一种适用于丝状真菌胞内氢离子浓度原位监测的传感器及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于应用微生物技术领域，具体涉及一种适用于丝状真菌胞内氢离子浓度原位监测的传感器及其构建方法和应用。

背景技术

过量施用化肥、农药等化学品使土壤微生物区系受到极大破坏，土壤养分生物转化能力越来越弱，作物产量对化肥供应养分的依赖性越来越强，经济作物的土传病害更严重，严重影响了农业的可持续发展。同时，过量施肥也会导致土壤酸化，其中土壤根际土的酸化最为显著。近年来，哈茨木霉NJAU 4742(Trichoderma guizhouense NJAU 4742，以下简称NJAU 4742)因其具有显著的促进植物生长或防控土传病害的能力以及环境友好、安全无毒的特点，在农业生产上得到越来越广泛的应用。NJAU 4742作为土壤有益微生物定殖与根际，所以土壤酸化会较为显著地影响NJAU 4742的功效。在酸性胁迫下，NJAU 4742的生长明显受到抑制，同时其生物代谢紊乱，进而影响细胞的正常功能。氢离子作为土壤酸化后胁迫微生物生长的介质，研究其在微生物胞内的代谢转运过程是必要的。

检索暂未发现有适用于丝状真菌胞内氢离子浓度监测的传感器报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的第一个目的提供一种适用于丝状真菌胞内氢离子浓度原位监测的传感器及其构建方法和应用；本发明的传感器可以实时监测丝状真菌如NJAU 4742不同细胞器中氢离子浓度及其动态变化特征。这项发明将为提高丝状真菌氢离子浓度的精准监测和调控提供充实的理论和应用基础。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

第一方面，本发明保护一种适用于丝状真菌胞内氢离子浓度原位监测的传感器，其选自如下(1)或(2)：

(1)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

(2)将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与(1)具有80％以上同源性且具有相同的功能的蛋白质。

优选的，所述丝状真菌为哈茨木霉NJAU 4742。

本发明的传感器基本组成为pHluorin2、Mcherry，两者通过两个氨基酸EF连接。该传感器基于质子转移效果影响pHluorin2的绿色荧光强度，通过比较绿色荧光与红色荧光的荧光强度的比值判断氢离子相对浓度；绿色荧光蛋白的激发波长为488nm，发射波长为518nm；Mcherry的激发波长为587nm，发射波长为610nm。该比值可用于表征氢离子浓度的变化，构建原理如图1所示。

在一些具体的实施例中，所述丝状真菌为哈茨木霉，具体为哈茨木霉NJAU 4742。

本发明还保护编码前文所述的一种适用于丝状真菌胞内氢离子浓度原位监测的传感器的基因。

作为本申请的优选技术方案，所述基因中含有氢离子浓度敏感基因片段，所述基因片段为GFP特定位点突变的基因片段。

优选的，所述氢离子浓度敏感基因片段为GFP的第202位的丝氨酸突变为组氨酸的基因片段。

优选的，所述基因片段为以质粒pME pHluorin2为模板，以PH-F和PH-R扩增获得氢离子浓度敏感基因片段；其中，

PH-F：GCTGGACGAGCTGTACAAGGAATTCatgagcaaaggagaagaacttttcactgA；

PH-R：CGGTCCCGACCTTTtGCTTCCGTCGATGACttatttgtagagctcatccatgccatgtg。

本发明所涉及的氢离子浓度传感器，其基本组成为pHluorin2、Mcherry，两者通过两个氨基酸EF连接。该传感器基于质子转移效果影响pHluorin2的绿色荧光强度，通过比较绿色荧光与红色荧光的荧光强度的比值判断氢离子相对浓度。

本发明还保护含有前文所述基因的表达盒、表达载体、或重组工程菌；

其中，表达载体为质粒载体。

作为本申请的优选技术方案，所述重组工程菌为哈茨木霉NJAU 4742，由含有前文编码基因的质粒转化哈茨木霉NJAU 4742而得。

本发明所述方法中哈茨木霉NJAU 4742保藏编号为CGMCC No.12166，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心。

作为本申请的优选技术方案，所述转化为PEG介导的原生质体转化。

第二方面，本发明还保护一种适用于丝状真菌胞内氢离子浓度原位监测的传感器的构建方法，包括如下步骤：以质粒pME pHluorin2为模板，扩增获得氢离子浓度敏感基因片段；以质粒pcDNA为模板，扩增HygB和Mcherry片段；以哈茨木霉NJAU 4742的基因组为模板，扩增基因启动子、ura3功能基因片段、ura3上游500bp片段、ura3下游1200bp片段；利用重叠延伸PCR方法将这些片段以U3-hygB-U3 up(ura3上游)-promotor(启动子)-M(Mcherry)-pHluorin2(氢离子浓度敏感基因片段)-U3 down(ura3下游)的顺序连接，形成含有潮霉素抗性的Mcherry与氢离子浓度传感器双荧光示踪工作片段。

优选的，所述质粒pcDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

第三方面，本发明还保护前文所述的传感器，前文所述的基因，前文所述的表达盒、表达载体、或重组工程菌，在原位监测丝状真菌胞内氢离子浓度中的应用。

作为本申请的优选技术方案，所述丝状真菌为哈茨木霉NJAU4742。

第四方面，本发明还保护一种原位监测丝状真菌胞内氢离子浓度的方法，使用前文所述的传感器。

优选的，将编码前文所述传感器的基因导入目的菌株中。

有益效果

(1)本发明首次在丝状真菌进行了氢离子传感器的构建与应用，实现了对丝状真菌胞内氢离子浓度动态监测的目标。

(2)本方法方便快捷且准确，为丝状真菌能量代谢相关通路的深入研究提供了可行的工具支撑。

(2)本发明的氢离子浓度传感器扩展了pHluorin2的pH范围，将pH的监测范围由5.4-8.0扩展到2.5-8.0。

附图说明

图1为氢离子传感器荧光菌株构建过程；

图2为氢离子传感器荧光菌株一次同源和二次同源的琼脂糖凝胶电泳验证；

图3为氢离子传感器荧光菌株原生质体氢离子共聚焦成像和数据分析；

图4为氢离子传感器菌丝的共聚焦成像。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的公知手段。

实施例1菌株活化与制备

1、菌株的观察：哈茨木霉NJAU 4742(Trichoderma guizhouense NJAU 4742)，具有以下特征：丝状真菌，菌丝有隔丛枝状，分生孢子梗光滑，绿色，顶端膨大呈球形，上面有生小梗产生孢子，分生孢子光滑球形，绿色。

2、菌株的培养：将NJAU 4742接种到固体培养基PDA玻璃培养皿中，培养条件为：28℃、7天，将培养皿上的绿色孢子用5mL的无菌水洗刮下来，用无菌纱布过滤到灭完菌的玻璃瓶中制备成了孢子悬液备用。

实施例2 NJAU 4742中氢离子浓度传感器的构建

1、菌体培养：将NJAU 4742孢子液接种到固体培养基PDA玻璃培养皿中，培养条件为：28℃、7天，将培养皿上的绿色孢子用5mL的无菌0.9％NaCl洗刮下来，用无菌纱布过滤到灭完菌的离心管中待用。

2、氢离子浓度传感器的构建：以质粒pME pHluorin2为模板，以PH-F和PH-R扩增获得氢离子浓度敏感基因片段；以质粒pcDNA为模板，以HygB-F和HygB-R扩增HygB和Mcherry片段；以哈茨木霉NJAU 4742的基因组为模板，以P-F和P-R扩增基因启动子、以U3-F和U3-R扩增ura3功能基因片段、U3-up-F和U3-up-R扩增ura3上游500bp片段、以U3-do-F和U3-do-F扩增ura3下游1200bp片段；利用重叠延伸PCR方法将这些片段以U3-hygB-U3 up-promotor-M-pHluorin2-U3down的顺序连接，形成含有潮霉素抗性的Mcherry与氢离子浓度传感器双荧光示踪工作片段。

单基因片段PCR扩增程序如下：

PCR扩增反应体系如下：

反应条件：

用DNA切胶回收试剂盒(OMEGA)回收PCR产物，保证DNA片段浓度大于200ng/μL。将氢离子浓度传感器片段与其他片段通过重叠延伸PCR方法连接。

重叠延伸PCR方法程序如下：

重叠延伸PCR方法反应体系为：

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引物参见表1。

3、NJAU 4742原生质体制备：

按要求配制200mL溶液A(含1.2M山梨醇和0.1M KH

1)将50μL NJAU 4742新鲜孢子悬液均匀涂布于覆盖有玻璃纸Cellophane的PDA培养基上，每个菌株准备5份，于28℃黑暗培养约16h；

2)将带有刚萌发菌丝的玻璃纸小心撕下，浸泡于含4mL无菌的细胞壁酶裂解液(由20mL溶液A和0.15g哈茨木霉细胞壁裂解酶配制)的90mm平皿中，继续加入3-4张玻璃纸，每隔一张玻璃纸加4mL酶裂解液，将平皿置于28℃、100rpm条件下孵育约2h(可在孵育1h后用镊子将团聚在一起的菌丝小心拨开)；

3)取出平皿，弃去玻璃纸，用移液枪反复吸打细胞酶解液以助菌丝分开；

4)吸取细胞酶解液，用带有玻璃丝的无菌滤头滤去菌丝，可用少量溶液A冲洗菌丝，收集约30mL滤液于50mL无菌离心管中(冰上操作)；

5)在4℃、2000rpm条件下离心10min，弃去上清液，用0.5-1mL溶液B复溶细胞沉淀，即获得木霉原生质体，置于冰上待用。

4、氢离子浓度传感器载体转化

氢离子浓度传感器载体转化主要分为以下五个步骤进行：

1)吸取NJAU 4742原生质体悬液200μL于2mL离心管中，离心管置于冰上；向其中加入20μL氢离子浓度传感器表达片段，50μL PEG溶液，小心混匀至PEG完全溶解，冰上静置20min；

2)室温下加入2mL PEG溶液，轻轻混匀，静置5min后加入3mL溶液B，轻轻混匀，室温下静置待用；

3)吸取200-500μL上述混合液至含1M蔗糖的PDA平皿(90mm)中，涂布均匀，于28℃黑暗培养12-16h；

4)次日，在该PDA(含1M蔗糖)培养基上小心倒入一层厚度约2-3mm的含200μg/mL潮霉素B的PDA(不含1M蔗糖)培养基，在28℃黑暗条件下继续培养24-48h，直至含潮霉素B的PDA平皿上长出小的木霉突变子菌落。

5、氢离子浓度传感器表达菌株筛选验证

1)用无菌枪头挑取各个转化子菌丝若干，分别置于含20μL Dilution Buffer(Phire Plant Direct PCR Master Mix试剂盒，Thermo Scientific)的PCR管中，用枪头稍微压打菌丝，破壁释放gDNA；

2)在氢离子浓度传感器上下游分别设置引物E-U3-F和E-U3-up-R；E-P-F和E-U3-do-R.

3)PCR跑胶验证；PCR体系设置如下：

2×Phire Plant Direct PCR Master Mix 10μL

引物1μL

引物1μL

上述含DNA的Dilution Buffer 0.5μL

加超纯水至20μL。

PCR反应设置如下：

所用引物见表1：筛选氢离子浓度传感器转化子用引物E-U3-F和E-U3-up-R；E-P-F和E-U3-do-R进行验证，目的片段长度为3100bp和1900bp；将菌落PCR验证为阳性的转化子置于28℃光照条件下继续培养，直至产孢；收集各阳性转化子孢子，稀释涂布于含200μg/mL潮霉素B的PDA平皿(90mm)中培养16-24h，孢子萌发后进行单胞分离，纯化菌株至新的PDA平皿(60mm)中培养，每个转化子分离5-6个单株；采用菌落PCR法进一步验证氢离子浓度传感器片段的表达。第一步同源重组菌株纯化后稀释100倍后涂于含有5-氟乳清酸和脲苷的MM培养基上，48小时候挑取菌落培养后验证，引物为E-U3-F和E-U3-up-R；E-P-F和E-U3-do-R。

验证结果如图1所示，菌株wt-pH-HR1正确导入了氢离子传感器片段(T-pH-HR1泳道)；菌株wt-pH-HR2自发同源重组去除了生物标记，可以进行其他基因的编辑(T-pH-HR1泳道)将通过验证的纯化的阳性突变子备份保存至-80℃。

表1氢离子浓度传感器表达及验证所用引物

实施例3 NJAU 4742的氢离子浓度传感器原生质体响应胞外氢离子浓度

构建完NJAU 4742的氢离子浓度传感器菌株后为了验证菌株功能，我们将菌株制备成缺少细胞壁的原生质体，用以更好感受胞外氢离子来判断菌株是否可用。

1、NJAU 4742氢离子浓度传感器菌株原生质体制备：

按要求配制200mL溶液A(含1.2M山梨醇和0.1M KH2PO4，pH 5.6)、100mL溶液B(含1M山梨醇、50mM CaCl2和10mM Tris-HCl，pH 7.5)和100mL PEG溶液(含25％PEG6000、50mMCaCl2和10mM Tris-HCl，pH 7.5)。NJAU 4742原生质体制作分如下5步完成：

1)将50μL NJAU 4742新鲜孢子悬液均匀涂布于覆盖有玻璃纸Cellophane的PDA培养基上，每个菌株准备5份，于28℃黑暗培养约16h；

2)将带有刚萌发菌丝的玻璃纸小心撕下，浸泡于含4mL无菌的细胞壁酶裂解液(由20mL溶液A和0.15g哈茨木霉细胞壁裂解酶配制)的90mm平皿中，继续加入3-4张玻璃纸，每隔一张玻璃纸加4mL酶裂解液，将平皿置于28℃、100rpm条件下孵育约2h(可在孵育1h后用镊子将团聚在一起的菌丝小心拨开)；

3)取出平皿，弃去玻璃纸，用移液枪反复吸打细胞酶解液以助菌丝分开；

4)吸取细胞酶解液，用带有玻璃丝的无菌滤头滤去菌丝，可用少量溶液A冲洗菌丝，收集约30mL滤液于50mL无菌离心管中(冰上操作)；

5)在4℃、2000rpm条件下离心10min，弃去上清液，用0.5-1mL溶液B复溶细胞沉淀，即获得木霉原生质体，置于冰上待用。

2、原生质体浸泡于不同pH的溶液B(含1M山梨醇、50mM CaCl2和10mM Tris-HCl，pH7.5)；

3、激光共聚焦观察原生质体荧光比值。

如图3所示，溶液B的pH范围为5.0，4.5，4.0，3.5，3.0和2.5，其对应的荧光比值为8.509442069，8.122167654，7.50769307，7.193207661，6.749728172，5.684373971。数据结果显示二者具有高度的正相关性，即pH越低，比值越小。

实施例4 NJAU 4742的氢离子浓度传感器菌株胞内氢离子浓度变化

1.菌体培养：将NJAU 4742氢离子浓度传感器菌株孢子液接种到不同pH的固体培养基PDA玻璃培养皿中，培养条件为：28℃、7天；

2.在菌丝周围斜向插入无菌的盖玻片；

3.激光共聚焦观察菌丝荧光比值。

如图4所示，固体培养基pH范围为5.0，4.0，3.5，3.0和2.5，其对应的菌丝荧光比值为15.09959953，6.031168172，10.82105076，12.34789648，5.855390597。数据说明具有完整细胞壁的结果具有一定的氢离子缓冲能力。

本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求为保护范围。