一种小核糖核酸属病毒的检测引物和检测方法

技术领域

本发明属于病原微生物技术领域，具体涉及一种小核糖核酸属病毒的检测引物和检测方法。

背景技术

世界各地的农作物和水果等农产品都受到各种病原体的危害，包括致病真菌、细菌和病毒。在包括上述真菌和细菌在内的所有植物病原体中，病毒是导致水果质量和产量严重损失的主要病原体。昆虫是携带和传播农作物和水果病原体的重要媒介。同翅目昆虫

小核糖核酸属病毒

发明内容

本发明的目的在于提供一种小核糖核酸属新病毒的检测引物和检测方法。本发明所述的小核糖核酸属新病毒为

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：

一种小核糖核酸属病毒的检测引物，所述的小核糖核酸属病毒基因组全长序列如SEQ ID NO.1所示；所述引物的核苷酸序列如下所示：

LYJ-H-F：5’-GGTCTATGCTGTATCCAAA-3’，

LYJ-H-R：5’-ATATTGTCAAGCTGGTGAG-3’。

进一步的，上述引物LYJ-H-F/LYJ-H-R对小核糖核酸属病毒

一种检测上述小核糖核酸属病毒的方法，所述方法包括如下步骤：

1）提取待测样本的RNA，反转录成cDNA；

2）以步骤1）反转录得到的cDNA作为模板，利用权利要求1所述的引物按如下PCR反应体系和反应条件对病毒进行检测：

PCR反应体系：

；

PCR反应条件：

；

3）将步骤2）得到的PCR产物进行琼脂凝胶电泳，根据电泳后的条带大小鉴定样品模板中是否存在所述小核糖核酸属病毒。

本发明的有益效果在于：

（1）本发明获得了小核糖核酸属病毒

（2）本发明鉴定小核糖核酸属病毒

附图说明

图1是本发明从RNA-seq所获序列通过SnapGene与NCBI上序列比对图；

图2是本发明利用MEGA X构建的系统发育树；

图3是本发明小核糖核酸属代表性病毒进化树的构建图；

图4是本发明从采集的同翅目昆虫龙眼鸡样本中鉴定龙眼鸡中是否存在小核糖核酸属病毒

具体实施方式

以下结合具体实施例进一步阐述本发明，但本发明的保护内容并不局限于下述具体实施例。下述实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特别说明，均购自常规生化试剂商店。

实施例1 利用宏基因组学鉴定小核糖核酸属病毒

样本采集：从福建省农业科学院研究所，福建农林大学，以及福建省福州市闽侯县3个地区采集同翅目昆虫龙眼鸡样本。采集过程中均使用一次性用具以避免样本交叉污染。

样本的处理及总核酸的提取：采用氯仿-异丙醇核酸提取法提取所采集的同翅目昆虫龙眼鸡样本的总RNA，用TransScript®试剂盒将提取的RNA反转录为cDNA，送北京基因组研究所建库测序。

建库和测序：利用DNaseI降解DNA后，用Ribo-ZeroTM试剂盒从总RNA中去除核糖体RNA。具体过程为：利用polyA的特性，通过连接在磁珠上的oligo-dT探针去除编码序列（mRNA），并最大程度地保留所有ncRNA。NEB裂解缓冲液与保留的ncRNA混合，将RNA切割成250至300 bp的短片段。然后，以随机六聚体为引物合成第一条cDNA链，在Thermomixer中加入缓冲液、dNTPs、RNase H和DNA聚合酶I进一步合成第二条cDNA链，并用AMPure XP珠纯化。在双链cDNA末端加入A- Tailing Mix进行修复，在其3′末端加入A碱基。然后，加入连接物混合液将连接物与cDNA连接，连接产物用磁珠纯化回收。将回收的cDNA放入PCR混合液中扩增建立文库，用Qubit2.0荧光仪定量文库浓度，将文库稀释至1.5 ng / µ L，同时用Agilent 2100生物分析仪测定文库质量。将符合条件的文库加入NaOH变性成单链，将变性、稀释后的文库加入FlowCell中，图与FlowCell中的连接子杂交，在cBot中完成桥式PCR扩增，最后按照合成测序的原则在Illumina测序系统中以10G的测序深度进行测序。

生物信息学分析：在质量控制方面，选择fastqc软件检查RNA-seq的原始读段；然后通过fastp软件检查读段的质量，并再次删除低质量的读段序列。在质量控制之后，使用hisat2软件将清洁读数与宿主参考基因组(包括龙眼和龙眼鸡)进行比较；然后，选择samtools软件将比较结果文件从Sam格式转换为BAM格式，并通过samtools软件提取BAM文件中的非匹配序列；最后，通过bamtofastq软件将不匹配的读数从BAM格式转换为fastq格式。

病毒全基因组获得：使用Trinity 软件分析得到的小核糖核酸属病毒

图1：为进一步鉴定小核糖核酸属病毒

图2：利用MEGA X软件构建上述3个序列的系统发育关系树。

实施例2

根据

LYJ-H-F（SEQ ID NO.3）：5’-GGTCTATGCTGTATCCAAA-3’，

LYJ-H-R（SEQ ID NO.4）：5’-ATATTGTCAAGCTGGTGAG-3’。

实施例3 特异性引物LYJ-H-F/LYJ-H-R在鉴定同翅目昆虫龙眼鸡样本中病毒

样本采集：从福建省农业科学院研究所，福建农林大学，以及福建省福州市闽侯县3个地区采集同翅目昆虫龙眼鸡样本。采集过程中均使用一次性用具以避免样本交叉污染。

样本的处理及总核酸的提取：采用氯仿-异丙醇核酸提取法提取所采集的同翅目昆虫龙眼鸡样本的RNA，用TransScript®试剂盒将提取的RNA反转录为cDNA。

聚合酶链式反应（PCR）鉴定：以反转录得到的cDNA作为模板，用Hieff® Taq试剂盒进行聚合酶链式反应（PCR）扩增，扩增结果由1%琼脂凝胶电泳验证。PCR反应体系如下：

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PCR反应条件：

；

结果如图4所示；

图4：用特异性引物检测小核糖核酸属病毒