一种重组杆状病毒载体及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于病毒载体技术领域，尤其涉及一种重组杆状病毒载体及其构建方法和应用。

背景技术

从哺乳动物到低等无脊椎动物，p53的作用机制在进化上是保守的。哺乳动物p53是细胞凋亡的关键调控因子，其通过调控细胞凋亡、DNA修复、遗传稳定性、细胞周期阻滞和衰老等多种途径参与一系列应激反应，可以有效避免机体发生炎症反应。p53基因是迄今发现与人类肿瘤相关性最高的基因，是当前肿瘤分子生物学研究的热点。

构建Bmp53过表达转基因细胞系和个体，研究Bmp53信号通路对于变态期组织凋亡与重塑等发育过程的调控作用，能够更好的认识家蚕变态期组织凋亡的遗传调控，同时为变态发育为主的害虫生物防治提供重要的基础信息。

目前昆虫杆状病毒表达系统已广泛用于各种重组蛋白的生产。然而，还未有用于过表达家蚕Bmp53的重组杆状病毒载体。

发明内容

发明目的：本发明的第一目的是提供一种重组杆状病毒载体。

本发明的第二目的是提供所述重组杆状病毒载体的构建方法。

本发明的第三目的是提供含有所述重组杆状病毒载体的表达盒、重组病毒、重组细胞或重组菌。

本发明的第四目的是提供所述重组杆状病毒载体，以及含有所述重组杆状病毒载体的表达盒、重组病毒、重组细胞或重组菌在研究家蚕发育和变态情况中的应用。

技术方案：本发明的重组杆状病毒载体，包括p10启动子、EGFP核酸序列、pH启动子和Bmp53核酸序列，所述p10启动子启动EGFP基因表达，所述pH启动子启动Bmp53基因表达。

一种所述重组杆状病毒载体的构建方法，包括以下步骤：

(1)分别设计用于家蚕Bmp53和EGFP基因片段扩增的引物；

(2)用引物扩增的方法获得Bmp53基因片段和EGFP基因片段；

(3)步骤(2)所述EGFP基因片段连接到带有启动子p10和pH的表达载体，获得重组质粒p10-EGFP-pH；

(4)步骤(2)所述Bmp53基因片段连接到步骤(3)所述重组质粒p10-EGFP-pH，获得重组质粒p10-EGFP-pH-Bmp53。

(5)将步骤(4)所述重组质粒p10-EGFP-pH-Bmp53转化DH10Bac感受态细胞，在复合抗生素平板上培养，挑取白色克隆鉴定，即得

优选的，步骤(1)所述用于家蚕Bmp53基因扩增的引物为：

Bmp53-F(BamHI)：AAGGATCCATGAAACACGAAATCATGAC；

Bmp53-R(XbaI)：CTAGTCTAGA TTCGCTGGCATGTTTCGTCG；

步骤(1)所述用于EGFP基因扩增的引物为：

EGFP-F(SmaI)：TCCCCCGGGATGGTGAGCAAGGGCGAG；

EGFP-R(KpnI)：CGGGGTACCTCACTTGTACAGCTCGTCC。

优选的，所述用于家蚕Bmp53基因片段扩增的上游引物设有BamHI酶切位点，下游引物设有XbaI酶切位点，用于EGFP基因片段扩增的上游引物设有SmaI酶切位点，下游引物设有KpnI酶切位点。

本发明内容还包括所述重组杆状病毒载体的表达盒、重组病毒、重组细胞或重组菌。

本发明内容还包括所述重组杆状病毒载体、表达盒、重组病毒、重组细胞或重组菌在研究家蚕发育和变态情况中的应用。

本发明内容还包括所述的重组病毒在研究家蚕发育和变态情况中的应用，包括如下步骤，将所述重组杆状病毒载体转染家蚕细胞，收集细胞中的病毒液感染家蚕，饲养并观察家蚕的生长发育情况。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：(1)可以显著提高Bmp53基因的表达量；(2)通过将Bmp53基因与绿色荧光基因EGFP基因共表达，使Bmp53基因的表达可视化，便于研究观察；(3)有助于更好的认识家蚕变态期组织凋亡的遗传调控，为通过抑制凋亡增加丝蛋白的合成提供理论基础，同时为防治变态发育为主的害虫生物和凋亡引起的人类疾病提供重要的基础信息。

附图说明

图1为家蚕Bmp53 CDS序列及推导氨基酸序列；

图2为pfastbac-dual-p10-EGFP-pH-Bmp53载体示意图；

图3为Bacmid重组病毒质粒PCR扩增EGFP和Bmp53基因鉴定；

图4为Bacmid转染家蚕转基因细胞系及Bmp53表达量分析；

图5为Bacmid富集杆状病毒感染家蚕转基因个体及Bmp53表达量分析。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。

实施例1克隆家蚕Bmp53基因

利用家蚕基因组数据库SilkDB 3.0(bioinfotoolkits.net)和NCBI gene(Home-Gene-NCBI(nih.gov))数据库设计家蚕Bmp53基因片段扩增引物，上游引物设有BamHI酶切位点，下游引物设有XbaI酶切位点。根据如下EGFP序列设计基因片段扩增引物，上游引物设有SmaI酶切位点，下游引物设有KpnI酶切位点。

EGFP序列来源于质粒pcDNA3.0-IE1-EGFP。pcDNA3.0-IE1-EGFP为可在家蚕细胞表达的质粒，由pcDNA3.0(Invitrogen)经农业农村部蚕桑遗传改良重点实验室改良而成。序列如下：

ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA(SEQ ID NO.1)

引物设计如下：

Bmp53-F(BamHI):AAGGATCCATGAAACACGAAATCATGAC(SEQ ID NO.2)；

Bmp53-R(XbaI):CTAGTCTAGA TTCGCTGGCATGTTTCGTCG(SEQ ID NO.3)；

EGFP-F(SmaI):TCCCCCGGGATGGTGAGCAAGGGCGAG(SEQ ID NO.4)；

EGFP-R(KpnI):CGGGGTACCTCACTTGTACAGCTCGTCC(SEQ ID NO.5)。

以中国农业科学院蚕业研究所保存的纯种P50家蚕为材料，取100mg家蚕组织，提取总RNA，利用反转录试剂盒HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(+gDNAwiper)(R312，Vazyme)进行反转录，合成cDNA。以上述合成的cDNA为模板，扩增体系如下：

PCR扩增反应条件如下：

上述Bmp53基因PCR扩增片段进行胶回收保存。如图1所示，克隆所得CDS序列为1107bp的Bmp53基因，编码368个氨基酸，GenBank登录号为HM773025.1。Bmp53CDS序列如下：

ATGAAACACGAAATCATGACATCTCTTGAGGTTGCCACATGCGAAGATGACATAGTGAACATTGATTTGAACACTATACCGGATGAAGCATTGTTTCAAGGGGGGATACACGATCAAGTTGACATTGGAGTGCTAGATGACATTCCGTACATAATCAGTGATGTGTCTAACAATTCAAACAATTCCTTTCCTCTTGGACCCCGAGGACCGCCGCCTCGCAAAGACGATCCCGGGCAATACAACTTCAGCGTCGAAATCCACAGCAAGGATACACACAAGAAGAAGTTCTTGTTCTCGCACAAGCTGAACCGGATCTACGTGAACATGGAGACCGACTTCGCTGTCCAGTTCAACTGGGAGCTGGTGGACCTCGCCGTGACGCAGATGTACGTGCGCGCCACCGTCGTCTTCGAGGACGAGTCCCAGGCCGAGAAGAGAGTCGAGAGATGCATCCAGCACAAACTCTGCAGTTCCGATAAAGGCCAGGACCGCGTCGTGTCGGAGAACGTGCTGCGCTCGTCGCGGCCCCTGGGCACCAACGACGTGCAGTACTGCGGCCACCCGGACGACCCCGACTACTGGTACTCCGTGCTGGTGCAGCTGCCCAAGCCGGGCCGGGAGCCTTGCACGCACGCCTTCAAGTTCGTCTGCAAGAACTCCTGCAGCACCGGCATCAACCGCCGCTCCATAGCCGTCATCTTCACCCTGGAGAGCGCCTCCGGCTCGGTGCTGGGGCGGCAGACGGTGGGCGCGCGGGTGTGCTCGTGCACGGCGCGCGACATGTGCAAGGACGAGGAGGCGGAGGGCGCGCGCGCGGCCAGGAAGCGGCCCCGGCCCGCGCAGTCGCGCCTCCTCAAGAAGATCAAGCTGGAGACCGTCGGCGACCTGCCCGTCGACGCCGAGACCCTCACCCTGCCGCCGCTGGAAATTATCGGAGCCAAAACGGTGAAGACCGGCCTGGAAGTGATGCTGCGCATGATGGAGCAGGCGGCCCACTTCCACAAGCACGACCAGCTCGCCGCCGACGGCTACCAGCGCCGCGTCGCCAGCCTCCGACAGTACATCGACACGCTCGACGCCAAACCGACGAAACATGCCAGCGAATAG(SEQ ID NO.6)

以pcDNA3.0-IE1-EGFP质粒为模板，按上述扩增体系和反应条件扩增EGFP序列。

实施例2构建过表达重组载体pfastbac-dual-p10-EGFP-pH-Bmp53

取带有启动子p10和启动子pH的pfastbac-dual(Invitrogen)和EGFP回收产物分别用KpnI-HF(R3142，NEB)和SmaI(R0141，NEB)两种限制性内切酶进行双酶切反应，酶切体系如下：

将回收所得产物采用Solution I在16℃下连接2h，连接产物转化DH10B感受态细胞，培养单菌落，提取质粒并利用如下引物扩增：

pFastbac-F:TATTCCGGATTATTCATACC(SEQ ID NO.7)；

pFastBac-R:ACAAATGTGGTATGGCTGA(SEQ ID NO.8)。

获得符合预期大小的目的片段并测序鉴定，得到重组质粒pfastbac-dual-p10-EGFP。

取pfastbac-dual-p10-EGFP载体和Bmp53分别用BamHI(R0136，NEB)和XbaI(R0145，NEB)两种限制性内切酶进行双酶切反应，酶切体系如下：

将回收所得产物采用Solution I在16℃下连接2h，连接产物转化DH10B感受态细胞，培养单菌落，提取质粒进行BamHI和XbaI双酶切鉴定，提取质粒并利用如下引物扩增鉴定：

pFastbac-F:TATTCCGGATTATTCATACC(SEQ ID NO.7)；

pFastbac-R:ACAAATGTGGTATGGCTGA(SEQ ID NO.8)。

得到重组质粒pfastbac-dual-p10-EGFP-pH-Bmp53。如图2所述，绿色荧光蛋白基因EGFP通过KpnI和SmaI位点插入p10启动子下，家蚕基因Bmp53通过BamHI和XbaI位点插入pH启动子下，最终质粒大小6960bp。

将上述1ng重组质粒pfastbac-dual-p10-EGFP和pfastbac-dual-p10-EGFP-pH-Bmp53分别转化DH10Bac感受态细胞，在50μg/ml卡那霉素、7μg/ml庆大霉素、7μg/ml四环素、40μg/ml X-gal和40μg/ml IPTG复合抗生素平板上生长36h，挑取白色克隆用M13引物鉴定。本实施例分别构建了Bmp53过表达重组杆状病毒载体Bacmid-p10-EGFP-pH-Bmp53和作为对照的空载Bacmid-p10-EGFP，如图3所示鉴定结果，条带分别约2000bps和900bps左右。

实施例3建立Bmp53过表达转基因家蚕细胞系

转染步骤按照EntransterTM-D4000(Engreen)说明书进行。转染前24h接种BmN细胞(3X10

在FITC显微镜下观察到绿色荧光蛋白且上述两种转染细胞少量死亡时，分别收集一代病毒液。病毒液以100μl/孔加入6孔板，约48h可建成稳定的Bmp53过表达转基因及EGFP对照家蚕细胞系。待细胞完全表达荧光后收集病毒液上清，收集细胞用于Bmp53信号通路分析，并检测蛋白表达情况。

如图4所示，荧光显微镜下，Bacmid转染家蚕细胞显示绿色荧光，表明EGFP在细胞中表达。通过定量PCR检测，发现转入Bacmid-p10-EGFP-pH-Bmp53重组杆状病毒载体细胞中Bmp53表达量是转入空载对照Bacmid-p10-EGFP的两倍以上。

实施例4构建Bmp53信号传导通路过表达的家蚕个体

上述步骤中收集的Bacmid-p10-EGFP-pH-Bmp53病毒液取5ml，加至放置有5ml20％糖垫的超速离心管中，配平后25000rpm在4℃下超速离心2h。超离完成后去上清，用500ul PBS悬浮，加PBS定容到10ml称重配平，35000rpm在4℃下超离1h，用300ul PBS 4℃过夜悬浮，制成富集病毒液，置于-20℃冰箱备用。为探究Bmp53对变态发育的影响，等待家蚕生长至5龄第6天，在腹部第三与第四体节节膜处用10μl微量注射器注射5μl富集病毒液，待4～5天可在体视显微镜下见蚕体发绿色荧光，从而获得Bmp53信号传导通路过表达的家蚕个体。Bacmid-p10-EGFP病毒液转染家蚕个体按如上步骤操作。同时选取同批次(5龄第6天)未经任何处理的家蚕作为正常对照(normal)，待正常对照(normal)化蛹后在体视显微镜下观察所有处理，并定量检测Bmp53表达量。

如图5所示，Bacmid转染家蚕个体体视显微镜下家蚕现绿色荧光，表明杆状病毒成功感染个体且EGFP在个体中表达。通过定量PCR检测发现转入Bacmid-p10-EGFP-pH-Bmp53重组杆状病毒载体细胞中Bmp53表达量是转入空载对照Bacmid-p10-EGFP的两倍以上。