巴西木素-7-乙酸酯在制备帕金森病预防或治疗药物中的用途

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及巴西木素-7-乙酸酯在制备作为帕金森病药物中的用途。

背景技术

帕金森综合症状(Parkinson’s disease，PD)是一种常见的神经系统变性疾病，该病的发病率随着年龄的而急剧上升，50岁至59岁之间的每10万人中有17.4名患病，70岁到79岁之间每10万人就有93.1名患者，中位发病年龄为60岁，从诊断到死亡的平均病程为15年，死亡率为2∶1.5，患此病的终生风险为1.5％。细胞内路易小体(Lewy body，LB)的积累可能在PD的直接发病机制中发挥更重要的作用，LB的主要成分是突触前短蛋白α-突触核蛋白(α-synuclein，简称α-Syn)。

α-Syn约15kDa，可溶性高，高度保守，主要的亚型是140个氨基酸长，含有NAC结构域并参与LB的形成。它可以根据环境采用不同的构象，并容易与其他配体，如脂质相互作用，通常位于中枢神经系统，主要位于突触前神经终末，并发挥重要的调节作用，包括参与突触维持、线粒体稳态、蛋白酶体功能、多巴胺代谢和伴侣活性，其不溶性聚集物在神经元或胶质细胞中异常聚集会出现病变，被统称为α-Syn系病，其中包括PD。

聚集的α-Syn使内质网和线粒体功能障碍，导致ROS产生过多从而导致氧化应激。过多的ROS引起脂质的氧化，增加细胞膜的通透性，引起神经元死亡。此外，在高度氧化的环境中α-Syn的不能被有效降解，导致其积累和聚集加剧。因此。抑制α-Syn聚集并降低氧化应激可能是一种有效的PD治疗策略。

目前已开发出各种各样治疗PD的药物，其中包括金属离子、纳米颗粒、抗体以及小分子化合物。其中，类黄酮是一种多酚类化合物，在自然界中广泛存在，主要存在于水果、蔬菜、饮料和中药里。类黄酮化合物具有广泛的药理活性，可用于癌症的预防、抗炎症和抗氧化，并被认为是潜在的神经保护剂。此外，前期研究发现部分类黄酮化合物能与α-Syn非共价结合，使天然未折叠但蛋白构想变化受到限制，同时增强被结合蛋白的稳定性。目前，一些具有抑制α-Syn聚集的类黄酮化合物也已经被报道，其中包括氧化槲皮素、甘草苷以及黄芩素等。

大多数类黄酮化合物都是由植物中提取纯化而来。巴西木素是苏木主要活性物质之一，具有抗炎症、抗癌和抗氧化等多种功能。目前也有报道，证明巴西木素可以抑制淀粉样蛋白纤维化，其中包括人类胰岛淀粉样多肽以及β-淀粉样蛋白。此外，巴西木素通过疏水作用和α-Syn五聚体直接结合，从而抑制其聚集形成纤维，因此，巴西木素被评价为潜在的抗PD药物。但是，巴西木素体内利用率低，在体内降解过快，这可能是因为巴西木素的羟基不稳定造成的。此外，巴西木素有4个羟基，而7位碳的羟基是与α-Syn的结合位点之一。于是，我们用苯环、氟苯以及乙酸等有机分子对巴西木素7位碳的羟基进行修饰保护。经过ThT实验筛选发现，使用乙酸对7位羟基进行酯化修饰保护后，对α-Syn的抑制效果最好，甚至超过巴西木素。最终，筛选出巴西木素-7-乙酸酯(B-7-A)作为预防或治疗PD的候选药物。

秀丽隐杆线虫(C.elegans)是研究神经退行性疾病分子机制和药物开发实验模型。秀丽隐杆线虫是一种相对简单的无脊椎动物，但它有一个完整的神经系统，由302个神经元和大约5000突触组成。此外，许多编码秀丽隐杆线虫神经机制的基因与其他生物体的基因同源，如神经递质和生长因子等。因此，线虫已成为研究神经退行性疾病的一种简单可靠的动物模型。

发明内容

本发明提出巴西木素-7-乙酸酯在预防或治疗PD的用途，并将其用于制备药物，有效防止PD的发生。

进一步地，巴西木素-7-乙酸酯用于抑制帕金森病人α-突触核蛋白的聚集沉淀。

进一步地，巴西木素-7-乙酸酯用于改善帕金森病人的运动障碍

进一步地，巴西木素-7-乙酸酯用于减少帕金森病人的体内活性氧水平。

进一步地，巴西木素-7-乙酸酯用于提高帕金森病人的超氧化物歧化酶含量。

进一步地，巴西木素-7-乙酸酯用于降低帕金森病人的丙二醛含量。

进一步地，巴西木素-7-乙酸酯用于恢复帕金森病人脑内脂质含量。

进一步地，巴西木素-7-乙酸酯可以针剂、注射制剂、软胶囊、口服形式。

进一步地，巴西木素-7-乙酸酯以水分散体系存在。

进一步地，巴西木素-7-乙酸酯以浓度为2.5-100μM的巴西木素水分散体系存在。

本发明对将巴西木素-7-乙酸酯制成药物的剂型以及巴西木素-7-乙酸酯的含量没有特殊限定，采用巴西木素-7-乙酸酯在医学领域可接受的剂型和含量即可。

本发明技术方案，具有如下优点：

本发明提出巴西木素-7-乙酸酯在制备预防或治疗帕金森病药物中的用途。通过实验证明，巴西木素-7-乙酸酯可效抑制α-Syn聚集且抑制效果优于巴西木素，减缓α-Syn的二级结构向β-折叠的转变，减少NL5901秀丽隐杆线虫体内α-Syn聚集，延长NL5901寿命，改善NL5901运动障碍，减少NL5901的超氧化物歧化酶含量，降低NL5901丙二醛含量，恢复NL5901脂质含量，进而提出巴西木素-7-乙酸酯对帕金森病具有很好的预防及治疗作用，为开发预防与治疗帕金森病有关的药物提供了新的途径。

附图说明

构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1为本发明实施例1中不同浓度巴西木素-7-乙酸酯与α-Syn共培养不同时间后培养物的ThT荧光图。

图2为本发明实施例2中巴西木素和巴西木素-7-乙酸酯分别与α-Syn共培养到平台期后ThT最大荧光值

图3为本发明实施例3中巴西木素-7-乙酸酯与α-Syn共培养6天后培养物对二级结构变化图。

图4为本发明实施例4中巴西木素-7-乙酸酯对NL5901干预治疗5天后摇摆实验测定结果。

图5为本发明实施例5中巴西木素-7-乙酸酯治疗NL5901线虫寿命统计结果。

图6为本发明实施例6中巴西木素-7-乙酸酯治疗NL5901线虫5天时体内聚集α-Syn表征。

图7为本发明实施例7中巴西木素-7-乙酸酯对NL5901干预治疗5天后虫体内活性氧水平测定。

图8为本发明实施例8中巴西木素-7-乙酸酯对NL5901干预治疗5天后虫体超氧化物歧化酶含量检测。

图9为本发明实施例9中巴西木素-7-乙酸酯对NL5901干预治疗5天后虫体丙二醛含量测定。

图10为本发明实施例10中巴西木素-7-乙酸酯对NL5901干预治疗5天后虫体脂质量测定。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

本发明实施例提出巴西木素-7-乙酸酯在制备预防或治疗帕金森病药物的用途。

巴西木素-7-乙酸酯结构式如下：

本发明实施例中，巴西木素-7-乙酸酯是化学合成出来的小分子化合物。α-Syn是一种丰富的突触前蛋白，它由高度可溶性的140个氨基酸构成，分子量为15kDa，通常定位于神经元突触前端，在中枢神经系统中表达，它包含一个保守的脂质结合结构域，参与突触囊泡运输。活性氧(ROS)通常在线粒体电子转移链中产生或氧化还原反应，实际上也是是细胞内稳态的必要组成部分。ROS在正常生理中很重要，抗氧化蛋白如超氧化物歧化酶(SOD)能防止ROS水平过高，这些抗氧化剂在调节ROS水平方面的失败会导致氧化应激，这可能会产生各种有害的影响。细胞内大分子的随机氧化会破坏细胞结构，甚至导致细胞死亡。本发明提出巴西木素-7-乙酸酯能够有效抑制α-Syn的聚集，降低ROS水平，为治疗和预防PD的研究提供了新思路。

本发明实施例还提出巴西木素-7-乙酸酯在制备作为治疗和预防PD的药物中的用途。本发明充分利用巴西木素-7-乙酸酯，毒副作用小、患者顺应性良好的特性，将其用于药物的新开发。

本发明实施例提出巴西木素-7-乙酸酯在制备用于预防或治疗以α-Syn的聚集和氧化应激为特征的疾病的药物中的用途。优选的，本发明实施例还提出巴西木素-7-乙酸酯作为用于制备预防或治疗帕金森病的药物。帕金森病(PD)为一种常见的中老年人神经系统变性疾病，大部分PD患者主要病变发生在中脑黑质和纹状体中，其内存在LB。α-Syn含有NAC结构域并参与LB的形成，LB可以破坏线粒体和内质网功能造成氧化应激导致PD。可见，本发明实施例提供的用途进一步促进了治疗帕金森病的研究进展。

具体而言，巴西木素-7-乙酸酯可以以水分散体系存在。换言之，巴西木素-7-乙酸酯可以以水分散体系的形式服用，如针剂、注射液、软胶囊、口服液等形式。

具体而言，巴西木素-7-乙酸酯以浓度为2.5-100μM的巴西木素-7-乙酸酯水分散体系存在。具体可以为2.5μM、5μM、20μM、25μM、40μM，50μM，80μM、100μM等。

下面参照具体实施例进一步阐述巴西木素-7-乙酸酯在治疗或预防帕金森病中的用途。

实施例1

首先，重组α-Syn蛋白大肠杆菌菌株由课题组前期构建，经诱导表达、纯化，最终获得纯度达95％以上的α-Syn蛋白，冻干后置于-20℃储存，得纯化冻干的α-Syn。向纯化冻干的α-Syn中加入TBS缓冲溶液，超声10min使之充分溶解，以16000xg的速度离心20min去除已经发生聚集的多肽，然后取上清液体积的75％，测定蛋白浓度。将上述α-Syn蛋白用TBS稀释，得浓度为50μM的α-Syn母液。

其次，称取40mgThT溶于500mL Tris-HCl缓冲液(TBS，tris buffered saline，三乙醇胺缓冲盐水溶液，其中三羟甲基氨基甲烷(Tris buffer)浓度为20mM，NaCl浓度为150mM，PH＝7.0)配制，得浓度为250μM的ThT母液。

再次，称取0.32mg巴西木素-7-乙酸酯溶于1mL过膜水中，得浓度为1mM的巴西木素-7-乙酸酯母液。

将上述所得α-Syn母液与巴西木素-7-乙酸酯按梯度稀释，获得巴西木素-7-乙酸酯终浓度分别为0μM，25μM，50μM，100μM的α-Syn溶液(其中α-Syn的终浓度为50μM)，加入1.5mL灭菌的EP管中，37℃震荡培养得培养液，不同时间分别吸取等份10μLα-Syn培养液加入90μL ThT母液。

测定其在440nm处激发波长和480nm处发射波长下的荧光强度，激发和发射缝宽均为5nm，扫描速度为100nm/min，扫描结果均为3次平均值。将480nm处的荧光强度对时间作图，结果如图1所示。

参阅图1，α-Syn的ThT荧光图为“S”形曲线，存在滞后期(0～96h)，快速增长期(96h～280h)和稳定平台期(280h～360h)，加入巴西木素-7-乙酸酯后α-Syn的ThT荧光强度明显下降，且ThT荧光下降程度与加入的巴西木素-7-乙酸酯的浓度呈正比，加入巴西木素-7-乙酸酯的浓度越大，荧光抑制效果越强，说明巴西木素有效抑制了α-Syn的聚集。

实施例2

将实施例1的α-Syn母液分别和巴西木素和巴西木素-7-乙酸酯混合混匀，巴西木素和巴西木素-7-乙酸酯终浓度都为100μM，α-Syn终浓度为50μM。加入1.5mL灭菌EP管中，37℃震荡培养，α-Syn培养到平台期时，吸取等分10μLα-Syn培养液加入90μL ThT母液。根据实施例1的测定方法测定荧光值。

如图2所示，α-Syn与巴西木素-7-乙酸酯共培养的荧光强度明显低于与和巴西木素共培养的。这说明，巴西木素-7-乙酸酯抑制α-Syn聚集能力强于巴西木素，抑制效果比巴西木素强约21％

实施例3

首先，配制巴西木素-7-乙酸酯终浓度为100μM的α-Syn溶液500μL(其中α-Syn的浓度均为50μM)，其中α-Syn的处理方法与实施例1相同，37℃培养6天。

取500μL培养液加入光程0.1mm的CD检测池中进行检测，波长扫描范围是190～260nm，带宽2nm，扫描速度是100nm/min，实验结果为三次扫描平均值，参阅图3。

由图3可得，培养6天时，不加巴西木素-7-乙酸酯的培养液中，α-Syn的结构由α-螺旋转变为典型的β-折叠结构；当向α-Syn中加入巴西木素-7-乙酸酯以后，在225nm左右存在一个负峰，同时在205nm出现一个正峰，说明二级结构向β-折叠结构转化，但与只有α-Syn的培养液来说β-折叠结构程度较轻，可以说明巴西木素可以缓解α-Syn结构的转变。

实施例4

NL5901线虫同期化处理：将传代后第4天的线虫用M9缓冲溶液从NGM培养基上冲洗下来，800xg离心3min将附着在线虫身上的OP50，重复3次，收集虫体。加入线虫裂解液裂解线虫，直到没有完整的虫体被观察到，800xg离心3min收集虫卵，用M9缓冲液清洗虫卵，直到裂解液洗净。将洗净的虫卵滴加到新鲜的NGM平板上，放入20℃培养2天。待虫卵孵化并发育到L1期时，加入OP50大肠杆菌继续培养，直到L1期的线虫进一步发育到L4期。

提取L4期NL5901线虫放入涂布含有或者不含有巴西木素-7-乙酸酯和OP50大肠杆菌的NGM平板中，每个平板10条线虫，每两天更换一次新鲜NGM平板。药物治疗5天后，将线虫挑入纯的NGM平板，记录20秒内线虫摆动次数，记录10条线虫摆动次数，做出平均值，实验重复三次。

如图4所示，在巴西木素-7-乙酸酯干预治疗5天后，NL5901线虫的运动障碍得到明显的缓解，和对照组相比平均摇摆次数从每20秒13.6次提升到了每20秒19.3次。这一结果表明，巴西木素-7-乙酸酯可以改善NL5901线虫的运动障碍。

实施例5

按照实施例子4的方法将同期化到L4期的NL5901线虫放入涂布含有或者不含有巴西木素-7-乙酸酯、FUDK(抑制虫卵孵化)和OP50大肠杆菌的NGM平板中，每个平板30条线虫，设置3个平行。挑入当天记为第0天。每两天更换一次新鲜的NGM平板。每24h进行一次计数，将行为异常(瘫痪或者反应极慢)或者死亡的线虫记为丢失并挑出，直至全部线虫记为丢失。最终绘制出寿命曲线图，参阅图5。

如图5所示，NL5901线虫与野生型相比，平均寿命为3.71天，而N2的平均寿命为5.82天，在经过巴西木素-7-乙酸酯干预治疗后平均寿命提升了4.77天。这一结果说明巴西木素-7-乙酸酯可以延长NL5901线虫寿命。

实施例6

按照实施例子4的方法将同期化到L4期的线虫挑入含有或者不含有巴西木素-7-乙酸酯、OP50大肠杆菌和FUDK的NGM平板中，每板挑50条，培养到成虫期第5天。用M9缓冲液将培养至成虫期第5天的线虫进行清洗，然后800xg离心3min，使用组织固定液对线虫进行12h固定。固定后，使用PBS缓冲溶液对线虫清洗。最后，使用激光扫描共聚焦荧光显微镜观察线虫，获取图片，参阅图6。

如图6所示，在未经过巴西木素-7-乙酸酯治疗的NL5901线虫体内α-Syn聚集明显高于巴西木素-7-乙酸酯处理后的线虫，这表现为未经过处理的虫体内α-Syn聚集斑块较多，而且荧光强度更强，经过巴西木素-7-乙酸酯处理后的线虫体内α-Syn聚集斑块较少，且荧光强度较低。随后，我们对每条NL5901线虫体内α-Syn聚集斑块进行计数。结果参阅图6，经过巴西木素-7-乙酸酯处理后的每条线虫平均α-Syn聚集斑块数量明显低于未经处理过的对照组，聚集斑块数量大约只有对照组的50％。

实施例7

避光称取1.5mg的二氢乙锭(DHE)溶于1ml的DMSO，配置成5mM的DHE母液，-20℃避光保存。使用时需将将DHE母液稀释为100μM的工作液。将巴西木素-7-乙酸酯干预治疗5天的NL5901线虫挑入4％的多聚甲醛过夜固定，800xg离心3min，去上清，加入PBS清洗三遍，加入DHE工作液，37℃孵育30分钟。最后使用扫描共聚焦荧光显微镜观察线虫，获取图片，参阅图7。

如图7所示，没有经过药物治疗的NL5901线虫体内活性氧水平明显高于N2的线虫，这主要表现在荧光增强上，经过巴西木素-7-乙酸酯治疗后的NL5901荧光强度明显下降。随后，对10条线虫进行荧光强度分析，经过巴西木素-7-乙酸酯治疗后的NL5901线虫荧光强度下降了约46％。这说明巴西木素-7-乙酸酯降低NL5901线虫体内活性氧水平。

实施例8：

用PBS将巴西木素-7-乙酸酯治疗5天的NL5901线虫大约3000条从NGM平板上冲洗下来转移到干净的离心管中，然后，冰上研磨获得线虫的研磨匀浆。3000rpm/min离心5分钟，收集上清置于4℃保存。采用BCA试剂盒对线虫匀浆经行蛋白浓度进行定量分析。用检测试剂盒测定线虫体内超氧化物歧化酶体内含量。

如图8所示，在巴西木素-7-乙酸酯治疗后的NL5901线虫体内超氧化物歧化酶含量显著提升。与N2相比提升了50％，与未治疗的NL5901相比提升了200％。这表明，巴西木素-7-乙酸酯可以增强线虫的抗氧化性。

实施例9

将实施例7活得的线虫匀浆，使用检测试剂盒对丙二醛进行测定。

如图9所示，未经过治疗的NL5901丙二醛的含量明显高与N2，经过巴西木素-7-乙酸酯干预治疗后，丙二醛的含量明显降低，但是仍然高于N2。这表明，巴西木素-7-乙酸酯缓解NL5901脂质氧化损伤。

实施例10

巴西木素-7-乙酸酯治疗5天的成虫转移到含有PBS的EP管中冲洗3次。然后用100mM叠氮化钠溶液麻醉10分钟，加入4％的多聚甲醛在4℃下固定15分钟。然后，在-80℃冷冻20分钟和水解冻5分钟之间进行两次冻融循环，然后用液氮速冻。用PBS洗涤去除多聚甲醛上清后，在60％异丙醇中脱水15分钟。置于在26℃，200rpm/min尼罗红染色6小时。染色的蠕虫被清洗两次以去除染料，并使用配有数码相机的倒置显微镜拍照。用ImageJ软件对图像进行量化，结果以染色脂肪的强度表示。实验重复三次。每次测定10只线虫。

结果如图10所示，N2线虫的荧光值最高，而未治疗的NL5901线虫的荧光值明显下降，当经过巴西木素-7-乙酸酯治疗后，荧光值得到提高。这说明，巴西木素-7-乙酸酯可以恢复NL5901脂质含量。

通过抑制α-Syn聚集以及活性氧的产生，从而预防或治疗PD，并且相关文献中也曾报道抑制α-Syn聚集减少氧化应激对治疗或预防PD有重要影响。本发明提出了巴西木素-7-乙酸酯在制备预防或治疗PD药物的用途，并将其应用于体外α-Syn聚集和NL5901线虫实验，已通过现场较佳实施例子进行了描述，相关技术人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法进行改动或适当变更与组合，来实现本发明技术。特别需要指出的是，所有相类似的替代和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明精神、范围和内容中。

以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。