北虫草子实体萃取物用于制造提升抗蓝光伤害效应的药物的用途

技术领域

本发明关于一种北虫草子实体萃取物的用途，尤其是一种北虫草子实体萃取物用以制造提升抗蓝光伤害效应的药物的用途。

背景技术

可见光指人眼可见的电磁辐射，具有大约介于380～750nm的波长，其中，蓝光(blue light)泛指波长介于380～500nm的可见光，主要可以区分为波长约介于380～410nm之间的紫光(violet light)、波长约介于410～455nm之间的的蓝紫光(blue-violetlight)及波长约介于455～500nm之间的蓝绿松石光(blue-turquoise light)。紫光及蓝紫光的波长较短，因而具有较高的能量，因而会对眼睛造成伤害，因此常被称为有害蓝光(harmful blue light)。

蓝光可以通过角膜(cornea)和晶状体(lens)，进而到达视网膜(retina)，且研究已经证实，蓝光不仅会影响视力，并可能导致眼睛的过早老化(premature aging)，举例而言，过度暴露于蓝光可能会导致眼睛的酸涩或受刺激(sore or irritated eyes)、难以集中注意力(difficulty focusing)等的数位视觉疲劳(digital eye strain)、与年龄相关的黄斑变性(age-related macular degeneration)等的视网膜损伤(retina damage)。

一般而言，生活中的蓝光来源包含阳光、萤光灯、LED灯及电视、平板及智慧型手机的荧幕等，尽管来自于荧幕的蓝光暴露量远小于来自阳光的暴露量，但由于眼睛与荧幕的距离较近，且注视荧幕的时间也较长，因此市面上开发出许多荧幕过滤器(screenfilter)、电脑眼镜(computer glasses)、防反射镜片(anti-reflective lenses)等抗蓝光商品，期望能有助于避免蓝光对眼睛造成的伤害。

北虫草(Cordyceps militaris)是冬虫夏草科(family Cordycipitaceae)的一种真菌，是冬虫夏草属(genus Cordyceps)的模式种，目前已知北虫草的活性成分有利于促进性欲、抗发炎、抗氧化、抗衰老、抗肿瘤/抗癌/抗白血病、抗增殖、抗转移、免疫调节、抗细菌、真菌、病毒等微生物、抗纤维化、降血糖、降血脂、抗血管生成、抗疲劳，北虫草的活性成分另有助于保护神经、肝脏、肾脏及肺部等器官。

目前已经开发多种北虫草的培养技术，如中国台湾公告第I459953号专利案，将北虫草接种于包含添加动物性蛋白(牛奶、肉汁萃取物、胎牛血清、鱼粉、鱼精、蚕蛹、红蚯蚓)、植物性蛋白、益生菌发酵液(乳酸菌发酵液、真菌发酵液)、中药材萃取液等的PCB(platecount broth)培养基之后，于20～24℃的温度下，以90rpm的转速进行摇瓶培养3～7天之后，再接种至包含白米或糙米或燕麦等的谷物培养基上，先于温度为18～25℃、湿度为70～90％的黑暗环境(光照强度约为0Lux)中培养5～7天，再于温度为18～25℃、湿度为70～90％的照光环境(光照强度为500Lux以上，且照光时间为每天8～15小时)再培养约50天，如此所获得的北虫草子实体不仅生长速度较快，且经萃取所得的北虫草子实体萃取物所含有的虫草素(cordycepin)含量也较高。然而，如此获得的北虫草子实体萃取物是否能够用于提升抗蓝光伤害效应，仍为未知数。有鉴于此，仍有必要提供一种北虫草子实体萃取物用以制造提升抗蓝光伤害效应的药物的用途。

发明内容

为解决上述问题，本发明的目的是提供一种北虫草子实体萃取物的用途，用以制造提升抗蓝光伤害效应的药物。

本发明的北虫草子实体萃取物的用途，可以用以制造提升抗蓝光伤害效应的药物；其中，该北虫草子实体萃取物由一乙醇水溶液萃取一北虫草子实体样品所获得。

据此，本发明的北虫草子实体萃取物的用途，能够以该北虫草子实体萃取物所含有的活性成分(如包含北虫草黄素Ⅲ等北虫草类胡萝卜素)保护该所需个体的位于视网膜的感光受体细胞，防止这些感光受体细胞发生细胞凋亡，因而可以防止在有害蓝光(泛指波长介于380～500nm的高能量可见光)的照射下导致的视网膜变性，进而可以应用于制造提升抗蓝光伤害效应的药物，为本发明的功效。

本发明的北虫草子实体萃取物的用途，其中，该北虫草子实体萃取物可以由乙醇浓度为20％以上的乙醇水溶液萃取该北虫草子实体样品所获得。如此，该北虫草子实体萃取物所含有的北虫草类胡萝卜素能够有效地溶出于该乙醇水溶液中(例如于20～100分钟内即可以大量溶出，且每千克的北虫草子实体萃取物所含有的北虫草类胡萝卜素可以达200毫克以上)，无须重复多次萃取，达成优化用于获得该北虫草子实体萃取物的方法的工艺的功效。

本发明的北虫草子实体萃取物的用途，其中，该北虫草子实体萃取物可以由浓度为60％以上的乙醇水溶液萃取该北虫草子实体样品40～100分钟所获得。如此，该北虫草子实体萃取物所含有的北虫草类胡萝卜素能够有效地溶出于该乙醇水溶液中，使每千克的北虫草子实体萃取物所含有的北虫草类胡萝卜素可以达500毫克以上，实现优化用于获得该北虫草子实体萃取物的方法的工艺的功效。

本发明的北虫草子实体萃取物的用途，其中，该北虫草子实体萃取物可以由浓度为62.9％的乙醇水溶液萃取该北虫草子实体样品88.3分钟所获得。如此，该北虫草子实体萃取物所含有的北虫草类胡萝卜素能够有效地溶出于该乙醇水溶液中，使每千克的北虫草子实体萃取物所含有的北虫草类胡萝卜素可以达690毫克以上，实现优化用于获得该北虫草子实体萃取物的方法的工艺的功效。

本发明的北虫草子实体萃取物的用途，其中，该北虫草子实体萃取物以经口喂食的方式投予一所需个体。如此，使用者能够利用简便的方式摄取该北虫草子实体萃取物，有助于提升使用者的服药顺从性(drug compliance)。

本发明的北虫草子实体萃取物的用途，其中，该北虫草子实体萃取物能够以10～100毫克/千克/天的剂量连续投予该所需个体2～30天。如此，使该北虫草子实体萃取物具有较佳的保护感光细胞的能力，并可以防止视觉敏锐度、视觉对比敏感度的下降。

本发明的北虫草子实体萃取物的用途，其中，该北虫草子实体萃取物能够以20毫克/千克/天的剂量连续投予该所需个体7～22天。如此，使该北虫草子实体萃取物具有较佳的保护感光细胞的能力，并可以防止视觉敏锐度、视觉对比敏感度的下降。

本发明的北虫草子实体萃取物的用途，其中，该北虫草子实体萃取物能够以1～10毫克/千克/天的剂量连续投予该所需个体7～60天。如此，使该北虫草子实体萃取物具有较佳的保护感光细胞的能力，并可以防止视觉敏锐度、视觉对比敏感度的下降。

本发明的北虫草子实体萃取物的用途，其中，该北虫草子实体萃取物能够以1～3毫克/千克/天的剂量连续投予该所需个体7～22天。如此，使该北虫草子实体萃取物具有较佳的保护感光细胞的能力，并可以防止视觉敏锐度、视觉对比敏感度的下降。

本发明的北虫草子实体萃取物的用途，其中，该北虫草子实体萃取物能够以1～3次/天的频率连续投予该所需个体。如此，使该北虫草子实体萃取物具有较佳的保护感光细胞的能力，并可以防止视觉敏锐度、视觉对比敏感度的下降。

本发明的北虫草子实体萃取物的用途，其中，该北虫草子实体萃取物能够以2次/天的频率连续投予该所需个体。如此，使该北虫草子实体萃取物具有较佳的保护感光细胞的能力，并可以防止视觉敏锐度、视觉对比敏感度的下降。

附图说明

图1是北虫草黄素Ⅲ的化学结构式。

图2是试验(A)中，不同萃取时间下萃取所得的北虫草子实体萃取物中的北虫草类胡萝卜素的总含量的变化折线图。

图3是试验(B)中，以不同乙醇浓度的乙醇水溶液萃取所得的北虫草子实体萃取物中的北虫草类胡萝卜素的总含量的变化折线图。

图4是试验(C)中，以乙醇水溶液的乙醇浓度、萃取时间作为反应变异数，及以所得的北虫草子实体萃取物中的北虫草类胡萝卜素的总含量作为反应值，进行反应曲面法的模型预测所得的三维曲面反应图。

图5是试验(E)中，液相层析串连质谱仪的分析结果。

图6是试验(F)中，用以形成视网膜光损伤模型小鼠的LED光源所产生的白光的光谱图。

图7是试验(G)中，于试验1天时，第F1～F5组小鼠的外核膜区域中进入细胞凋亡的感光受体细胞的数量的柱状图。以Mann-Whitney U检定进行分析，其中，〝#〞代表与第F1组相比具有显著差异(p＜0.05)；〝＊〞代表与第F2组相比具有显著差异(p＜0.05)；〝＄〞代表与第F5组相比具有显著差异(p＜0.05)。

图8是试验(G)中，于试验1天时，第F3组小鼠的TUNEL检测分析结果，其中，〝ONL〞代表外壳膜(outer nuclear layer)区域，且〝INL〞代表内壳膜(inner nuclear layer)区域。

图9是试验(G)中，于试验1天时，第F5组小鼠的TUNEL检测分析结果，其中，ONL代表外壳膜区域，且INL代表内壳膜区域。

图10是试验(H)中，于试验第-5天至第15天之间，第F1～F5组小鼠的视觉敏锐度的阈值的变化折线。

图11是试验(H)中，于试验15天时，第F1～F5组小鼠的视觉敏锐度的阈值的柱状图。以Mann-Whitney U检定进行分析，其中，〝#〞代表与第F1组相比具有显著差异(p＜0.05)；〝＊〞代表与第F2组相比具有显著差异(p＜0.05)；〝＄〞代表与第F5组相比具有显著差异(p＜0.05)。

图12是试验(I)中，于试验第15天时，第F1～F5组小鼠的视觉对比敏感度的变化曲线图。

图13是试验(I)中，于试验第15天时，第F1～F5组小鼠的视觉对比敏感度能见度指数的柱状图。以Mann-Whitney U检定进行分析，其中，〝#〞代表与第F1组相比具有显著差异(p＜0.05)；〝＊〞代表与第F2组相比具有显著差异(p＜0.05)；〝＄〞代表与第F5组相比具有显著差异(p＜0.05)。

图14是试验(J)中，于试验第16天时，第F1～F5组小鼠的外核膜区域中的感光受体细胞的细胞核的数量的柱状图。以Mann-Whitney U检定进行分析，其中，〝#〞代表与第F1组相比具有显著差异(p＜0.05)；〝＊〞代表与第F2组相比具有显著差异(p＜0.05)；〝＄〞代表与第F5组相比具有显著差异(p＜0.05)。

具体实施方式

为让本发明的上述及其他目的、特征及优点能更明显易懂，下文特举本发明的较佳实施例，并配合所附图式，作详细说明如下：

本发明的北虫草子实体萃取物可以由一乙醇水溶液萃取一北虫草子实体样品所获得。举例而言，技术人员可以取10克的北虫草子实体样品混合100～1000毫升的乙醇水溶液(如，乙醇浓度为20％以上的乙醇水溶液)，于40～70℃的温度下回流萃取20～100分钟，在回流萃取的同时，也可以同时进行超音波震荡(频率为40kHz)，以提升萃取效率。依前述流程所得的北虫草子实体粗萃液，在经过滤、减压浓缩及冷冻干燥之后，即可以获得该北虫草子实体萃取物。

详而言之，该北虫草子实体样品可以为经由如中国台湾公告第I459953号专利案所揭示的方法所培养获得的北虫草子实体，先使用包含包含动物性蛋白(牛奶、肉汁萃取物、胎牛血清、鱼粉、鱼精、蚕蛹、红蚯蚓)、植物性蛋白、益生菌发酵液(乳酸菌发酵液、真菌发酵液)、中药材萃取液等的PCB(plate count broth)培养基，于20～24℃的温度下，以90rpm的转速进行摇瓶培养3～7天，以获得一北虫草菌丝体，将该北虫草菌丝体接种至包含白米或糙米或燕麦等的谷物培养基上，先于温度为18～25℃、湿度为70～90％的黑暗环境(光照强度约为0Lux)中培养5～7天，再于温度为18～25℃、湿度为70～90％的照光环境(光照强度为500Lux以上，且照光时间为每天8～15小时)再培养约50天，即可以获得该北虫草子实体样品。

较佳地，在以该乙醇水溶液进行萃取之前，技术人员可以预先将该北虫草子实体样品进行干燥，得到一北虫草干燥物(该北虫草干燥物的含水量低于15％)；此外，该北虫草子实体样品也可以预先进行碎成粉粒(例如粒径小于0.4mm的粉粒)，以增加该北虫草子实体样品与该乙醇水溶液的接触表面积，借此提升后续萃取的萃取效率。

于本实施例中，取100克的如上述所获得的北虫草子实体样品混合1000毫升的乙醇水溶液(乙醇浓度为62.9％的乙醇水溶液)，于70℃的温度下回流萃取88.3分钟，并且在回流萃取的同时，以超音波设备(DC-100H，购自三角洲超音波有限公司)进行超音波震荡(频率为40kHz)，在经过滤、减压浓缩及冷冻干燥之后，最终获得约5克的北虫草子实体萃取物。

依前述流程所获得的北虫草子实体萃取物富含类胡萝卜素(carotenoid，以下称为北虫草类胡萝卜素)，这些北虫草类胡萝卜素中，除了不溶于水的油溶性类胡萝卜素之外，也包含可溶于水的水溶性类胡萝卜素(water-soluble carotenoid)，其中更以具有如图1所示的化学式的北虫草黄素Ⅲ(cordyxanthinⅢ，2,3,2’,3’-tetradehydro-18,17’,18’-trinor-ε,ε-carotene-5,5’,-diol)为大宗(约占该北虫草子实体萃取物的北虫草类胡萝卜素总量的35％)，与同属于类胡萝卜素的叶黄素(β,ε-carotene-3,3’-diol，lutein)相比，前述北虫草黄素Ⅲ的甲烷基(methyl group)数量较少，使北虫草黄素Ⅲ具有良好的水溶解度，因而在投予一所需个体时，可以较为容易被该所需个体所吸收，进而于该所需个体的体内发挥北虫草黄素Ⅲ的生物活性(bioactivity)。

依前述流程所获得的北虫草子实体萃取物可以投予该所需个体，使该北虫草子实体萃取物中的活性成分(如包含北虫草黄素Ⅲ等北虫草类胡萝卜素)保护该所需个体的位于视网膜的感光受体细胞(photoreceptor cell)，防止这些感光受体细胞发生细胞凋亡(apoptosis)，因而可以防止在有害蓝光(泛指波长介于380～500nm的高能量可见光)的照射下导致的视网膜变性(retinal degeneration)，进而可以应用于制造提升抗蓝光伤害效应的药物，该北虫草子实体萃取物与医药学上可以接受的载剂或赋形剂组合形成一医药组合物，该北虫草子实体萃取物也可以制备成任何方便食用的型式，如锭剂、胶囊、粉剂、粒剂或液剂等，或者将该北虫草子实体萃取物与其他食品或饮料组合，以适于食用的方案供该所需个体以口服方式服用。

又，在该所需个体为一小鼠个体的情况下，该北虫草子实体萃取物能够以10～100毫克/千克/天的剂量投予该所需个体，较佳能够以20毫克/千克/天的剂量投予该所需个体。并且，该北虫草子实体萃取物能够连续投予该所需个体2～30天，较佳可以连续投予该所需个体7～22天。此外，该北虫草子实体萃取物能够以1～3次/天的频率连续投予该所需个体，较佳能够以2次/天的频率连续投予该所需个体。

而依据体表面积(body surface area，简称BSA)的剂量转换(dose translation)的公式(参考〝Dose translation from animal to human studies revisited〞期刊论文，Reagan-Shaw等人，2008年发表于《FASEB Journal》期刊)，进一步换算前述投予剂量，可以得知在该所需个体为一人类个体的情况下，该北虫草子实体萃取物的投予剂量可以为1～10毫克/千克/天，较佳约为1～3毫克/千克/天。并且，该北虫草子实体萃取物能够连续投予该所需个体7～60天，较佳可以连续投予该所需个体7～22天。此外，该北虫草子实体萃取物能够以1～3次/天的频率连续投予该所需个体，较佳能够以2次/天的频率连续投予该所需个体。

为证实本发明的北虫草子实体萃取物确实富含北虫草类胡萝卜素，且其中也包含前述北虫草黄素Ⅲ等北虫草类胡萝卜素，遂进行以下试验：

(A)萃取参数的优化(一)

本试验以乙醇浓度为65％的乙醇水溶液作为萃取溶剂，于55℃的温度下回流萃取如上述所获得的北虫草子实体样品，萃取时间分别为20、40、60、80或100分钟，且在回流萃取的同时，以超音波设备进行超音波震荡(频率为40kHz)，在经过滤、减压浓缩及冷冻干燥之后，以分光光度计测定于波长为445nm下的吸光值，进而换算北虫草类胡萝卜素的总含量(参考〝Metabolic Responses of Carotenoid and Cordycepin Biosynthetic Pathwaysin Cordyceps militaris under Light-Programming Exposure through Genome-WideTranscriptional Analysis〞期刊论文，Thananusak等人，2020年发表于《Biology》期刊)。

请参照图2所示，萃取时间介于20～100分钟均可以自该北虫草子实体样品中萃取出北虫草类胡萝卜素，其中以60～100分钟的萃取时间为佳。

(B)萃取参数的优化(二)

本试验分别以乙醇浓度为20％、40％、60％、80％及95％的乙醇水溶液作为萃取溶剂，于60℃的温度下回流萃取如上述所获得的北虫草子实体样品，萃取时间为50分钟，且在回流萃取的同时，以超音波设备进行超音波震荡(频率为40kHz)，在经过滤、减压浓缩及冷冻干燥之后，以如前述的分光光度计法分析所得的北虫草子实体萃取物中的北虫草类胡萝卜素的总含量。

请参照图3所示，乙醇浓度为20％以上均可以自该北虫草子实体样品中萃取出北虫草类胡萝卜素，其中以乙醇浓度为40％以上的乙醇水溶液的效果为佳。

(C)萃取参数的优化(三)

接着，以所使用的乙醇水溶液的乙醇浓度、萃取时间作为反应变异数(responsevariable)，并以所得的北虫草子实体萃取物中的北虫草类胡萝卜素的总含量作为反应值(response)，进行反应曲面法(response surface methodology，RSM)的模型预测，各反应变异数的统计结果以变异数分析法(analysis of variance，ANOVA)所得的结果如表1所示，且所得的三维曲面反应图(three-dimensional response surface plot)如图4所示。

表1、反应变异数的统计结果

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参照表1及图4的结果，以Design Expert 8.0软件分析可以得知，以乙醇浓度为62.9％的乙醇水溶液进行萃取，且萃取时间为88.3分钟的状况下，可以得到包含最多北虫草类胡萝卜素的北虫草子实体萃取物，且该北虫草子实体萃取物的北虫草类胡萝卜素的浓度(北虫草类胡萝卜素的总含量/北虫草子实体萃取物的总量)预测为690.8mg/kg。

(D)萃取参数的优化(四)

本试验以乙醇浓度为62.9％的乙醇水溶液作为萃取溶剂，于65℃的温度下回流萃取如上述所获得的北虫草子实体样品，萃取时间为88.3分钟，且在回流萃取的同时，以超音波设备进行超音波震荡(频率为40kHz)，在经过滤、减压浓缩及冷冻干燥之后，以分光光度计分析所得的北虫草子实体萃取物中的北虫草类胡萝卜素的总含量，可知于前述最佳参数下得到的北虫草子实体萃取物的北虫草类胡萝卜素的浓度为691.7±1.5mg/kg，与前述预测结果相似。

(E)北虫草类胡萝卜素的鉴定

本试验中，取以乙醇浓度为62.9％的乙醇水溶液作为萃取溶剂，于65℃的温度下进行回流萃取88.3分钟，且在回流萃取的同时，以超音波设备进行超音波震荡(频率为40kHz)，在经过滤、减压浓缩及冷冻干燥之后所得的北虫草子实体萃取物，将该北虫草子实体萃取物回溶于甲醇，使该北虫草子实体萃取物的浓度为1mg/mL之后，再以液相层析串连质谱仪(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS)进行鉴定。

详而言之，在收取包含北虫草类胡萝卜素的馏份(fraction)之后，再以质谱检测器(MSD-TRAP-XCT)分析所得的分离液，正电荷模式质谱检测器的参数为：离子喷雾电压(ion spray voltage，IS)为4,500V；雾化气体压力(nebulizer gas pressure)为12psi；氮气帘压力(nitrogen curtain gas pressure)为10psi；加热器温度(heater temperature)为450℃；碰撞活化解离(collision induced dissociation，CID)气体压力：6psi。

请参照图5所示，该北虫草子实体萃取物的分析结果可知在523m/z处具有一信号，推断该北虫草子实体萃取物中的水溶性北虫草类胡萝卜素至少包含分子量(molecularweight)为522Da的水溶性北虫草类胡萝卜素，与已知的北虫草黄素相比(参考〝Composition and Characterization of Cordyxanthins from Cordyceps militarisfruit bodies〞期刊论文，Dong等人，2013年发表于《Journal of Functional Foods》期刊)，可知该北虫草子实体萃取物中的水溶性北虫草类胡萝卜素中最大宗的为北虫草黄素Ⅲ。

接着，为证实本发明的北虫草子实体萃取物确实能够于活体内保护位于视网膜的感光受体细胞，因而可以防止在有害蓝光的照射下导致的视网膜变性，进而可以应用于制造提升抗蓝光伤害效应的药物，遂以前述最佳参数下得到的北虫草子实体萃取物进行，将24mg的北虫草子实体萃取物，溶于800μL的载体溶液中，该载体溶液包含以体积百分比计为50％的水、20％的聚乙二醇400(polyethylene glycol 400，PEG400)及30％的丙三醇(glycerol)，再加入10μL的氢氧化钠水溶液(浓度为12N)，以将酸碱值调整为11以上，震荡隔夜之后，再以约35～40μL的盐酸水溶液(浓度为4N)，以将酸碱值调整为介于7.0～7.5之间备用。

(F)视网膜光损伤模型小鼠的建立

以下试验选用8～14周龄的ICR(BLTW：CD1)小鼠作为试验动物(购自中国台湾乐斯特生物科技股份有限公司)，将前述小鼠饲养于温度为23±2℃、湿度为55±7％的动物室中，且可以自由进食及饮水，并且依表2所示，将小鼠分为第F1～F5组(各4只小鼠)。

表2、各组小鼠的处理条件

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自试验开始的前5天起，以每天2次的频率(于每天的下午5点及上午9点)，以喂食管(oral gavage)将该载体溶液(第F1、F2组)、低剂量的叶黄素粉末(第F3组)、高剂量的叶黄素粉末(第F4组)及该北虫草子实体萃取物(第F5组)分别经口投予前述小鼠，并且于试验的第0天时，将第F2～F5组小鼠置入一处理箱中，该处理箱的四周以锡箔纸包裹，上方有一LED光源，该LED光源能够产生14,000～20,000Lux的光通量的白光，该白光的光谱图(spectrogram)如第6图所示(其中波长介于380～500nm之间的有害蓝光约占可见光的光通量的27.1％，即约为3,800～5,500Lux)，以该LED光源所产生的白光对第F2～F5组小鼠进行光照处理4～5小时，使这些小鼠的视网膜的感光受体细胞(photoreceptor cell)发生细胞凋亡(apoptosis)，进而形成视网膜光损伤模型(light-induced retinal damage model)小鼠。

此外，在试验的第0天至第15天，仍然以每天2次的频率，将该载体溶液(第F1、F2组)、低剂量的叶黄素粉末(第F3组)、高剂量的叶黄素粉末(第F4组)及该北虫草子实体萃取物(第F5组)分别经口投予前述小鼠。

(F)细胞凋亡的分析结果

于试验的第1天(对第F2～F5组小鼠进行光照处理的24小时之后)，将前述第F1～F5组小鼠牺牲之后，快速摘除眼睛，接着以固定液进行固定。将固定的眼睛包埋于石蜡(paraffin)中，并进行垂直切片，选择包含外核膜(outer nuclear layer，ONL)区域的切片进行TUNEL检测(terminal deoxynucleotidyl transferase(TdT)dUTP nick andlabeling assay)，即以末端去氧核苷酸转移酶(terminal deoxynucleotidyltransferase，TdT)，将经溴化去氧尿嘧啶(bromodeoxyridine，BrdU)或绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)等标记物标记的脱氧尿苷三磷酸(2’-deoxyuridine5’-triphosphate，dUTP)掺入由断裂的DNA所产生的3’-羟基黏性末端(3’-OH stickyend)，再以抗体辨识该标记物以进行染色，进而可以标记各组小鼠的切片中的DNA断裂(DNAfragmentation)，以计算外核膜区域中进入细胞凋亡的感光受体细胞的数量。

请参照图7所示，该光照处理会导致感光受体细胞大量进入细胞凋亡(第F2组)，预先喂食该北虫草子实体萃取物有助于减少进入细胞凋亡的感光受体细胞的数量(第F5组)，且其效果显著优于预先喂食低剂量或高剂量的叶黄素(第F3、F4组)。第F3、F5组的TUNEL染色分析结果分别如图8、9所示。

以下所述的视觉敏锐度(visual acuity，VA)及视觉对比敏感度(visualcontrast sensitivity function，VCSF)等试验，均基于动物的视动反射(optomotorreflex，OMR)，各试验的阈值由一受试小鼠的视野(visual field)出现刺激光栅(stimulusgrating)时，该受试小鼠的反射性头部移动(reflexive head movement)所决定。详而言之，将该受试小鼠放置于一高台上，该高台的前方设置一显示器，该受试小鼠与荧幕之间的距离为15厘米，且覆盖110×90°的视野，该显示器显示用以激发该受试小鼠的是视动反射的刺激光栅(该刺激光栅为彼此宽度相等、间距相等的数个垂直光栅)。操作者可以记录受试小鼠的头部及身体的反射运动(即，该受试小鼠的头部及身体是否跟着该刺激光栅移动)，借此获知该受试小鼠的阈值。

(G)视觉敏锐度试验

分别于试验开始的前5天(第-5天)、试验的第0天(进行光照处理之后)及第5、10、15天，进行视觉敏锐度试验。

于视觉敏锐度试验中，操作者将该显示器上的刺激光栅的对比度设为100％，该显示器以0.033、0.055、0.082、0.164、0.328及0.437周期/度(cycle per decree，cpd)的空间频率(spatial frequency)，及以每秒12度(°)的恒定旋转速度(constant rotationalspeed)水平飘移，显示由全荧幕矩形波(full-screen square wave)所组成的间歇性刺激(episodic stimulus)。在开始该刺激光栅之后，操作者即可以记录受试小鼠的头部及身体的反射运动(即，该受试小鼠的头部及身体是否跟着该刺激光栅移动)，直到前述反射运动不再与该刺激光栅协调，借此获知该受试小鼠于100％的对比度下的阈值。

请参照图10所示，在经过该光照处理之后，第F2～F5组小鼠的视觉敏锐度均有所损伤，但以预先喂食该北虫草子实体萃取物的第F5组小鼠的视觉敏锐度损伤程度较低(第0天)，在经过15天之后，无论是预先喂食低剂量或高剂量的叶黄素的第F3、F4组小鼠，或是预先喂食该北虫草子实体萃取物的第F5组小鼠，其视觉敏锐度的阈值均有所上升，但效果仍以预先喂食该北虫草子实体萃取物的第F5组小鼠的恢复程度最佳。

续请参照图11所示，以第15天的试验结果为例，该光照处理会破坏该受试小鼠的视觉敏锐度(第F2组)，预先喂食该北虫草子实体萃取物有助于恢复该受试小鼠的视觉敏锐度(第F5组)，且其效果显著优于预先喂食低剂量或高剂量的叶黄素(第F3、F4组)。

(H)视觉对比敏感度试验

于试验的第15天，进行视觉对比敏感度试验。

于视觉对比敏感度试验中，操作者则是将该显示器上的刺激光栅的对比度分别设为10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％及100％等不同级别，并重复上述试验，借此获知该受试小鼠于10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％及100％等对比度下的阈值，据此可以绘出如图12所示的视觉对比敏感度曲线(VSCF curve)，再依据该视觉对比敏感度曲线下的面积换算为如图13所示的视觉对比敏感度能见度指数(VSCFvisibility index)。

请参照图12、13所示，该光照处理会使该受试小鼠的视觉对比敏感度曲线缩小，使视觉对比敏感度能见度指数下降(第F2组)，喂食该北虫草子实体萃取物有助于恢复该受试小鼠的视觉对比敏感度能见度指数(第F5组)，且其效果显著优于预先喂食低剂量或高剂量的叶黄素(第F3、F4组)。

(I)组织染色结果分析

于试验的第16天，将前述第F1～F5组小鼠牺牲之后，快速摘除眼睛，接着以固定液进行固定。将固定的眼睛包埋于石蜡(paraffin)中，并进行垂直切片(厚度为5μm)，选择包含外核膜及内核膜区域的切片进行苏木精─伊红染色(hematoxylin and eosin stain，H&E stain)，计算与视神经头(optic nerve head，ONH)相距约0.4～0.6mm处的细胞核的数量。

请参照图14所示，该光照处理会导致感光受体细胞的死亡而降低所能够染色到的细胞核的数量(第F2组)，预先喂食该北虫草子实体萃取物有助于减缓感光受体细胞的死亡，使染色到的细胞核的数量有所提升(第F5组)，其效果显著优于预先喂食低剂量的叶黄素(第F3组)，但与预先喂食高剂量的叶黄素(第F4组)无显著差异。

综上所述，本发明的北虫草子实体萃取物的用途，能够以该北虫草子实体萃取物所含有的活性成分(如包含北虫草黄素Ⅲ等北虫草类胡萝卜素)保护该所需个体的位于视网膜的感光受体细胞，防止该些感光受体细胞发生细胞凋亡，因而可以防止在有害蓝光(泛指波长介于380～500nm的高能量可见光)的照射下导致的视网膜变性，进而可以应用于制造提升抗蓝光伤害效应的药物，为本发明的功效。