一种检测人细小病毒B19核酸的试剂盒和方法

技术领域

本发明涉及PCR检测技术领域，尤其涉及一种检测人细小病毒B19核酸的试剂盒和方法。

背景技术

人细小病毒B19是已知的最小的病毒，为单链线状DNA病毒，属于细小病毒科，无包膜，3500碱基组成的单链dna病毒，属微小病毒科，是红细胞病毒属的一种，直径20～25nm，对外界理化因素的抵抗力非常强。B19病毒可以被分为1、2、3三种基因型，其中1型和3型又各自分为两种亚型。

检测人细小病毒B19感染的常用方法依赖于抗原、抗体和核酸检测。B19病毒抗体的检测存在2～4周时间等待抗体产生的“窗口期”，抗原检测则灵敏度偏低，而核酸检测针对B19病毒的DNA，不受检测时间限制，且灵敏度最高，能够检测到样品中微量B19病毒核酸的存在，在B19病毒的检测方法中具有很大优势。目前B19核酸检测方法主要有PCR检测技术和恒温检测技术，由于恒温检测技术存在诸多苛刻条件，因此，采用荧光探针PCR原理，针对B19病毒特异性区域设计相应的引物及探针。

目前，市面上用于B19的PCR检测试剂盒的荧光PCR反应液和酶混合液分开，如专利号为CN111270008A公开的试剂盒，由于酶混合液添加量通常较少，容易引起一定的实验误差，因此需要开发一种稳定性和准确性均较高的B19病毒检测试剂盒以及方法。

发明内容

有鉴于此，本发明提出了一种稳定性和准确性均较高的检测人细小病毒B19核酸的试剂盒和方法。

本发明的技术方案是这样实现的：第一方面，本发明提供了一种检测人细小病毒B19核酸的试剂盒，其特征在于：包括预混反应液、阳性对照和阴性对照，所述预混反应液包括核酸扩增反应液和酶混合液，所述核酸扩增反应液包括B19上游引物、下游引物和探针，其序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示；以及内标上游引物、下游引物和探针，其序列分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。

在以上技术方案的基础上，优选的，所述序列号SEQ ID NO:3的探针5'端标记FAM荧光发生基团，3'端标记ZENTM-IBFQ的双淬灭基团。

在以上技术方案的基础上，优选的，所述序列号SEQ ID NO:6的探针5'端标记ROX荧光发生基团，3'端标记MGB。

在以上技术方案的基础上，优选的，所述序列号为SEQ ID NO:1-6的引物和探针的浓度均为10-15umol/L。

在以上技术方案的基础上，优选的，所述内标基于人管家基因锚定蛋白重复区域53而设计

在以上技术方案的基础上，优选的，所述酶混合液包括Taq聚合酶和UNG酶。

在以上技术方案的基础上，优选的，所述Taq聚合酶的浓度为3-5U/μL，UNG酶的浓度为1-3U/μL。

在以上技术方案的基础上，优选的，所述核酸扩增反应液还包括Buffer缓冲液、dNTPs、ROX、TMAC、PEG2000、海藻糖和明胶。

在以上技术方案的基础上，优选的，所述Buffer缓冲液的浓度为5×Buffer缓冲液，dNTPs的浓度为1-3mmol/L，ROX的含量为25μL，TMAC的浓度为20-30mmol/L、PEG2000的质量分数为3-5％、海藻糖的质量分数为1-3％、明胶的质量分数为0.01-0.05％。

第二方面，本发明提供了一种用于以非诊断目的检测人细小病毒B19的荧光定量PCR检测方法，包括如下步骤：

S1，提取待测样本的核酸；

S2，使用上述试剂盒对S1获得的核酸进行荧光PCR反应；

S3，获得并分析结果。

在以上技术方案的基础上，优选的，所述步骤S1中，样本为血液。

本发明的一种检测人细小病毒B19核酸的试剂盒和方法相对于现有技术具有以下有益效果：

(1)本发明试剂盒为预混反应液，避免了反应液和酶混合时带来的误差，减少了操作难度，极大提高了检测灵敏度，同时缩短了操作时间。

(2)本发明利用B19探针ZEN双淬灭探针含有一个5'端荧光基团，一个3'端IBFQ淬灭基团，以及专有的内置ZEN淬灭基团，使得本发明具有双重保障，除了在探针3'端具有普通淬灭基团外，其内部还添加有第二个淬灭基团，可降低本底信号，提高信噪比，降低多通道检测中荧光信号的相互串扰，还可增强双链结构的稳定性，阻止核酸外切酶的酶切作用。

(3)内标基于人管家基因锚定蛋白重复区域53设计，能在人体样本提取核酸中稳定扩增，内标3’端加入一个能插入DNA小沟的小沟结合物(MGB)，可以大大提高探针的Tm值，增加杂交反应的特异性，避免因样本保存条件问题或核酸提取质量较差导致的假阴性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明试剂盒的灵敏度验证结果图；

图2为本发明试剂盒利用标准品制作的B19的标准曲线图；

图3为本发明试剂盒稳定性检测验图(0天)；

图4为本发明试剂盒稳定性检测验图(7天)。

具体实施方式

下面将结合本发明实施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例一

1、引物序列设计

针对B19病毒特异性区域设计的相应引物及探针如下：

上游引物：5'-CCAAGAAACCCCGCATTACC-3'，如SEQ ID NO:1所示；

下游引物：5'-GCTAGCCTTAGTTCCCTTCCCAT-3'，如SEQ ID NO:2所示；

探针：5'-CAACCTCTGCCCCTGTGCCGCTA-3'，如SEQ ID NO:3所示。

其中，探针的5’端标记FAM荧光发生基团，3’标记ZENTM-IBFQ的双淬灭基团。

PCR扩增产物序列为：AAGAAACCCCGCATTACCACAGCCATAAATGAT ACTAGTAGTGATGCTGGGGAGTCTAGCGGCACAGGGGCAGAGGTTGTGCC ATTTAATGGGAAGGGAACTAAGGCTA，如SEQ ID NO:7所示。

根据人锚定蛋白重复区域53设计内标序列如下：

上游引物：5'-CGATCTCATCAAGGACTCCCC-3'，如SEQ ID NO:4所示；

下游引物：5'-CACAACGTGAATTGCCACACT-3'，如SEQ ID NO:5所示；

探针：5'-CCTGCCCTCCCCACAAACCAACCC-3'，如SEQ ID NO:6所示。

其中，探针的5’端标记ROX荧光发生基团，3’端标记MGB。

PCR扩增产物序列为:CGATCTCATCAAGGACTCCCCACCCTGCCCTCCC CACAAACCAACCCATAAAGTTATTATGGCTACCTCTCCCCCTGAGGCAGCC CAGTGAAGGCTGAAGTGTGGCAATTCACGTTGTG，如SEQID NO:8所示。

本发明利用B19探针双淬灭探针含有一个5′端荧光基团，一个3′端IBFQ淬灭基团，以及专有的内置ZEN淬灭基团，使得本发明具有双重保障，除了在探针3’端具有普通淬灭基团外，其内部还添加有第二个淬灭基团，可降低本底信号，提高信噪比，降低多通道检测中荧光信号的相互串扰，还可增强双链结构的稳定性，阻止核酸外切酶的酶切作用。

上述内标基于人管家基因锚定蛋白重复区域53设计，能在人体样本提取核酸中稳定扩增，内标3’端加入一个能插入DNA小沟的小沟结合物(MGB)，可以大大提高探针的Tm值，增加杂交反应的特异性，避免因样本保存条件问题或核酸提取质量较差导致的假阴性。

实施例二

检测人细小病毒B19核酸的试剂盒，包括预混反应液、阳性对照和阴性对照。

其中，预混反应液包括核酸扩增反应液和酶混合液，核酸扩增反应液包括B19上游引物、下游引物和探针，其序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示；以及内标上游引物、下游引物和探针，其序列分别如SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示，以及Buffer缓冲液、dNTPs、ROX、TMAC、PEG2000、海藻糖和明胶。

其中，酶混合液包括Taq聚合酶和UNG酶。

序列号为SEQ ID NO:1-6的引物和探针的浓度均为10-15umol/L，优选为10umol/L。

酶混合液中Taq聚合酶的浓度为3-5U/μL，优选为5U/μL；UNG酶的浓度为1-3U/μL，优选为1U/μL。

Buffer缓冲液的浓度为5×Buffer缓冲液，dNTPs的浓度为1-3mmol/L，优选为2.5mmol/L；ROX的含量为20-25μL，优选为20μL；TMAC的浓度为20-30mmol/L，优选为20mmol/L、PEG2000的质量分数为3-5％，优选为5％；海藻糖的质量分数为1-3％，优选为3％；明胶的质量分数为0.01-0.05％，优选为0.03％。

在这个体系中ROX是一种荧光染料，能够作为qRT-PCR的基准，在进行qRT-PCR时，扩增片段的荧光信号要根据ROX的荧光信号作标准化。ROX还能够消除由于蒸发等原因导致的反应体系的变化造成的误差。

阳性对照为B19灭活的病毒血清样本稀释而成，阴性对照为0.9％的氯化钠溶液。

实施例二

检测人细小病毒B19的荧光定量PCR检测方法，包括如下步骤：

S1，提取待测血样的核酸；

取含有B19病毒的灭活血清稀释至10

S2，使用实施例一中的试剂盒对S1获得的核酸进行荧光PCR分析；

本实施例中PCR反应液的各组分及含量见表1。

表1PCR预混反应液组分及浓度

依照本文PCR扩增体系按图1配制，取PCR预反应液向每管PCR反应管中分装30μL。取出样本及质控品抽提产物20μl作为模板加入PCR反应管中，盖好PCR反应管，混匀进行PCR反应。

使用上海宏石SLAN 96P荧光定量PCR仪进行RT-PCR扩增，程序为：50℃逆转录2min，1个循环；95℃预变性3min，1个循环；95℃变性10s，60℃退火1min，收集荧光信号，变性和退火45个循环。检测通道选择：荧光信号收集设定为FAM和ROX通道，结果见图1。

S3，获得并分析结果；

根据通道扩增模板的荧光信号强弱和循环阈值来判断样品中弓形虫病毒的存在。

实验有效性的判定条件：

①如果样本扩增曲线不呈S型、Ct值为UNDET或者>40.00，则结果为阴性。

②如果样本扩增结果38.00＜Ct值≤40.00，建议复检，若复检扩增曲线不呈S型、Ct值为UNDET或者>40.00，则结果为阴性，否则为阳性。

③如果样本扩增曲线呈S型且Ct值≤38.00，则结果为阳性。

图1所示，B19引物和内标引物通道在10

利用标准品制作B19的标准曲线，结果如表2和图2：

表2标准曲线

由图2可见，R

稳定性测试：将配制好的B19反应液放置于37℃恒温箱中，分别放置0天、7天，然后进行PCR检测，结果见图3和4。

由图3和4可见，反应液的效率未降低，仍能检出浓度为200copies/mL的样本，表明稳定性良好。

对比例

对比例的PCR反应液不是预混液，PCR反应液和酶混合液单独存放，现场配置，B19探针采用单猝灭基团IBFQ，试剂盒缺少TMAC、PEG2000、海藻糖和明胶。除此之外，PCR反应体系中的试剂浓度和检测样本浓度同实施例。

检测结果显示，对比例的检测限和稳定性均较差，最低检测限为500copies/mL，且将配制好的B19反应液放置于37℃恒温箱中7天后，检测限为1000copies/mL。

以上所述仅为本发明的较佳实施方式而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。