫星DNA核心序列DNA分子遗传标记技术方法。首先提取叶尔羌高原鳅肌肉中的基因组DNA并稀释备用；再利用叶尔羌高原鳅DNA序列中含有的小卫星DNA核心序列，在其序列两端设计特异性引物；然后使用该引物对叶尔羌高原鳅不同地理群或叶尔羌高原鳅群内个体的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，确定每个个体的基因型，即获得叶尔羌高原鳅的遗传多态性图谱。

1、叶尔羌高原鳅基因组DNA的提取：将100µg叶尔羌高原鳅肌肉加入Eppendorf管中，再加入细胞裂解液 500µl和20mg/ml的蛋白酶K 5µl，轻轻摇匀，37℃过夜。然后在裂解好的样品中加入600µl酚氯︰仿︰异戊醇（25︰24︰1）混合液，晃动20min后12000rpm 离心10min，取上清液。再加入酚︰氯仿︰异戊醇混合液，重复上述操作3次。再取上清液，加入2倍体积冷却的无水乙醇和1/10体积的3mol/L的醋酸钠，12000rpm 离心10min，弃去上清液，保留DNA沉淀，再用70％乙醇洗涤该沉淀2次，待乙醇挥发完全后，以TE 缓冲液溶解DNA，并稀释为100ng/μl，4℃保存。

2、小卫星DNA引物的设计：在叶尔羌高原鳅DNA序列基础上，利用小卫星DNADNA两侧的序列在同一物种相对于核心序列的高度保守性，据此在其两端设计特异性引物，用其扩增出该位点的小卫星DNA片段。由于小卫星DNA核心序列突变率相对较高，造成小卫星DNADNA核心序列重复次数的增加或减少，即小卫星DNADNA序列长度的变化，这是检测小卫星DNA多态性的根源。本发明的小卫星DNA区核心序列两端的特异性引物序列为：正链5’-atcagccttaactttggtcccgt -3’，负链5’- atccgcatgcctttggacaggt -3’，使用该引物时的退火温度为55℃。

3、PCR扩增：首先加样，加样量如下：叶尔羌高原鳅基因组DNA(100ng／L)，1μl；10×PCR Buffer，2.5μl；Mg

4、PCR产物的检测：将PCR产物在8％的变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，电泳仪功率为15W，电泳时间为1.5小时左右。电泳结束后，首先用10％的冰醋酸溶液浸泡30min，然后蒸馏水冲洗5min，0.1％的硝酸银溶液浸泡30min，3％的碳酸钠溶液显色5min，最后用10％的冰醋酸溶液浸泡5min即可得到叶尔羌高原鳅在Trip-yark01小卫星DNA核心序列的多态性图谱，如图1所示。图1结果表明，叶尔羌高原鳅的26个个体共扩增出15个等位基因，说明小卫星DNA标记Trip-yark01具有较高的多态性，适合进行叶尔羌高原鳅遗传多样性和遗传结构分析、个体识别和系谱认证等方面的研究和应用。