SlCAS基因及其所编码的蛋白质在调控番茄抗灰霉病中的应用

技术领域

本发明属于微生物基因工程技术领域，尤其涉及SlCAS基因及其所编码的蛋白质在调控番茄抗灰霉病中的应用。

背景技术

灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)引起的植物灰霉病属于世界性病害，是露地和保护地植物常见且较难防治的一种真菌性病害。灰葡萄孢菌是典型的死体营养型病原真菌，可侵染1400多种不同的寄主植物，包括几乎所有的蔬菜及果树。寄主植株从苗期到挂果期、运输、储存期均可发病，造成巨大的经济损失，特别是在现代设施农业的快速发展阶段，为灰霉病的发生提供了适宜的环境条件，灰霉病的危害呈逐年提高的趋势。正因为它寄主广泛、危害巨大，灰葡萄孢菌名列分子植物病理学中十大重要真菌病原物的第二位。目前对灰葡萄孢菌的防治还没有十分有效的方法，传统的解决方法是使用大量的农药，不仅涉及食品安全，而且还造成环境污染，严重危害人们的身体健康。因此，亟需深入研究灰葡萄孢菌的致病机制，以便寻找到有效和环境友好的灰霉病防治方法。

番茄(Solanum lycopersicum)富含丰富的维生素、番茄红素、蛋白质等营养成分，在世界上种植面积广阔，深受消费者喜爱。但病害严重制约其生产及采后保鲜，降低生产的经济效益。随着温室栽培的普及，大量农药的滥用，番茄灰霉病抗药性增加，使得灰霉病的防治愈加困难。因此，培育番茄灰霉病抗性品种具有重要的价值。

发明内容

本发明实施例的目的在于提供SlCAS基因及其所编码的蛋白质在调控番茄抗灰霉病中的应用，旨在解决上述背景技术中提出的问题。

本发明实施例是这样实现的，SlCAS基因及其所编码的蛋白质在调控番茄抗灰霉病中的应用，所述的SlCAS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的SlCAS基因编码的SlCAS蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步的技术方案，所述的调控番茄抗灰霉病是通过培育SlCAS基因过表达的转基因植株来实现的。

进一步的技术方案，所述转基因植株的获取方法包括以下步骤：

步骤1：过表达载体的构建，

提取野生型番茄植株叶片的总RNA，反转录出cDNA第一条链，以获得的cDNA为模板，引物对为：

SlCAS1-L:TACGAACGATACTCGACCCCATGGCACTTAGAGCTTCAGCSlCAS1-R:TAGAGTCGACGGATCCCCATCTGAAAGCAATTTGACAGTGCC；

进行PCR扩增，胶回收约1100bp的DNA片段。用限制性内切酶SmaI酶切pCambia1300-YFP载体，使其线性化，凝胶电泳回收线性化载体。利用无缝克隆技术将目标基因片段连接到pCambia1300-YFP载体上，构建过表达载体。

步骤2：根癌农杆菌介导遗传转化获得过表达植株，

将重组质粒35S-SlCAS-YFP通过冻融法转化至根癌农杆菌GV3101，得到重组农杆菌。选取阳性菌进行挑菌、保菌，菌液存放于-80℃冰箱进行后续的实验，无菌处理的番茄外植体预培养2d后，膨大的子叶外植体在制备好的农杆菌菌液中浸泡10～15min，在灭菌滤纸上吸取多余菌液后接种到铺上无菌滤纸的预培养培养基上。之后进行继代培养和生根培养，获得T0代番茄植株，自交获得T1代转基因种子；

步骤3:转基因植株抗灰霉病功能的鉴定，

步骤3.1：植物材料的播种和培养；

步骤3.2：转基因阳性苗的鉴定

取新鲜叶片样品提取DNA，基因组DNA的提取采用2％CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)抽提缓冲液的方法。引物：

35SF：GACGCACAATCCCACTATCC，

SlCAS1RT2:TAGATGGAAGACGAGGGA；进行PCR扩增，PCR结束后，按1g：100mL的比例配制琼脂糖和TAE缓冲液，转基因载体作为阳性对照，同时设置阴性对照。与过表达载体有对应的条带的即为阳性植株，挑选阳性植株进行后续的留种以及其他实验。

进一步的技术方案，所述步骤2中的冻融法转化的具体步骤如下：

步骤2.1：取-80℃保存的农杆菌感受态于室温或手心片刻待其部分融化，处于冰水混合状态时插入冰中。

步骤2.2：每50μL感受态加入5μL(或者更少一些)质粒DNA，用手拨打管底混匀，依次于冰上静置5min、液氮5min、37℃水浴5min、冰浴5min。

步骤2.3：加入500μL LB液体培养液(不加抗生素)，于28℃振荡培养3～5h。

步骤2.4：6000rpm离心1min收菌，留取100μL左右上清液轻轻吹打重悬菌块涂布于含利福平和潮霉素的LB平板上，倒置放于28℃培养箱培养2～3d。

进一步的技术方案，所述步骤2中的农杆菌菌液的制备具体步骤如下：

吸取保存好的菌液5μL，接种于含有利福平和潮霉素的5mL LB液体培养基中(具体用量可按比例增加)，28℃、200rpm/min振荡培养至对数生长期。测定其0D

进一步的技术方案，所述步骤3.1包括以下具体步骤：

番茄在种植前需要进行催芽处理，将种子放入垫有两张吸水滤纸的培养皿中，加入适量的蒸馏水在培养室黑暗培养2～3d进行催芽。出芽后播在由泥炭土和蛭石(体积比为3：1)混合作为基质的营养钵中，顶部覆盖相同厚度的基质。放置在培养室中，生长环境为：温度25/20℃(昼/夜)，光周期16/8h光暗循环，光照强度600mol·m

进一步的技术方案，所述步骤3.2中的PCR反应体系(10μL)如下：

反应条件为：

本发明实施例提供的SlCAS基因及其所编码的蛋白质在调控番茄抗灰霉病中的应用，是将所述SlCAS基因通过根癌农杆菌介导的方式转入番茄外植体，对转基因植株接种灰葡萄孢菌后，与对照组野生型植株进行表型观察和生理指标测定，同时研究其抗灰霉病的生理机理，探索其中涉及的基因层面的分子机制，同时验证了过表达番茄SlCAS-2、SlCAS-4和SlCAS-6具有显著的抗灰霉病的能力，番茄基因SlCAS具有显著的抗灰霉病的能力。

附图说明

图1为番茄SlCAS基因在不同组织预测表达量；

图2为盐胁迫下SlCAS基因的表达分析；

图3为低温胁迫下SlCAS基因的表达分析；

图4为高温胁迫下SlCAS基因的表达分析；

图5为干旱胁迫下SlCAS基因的表达分析；

图6为脱落酸(ABA)处理下SlCAS基因的表达分析；

图7为油菜素内酯(BR)处理下SlCAS基因的表达分析；

图8为离体接种灰葡萄孢菌后不同品系番茄叶片的感病情况；

图9为MT和三个转CAS基因株系离体接种灰葡萄孢菌处理3d后叶片病斑面积；

图10为灰葡萄孢菌喷施后不同品系的病情指数；

图11为灰葡萄孢菌喷施后POD含量。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

以下结合具体实施例对本发明的具体实现进行详细描述。

实施例一：

一、野生型番茄植株不同组织部位SlCAS表达情况，其中所述的SlCAS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的SlCAS基因编码的SlCAS蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所用植物材料为番茄常规实验品种Micro Tom，由实验室繁育保存。

利用实时荧光定量技术检测SlCAS在野生型番茄植株中不同组织部位的表达情况，包括根、茎、叶、花、果实(授粉后14d)和成熟红果。总RNA的提取使用北京全氏金生物技术有限公司生产的试剂盒，TAKARA公司生产的试剂盒PrimeScript

根据上表进行加样，以番茄的Actin作为内参基因，程序为：预变性95℃30s，PCR反应95℃5s，60℃30s，共40个循环。熔解曲线程序为95℃5s,60℃1min，95℃15s，50℃30s。每个样品3次重复，待反应结束后分析荧光值变化曲线。

其中，检测SlCAS的引物为：

SlCAS1RT1:CGTGGTTACAAGGGTGAA，

SlCAS1RT2:TAGATGGAAGACGAGGGA；

Actin的引物为：

SlActin-F:TGTCCCTATCTACGAGGGTTATGC；

SlActin-R:AGTTAAATCACGACCAGCAAGAT。

二、野生型番茄植株盐处理不同时期后SlCAS表达情况

对一批野生型番茄进行盐处理(200mmol/L的NaCl溶液)，在开始处理的第0h、1h、3h、6h、12h、24h分别对番茄植株进行取样，每次取3株，取过样的下次则不再取。检测SlCAS在盐处理不同时期的表达情况，总RNA的提取、cDNA第一条链的合成以及表达水平的测定同上。

三、转基因植株的获得

1、过表达载体的构建

提取野生型番茄植株叶片的总RNA，反转录出cDNA第一条链，以获得的cDNA为模板，引物对为：

SlCAS1-L:TACGAACGATACTCGACCCCATGGCACTTAGAGCTTCAGCSlCAS1-R:TAGAGTCGACGGATCCCCATCTGAAAGCAATTTGACAGTG CC；

进行PCR扩增，胶回收约1100bp的DNA片段。用限制性内切酶SmaI酶切pCambia1300-YFP载体，使其线性化，凝胶电泳回收线性化载体。利用无缝克隆技术将目标基因片段连接到pCambia1300-YFP载体上，构建过表达载体。

2、根癌农杆菌介导遗传转化获得过表达植株

将重组质粒35S-SlCAS-YFP通过冻融法转化至根癌农杆菌GV3101，得到重组农杆菌。冻融法转化的步骤如下：

(1)取-80℃保存的农杆菌感受态于室温或手心片刻待其部分融化，处于冰水混合状态时插入冰中。

(2)每50μL感受态加入5μL(或者更少一些)质粒DNA，用手拨打管底混匀，依次于冰上静置5min、液氮5min、37℃水浴5min、冰浴5min。

(3)加入500μL LB液体培养液(不加抗生素)，于28℃振荡培养3～5h。

(4)6000rpm离心1min收菌，留取100μL左右上清液轻轻吹打重悬菌块涂布于含利福平和潮霉素的LB平板上，倒置放于28℃培养箱培养2～3d。

选取阳性菌进行挑菌、保菌，菌液存放于-80℃冰箱进行后续的实验。

农杆菌菌液的制备：吸取保存好的菌液5μL，接种于含有利福平和潮霉素的5mL LB液体培养基中(具体用量可按比例增加)，28℃、200rpm/min振荡培养至对数生长期。测定其0D

四、SICAS过表达番茄材料抗灰霉病功能的鉴定

1、植物材料的播种和培养条件

番茄在种植前需要进行催芽处理，将种子放入垫有两张吸水滤纸的培养皿中，加入适量的蒸馏水在培养室黑暗培养2～3d进行催芽。出芽后播在由泥炭土和蛭石(体积比为3：1)混合作为基质的营养钵中，顶部覆盖相同厚度的基质。放置在培养室中，生长环境为：温度25/20℃(昼/夜)，光周期16/8h光暗循环，光照强度600mol·m

2、转基因阳性苗的鉴定

取新鲜叶片样品提取DNA，基因组DNA的提取采用2％CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)抽提缓冲液的方法。引物：

35SF：GACGCACAATCCCACTATCC，

SlCAS1RT2:TAGATGGAAGACGAGGGA；进行PCR扩增，PCR反应体系(10μL)如下：

反应条件为：

PCR结束后，按1g：100mL的比例配制琼脂糖和TAE缓冲液，转基因载体作为阳性对照，同时设置阴性对照。与过表达载体有对应的条带的即为阳性植株，挑选阳性植株进行后续的留种以及其他实验。

3、过表达SlCAS植株与野生型植株表型观察

在植株生长过程中我们发现，处在同一生长时期的野生型Micro Tom和SlCAS转基因T2代植株在株高上存在较大差异，野生型植株显著高于SlCAS过表达植株。同一批次播种的两组植株生长两个半月后，此时的植株高度和茎粗不再发生变化，对两组植株进行表型观察，测量其株高和茎粗。每组选取相同生长环境下长势一致的番茄植株，株高测量以子叶节所在位置到顶部分生花序为范围，单位为cm；茎粗以第一节间直径为准，用游标卡尺进行测量，单位为mm。

4、灰葡萄孢菌分生孢子悬浮液的准备

灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)标准菌株B05.10。将灰葡萄孢菌标准菌株B05.10用PDA培养基重新活化，培养到第10天的时候，培养基表面会生成大量的分生孢子，用1/2PDB培养液收集培养皿表面的分生孢子，过滤除去菌丝。将孢子液浓度调至1×10

5、番茄的培养

番茄(Solanum lycopersicum cv Moneymaker)在25℃、相对湿度80％、光周期为14h:10h光/暗的条件下培养到7周的时候进行与灰葡萄孢菌的互作实验。

6、番茄与灰葡萄孢菌接种处理及致病性测定

番茄与灰葡萄孢菌互作组：分别用PDB培养基将野生型菌株B05.10孢子悬浮液浓度调为1×10

数据分析：

1.野生型番茄植株不同组织部位SlCAS表达情况

利用qPCR技术检测SlCAS在野生番茄植株不同器官的表达情况，结果表明SlCAS在叶片中表达量最高，其次是花芽和花，在早期的果实发育时间表达量较高，随着果实的成熟，表达量降低，在根中表达量非常低(如图1所示)。

2.不同胁迫下番茄SlCAS基因的表达分析

探究盐胁迫下SlCAS在番茄中的表达情况，实时荧光定量结果显示，番茄在遭受盐胁迫后，前1h内能看到明显的上升表达，但是着时间的推移表达量开始逐渐下降，6h时表达量最低，但是在随后的18h里表达量开始逐渐上升，在24h时达到最高值。这说明在盐胁迫对番茄中SlCAS的表达水平具有明显的影响作用(如图2所示)。

探究低温胁迫下SlCAS在番茄中的表达情况，实时荧光定量结果显示，低温胁迫中，SlCAS基因表达量在前1h极显著下降，3h-6h时虽然有所增加，但是相较于对照组，整体还是呈现很明显的下降趋势。说明低温胁迫对番茄SlCAS基因的表达有一定影响(如图3所示)。

探究高温胁迫下SlCAS在番茄中的表达情况，实时荧光定量结果显示，高温胁迫中，SlCAS基因在整个时间段内整体都受到不同程度的上调。说明高温胁迫对番茄SlCAS基因的表达具有显著影响(如图4所示)。

探究干旱胁迫下SlCAS在番茄中的表达情况，实时荧光定量结果显示，干旱胁迫不同时间后基因表达量一直呈现极其显著的下降。说明干旱胁迫对番茄SlCAS基因的表达具有显著影响(如图5所示)。

因此可推测出，番茄SlCAS基因可能在植物应对盐胁迫和温度胁迫中具有一定的功能和作用，参与番茄的非生物胁迫调节。

3.不同激素处理下番茄SlCAS基因的表达分析

使用脱落酸(ABA)和油菜素内酯(BR)对番茄植株进行处理，分析使用不同激素处理对SlCAS基因的表达水平的影响。结果如图6、图7所示：在ABA处理下前3h基因表达量逐渐降低，但从3h开始，表达量呈极显著上升的趋势，1d后又趋于原水平；BR处理下，短时间内，SlCAS基因表现显著上升趋势，尤其是处理后的1h时内。处理时间越长，表达量缓慢下降。我们推测番茄SlCAS基因参与了这两种激素的调控过程，其中对BR处理的响应更加敏感。

4.接种灰葡萄孢菌后的表型观察与生理数据的统计分析

分别选取长势一致的番茄品系SlCAS-2、SlCAS-4、SlCAS-6和野生型MT的叶片，放置与湿润的滤纸上并接种同时间培养的灰葡萄孢菌菌柄，接种3d之后观察表型变化。结果如图8所示。野生型MT的叶片颜色枯黄，失水严重，接种了灰霉菌菌饼的叶片，接种点周围已经干枯，受害严重。而SlCAS-2、SlCAS-4、SlCAS-6相较于MT受害情况明显较轻。其中SlCAS-6的接种叶片比SlCAS-2和SlCAS-4的叶片严重一些，叶子整体有发黄的迹象，菌斑周围出现小面积的发黄干枯现象，SlCAS-2只发生了正常的失水现象，SlCAS-4的叶片几乎没有出现任何变化。

针对离体接种灰葡萄孢菌的实验结果，使用ImageJ对叶片的病斑面积进行统计分析，统计分析结果如图9所示：相比于野生型MT，SlCAS-2、SlCAS-4、SlCAS-6均具有不同程度的抗灰霉病的能力，其中SlCAS-2、SlCAS-4的抗灰霉病的能力更强。

因此，针对SlCAS-2、SlCAS-4两个品系，进一步进行了使用灰葡萄孢菌孢子悬浮液喷施的处理方式，并对植株染病情况和POD(过氧化物酶)指数进行统计分析，结果如图10和图11所示，由如图10和图11可知，过表达番茄SlCAS-2、SlCAS-4、SlCAS-6具有显著的抗灰霉病的能力，番茄基因SlCAS具有显著的抗灰霉病的能力。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。