一种施氏獭蛤SSR引物组及其应用

【技术领域】

本发明涉及分子标记技术领域，特别涉及一种施氏獭蛤SSR引物组及其应用。

【背景技术】

施氏獭蛤(Lutraria sieboldii Reeve)俗称象鼻螺，为蛤蜊科獭蛤属的一种暖水性贝类物种，主要分布于广东、广西及东南沿海等热带-亚热带海区。由于施氏獭蛤水管肌肉发达，出肉率高，味道鲜美，香脆可口，生长速度快，周期短等特点，深受大众喜爱，是一种经济价值较高的贝类，具有十分广阔的市场前景。

由于施氏獭蛤的自然资源有限，再加上多年的乱捕，导致施氏獭蛤遗传资源急剧下降。遗传资源是物种遗传改良的基础，研究人员开始认识到遗传资源的重要性。现有技术中，利用RAPD分子标记对广西北海、防城港和广东湛江3个群体的145个样本进行研究，发现这个三个群体施氏獭蛤的遗传多样性处于较高水平；利用AFLP分子标记对广西钦州、北海、防城港、广东湛江及菲律宾獭蛤群体开展遗传多样性研究，表明约80％的遗传变异在群体内，20％的遗传变异在群体间。除此之外，关于施氏獭蛤遗传多样性的相关研究尚未见报道。

上述遗传多样性所用的分子标记都为显性分子标记，不能区分纯合子和杂合子。其中的RAPD分子标记，由于其引物序列很短，退火温度较低，导致其在基因组中的结合位点不稳定，造成了RAPD分子标记的重复性低和可靠性差；另外，AFLP分子标记结合了RFLP和RAPD两种分子标记的优点，可靠性好、灵敏度高；然而AFLP的实验操作要求比较高，步骤比较繁琐，对DNA的质量要求很高。而微卫星(Microsatellite)亦或称为简单重复序列(SSR,Simple Sequence Repeats)分子标记是一种能提供多个等位基因的共显性分子标记，是遗传多样性分析中最常用的分子标记。

微卫星分子标记开发通常有三种方法：前两种分别为BAC文库末端测序和利用分子杂交技术进行克隆重复序列；最后利用已有的基因表达序列、转录组和基因组测序数据挖掘微卫星标记。在高通量测序广泛应用于生物研究的今天，利用第三种方法开发微卫星标记成本低、速度快、效率高，因此被广泛应用。为了提供大规模的微卫星标记开展施氏獭蛤的遗传多样性和分子育种研究，本研究拟利用施氏獭蛤PacBio转录组测序数据进行微卫星分子标记开发和初步试验，为后续开展遗传育种、基因组作图、基因定位和物种亲缘关系鉴别等研究提供新的引物。

【发明内容】

鉴于上述内容，有必要提供一种施氏獭蛤SSR引物组及其应用，该引物组具有扩增多态性好，能快速区分广西北海的施氏獭蛤品种，为今后开展遗传育种、基因组作图、基因定位和物种亲缘关系鉴别等研究提供新的基因位点和鉴定引物。

为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种施氏獭蛤SSR分子标记引物组，所述SSR引物组的序列如SEQ ID NO.1～22所示。

本发明还包括所述施氏獭蛤SSR分子标记引物组在施氏獭蛤聚类分析上的应用。

本发明还包括所述施氏獭蛤SSR分子标记引物组在不同施氏獭蛤品种遗传多样性分析上的应用。

本发明还包括所述施氏獭蛤SSR分子标记引物组在绘制不同施氏獭蛤品种DNA指纹图谱上的应用。

进一步的，所述应用的不同不同施氏獭蛤品种来源于广西壮族自治区北海市侨港镇。

本发明具有如下有益效果：

本发明以施氏獭蛤为材料，利用PacBio测序平台完成施氏獭蛤的全长转录组测序，并利用MISA搜索SSR位点，得到438个SSR位点，根据SSR位点设计出11对施氏獭蛤的SSR分子标记引物，通过验证，该引物的等位基因数目和多态信息指数远高于现有技术开发的施氏獭蛤SSR引物，具有多态性好，特异性高，有效区分参试样本，甚至在亲缘关系较近的几个本地品种中都能对施氏獭蛤进行有效区分的特点，同时，本申请利用该引物组进行聚类分析、绘制DNA指纹图谱都能取得良好的效果，是一种准确、高效的SSR分子标记，能为今后施氏獭蛤开展遗传育种、基因组作图、基因定位和物种亲缘关系鉴别等研究提供新的基因位点和鉴定引物。

【附图说明】

图1是本发明实施例施氏獭蛤的聚类分析图；

图2是本发明实施例施氏獭蛤的DNA指纹图谱；

图3是本发明LuSSR50和LuSSR68引物构建的DNA指纹图谱。

【具体实施方式】

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。

实施例1：

构建施式獭蛤分子标记，具体实验方法如下：

(一)施式獭蛤样品来源：

本研究材料养殖于广西海洋研究所养殖基地，水温26°-28°，盐度为26°-28°，采集施氏獭蛤胚胎、腮、外套膜三个组织等量混样，利用RNAprep Pure Tissue Kit试剂盒(目录号：DP431)提取其RNA，送诺禾致源生物技术有限公司，利用PacBio平台开展转录组测序。

另外，从广西北海市侨港镇海面分布区收集24个施式獭蛤样品，采集样品的肌肉，利用海洋动物DNA提取试剂盒(DP324-02)提取施氏獭蛤样本的基因组DNA作为PCR模板。

保存于–20℃冰箱

(二)施式獭蛤转录组组装及SSR位点鉴定：

1、施氏獭蛤基因组DNA的提取方法：

利用IsoSeq3对PacBio测序所得序列数据进行分析，使用ccs命令将subreads转换获得CCS数据，使用lima去除引物和barcode序列，并调整序列方向；利用refine命令去除PolyA和嵌合体序列；利用cluster和polish命令对转录本序列进行聚类组装，修正，最终得到转录本数据。

利用MicroSAtellite(MISA,http://pgrc.ipkgatersleben.de/misa/)工具对转录本序列进行SSR位点的鉴定。筛选标准为双核苷酸重复的次数在10次及以上，三核苷酸重复的次数在7次及以上，四至六核苷酸重复的次数在5次及以上。将两个中间序列长度小于100nt的SSR称为复杂SSR。利用Primer3设计SSR引物，随机选取100对引物进行合成，用于后续试验。

2、施式獭蛤基因组DNA提取及SSR-PCR分析

SSR-PCR的扩增体系为：2×SanTaq PCR Master Mix(with Blue Dye)5μL，正向SSR引物(10μmol·L

利用6％聚丙酰胺凝胶分离PCR扩增产物，快速银染，显影，照相；利用人工读带方式记录分子数据。

3、数据统计与分析

利用PowerMarker、GenAlEx6软件对24份施式獭蛤样本的多态SSR数据进行遗传多样性分析，具体多样性参数包括等位基因数目(Number of alelles,Na)、有效等位基因数目(Effective Number of Alelles,Ne)、等位基因频率(Frequencey of alelles,Fa)、多态性信息含量(Polymorphic Information Content,PIC)、观测杂合度(ObservedHeterozygosity,Ho)、期望杂合度(Expected Heterozygosity,He)和固定指数(Fixationindex)；利用PowerMarker计算Nei遗传距离，并利用Neighbor-Join方法构建进化树，进一步利用MEGA作进化图。

指纹图谱构建根据已读取的SSR分子数据，将所有个体的条带按每一对SSR标记扩增产物分子量从小到大进行排序，将对应个体中有条带的记为“1”，没有条带的记为“0”，从而形成指纹矩阵；再利用R代码筛选能区分所有参试样本的最少SSR引物或引物组合，再将“1”设置为红色，将“0”设置为白色进而形成指纹图谱。

4、结果分析：

(1)转录组情况

利用IsoSeq3对PacBio测序得到的数据进行分析，总共得到转录本数据38.187Mb，由20,978条序列组成，其中最长序列为5,088nt，最短的为220nt，平均长度为1,820.35nt,长度的中位数为1,741nt，N50为2,032nt。

(2)施式獭蛤中的SSR位点的数量与分布

利用MISA脚本对施式獭蛤转录组中18,769条Unigenes进行SSR鉴定。鉴定得到SSR位点438个，包含复杂SSR位点25个，这些位点分布在407条序列上(表1)，分布有SSR序列的数目占总序列数的2.168％。其中，23条序列含1个以上SSR位点。每83.137kb序列中存在一个SSR位点。

表1施式獭蛤转录组测序EST-SSR搜索

从不同长度基序重复类型来看，四核苷酸重复类型的数量最多，占41.78％,其次是三核苷酸和双核苷酸重复类型，分别占30.59％和24.65％。五核苷酸重复类型的数量最少，只占到总SSR的2.96％；本研究未检测到六核苷酸的微卫星位点(表2)。施式獭蛤转录组中SSR位点的序列总长度为11,861nt，位点平均长度为27.08nt，其中，二、三、四、五核苷酸类型SSR位点的平均长度分别为24.61nt、24.34nt、30.23nt、31.54nt。

表2施式獭蛤转录组SSR类型和出现频率

施式獭蛤转录组中SSR位点的重复次数统计表明(表3)，重复5次的数量为最多(112个)，占总SSR的25.57％，其中以四核苷酸最多(104个)，其次为重复7次(86个，19.63％)、和10次(48个，10.95％)，接下来为重复6次(32个，7.31％)。SSR相对较少的重复次数为8、9、11、12次,依次为5.48％、6.62％、6.16％和5.02％。

表3施式獭蛤转录组SSR位点重复次数分布

(3)施式獭蛤转录组SSR位点的分布特征

从施式獭蛤SSR核苷酸基序类型(表4)来看，SSR以四核苷酸重复基序为主要类型(183)，其次为三核苷酸(134)和双核苷酸(108)。在二核苷酸重复基序中以AT/AT为主(87，80.56％)，且以10～13次重复为主；在四核苷酸重复基序中以ACAT/ATGT为主(72，39.34％)，且以5次重复为主；在三核苷酸重复基序中以ATC/ATG和AAC/GTT两个为主(117，87.31％)，且以7次重复为主。

表4施式獭蛤转录组中的SSR主要类型分布

(4)SSR引物多态性分析

利用Primer3.0软件根据SSR位点信息进行引物设计，总共得到329对SSR引物。从中随机选出100对进行合成，并对合成的SSR引物开展多态性筛选。结果表明，18对SSR引物没有扩增产物，其余都具有扩增产物，其中5对引物只能扩增处单态条带，另外77对引物表现为多态。从多态引物中筛选出11对(表5)多态性较好、扩增稳定的高质量SSR引物用于施氏獭蛤群体的扩增。

表5引物信息表

表5的11对SSR引物在24个施式獭蛤中共检测出119个等位基因，检测等位基因数目(Na)变化范围为9～16个，平均为10.818个；等位基因频率变化范围为0.472～0.205，平均为0.338；有效等位基因数目变化范围为3.429～9.574，平均为5.700；多态信息含量值的变化范围为0.676～0.888，平均为0.787；观测杂合度的变化范围为0.267～1.000，平均为0.812；期望杂合度的变化范围为0.708～0.896，平均为0.807；固定指数的范围为-0.255～0.674，平均为-0.010。其中，LuTSSR-55扩增的等位基因最多为16个，LuTSSR-19、LuTSSR-26、LuTSSR-45、LuTSSR-51和LuTSSR-70这5对引物能扩增最少，为9个等位位点。具体参见表6。

表6SSR引物组的多态性数据

实施例2：

应用实施例1得到的11对SSR引物对广西壮族自治区侨港镇海域的24个施氏獭蛤品种进行聚类分析，结果如图1所示：图1可见，24个施式獭蛤样本被划分成4类，其中第一类仅有23、24号；第二类为15、16、17、19、20号；第三类为1、2、18、21、22号；第四类为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14号，是最多的一类，说明这12个施式獭蛤的亲缘关系较近。

实施例3：

应用实施例1的11对SSR引物对构建24个样本的指纹图谱，结果如图2所示：从图2可见，11对引物能很好的区分24个样本，单对引物(LuSSR26)最少能去能10个样本，最多(SSR9)能区分17个样本。用双引物(LuSSR45和LuSSR68共有19个位点)最少能区分17个样本都能区分部分样本，引物LuSSR55和LuSSR56总共有29个位点，却只能鉴定21个样本；双引物组合中，尽管LuSSR50和LuSSR68组合总共仅有22个位点，却能将24个样本完全区分开来(图3)。

综上，本研究利用PacBio测序平台完成施氏獭蛤的全长转录组测序，并利用MISA搜索SSR位点，根据SSR位点设计施氏獭蛤分子标记引物，在82对可扩增的SSR引物中，有7对引物的扩增产物分子量明显超出产物大小规定范围，这可能是在该对引物扩增范围内插入了一段序列，导致扩增产物分子量远远超出扩增产物分子量的大小。另外，18对引物无法扩增处产物，其可能原因是在设计的引物的存在突变、插入或缺失，导致扩增的失败，因而无法扩增处产物。

本研究中所采用的11对SSR引物平均每个位点检测到10.818个等位基因，标准差为2.359，其平均信息多态指数为0.787，标准差为0.066。本研所采用的SSR揭示的等位基因数目和多态信息指数远高于现有技术开发的施氏獭蛤SSR引物，因此，这11对是高质量的SSR引物。

DNA指纹图谱是根据DNA水平上的差异能有效鉴定不同个体的一种方法，可广泛应用于种质资源的区分和新品种的保护。DNA指纹图谱不受物种的组织和季节等因素的影响，具有很好的稳定性。通常用于指纹图谱的构建的分子标记有RFLP，RAPD，ISSR，AFLP，SSR，SNP等，出于标记的可用性、成本、设备和经验等因素的考虑，SSR分子标记是指纹图谱中最常用的技术。本研究也证明了利用开发的SSR分子标记构建实施獭蛤的指纹图谱是可行的。构建指纹图谱的引物组合中不同引物呈现不同的多态形式才能更有效的区分参试样本。

本研究利用施氏獭蛤多种组织的PacBio测序数据鉴定了SSR位点，分析了其特征，随机筛选了100对SSR引物进行多态性分析得到77对多态SSR标记，利用11对高质量SSR标记首次构建了参试样本的指纹图谱，为施氏獭蛤种质资源的鉴定、保护和开发提供有力的工具和方法。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。