一种在同一肝内胆管组织样本中同时进行外泌体、单细胞、单细胞核测序的方法
文献发布时间：2023-06-19 19:30:30
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于同一人肝内胆管组织样本中同时进行外泌体、单细胞悬液和单细胞核悬液的制备方法，及同时进行外泌体small RNA测序、单细胞测序和单细胞核测序的方法，以及用于单细胞及单细胞核悬液制备的试剂盒及其应用。
背景技术
组织或器官的发育、机体的内稳态平衡等均有赖于不同细胞之间通讯。正是通过不同的信号分子，各种各样的细胞才能井然有序的彼此协调一致，从而展现出多种多样的生命现象。因此，生命的本质是不同类型细胞间的相互作所组成的网络。对于这种互作网络，我们需要了解单个细胞功能的同时，也了解细胞之间是如何传递信号的，即细胞互作网络中的通讯信号。两者的结合能够“重构”完整的细胞互作网络，从而去更深入的揭示生命现象背后的分子机制。所以我们只有把这两部分同时发掘出来，才能真正的挖掘出这个网络背后运作的机制。
单细胞测序自问世以来，已经在基础科研与工业界得到了广泛的关注，是一项非常有前景的技术。与传统的全基因组测序多细胞水平相比，单细胞测序不仅测量基因表达水平更加精确，而且还能检测到微量的基因表达子或罕见非编码RNA，其优势是全方位和多层次的。与此同时，外泌体是活细胞分泌的携带RNA、蛋白、脂质等成分的纳米级小囊泡，是细胞间通讯的载体，也是组织微环境研究、不同细胞亚群通讯研究的天然工具。其可以参与到机体免疫应答、细胞迁移、细胞分化、肿瘤侵袭等。单细胞转录组能明确细胞的功能，外泌体mirna可以获知细胞间传递的信息。因此，在同一组织中同时检测外泌体small RNA及单细胞转录组，才能够真正解析生命现象背后这种细胞互作的网络机制。
对于scRNA-seq测序来讲，“优质”的单细胞悬液是决定单细胞测序结果的下限，也是单细胞测序高质量数据的唯一相关因素，但由于制备单细胞悬液过程中涉及37℃酶解过程，scRNA-seq经常造成一些不耐受酶解的细胞类型的丢失，如上皮细胞等，通常较难捕获；成纤维细胞和内皮细胞更多嵌于细胞外基质和基底膜中，因此更难以分解。而免疫细胞类型因为本身“游离于组织环境中”的特性，很容易酶解得到。这样，就造成了scRNA-seq数据经常出现对免疫细胞类型的“偏好”。同时一些较为敏感的细胞可能会因为解离过度而破碎。与之相对，由于采用机械法和化学试剂破碎细胞，snRNA-seq不会出现酶解方法的偏向性，所有细胞类型均能够得到有效回收和鉴定，帮助研究人员获取更加完整和全面的细胞图谱，能够反映组织中真实的细胞类型比例，因而受到众多研究者的青睐。但因为免疫细胞本身占比不高，同时10xGenomics等细胞上机系统对细胞量有限制，因此snRNA-seq对免疫细胞类型通常捕获较少，这对很多关注免疫机制的研究者造成了很大困扰。尽管有报导可以将同一组织一分为二分别进行scRNA-seq及snRNA-seq，但这样的处理方式，对很多具有很大异质性的样本来说同样会产生偏好性，不能真实反映组织的细胞组成，导致结果的真实性和准确性大打折扣。如果能够建立一种在同一组织中能够同时进行scRNA-seq和snRNA-seq的方法，使用scRNA-seq收集到较多的免疫细胞后，再通过snRNA-seq将其他细胞类型补充完整，从而达到“较为全面的捕获组织中的细胞类型的同时也能对免疫细胞类型进行突出”的目标，即可满足研究者的多种需求。
综上所述，目前需要建立一种能在同一组织中同时进行外泌体、单细胞及单细胞核测序的方法。通过scRNA-seq&snRNA-seq捕获较为全面的细胞类型去解答网络单个节点的同时，再使用外泌体small RNA测序去解答节点之间的通讯信号，从而去挖掘更深层次的生物学信息。
肝内胆管细胞癌是原发性肝癌中的一种，其发病率仅次于肝细胞癌，治疗方法主要为手术治疗，预后较差，难以治愈，手术后生存时间短。但目前现有技术中，尚未有任何技术方案可以实现在同一肝内胆管癌中同时开展外泌体、单细胞及单细胞核测序。这其中有一个关键技术问题需要解决，即如何同时分离同一组织的外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。如果能在较早的时间节点，在人肝内胆管组织中进行exo+snRNA-seq&scRNA-seq，即可找到相应的TME环境中的信号调控网络及细胞类型和对应的功能，将填补现有空白，为高水平研究奠定基础，并为开发更加有效的早期治疗乃至预防提供精准依据。
发明内容
为克服现有技术中存在的问题，本发明首次创新提出了一种基于同一组织样本(例如，同一肝内胆管癌组织)，同时进行外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液的制备方法和应用。使用肝内胆管组织进行exo+snRNA-seq&scRNA-seq可以制备到细胞总量为98W、碎片率为4％、结团率为4％的单细胞悬液，细胞核总量为220W、碎片率为5％、结团率为5％的单细胞核悬液，且外泌体形态及浓度等都可满足small RNA建库要求。至目前现有技术中有关这方面的技术研究还处于空白阶段，尚未见有报道。本发明方法不仅可以全面获得肝内胆管组织样本中的细胞类型，而且可以对肝内胆管样本细胞间节点的通讯进行更深入的挖掘，例如细胞之间是如何传递信号的，然后特定的细胞对信号会有什么响应。而现有技术方法中只能分别检测外泌体miRNA及单细胞(单细胞核)转录组，而无法在同一份样品中同时获取这两种数据。目前有些研究是先通过单细胞(核)转录组找到特定细胞类型，然后再通过分选及体外培养方式，检测这些培养细胞上清中的外泌体，但这些外泌体无法真实的反应细胞在组织中的状态，因此可能造成假阳性和遗漏的情况。也有研究同时鉴定单细胞外泌体及单细胞(核)转录组，但同样是体外培养环境，很难真实反应细胞在组织和器官中的真实状态。这也就大大限制了两者之间的有机关系，很难互为补充与支撑，从而导致这种联合研究的真正能力无法完全发挥。与此同时，单细胞测序存在对免疫细胞解离偏好性，单细胞核测序又对免疫细胞捕获较少。因此本发明创建了exo+scRNA-seq&snRNA-seq流程，克服了现在技术存在的无法在同一组织中同时进行small RNA测序及单细胞&单细胞核测序的技术障碍和困难，通过对三种技术方案的改良，本发明实现了在同一肝内胆管组织中同时检测外泌体small RNA、单细胞及单细胞核转录组，具有包括但不限于解析生命现象背后调控网络的运作机制的广泛应用前景。
本发明术语“同时进行”指的是可在同一份组织中获得外泌体、单细胞悬液与单细胞核悬液，不分先后顺序，同时获得即可。因为核裂解液会对细胞有损伤，所以本发明先制备单细胞悬液再制备单细胞核悬液。
本发明“exo+snRNA-seq&scRNA-seq”是指在同一肝内胆管组织中同时进行外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液的制备，并同时进行外泌体smallRNA测序、单细胞&单细胞核测序。
目前尚未有能在同一组织中同时制备外泌体悬液、单细胞悬液及单细胞核悬液的技术。如何能在同一组织中同时制备出三种悬液是目前需要解决的主要问题。本发明创造性的使用复合酶(胶原酶Ⅱ溶液、胶原酶Ⅳ溶液、透明质酸酶溶液、胰酶溶液)在短时间(15min)高效率酶解组织，从而达到能够在同一组织中同时制备外泌体、单细胞悬液、单细胞核悬液的目的，且极大程度上减少了组织酶解对后续细胞核制备及外泌体提取的影响。本发明提出的exo+scRNA-seq&snRNA-seq流程实现了同一份样本中同时进行单细胞(核)转录组与外泌体smallRNA测序，本发明能够了解同一块组织来源的完整的细胞cluster之间是如何通过外泌体实现通讯，以及在肿瘤的发展，微环境重塑，转移，耐药等方面发挥了什么作用。突破了现有技术方法的障碍，填补了当前的技术空白，为本发明揭示细胞互作网络提供了更系统，更深入的原理和更精准的机制。
本发明提供了一种从同一肝内胆管组织样本出发，基于同一组织样本同时进行外泌体、单细胞悬液和单细胞核悬液的制备方法，包括如下步骤：
(一)样本准备：
取人肝内胆管组织，清洗，剪碎，并将剪碎的组织块转移至离心管中；
(二)酶解：
加入培养基，加入胶原酶Ⅱ、胶原酶Ⅳ、透明质酸酶溶液进行37℃消化酶解，37℃酶解后加入胰酶溶液，混匀后室温静置；
(三)分离：
室温静置后得到第一上清液、第一沉降的组织沉淀，收集的第一上清液进行第一次离心分离再次得到第二上清液、第二细胞沉淀；
(四)外泌体制备：
取前述第二上清液再次进行第二次离心处理，得到第三上清液与第三细胞沉淀。离心结束后，取上述第三上清液进行过筛处理，结束后采用Invitrogen-Total ExosomeIsolation Reagent from cell culture media试剂盒对所述第三滤液进行外泌体纯化，其中外泌体纯化是指将过筛后的第三上清与Invitrogen试剂混合孵育，孵育结束后，将混合液离心，离心后回收沉淀，使用PBS缓冲液将沉淀重悬得到外泌体悬液；
(五)悬液制备：
单细胞悬液的制备：
取前述步骤(三)中第二细胞沉淀与第三细胞沉淀分别使用培养基重悬后，转移到同一离心管中，进行过筛处理。过筛处理结束后进行第一次离心处理，离心结束后弃上清，向细胞沉淀中加入红细胞裂解液，吹打混匀后室温静置，裂红结束后进行第二次离心处理，离心结束后弃上清，加入去死细胞试剂(磁珠)对细胞沉淀进行重悬，并孵育15min后，用1×building buffer润洗LS柱，将细胞混合液过柱后，第三次离心处理，离心结束后弃上清，加入预冷的培养基对细胞沉淀进行第四次离心洗涤处理，离心结束后弃上清，加入预冷的培养基对细胞沉淀进行重悬处理，得到单细胞悬液。
单细胞核悬液的制备：
取前述步骤(三)中第一沉降的组织沉淀，使用PBS进行洗涤处理、第一次离心洗涤弃上清后，再次加入PBS洗涤，洗涤结束后加入Lysis Buffer(裂解缓冲液)重悬组织沉淀开始裂解处理，整个过程置于冰上孵育，裂解结束后进行过筛处理，过筛后收集滤液，第二次离心处理后弃上清，加入STWash Buffer(洗涤缓冲液)重悬细胞核沉淀，第三次离心洗涤后弃上清，用含1％BSA的PBS重悬细胞核沉淀，得到单细胞核悬液。
优选地，本发明中所述组织样本为人肝内胆管癌组织。
在具体方案中，本发明方法包括如下步骤：
I.准备试剂
1.1培养基、胰酶溶液、胶原酶Ⅱ溶液、胶原酶Ⅳ溶液、透明质酸酶溶液、预冷的PBS溶液、裂红液、去死细胞试剂(Dead Cell Removal MicroBeads、Binding Buffer)。
2.1配置Lysis Buffer(裂解缓冲液)、ST Wash Buffer(洗涤缓冲液)及最终buffer(上机缓冲液)，并将配置好的溶液置于碎冰上预冷。
3.1准备Invitrogen-外泌体exosomes纯化试剂、Exosomal RNAIsolation Kit
II.制备
1.2样品准备
取新鲜的人肝内胆管组织，将其置于培养皿中，将培养皿置于冰板上，用预冷的培养基洗涤组织，将组织表面的血迹洗净后洗涤液。
1.3组织破碎
使用无菌手术剪刀将对组织进行破碎，当组织被剪成糊状时即可停止，将培养皿中已剪碎的组织块转移至新的离心管中。
1.4组织酶解
向离心管中加入预冷的培养基后，加入胶原酶Ⅱ、胶原酶Ⅳ、透明质酸酶溶液，使用一次性滴管吹打混匀后，将离心管置于杂交炉中进行37℃消化酶解处理。酶解消化结束后向离心管中加入胰酶溶液，上下颠倒混匀后，室温静置。
1.5结束酶解
酶解结束后，使用一次性滴管混匀吹打，混匀吹打后静置，待组织块完全沉降，用移液器吸取上清，将上清转移至新的15mL离心管中备用。并将剩余的组织沉淀回收，用于后续单细胞核悬液的制备。将上清进行第一次离心处理，离心后，将第一次上清转移至新的离心管中，进行第二次离心处理。第一次细胞沉淀留存备用。第二次离心处理结束后，收集第二次离心上清用于后续外泌体的制备。将第一次细胞沉淀与第二次细胞沉淀使用培养基重悬后，共同转移至新的离心管中，用于后续单细胞悬液的制备。
按以下步骤1.6-1.9制备单细胞悬液：
1.6过筛
将上诉1.5中使用培养基重悬后的第一次与第二次细胞沉淀混合液滴加至40μm的筛网过滤，离心后，弃上清。
1.7裂红
加入红细胞裂解液与细胞沉淀混匀后，静置，静置结束后离心，离心结束后弃上清。
1.8去死细胞
加入Dead Cell Removal MicroBeads溶液，孵育，用building buffer润洗LS柱，孵育结束后过柱。过柱结束后，离心弃上清。
1.9洗涤镜检
向细胞沉淀中加入预冷的培养基，4℃离心洗涤，离心结束后弃上清。加入预冷的培养基重悬细胞沉淀，镜检，确定最终的细胞总量、细胞活率及碎片占比。
按以下步骤2.2-2.7制备单细胞核悬液：
2.2洗涤组织
向上述步骤1.5所保留的酶解后的组织块沉淀中加入PBS，对组织沉淀进行洗涤处理，离心结束弃上清。
2.3裂解
向上述2.2洗涤后的组织沉淀中加入Lysis Buffer(裂解缓冲液)，使用一次性滴管吹打混匀后，置于碎冰上孵育一定时间。裂解结束后镜检。
2.4过筛
对细胞核悬液进行过筛处理，过筛结束后收集滤液至新的离心管中，离心结束后弃上清。
2.5洗涤纯化
加入STWash Buffer重悬上述2.4中离心后的细胞核沉淀，离心结束后弃上清。重复洗涤。
2.6质检
向上述2.5中得到的细胞核沉淀中加入加入最终Buffer，重悬细胞核沉淀，最终得到上机所用的细胞核悬液。
2.7质检
取上述2.6步骤中得到的细胞核悬液进行镜检，镜检后稀释，确定最终上机的细胞核浓度、细胞核碎片比例及细胞核结团比例。
2.8上机测序
依照10x Genomics公司说明书进行单细胞上机测序操作。
按以下步骤3.2-3.4制备纯化外泌体：
3.2去碎片处理
将上述步骤1.5中所述第二次离心上清进行离心处理，离心结束后，收集上清至新的离心管中。
3.3孵育
将上述3.2中离心后的上清与Invitrogen试剂混合，4℃孵育。
3.4回收
将上述3.3中孵育后的混合液，离心，离心后回收沉淀，使用缓冲液将沉淀重悬。
3.5RNA抽提及定量
将上述3.4获得的外泌体，以试剂盒法提取RNA，所有操作依照试剂盒说明书进行。获得的RNA以NanoDrop 2000进行定量，以确定获得的RNA量。
在具体实施方案中，
步骤1.1中，所述的培养基是指向RPMI1640培养基中加入1％BSA。其中，RPMI1640培养基厂家为Corning，货号为CGR-10-040-CV。其中，BSA厂家为MACS，货号为130091376。
步骤1.1中，所述预冷的PBS的预冷温度为0～5℃；优选地，为4℃预冷。
步骤1.1中，所述的PBS厂家为Gibco，货号为10010-031。
步骤1.1中，所述的胰酶溶液是指将胰酶冻干粉溶于PBS中，配置浓度为2.5％(m/v)的胰酶溶液，并使用0.22μm的过滤器过滤，-20℃保存备用。
步骤1.1中，所述的胶原酶Ⅱ溶液是指将胶原酶冻干粉溶于含有钙镁离子的HBSS溶液中，配置浓度为1％(m/v)的胶原酶溶液，并使用0.22μm的过滤器过滤，-20℃保存备用。
步骤1.1中，所述的胶原酶Ⅳ溶液是指将胶原酶冻干粉溶于含有钙镁离子的HBSS溶液中，配置浓度为1％(m/v)的胶原酶溶液，并使用0.22μm的过滤器过滤，-20℃保存备用。
步骤1.1中，所述胰酶干粉厂家为索莱宝，货号为T8150-10g。
步骤1.1中，所述的胶原酶Ⅱ干粉厂家为Gibco，货号为17101-015。
步骤1.1中，所述的胶原酶Ⅳ干粉厂家为Gibco，货号为17104-019。
步骤1.1中，所述的透明质酸酶干粉厂家为sigma，货号为H3506。
步骤1.1中，所述的HBSS厂家为Gibco，货号为14025-076。
步骤1.1中，所述的裂红液厂家为上海生工生物工程股份有限公司，货号为B541001-0100。
步骤1.1中，所述的去死细胞试剂(Dead Cell Removal MicroBeads、BindingBuffer)，Dead Cell Removal MicroBeads厂家为Miltenyi Blotec，货号为130-109-398，Binding Buffer厂家为Miltenyi Blotec，货号为130-090-101。
步骤1.2中，所述的新鲜的人肝内胆管组织的鲜重为500～800mg；优选地，为600mg。
步骤1.2中，所述的使用培养基洗涤组织，目的是为了将人肝内胆管组织样本上残留的血液充分清洗，以减少后续样本处理时的红细胞占比。
步骤1.2中，所述的洗涤样本，次数为1～4次；优选地，为3次。
步骤1.3中，所述的离心管为15mL离心管，厂家为Corning，货号为430790。
步骤1.3中，所述的剪刀为高温灭菌后的无菌眼科剪刀。
步骤1.4中，所述的胶原酶Ⅱ的终浓度为0.5％(v/v)。
步骤1.4中，所述的胶原酶Ⅳ的终浓度为0.3％(v/v)。
步骤1.4中，所述的透明质酸酶的终浓度为0.1％(v/v)。
步骤1.4中，所述的杂交炉中37℃消化酶解，酶解时间为10～20min；优选地，为15min。
步骤1.4中，所述的胰酶的终浓度为0.2％(v/v)。
步骤1.4中，所述的室温静置的时间为3～6min；优选地，为4min。
步骤1.4中，所述的预冷培养基是指向RPMI1640培养基中加入1％BSA，其中，预冷温度为4℃。
步骤1.5中，所述的酶解结束后是指37℃杂交炉消化结束后再使用胰酶在室温静置结束后。
步骤1.5中，所述的将上清转移至新的15m离心管备用的目的是用于制备外泌体和单细胞悬液。
步骤1.5中，所述的将剩余组织沉淀转移至新的15mL离心管备用的目的是用于制备细胞核悬液。
步骤1.5中，所述的第一次离心条件为2000～3000×g、5～10min、4～6℃；优选地，3000×g、4℃、10min。
步骤1.5中，所述的将第一次上清转移至新的离心管，所述的离心管为1.5mL离心管，厂家为CNW，货号为ABEQ-5615000-500。
步骤1.5中，所述的第二次离心条件为13000×g～16000×g、5～10min、4～6℃；优选地，16000×g、4℃、10min。
步骤1.5中，所述的第二次离心是为了去除杂质、碎片。
步骤1.5中，所述的将第一次细胞沉淀与第二次细胞沉淀使用培养基重悬后转移至新的15mL离心管备用的目的是用于制备单细胞悬液。
步骤1.6中，所述的加入培养基重悬，培养基的体积为4～8mL；优选地，为7mL体系。
步骤1.6中，所述的离心条件为500～800×g、5～10min、4～6℃；优选地，500×g、4℃、10min。
步骤1.7中，所述的红细胞裂解液的体积为6～10mL；优选地，为8mL。
步骤1.7中，所述的静置的时间为4～8min；优选地为5min。
步骤1.7中，所述的离心条件为500～800×g、5～10min、4～6℃；优选地，500×g、4℃、5min。
步骤1.8中，所述的孵育条件为室温下孵育15min。
步骤1.8中，所述的离心条件为300～500×g、5～10min、4～6℃；优选地，400×g、4℃、5min。
步骤1.8中，所述的building buffer为20×building buffer，使用无酶水稀释，配置为1×buildingbuffer。
步骤1.8中，所述的buildingbuffer润洗LS柱是指使用移液枪将3mL 1×buildingbuffer缓慢加入LS柱中。
步骤1.8中，所述的LS柱厂家为Miltenyi Blotec，货号为130-042-401。
步骤1.9中，所述的加入培养基洗涤体系为4～8mL；优选地，为6mL体系。
步骤1.9中，所述的离心条件为100～500×g，离心5～10min；优选地，为300×g，4℃，离心7min。
步骤1.9中，所述的洗涤次数为1～3次；优选地，为2次。
步骤1.9中，所述的预冷培养基是指向RPMI1640培养基中加入1％BSA，其中，预冷温度为4℃。
步骤1.9中，所述的加入培养基体系为0.5～2mL；优选地，为1.5mL。
步骤1.9中，所述的镜检是指取9μL单细胞悬液与1μL 0.4％台盼蓝溶液混匀后，进行镜检。
步骤1.9中，所述的台盼蓝溶液厂家为Thermo Fisher Scientifc，货号为T10282。
步骤1.9中，所述的单细胞悬液的细胞总量为300万、细胞活率为96％、碎片占比为6％。
步骤2.1中，所述的裂解缓冲液包括以下成份(终浓度)：50mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mM CaCl2、5mM NaCl、0.3％～0.4％(v/v)NP40、0.3％～0.4％(v/v)吐温20、0.4U/μLRNase Inhibitor(RNA酶抑制剂)。
步骤2.1中，所述细胞核洗涤缓冲液包含以下成分(终浓度)：50mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mM CaCl2、5mM NaCl、0.4U/μLRNase Inhibitor(RNA酶抑制剂)、1％～2％(v/v)BSA。
步骤2.1中，所述细胞核最终缓冲液包括以下成分(终浓度)：9％PBS、1％～2％(v/v)BSA。
步骤2.1中，所述细胞核最终缓冲液主要成分BSA，终浓度为1％～2％(v/v)；优选地，为1％(v/v)。
步骤2.1中，所述成份分别购自Tris-HCl(Invitrogen；15567027)、CaCl2(Sigma-Aldrich；21115-100ML)、NaCl(Thermo Fisher Scientific；AM9760G)、NP40(ThermoScientific
步骤2.1中，所述的冰是指制冰机产生的碎冰，装于适当大小的泡沫盒中，离心管插于碎冰内。
步骤2.2中，所述的PBS的体积为10～15mL；优选地，为14mL。
步骤2.2中，所述的洗涤组织次数为1～3次；优选地，为3次。
步骤2.2中，所述的对组织进行洗涤处理的目的为将组织残留的酶液清洗干净，以免对后续细胞核的制备产生影响。
步骤2.2中，所述的离心条件为500g～1000×g，离心5～10min；优选地，为800×g，4℃，离心10min。
步骤2.3中，所述的裂解缓冲液Lysis Buffer的体积为2～5mL；优选地，为4mL。
步骤2.3中，所述的置于冰上孵育裂解一定时间为5～10分钟；优选地，为8分钟。
步骤2.3中，所述的镜检使用0.4％台盼蓝(v/v)进行：取1μL台盼蓝溶液与9μL细胞核悬液混匀，进行镜检。
步骤2.4中，所述的细胞筛孔径为40μm。
步骤2.4中，所述的细胞筛购自BD falcon，货号352340。
步骤2.4中，所述的新的离心管为15mL离心管，厂家为Corning，货号为430790。
步骤2.4中，所述离心机的条件为800～1000×g、4～6℃离心5～15分钟；优选地，为800×g，4℃离心8分钟。
步骤2.5中，所述的STWash Buffer的体积为5～8mL；优选地，为6mL。
步骤2.5中，所述洗涤时离心条件为500～1000×g、4℃离心5～10分钟；优选地，为800×g，4℃离心10分钟。
步骤2.5中，所述的洗涤次数为1～3次；优选地，为2次。
步骤2.6中，所述的最终Buffer的体积为1～2mL；优选地，为1.5mL。
步骤2.7中，所述的镜检后稀释是使用最终Buffer将细胞核悬液浓度稀释为1200～1600个/Μl。
步骤2.7中，所述的镜检使用0.4％台盼蓝(v/v)进行：取1μL台盼蓝溶液与9μL细胞核悬液混匀，进行镜检。
步骤2.7中，所述的台盼蓝溶液，厂家为Thermo Fisher Scientifc，货号为T10282。
步骤3.1中，所述的外泌体exosomes纯化试剂，厂家为Invitrogen，货号为4478359。
步骤3.1中，所述的Exosomal RNA Isolation Kit厂家为Norgen Biotek，货号为NGB-58000。
步骤3.2中，所述的离心处理是为了再次去除碎片杂质。
步骤3.2中，所述的离心条件为16000×g、4℃离心5～10分钟；优选地，为16000×g，4℃离心10分钟。
步骤3.2中，所述的新的离心管为15mL离心管，厂家为Corning，货号为430790。
步骤3.3中，所述的孵育温度为2～8℃；优选地，为4℃。
步骤3.3中，所述的孵育时间为8～12h；优选地，为10h。
步骤3.3中，所述的离心条件为10000×g、4℃离心，60分钟。
步骤3.4中，所述的缓冲液为PBS，厂家为Gibco，货号为10010-031。
步骤3.5中，所述的提取所述外泌体中的小RNA，对所述小RNA进行建库，进行NGS测序。
本发明还提出了由所述的方法得到的外泌体、单细胞悬液和单细胞核悬液。
所述外泌体的收率较高、外泌体总RNA量为300ng，外泌体浓度(Particles/mL)为1.06E+10。且外泌体总RNA中的蛋白等杂质的“污染”较少(以260/280作为蛋白等杂质污染的质控指标)，260/280为2.01；
单细胞悬液的收率较高，可满足10x Genomics公司上机标准，制备到的单细胞悬液的细胞总量可达到98W,且单细胞悬液杂质较少，细胞悬液碎片率为4％，结团率为4％；
单细胞核悬液的收率较高，可满足10x Genomics公司上机标准，制备到的单细胞核悬液的细胞核总量可达到220W,且单细胞核悬液杂质较少，细胞核悬液碎片率为5％，结团率为5％。
本发明还提出了可用于在同一人肝内胆管组织样本中同时进行单细胞悬液及单细胞核悬液制备的试剂/试剂盒，其包括但不限于细胞酶解液、细胞核裂解液、细胞核洗涤缓冲液。
其中，所述细胞酶解液为0.5％的胶原酶II(v/v)溶液、0.3％的胶原酶IV溶液、0.1％的透明质酸酶溶液、0.2％(v/v)胰蛋白酶；
所述细胞核裂解液为所述的裂解缓冲液包括以下成份(终浓度)：50mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mM CaCl2、5mM NaCl、0.3％～0.4％(v/v)NP40、0.3％～0.4％(v/v)吐温20、0.4U/μLRNase Inhibitor；
所述所述细胞核洗涤缓冲液包含以下成分(终浓度)：50mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mM CaCl2、5mM NaCl、0.4U/μLRNase Inhibitor、1％～2％(v/v)BSA。
本发明还提出了所述试剂/试剂盒的应用，其可用于高效、快速、稳定且同时获得总量多、碎片及结团比例低的单细胞悬液及单细胞核悬液，可应用于在同一人肝内胆管组织中同时进行scRNA-seq和snRNA-seq的制备中的应用。
本发明提供的试剂盒在使用时，不同人员操作影响小，重复性好、即拆即用、无需复杂流程，操作简便、温和且高效获得高质量的单细胞悬液。
与现有技术相比，本发明有益效果还包括：本发明填补了目前的技术空白。目前并未有在同一组织、同一肝内胆管组织中同时进行单细胞悬液和单细胞核悬液、外泌体制备的技术。本发明提供的技术方案解决了这一问题，填补了技术空白。本发明提供的技术方案可以在同一份样本中得到更多有意义的数据，挖掘到更深层次的生物学信息。本发明创新改进地将外泌体制备、单细胞悬液制备和单细胞核悬液制备三种技术相结合，突破了现有的技术障碍，得到样本中更全面的细胞类型的同时，又真正解析了生命现象背后这种细胞互作的网络机制(既能了解单个细胞的功能，又能了解细胞之间是如何传递信号的)从而丰富了研究数据，为挖掘更深层次的生物学机理提供了基础。
附图说明
图1是本发明方法中的肝内胆管单细胞悬液镜检结果的示意图。
图2是本发明方法中的肝内胆管单细胞核悬液镜检结果的示意图。
图3是本发明方法中的肝内胆管细胞RNA质检结果的示意图。
图4是本发明方法中的肝内胆管细胞核RNA质检结果的示意图。
图5是本发明方法中的肝内胆管组织分离的外泌体TEM检测结果示意图。
图6是本发明方法中的肝内胆管组织分离的外泌体NTA检测结果示意图。
图7是本发明方法中的肝内胆管细胞、细胞核tsne图谱结果的示意图。
图8是本发明基于同一肝内胆管组织样本同时进行外泌体、单细胞悬液和单细胞核悬液制备以及exo+scRNA-seq+snRNA-seq流程示意图。
图9是本发明方法中用于同一肝内胆管组织样本同时进行单细胞悬液和细胞核悬液制备以及试剂盒示意图。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
实施例1
本实施例以同一肝内胆管为样本，同时制备外泌体、单细胞悬液与单细胞核悬液，并分别开展外泌体small RNA测序、单细胞(核)测序。
1.1准备试剂
培养基、胰酶溶液、胶原酶Ⅱ溶液、胶原酶Ⅳ溶液、透明质酸酶溶液、预冷的PBS溶液、裂红液、去死细胞试剂(Dead Cell Removal MicroBeads、Binding Buf
1.2样品准备
取新鲜的600mg的肝内胆管组织，将其用PBS清洗擦干后置于培养皿中，将培养皿置于冰板上，用预冷的培养基洗涤组织，结束后弃掉洗涤液。
1.3组织破碎
使用无菌剪刀将肝内胆管组织剪碎，当组织被剪成糊状时即可停止，将培养皿中已剪碎的组织块转移至新的15mL离心管中。
1.4组织酶解
加入8mL预冷的培养基，加入终浓度为0.5％的胶原酶Ⅱ(v/v)溶液、0.3％的胶原酶Ⅳ溶液、0.1％的透明质酸酶(v/v)溶液。上下颠倒混匀后，放入杂交炉中37℃消化酶解15min。消化结束后向离心管中加入0.2％(v/v)的胰酶溶液，上下颠倒混匀后，室温静置4min。
1.5结束酶解
室温静置结束后，待组织块完全沉降，用移液器吸取上清经至新的15mL离心管中，保留底部组织沉淀用于单细胞核悬液的制备。将上清进行第一次离心处理，3000×g、4℃离心，10分钟。离心结束后，吸取上清转移至新的离心管中，进行第二次离心处理，16000×g、4℃离心，10分钟。第一次细胞沉淀留存备用。第二次离心处理结束后，收集第二次离心上清用于后续外泌体的制备。将第一次细胞沉淀与第二次细胞沉淀使用4mL培养基重悬后，共同转移至新的离心管中，用于后续单细胞悬液的制备。
按以下1.6-1.9制备单细胞悬液：
1.6过筛
将上述1.5中重悬后的细胞沉淀用移液器吸取经40μm的筛网过滤至新的15mL离心管中，过筛结束后离心，500×g、4℃离心10min，离心结束后弃上清。
1.7裂解红细胞
向细胞沉淀中加入8mL的红细胞裂解液，使用移液器吹打混匀后，室温静置5min。裂解结束后500×g、4℃、离心5min，离心结束后弃上清。
1.8去除死细胞
向细胞沉淀中加入500μL Dead Cell Removal MicroBeads溶液，室温孵育15min，孵育结束前1min，用1×building buffer润洗LS柱，孵育结束后过柱。过柱结束后，400×g、4℃离心5min，离心结束后弃上清。
1.9洗涤镜检
向细胞沉淀中加入6mL培养基重悬细胞沉淀，300×g、4℃、离心7min，离心结束后弃上清。洗涤结束后加入1mL的预冷的培养基重悬细胞沉淀，使用0.4％台盼蓝(ThermoFisher Scientifc,T10282)进行镜检：取1μL台盼蓝溶液与9μL细胞悬液混匀，混匀后进行镜检。
2.1准备试剂
分别配置裂解缓冲液、洗涤缓冲液及最终Buffer，并将配置好的溶液预冷。
裂解缓冲液包括以下成份(终浓度)：50mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mM CaCl2、5mMNaCl、0.3％(v/v)NP40、0.3％(v/v)吐温20、0.4U/μL RNase Inhibitor(RNA酶抑制剂)。
洗涤缓冲液包含以下成分(终浓度)：50mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mM CaCl2、5mMNaCl、0.4U/μL RNase Inhibitor(RNA酶抑制剂)、1％(v/v)BSA。
最终Buffer包含以下成分(终浓度)：9％PBS、1％(v/v)BSA、0.4U/μL RNaseInhibitor(RNA酶抑制剂)。
按以下2.2-2.6制备单细胞核悬液：
2.2组织沉淀洗涤
加入14mL的PBS将上述1.5中所述剩余组织洗涤3次，800×g、4℃离心10min，离心结束后弃上清。
2.3裂解组织
向洗涤过的组织沉淀中，加入4mL的cell lysis buffer，置于冰上孵育8min。
2.4过筛
裂解结束后采用40μm细胞筛对其进行过滤，将其过滤至新的15mL离心管中，将滤液800×g、4℃离心8min，离心结束后弃上清。
2.5洗涤
加入6mL的洗涤缓冲液至细胞核沉淀中，800×g、4℃离心8min，离心结束后弃上清。
2.6洗涤
向上一步细胞核沉淀中加入6mL的洗涤缓冲液，以800×g、4℃离心5min，离心结束后弃上清。向最终的细胞核沉淀中加入1.5Ml最终Buffer重悬细胞核沉淀，以得到上机所用的细胞核悬液。
2.7镜检
使用0.4％台盼蓝(Thermo Fisher Scientifc,T10282)进行镜检：取1μL台盼蓝溶液与9μL细胞核悬液混匀后进行镜检。
3.1准备试剂
Invitrogen-外泌体exosomes纯化试剂、Exosomal RNA Isolation Kit、PBS
按以下3.2-3.4制备单细胞核悬液
3.2去碎片处理
将上述步骤1.5中所述第二次离心上清进行离心处理，，16000×g、4℃、10min。离心结束后，收集上清至新的离心管中。
3.3孵育
将上述3.2中离心后的上清与Invitrogen试剂混合，4℃孵育10h。
3.4回收
将上述3.3中孵育后的混合液，10000×g、4℃离心，60分钟，离心后回收沉淀，使用PBS缓冲液将沉淀重悬。
3.5RNA抽提及定量
将上述3.4获得的外泌体，以试剂盒法提取RNA，所有操作依照试剂盒(ExosomalRNA Isolation Kit)说明书进行。获得的RNA以NanoDrop 2000进行定量，以确定获得的RNA量。
结果及分析：
以上实验结果显示：通过本发明方法在同一肝内胆管组织中同时制备外泌体、单细胞悬液和单细胞核悬液，制备结束后，单细胞悬液、单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后，细胞、细胞核浓度、碎片杂质比例、结团比例，均能够达到10x Genomics公司单细胞测序要求，且分离的外泌体中的小RNA，对所述小RNA进行建库，也可达到NGS测序要求。(见表1)。
实施例2
本实施例以同一肝内胆管为样本，同时制备外泌体、单细胞悬液与单细胞核悬液，并分别开展外泌体small RNA测序、单细胞(核)测序。
1.1准备试剂
培养基、胰酶溶液、胶原酶Ⅱ溶液、胶原酶Ⅳ溶液、透明质酸酶溶液、预冷的PBS溶液、裂红液、去死细胞试剂(Dead Cell Removal MicroBeads、Binding Buf
1.2样品准备
取新鲜的600mg的肝内胆管组织，将其用PBS清洗擦干后置于培养皿中，将培养皿置于冰板上，用预冷的培养基洗涤组织，结束后弃掉洗涤液。
1.3组织破碎
使用无菌剪刀将肝内胆管组织剪碎，当组织被剪成糊状时即可停止，将培养皿中已剪碎的组织块转移至新的15mL离心管中。
1.4组织酶解
加入8mL预冷的培养基，加入终浓度为0.5％的胶原酶Ⅱ(v/v)溶液、0.3％的胶原酶Ⅳ溶液、0.1％的透明质酸酶(v/v)溶液。上下颠倒混匀后，放入杂交炉中37℃消化酶解15min。消化结束后向离心管中加入0.2％(v/v)的胰酶溶液，上下颠倒混匀后，室温静置4min。
1.5结束酶解
室温静置结束后，待组织块完全沉降，用移液器吸取上清经至新的15mL离心管中，保留底部组织沉淀用于单细胞核悬液的制备。将上清进行第一次离心处理，3000×g、4℃离心，10分钟。离心结束后，吸取上清转移至新的离心管中，进行第二次离心处理，16000×g、4℃离心，10分钟。第一次细胞沉淀留存备用。第二次离心处理结束后，收集第二次离心上清用于后续外泌体的制备。将第一次细胞沉淀与第二次细胞沉淀使用4mL培养基重悬后，共同转移至新的离心管中，用于后续单细胞悬液的制备。
按以下1.6-1.9制备单细胞悬液：
1.6过筛
将上述1.5中重悬后的细胞沉淀用移液器吸取经40μm的筛网过滤至新的15mL离心管中，过筛结束后离心，500×g、4℃离心10min，离心结束后弃上清。
1.7裂解红细胞
向细胞沉淀中加入8mL的红细胞裂解液，使用移液器吹打混匀后，室温静置5min。裂解结束后500×g、4℃、离心5min，离心结束后弃上清。
1.8去除死细胞
向细胞沉淀中加入500μL Dead Cell Removal MicroBeads溶液，室温孵育15min，孵育结束前1min，用1×building buffer润洗LS柱，孵育结束后过柱。过柱结束后，400×g、4℃离心5min，离心结束后弃上清。
1.9洗涤镜检
向细胞沉淀中加入6mL培养基重悬细胞沉淀，300×g、4℃、离心7min，离心结束后弃上清。洗涤结束后加入1mL的预冷的培养基重悬细胞沉淀，使用0.4％台盼蓝(ThermoFisher Scientifc,T10282)进行镜检：取1μL台盼蓝溶液与9μL细胞悬液混匀，混匀后进行镜检。
2.1准备试剂
分别配置裂解缓冲液、洗涤缓冲液及最终Buffer，并将配置好的溶液预冷。
裂解缓冲液包括以下成份(终浓度)：50mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mM CaCl2、5mMNaCl、0.4％(v/v)NP40、0.4％(v/v)吐温20、0.4U/μL RNase Inhibitor(RNA酶抑制剂)。
洗涤缓冲液包含以下成分(终浓度)：50mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mM CaCl2、5mMNaCl、0.4U/μL RNase Inhibitor(RNA酶抑制剂)、1％(v/v)BSA。
最终Buffer包含以下成分(终浓度)：9％PBS、1％(v/v)BSA、0.4U/μL RNaseInhibitor(RNA酶抑制剂)。
按以下2.2-2.6制备单细胞核悬液：
2.2组织沉淀洗涤
加入14mL的PBS将上述1.5中所述剩余组织洗涤3次，800×g、4℃离心10min，离心结束后弃上清。
2.3裂解组织
向洗涤过的组织沉淀中，加入4mL的cell lysis buffer，置于冰上孵育8min。
2.4过筛
裂解结束后采用40μm细胞筛对其进行过滤，将其过滤至新的15mL离心管中，将滤液800×g、4℃离心8min，离心结束后弃上清。
2.5洗涤
加入6mL的洗涤缓冲液至细胞核沉淀中，800×g、4℃离心8min，离心结束后弃上清。
2.6洗涤
向上一步细胞核沉淀中加入6mL的洗涤缓冲液，以800×g、4℃离心5min，离心结束后弃上清。向最终的细胞核沉淀中加入1.5Ml最终Buffer重悬细胞核沉淀，以得到上机所用的细胞核悬液。
2.7镜检
使用0.4％台盼蓝(Thermo Fisher Scientifc,T10282)进行镜检：取1μL台盼蓝溶液与9μL细胞核悬液混匀后进行镜检。
3.1准备试剂
Invitrogen-外泌体exosomes纯化试剂、Exosomal RNA Isolation Kit、PBS
按以下3.2-3.4制备单细胞核悬液
3.2去碎片处理
将上述步骤1.5中所述第二次离心上清进行离心处理，，16000×g、4℃、10min。离心结束后，收集上清至新的离心管中。
3.3孵育
将上述3.2中离心后的上清与Invitrogen试剂混合，4℃孵育10h。
3.4回收
将上述3.3中孵育后的混合液，10000×g、4℃离心，60分钟，离心后回收沉淀，使用PBS缓冲液将沉淀重悬。
3.5RNA抽提及定量
将上述3.4获得的外泌体，以试剂盒法提取RNA，所有操作依照试剂盒(ExosomalRNA Isolation Kit)说明书进行。获得的RNA以NanoDrop 2000进行定量，以确定获得的RNA量。
结果及分析：
以上实验结果显示：通过本发明方法在同一肝内胆管组织中同时制备外泌体、单细胞悬液和单细胞核悬液，制备结束后，单细胞悬液、单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后，细胞、细胞核浓度、碎片杂质比例、结团比例，均能够达到10x Genomics公司单细胞测序要求，且分离的外泌体中的小RNA，对所述小RNA进行建库，也可达到NGS测序要求。(见表1)。
对比实施例1
使用肝内胆管组织作为样本。制备完单细胞核悬液后，不加任何酶处理，于37℃放置。
1单细胞核悬液制备
1.1准备试剂、仪器、耗材
开始取材前，预先准备好离心管、剪刀、培养皿、PBS、离心机等。参考10X单细胞核制备方法分别配置裂解缓冲液及洗涤缓冲液，并将配置好的溶液置于冰上预冷。
裂解缓冲液成份包括(终浓度)：10mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mM CaCl2、5mM NaCl、0.1％～0.2％NP40、21mM MgCl2、0.4U/μLRNase Inhibitor(RNA酶抑制剂)。
洗涤缓冲液包含以下成分(终浓度)：10mM Tris-HCl(pH＝7.5)、1mM CaCl2、5mMNaCl、21mM MgCl2、0.4U/μLRNase Inhibitor(RNA酶抑制剂)、1％～2％(v/v)BSA。
1.2样本清洗
将新鲜组织取出后，使用冰上预冷的PBS漂洗3次，直至看不到明显的血液残留为止。
1.3细胞核悬液制备
一边向培养皿中加入2mL裂解缓冲液，一边使用无菌剪刀将小鼠肾脏组织在培养皿中剪碎，组织剪碎后冰上静置7分钟，裂解完成后加入洗涤缓冲液，再经过40μm孔径的细胞筛过滤，将滤液转移至新的15mL离心管中，然后以1000×g、4℃离心10分钟。将剩余组织回收用于单细胞悬液的制备。离心结束后细胞核沉淀使用洗涤缓冲液重悬，再经过洗涤纯化，制备得到单细胞核悬液。
1.4细胞核悬液质检
将9μL上述1.3步骤中得到的细胞核悬液与1μL的台盼蓝染色液混匀，进行镜检，确定最终细胞核的浓度、碎片比例及细胞核结团比例。
2单细胞核悬液静置
2.1 37℃静置
用移液器吸取制备好的单细胞核悬液至15mL离心管中，置于37℃中静置5min。
2.2RNA抽提
静置结束后对单细胞核悬液进行细胞核RNA抽提。
2.3RNA质检
对抽提的细胞核RNA进行nanodrop，4150质检。
2.4镜检
取9μL上述步骤中静置后的单细胞核悬液与1μL台盼蓝溶液混匀后，进行镜检。
结果显示：细胞核RNA于37℃放置5min后未发生降解。
对比实施例2
使用肝内胆管组织作为样本。制备完单细胞核悬液后，不加任何酶处理，于37℃放置。
除放置时间由5min替换为10min外，其余操作与对比实施例1完全相同。
结果显示：单细胞核悬液随着放置时间的增加，细胞核碎片杂质比列、结团比例均较对比实施例1未见明显升高，细胞核RNA于37℃放置10min后未发生降解。
对比实施例3
使用肝内胆管组织作为样本。制备完单细胞核悬液后，不加任何酶处理，于37℃放置。
除放置时间由5min替换为15min外，其余操作与对比实施例1完全相同。
结果显示：单细胞核悬液随着放置时间的增加，细胞核碎片杂质比列、结团比例均较对比实施例1未见明显升高，细胞核RNA于37℃放置15min后未发生降解。
对比实施例4
使用肝内胆管组织作为样本。制备完单细胞核悬液后，不加任何酶处理，于37℃放置。
除放置时间由5min替换为20min外，其余操作与对比实施例1完全相同。
结果显示：单细胞核悬液随着放置时间的增加，细胞核碎片杂质比列、结团比例均较对比实施例1未见明显升高，细胞核RNA于37℃放置20min后未发生降解。
对比实施例5
使用肝内胆管组织作为样本。制备完单细胞核悬液后，不加任何酶处理，于37℃放置。
除放置时间由5min替换为25min外，其余操作与对比实施例1完全相同。
结果显示：单细胞核悬液随着放置时间的增加，细胞核碎片杂质比列、结团比例均较对比实施例1稍有升高，细胞核RNA于37℃放置25min后，RNA未降解。
对比实施例6
使用肝内胆管组织作为样本。制备完单细胞核悬液后，不加任何酶处理，于37℃放置。
除放置时间由5min替换为30min外，其余操作与对比实施例1完全相同。
结果显示：单细胞核悬液随着放置时间的增加，细胞核碎片杂质比列、结团比例均较对比实施例1有所升高，细胞核RNA于37℃放置30min后，RNA主峰出现些许偏移。
对比实施例7
使用肝内胆管组织作为样本。制备完单细胞核悬液后，不加任何酶处理，于37℃放置。
除放置时间由5min替换为35min外，其余操作与对比实施例1完全相同。
结果显示：单细胞核悬液随着放置时间的增加，细胞核碎片杂质比列、结团比例均较对比实施例1升高，细胞核RNA于37℃放置35min后，RNA开始降解。
对比实施例8
参考《Enrichment of extracellular vesicles from tissues of the centralnervous system by PROSPR》一文中提供的现有技术，以肝内胆管组织作为样本，使用均质法对组织破碎后，进行外泌体纯化。
1外泌体制备
1.1准备试剂、仪器、耗材
100mM ammonium acetate(AA)buffer、bullet blender homogenizer(NextAdvance,NY,USA)、200mg of 0.9–2.00mm particles蛋白酶抑制剂、离心管、培养皿、PBS、离心机等
1.2样本清洗
将新鲜组织取出后，使用冰上预冷的PBS漂洗3次，直至看不到明显的血液残留为止。
1.3组织破碎
向肝内胆管组织中加入500μL 100mM的AA缓冲液和40mg金属珠在中等强度(速度<6)下均质化5分钟。均质结束后将均质化的样品以15000×g，4℃，离心10分钟，离心结束后收集上清液。颗粒清洗后重新放入500μL AA缓冲液中，并进行第二轮均质化，5分钟(速度小于8)。然后再次离心，15000×g下，4℃，离心10分钟，离心结束后收集上清液。
1.4外泌体分离纯化
将上述1.3中上清液采用Qiagen公司exoEasy Maxi Kit分离纯化外泌体，所有操作遵照说明书进行。
1.5外泌体表征
将上述1.4中得到的外泌体取出适量稀释至合适倍数后进行NTA(纳米颗粒跟踪分析)检测，以确定粒径和浓度。同时通过zeta电位确定外泌体电位数值。
使用肝内胆管组织作为样本。制备完外泌体悬液后，不加任何酶处理，于37℃放置。
2外泌体37℃静置
2.1 37℃静置
用移液器吸取制备好的外泌体悬液至1.5mL离心管中，置于37℃中静置5min。
2.2外泌体表征
将上述2.1中37℃放置5min后得到的外泌体取出适量稀释至合适倍数后进行NTA(纳米颗粒跟踪分析)检测，以确定粒径和浓度。同时通过zeta电位观察外泌体变化。
2.3RNA抽提
对静置结束后的外泌体以Trizol法提取总RNA，所有操作依照试剂说明书进行。
2.4RNA质检
对抽提的外泌体RNA进行nanodrop，4150质检，进行定量，以确定获得的总RNA量。
结果显示：外泌体于37℃放置5min后总RNA量未发生改变。且外泌体NTA结果显示，粒径和浓度未发生明显改变。zeta电位未发生明显改变。
对比实施例9
使用肝内胆管组织作为样本。制备完外泌体悬液后，不加任何酶处理，于37℃放置。
除放置时间由5min替换为10min外，其余操作与对比实施例8完全相同。
结果显示：外泌体于37℃放置10min后总RNA量未发生明显改变。且外泌体NTA结果显示，粒径和浓度未发生明显改变。zeta电位未发生明显改变。
对比实施例10
使用肝内胆管组织作为样本。制备完外泌体悬液后，不加任何酶处理，于37℃放置。
除放置时间由5min替换为15min外，其余操作与对比实施例8完全相同。
结果显示：外泌体于37℃放置15min后总RNA量未发生明显改变。且外泌体NTA结果显示，粒径和浓度未发生明显改变。zeta电位未发生明显改变。
对比实施例11
使用肝内胆管组织作为样本。制备完外泌体悬液后，不加任何酶处理，于37℃放置。
除放置时间由5min替换为20min外，其余操作与对比实施例8完全相同。
结果显示：外泌体于37℃放置20min后总RNA量未发生明显改变。且外泌体NTA结果显示，粒径和浓度未发生明显改变。zeta电位数值些许降低。
对比实施例12
使用肝内胆管组织作为样本。制备完外泌体悬液后，不加任何酶处理，于37℃放置。
除放置时间由5min替换为25min外，其余操作与对比实施例8完全相同。
结果显示：外泌体于37℃放置25min后总RNA量些许降低。且外泌体NTA结果显示，粒径和浓度些许降低。zeta电位数值较对比实施例11些许降低。
对比实施例13
使用肝内胆管组织作为样本。制备完外泌体悬液后，不加任何酶处理，于37℃放置。
除放置时间由5min替换为min外，其余操作与对比实施例8完全相同。
结果显示：外泌体于37℃放置30min后总RNA量些许降低。且外泌体NTA结果显示，粒径和浓度些许降低。zeta电位数值较对比实施例12些许降低。
对比实施例14
使用肝内胆管作为样本。采用均质法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
参考《Enrichment of extracellular vesicles from tissues of the centralnervous system by PROSPR》一文中提供的现有技术，以肝内胆管组织作为样本，使用均质法对组织破碎后，进行外泌体纯化。
1外泌体制备
1.2准备试剂、仪器、耗材
100mM ammonium acetate(AA)buffer、bullet blender homogenizer(NextAdvance,NY,USA)、200mg of 0.9–2.00mm particles蛋白酶抑制剂、离心管、培养皿、PBS、离心机等
1.2样本清洗
将新鲜组织取出后，使用冰上预冷的PBS漂洗3次，直至看不到明显的血液残留为止。
1.3组织破碎
向肝内胆管组织中加入500μL 100mM的AA缓冲液和40mg金属珠在中等强度(速度<6)下均质化5分钟。均质结束后将均质化的样品以15000×g，4℃，离心10分钟，离心结束后收集上清液，此时剩余组织留存备用，用于后续单细胞及单细胞核悬液的制备。颗粒清洗后重新放入500μL AA缓冲液中，并进行第二轮均质化，5分钟(速度小于8)。然后再次离心，15000×g下，4℃，离心10分钟，离心结束后收集上清液。
1.4外泌体分离纯化
将上述1.3中上清液采用Qiagen公司exoEasy Maxi Kit分离纯化外泌体，所有操作遵照说明书进行。
1.5外泌体表征
将上述1.4中得到的外泌体取出适量稀释至合适倍数后进行NTA(纳米颗粒跟踪分析)检测，以确定粒径和浓度。同时通过zeta电位确定外泌体电位数值
2 单细胞悬液制备
2.1 准备试剂
培养基、胶原酶Ⅱ溶液、PBS。
2.2样品清洗
取上述1.3剩余组织，将其用PBS进行清洗，1000×g下，4℃，离心5min。离心结束后弃掉上清液。
2.3组织酶解
向组织中加入4mL预冷的培养基，加入终浓度为0.2％的胶原酶Ⅱ(v/v)溶液，上下颠倒混匀后，放入杂交炉中37℃消化酶解10min。
2.4结束酶解
使用移液器吹打组织与酶、培养基混合液，静置待组织块完全沉降，用移液器吸取上清经40μm的筛网过滤至新的15mL离心管中，保留底部组织沉淀用于细胞核的制备。装有滤液的离心管进行500×g、4℃离心10min，离心结束后弃上清。
2.5镜检
加入1mL的预冷的培养基重悬细胞沉淀，使用0.4％台盼蓝(Thermo FisherScientifc,T10282)进行镜检：取1μL台盼蓝溶液与9μL细胞悬液混匀，混匀后进行镜检。
结果显示：制备结束后，单细胞悬液经台盼蓝染色镜检后，细胞总量不足、碎片杂质比例、结团比例，不能达到10x Genomics公司单细胞测序要求。
3单细胞核悬液制备
3.1样品清洗
取上述2.4剩余组织，将其用PBS进行清洗，1000×g下，4℃，离心5min。离心结束后弃掉上清液。
3.2核悬液制备
与对比实施例1制备方法完全一致。
3.3镜检
加入1mL的预冷的培养基重悬细胞核沉淀，使用0.4％台盼蓝(Thermo FisherScientifc,T10282)进行镜检：取1μL台盼蓝溶液与9μL细胞核悬液混匀，混匀后进行镜检。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后，基本观察不到细胞核，细胞核总量很少。
对比实施例15
使用肝内胆管作为样本。采用均质法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间由10min替换为20min外，其余操作与对比实施例14完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞与单细胞核均达不到10x Genomics公司单细胞测序要求。
对比实施例16
使用肝内胆管作为样本。采用均质法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间由10min替换为30min外，其余操作与对比实施例14完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞与单细胞核均达不到10x Genomics公司单细胞测序要求。
对比实施例17
使用肝内胆管作为样本。采用均质法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶替换为胶原酶Ⅳ溶液外，其余操作与对比实施例14完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞与单细胞核均达不到10x Genomics公司单细胞测序要求。
对比实施例18
使用肝内胆管作为样本。采用均质法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为20min外，其余操作与对比实施例17完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞与单细胞核均达不到10x Genomics公司单细胞测序要求。
对比实施例19
使用肝内胆管作为样本。采用均质法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为30min外，其余操作与对比实施例17完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞与单细胞核均达不到10x Genomics公司单细胞测序要求。
对比实施例20
使用肝内胆管作为样本。采用均质法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶替换为胶原酶Ⅳ+胶原酶Ⅱ溶液外，其余操作与对比实施例14完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞与单细胞核均达不到10x Genomics公司单细胞测序要求。
对比实施例21
使用肝内胆管作为样本。采用均质法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为20min外，其余操作与对比实施例20完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞与单细胞核均达不到10x Genomics公司单细胞测序要求。
对比实施例22
使用肝内胆管作为样本。采用均质法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为30min外，其余操作与对比实施例20完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞与单细胞核均达不到10x Genomics公司单细胞测序要求。
对比实施例23
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
参考《Tissue-derived extracellular vesicles:Research progress fromisolation to application》一文中提供的现有技术，以肝内胆管组织作为样本，使用酶解法进行外泌体纯化。
1 单细胞悬液制备
1.1 试剂准备
PBS，培养基，胶原酶D
1.2样品准备
取肝内胆管组织，将其用PBS清洗擦干后置于培养皿中，将培养皿置于冰板上，用预冷的培养基洗涤组织，结束后弃掉洗涤液。
1.3组织破碎
使用无菌剪刀将肝内胆管组织剪碎，当组织被剪成糊状时即可停止，将培养皿中已剪碎的组织块转移至新的15mL离心管中。
1.4组织酶解
加入8mL预冷的培养基，加入终浓度为0.2％的胶原酶D(v/v)溶液。上下颠倒混匀后，放入杂交炉中37℃消化酶解5min。
1.5结束酶解
室温静置结束后，待组织块完全沉降，用移液器吸取上清经至新的15mL离心管中，保留底部组织沉淀用于单细胞核悬液的制备。将上清进行第一次离心处理，3000×g、4℃离心，10分钟。离心结束后，吸取上清转移至新的离心管中，进行第二次离心处理，16000×g、4℃离心，10分钟。第一次细胞沉淀留存备用。第二次离心处理结束后，收集第二次离心上清用于后续外泌体的制备。将第一次细胞沉淀与第二次细胞沉淀使用4mL培养基重悬后，共同转移至新的离心管中，用于后续单细胞悬液的制备。
1.6过筛
将上述1.5中重悬后的细胞沉淀用移液器吸取经40μm的筛网过滤至新的15mL离心管中，过筛结束后离心，500×g、4℃离心10min，离心结束后弃上清。
1.7裂解红细胞
向细胞沉淀中加入8mL的红细胞裂解液，使用移液器吹打混匀后，室温静置5min。裂解结束后500×g、4℃、离心5min，离心结束后弃上清。
2单细胞核悬液制备
2.1样品清洗
取上述1.5剩余组织，将其用PBS进行清洗，1000×g下，4℃，离心5min。离心结束后弃掉上清液。
2.2核悬液制备
与对比实施例1制备方法完全一致。
2.3镜检
加入1mL的预冷的培养基重悬细胞核沉淀，使用0.4％台盼蓝(Thermo FisherScientifc,T10282)进行镜检：取1μL台盼蓝溶液与9μL细胞核悬液混匀，混匀后进行镜检。
2.4核RNA抽提质检
对分离好的单细胞核以Trizol法提取总RNA，所有操作依照试剂说明书进行。
3 外泌体分离纯化
3.1 外泌体分离
将上述1.5中上清液采用Qiagen-exoEasy Maxi Kit分离纯化外泌体。
3.2外泌体表征
将上述3.1中得到的外泌体取出适量稀释至合适倍数后进行NTA(纳米颗粒跟踪分析)检测，以确定粒径和浓度。同时通过zeta电位确定外泌体电位数值。
3.2外泌体RNA抽提
对分离好的外泌体以Trizol法提取总RNA，所有操作依照试剂说明书进行。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例24
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为10min外，其余操作与对比实施例23完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例25
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为15min外，其余操作与对比实施例23完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例26
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为20min外，其余操作与对比实施例23完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例27
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为25min外，其余操作与对比实施例23完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例28
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为30min外，其余操作与对比实施例23完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经经抽提RNA质检后，RNA主峰发生些偏移。细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例29
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解液替换为胶原酶Ⅱ外，其余操作与对比实施例23完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例30
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为10min外，其余操作与对比实施例29完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例31
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为15min外，其余操作与对比实施例29完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例32
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为20min外，其余操作与对比实施例29完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例33
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为25min外，其余操作与对比实施例29完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求
对比实施例34
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为30min外，其余操作与对比实施例29完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经经抽提RNA质检后，RNA主峰发生些偏移。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量不可达到small RNA建库要求。
对比实施例35
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解液替换为胶原酶Ⅳ外，其余操作与对比实施例23完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例36
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为10min外，其余操作与对比实施例35完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例37
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为15min外，其余操作与对比实施例35完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例38
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为20min外，其余操作与对比实施例35完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例39
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为25min外，其余操作与对比实施例35完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例40
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为30min外，其余操作与对比实施例35完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经抽提RNA质检后，RNA主峰发生些偏移。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量少，达不到small RNA建库要求。
对比实施例41
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解液替换为透明质酸酶外，其余操作与对比实施例23完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例42
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为10min外，其余操作与对比实施例41完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例43
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为15min外，其余操作与对比实施例41完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例44
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为20min外，其余操作与对比实施例41完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例45
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为25min外，其余操作与对比实施例41完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例46
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为30min外，其余操作与对比实施例41完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经经抽提RNA质检后，RNA主峰发生些偏移。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例47
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解液替换为胰蛋白酶外，其余操作与对比实施例23完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例48
用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为10min外，其余操作与对比实施例47完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例49
用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为15min外，其余操作与对比实施例47完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例50
用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为20min外，其余操作与对比实施例47完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例51
用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为25min外，其余操作与对比实施例47完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例52
用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为30min外，其余操作与对比实施例47完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经经抽提RNA质检后，RNA主峰发生些偏移。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例53
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解液替换为木瓜蛋白酶外，其余操作与对比实施例23完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例54
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为10min外，其余操作与对比实施例53完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例55
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为15min外，其余操作与对比实施例53完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例56
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为20min外，其余操作与对比实施例53完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例57
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为25min外，其余操作与对比实施例53完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例58
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为30min外，其余操作与对比实施例53完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经经抽提RNA质检后，RNA主峰发生些偏移。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例59
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解液替换为胶原酶D与胶原酶Ⅱ外，其余操作与对比实施例23完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例60
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为10min外，其余操作与对比实施例59完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例61
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为15min外，其余操作与对比实施例59完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例62
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为20min外，其余操作与对比实施例59完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例63
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为25min外，其余操作与对比实施例59完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例64
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为30min外，其余操作与对比实施例59完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经经抽提RNA质检后，RNA主峰发生些偏移。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例65
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解液替换为胶原酶D与胶原酶Ⅳ外，其余操作与对比实施例23完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例66
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为10min外，其余操作与对比实施例完65全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例67
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为15min外，其余操作与对比实施例完65全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例68
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为20min外，其余操作与对比实施例完65全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例69
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为25min外，其余操作与对比实施例完65全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例70
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为30min外，其余操作与对比实施例完65全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经经抽提RNA质检后，RNA主峰发生些偏移。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例71
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解液替换为胶原酶D与透明质酸酶外，其余操作与对比实施例23完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例72
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为10min外，其余操作与对比实施例完71全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例73
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为15min外，其余操作与对比实施例完71全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例74
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为20min外，其余操作与对比实施例完71全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例75
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为25min外，其余操作与对比实施例完71全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例76
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为30min外，其余操作与对比实施例完71全相同。
结果显示：制备结束后，制备结束后，单细胞核悬液经经抽提RNA质检后，RNA主峰发生些偏移。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例77
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解液替换为胶原酶D与木瓜蛋白酶外，其余操作与对比实施例23完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例78
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为10min外，其余操作与对比实施例77完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例79
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为15min外，其余操作与对比实施例77完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例80
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为20min外，其余操作与对比实施例77完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例81
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为25min外，其余操作与对比实施例77完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例82
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为30min外，其余操作与对比实施例77完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经经抽提RNA质检后，RNA主峰发生些偏移。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例83
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解液替换为胶原酶D与胰蛋白酶外，其余操作与对比实施例23完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例84
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为10min外，其余操作与对比实施例83完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例85
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为15min外，其余操作与对比实施例83完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例86
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为20min外，其余操作与对比实施例83完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例87
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为25min外，其余操作与对比实施例83完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例88
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为30min外，其余操作与对比实施例83完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经经抽提RNA质检后，RNA主峰发生些偏移。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例89
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解液替换为胶原酶Ⅱ与胶原酶Ⅳ外，其余操作与对比实施例23完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例90
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为10min外，其余操作与对比实施例89完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例91
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为15min外，其余操作与对比实施例89完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例92
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为20min外，其余操作与对比实施例89完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例93
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为25min外，其余操作与对比实施例89完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例94
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为30min外，其余操作与对比实施例89完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经经抽提RNA质检后，RNA主峰发生些偏移。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例95
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解液替换为胶原酶Ⅱ与透明质酸酶外，其余操作与对比实施例23完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例96
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为10min外，其余操作与对比实施例95完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例97
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为15min外，其余操作与对比实施例95完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例98
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为20min外，其余操作与对比实施例95完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例99
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为25min外，其余操作与对比实施例95完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例100
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为30min外，其余操作与对比实施例95完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经经抽提RNA质检后，RNA主峰发生些偏移。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例101
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解液替换为胶原酶Ⅱ与木瓜蛋白酶外，其余操作与对比实施例23完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例102
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为10min外，其余操作与对比实施例101完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例103
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为15min外，其余操作与对比实施例101完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例104
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为20min外，其余操作与对比实施例101完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例105
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为25min外，其余操作与对比实施例101完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例106
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为30min外，其余操作与对比实施例101完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经经抽提RNA质检后，RNA主峰发生些偏移。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例107
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解液替换为胶原酶Ⅱ与胰蛋白酶酶外，其余操作与对比实施例23完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例108
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为10min外，其余操作与对比实施例107完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例109
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为15min外，其余操作与对比实施例107完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例110
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为20min外，其余操作与对比实施例107完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例111
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为25min外，其余操作与对比实施例107完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例112
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为30min外，其余操作与对比实施例107完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经经抽提RNA质检后，RNA主峰发生些偏移。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例113
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解液替换为胶原酶Ⅳ与透明质酸酶外，其余操作与对比实施例23完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例114
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为10min外，其余操作与对比实施例113完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例115
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为15min外，其余操作与对比实施例113完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例116
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为20min外，其余操作与对比实施例113完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例117
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为25min外，其余操作与对比实施例113完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例118
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为30min外，其余操作与对比实施例113完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经经抽提RNA质检后，RNA主峰发生些偏移。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例119
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解液替换为胶原酶Ⅳ与木瓜蛋白酶外，其余操作与对比实施例23完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例120
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为10min外，其余操作与对比实施例119完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例121
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为15min外，其余操作与对比实施例119完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例122
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为20min外，其余操作与对比实施例119完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例123
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为25min外，其余操作与对比实施例119完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例124
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为30min外，其余操作与对比实施例119完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经经抽提RNA质检后，RNA主峰发生些偏移。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例125
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解液替换为胶原酶Ⅳ与胰蛋白酶外，其余操作与对比实施例23完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例126
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为10min外，其余操作与对比实施例125完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例127
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为15min外，其余操作与对比实施例125完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例128
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为20min外，其余操作与对比实施例125完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例129
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为25min外，其余操作与对比实施例125完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例130
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为30min外，其余操作与对比实施例125完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经经抽提RNA质检后，RNA主峰发生些偏移。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例131
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解液替换为透明质酸酶与木瓜蛋白酶外，其余操作与对比实施例23完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例132
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为10min外，其余操作与对比实施例131完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例133
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为15min外，其余操作与对比实施例131完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例134
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为20min外，其余操作与对比实施例131完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例135
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为25min外，其余操作与对比实施例131完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例136
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为30min外，其余操作与对比实施例131完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经经抽提RNA质检后，RNA主峰发生些偏移。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例137
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解液替换为透明质酸酶与胰蛋白酶外，其余操作与对比实施例23完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求
对比实施例138
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为10min外，其余操作与对比实施例137完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例139
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为15min外，其余操作与对比实施例137完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例140
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为20min外，其余操作与对比实施例137完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例141
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为25min外，其余操作与对比实施例137完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例142
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为30min外，其余操作与对比实施例137完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经经抽提RNA质检后，RNA主峰发生些偏移。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例143
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解液替换为木瓜蛋白酶与胰蛋白酶外，其余操作与对比实施例23完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求
对比实施例144
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为10min外，其余操作与对比实施例143完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例145
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为15min外，其余操作与对比实施例143完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例146
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为20min外，其余操作与对比实施例143完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例147
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为25min外，其余操作与对比实施例143完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例148
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为30min外，其余操作与对比实施例143完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经经抽提RNA质检后，RNA主峰发生些偏移。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例149
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解液替换为胶原酶D、胶原酶Ⅱ、胶原酶Ⅳ外，其余操作与对比实施例23完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求
对比实施例150
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为10min外，其余操作与对比实施例149完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例151
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为15min外，其余操作与对比实施例149完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量可达到small RNA建库要求。
对比实施例152
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为20min外，其余操作与对比实施例149完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量可达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例153
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解液替换为胶原酶D、胶原酶Ⅱ、透明质酸酶外，其余操作与对比实施例23完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例154
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为10min外，其余操作与对比实施例153完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例155
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为15min外，其余操作与对比实施例153完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量可达到small RNA建库要求。
对比实施例156
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为20min外，其余操作与对比实施例153完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量可达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例157
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解液替换为胶原酶D、胶原酶Ⅱ、木瓜蛋白酶外，其余操作与对比实施例23完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例158
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为10min外，其余操作与对比实施例157完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例159
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为15min外，其余操作与对比实施例157完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量可达到small RNA建库要求。
对比实施例160
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为20min外，其余操作与对比实施例157完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量可达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例161
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解液替换为胶原酶D、胶原酶Ⅱ、胰蛋白酶外，其余操作与对比实施例23完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例162
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为10min外，其余操作与对比实施例161完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例163
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为15min外，其余操作与对比实施例161完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量可达到small RNA建库要求。
对比实施例164
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为20min外，其余操作与对比实施例161完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量可达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例165
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解液替换为胶原酶Ⅱ、胶原酶Ⅳ、透明质酸酶外，其余操作与对比实施例23完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例166
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为10min外，其余操作与对比实施例165完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例167
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为15min外，其余操作与对比实施例165完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞可达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量可达到small RNA建库要求。
对比实施例168
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为20min外，其余操作与对比实施例165完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞可达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例169
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解液替换为胶原酶Ⅱ、胶原酶Ⅳ、木瓜蛋白酶外，其余操作与对比实施例23完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例170
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为10min外，其余操作与对比实施例169完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例171
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为15min外，其余操作与对比实施例169完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量可达到small RNA建库要求。
对比实施例172
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为20min外，其余操作与对比实施例169完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量可法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例173
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解液替换为胶原酶Ⅱ、胶原酶Ⅳ、胰白酶外，其余操作与对比实施例23完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例174
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为10min外，其余操作与对比实施例173完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例175
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为15min外，其余操作与对比实施例173完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量可达到small RNA建库要求。
对比实施例176
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为20min外，其余操作与对比实施例173完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量可达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例177
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解液替换为胶原酶Ⅳ、透明质酸酶、木瓜蛋白酶外，其余操作与对比实施例23完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例178
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为10min外，其余操作与对比实施例177完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例179
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为15min外，其余操作与对比实施例177完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量可达到small RNA建库要求。
对比实施例180
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为20min外，其余操作与对比实施例177完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量可达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例181
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解液替换为胶原酶Ⅳ、透明质酸酶、胰蛋白酶外，其余操作与对比实施例23完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例182
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为10min外，其余操作与对比实施例181完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例183
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为15min外，其余操作与对比实施例181完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量可达到small RNA建库要求。
对比实施例184
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为20min外，其余操作与对比实施例181完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量可达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例185
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解液替换为透明质酸酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶外，其余操作与对比实施例23完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例186
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为10min外，其余操作与对比实施例185完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例187
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为15min外，其余操作与对比实施例185完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量不足，无法达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量可达到small RNA建库要求。
对比实施例188
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除将酶解时间替换为20min外，其余操作与对比实施例185完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞数量可达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量达不到small RNA建库要求。
对比实施例189
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除在37℃酶解后加入0.2％胰蛋白酶室温静置2min外，其余操作与对比实施例167完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞可达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量可达到small RNA建库要求。
对比实施例190
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除在37℃酶解后加入0.2％胰蛋白酶室温静置4min外，其余操作与对比实施例167完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞可达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量可达到small RNA建库要求。
对比实施例191
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
除在37℃酶解后加入0.2％胰蛋白酶室温静置6min外，其余操作与对比实施例167完全相同。
结果显示：制备结束后，单细胞核悬液经台盼蓝染色镜检后可达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。单细胞悬液细胞可达到10x Genomics公司单细胞测序要求。外泌体总量可达到small RNA建库要求。
对比实施例192
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
1单细胞悬液制备
其单细胞悬液制备操作与对比实施例190完全一致。
2单细胞核悬液制备
将酶解后的组织沉淀洗涤0次，洗涤后进行单细胞核制备。
结果显示：细胞核不能够达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。
对比实施例193
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
1单细胞悬液制备
其单细胞悬液制备操作与对比实施例190完全一致。
2单细胞核悬液制备
将酶解后的组织沉淀洗涤1次，洗涤后进行单细胞核制备。
结果显示：细胞核不能够达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。
对比实施例194
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
1单细胞悬液制备
其单细胞悬液制备操作与对比实施例190完全一致。
2单细胞核悬液制备
将酶解后的组织沉淀洗涤2次，洗涤后进行单细胞核制备。
结果显示：细胞核不能够达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。
对比实施例195
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
1单细胞悬液制备
其单细胞悬液制备操作与对比实施例190完全一致。
2单细胞核悬液制备
将酶解后的组织沉淀洗涤3次，洗涤后进行单细胞核制备。
结果显示：细胞核能够达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。
对比实施例196
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
1单细胞悬液制备
其单细胞悬液制备操作与对比实施例190完全一致。
2单细胞核悬液制备
将酶解后的组织沉淀洗涤4次，洗涤后进行单细胞核制备。
结果显示：细胞核能够达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。
对比实施例197
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
1单细胞悬液制备
其单细胞悬液制备操作与对比实施例190完全一致。
2单细胞核悬液制备
除将细胞核裂解液主要成分由0.1％～0.2％NP40变更为0.1％～0.2％TritonX-100外，其单细胞核悬液制备操作与对比实施例1完全一致。
结果显示：细胞核不能够达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。
对比实施例198
除将细胞核裂解液主要成分由0.1％～0.2％NP40变更为0.1％～0.2％吐温20外，其余操作与对比实施例197完全一致。
结果显示：细胞核不能够达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。
对比实施例199
除将细胞核裂解液主要成分由0.1％～0.2％NP40变更为0.1％～0.2％NP40+TritonX-100外，其余操作与对比实施例197完全一致。
结果显示：细胞核不能够达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。
对比实施例200
除将细胞核裂解液主要成分由0.1％～0.2％NP40变更为0.1％～0.2％NP40+吐温20外，其余操作与对比实施例197完全一致。
结果显示：细胞核能够达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。
对比实施例201
除将细胞核裂解液主要成分由0.1％～0.2％NP40变更为0.1％～0.2％TritonX-100+吐温20外，其余操作与对比实施例197完全一致。
结果显示：细胞核不能够达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。
对比实施例202
除将细胞核裂解液主要成分由0.1％～0.2％NP40变更为0.3％NP40+吐温20外，其余操作与对比实施例197完全一致。
结果显示：细胞核能够达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。
对比实施例203
除将细胞核裂解液主要成分由0.1％～0.2％NP40变更为0.4％NP40+吐温20外，其余操作与对比实施例197完全一致。
结果显示：细胞核能够达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。
对比实施例204
除将细胞核裂解液主要成分由0.1％～0.2％NP40变更为0.5％NP40+吐温20外，其余操作与对比实施例197完全一致。
结果显示：细胞核不能够达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。
对比实施例205
除将细胞核裂解液、洗涤缓冲液成分Tris-HCl由10mM变更为50mM外，其余操作与对比实施例203完全一致。
结果显示：细胞核能够达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。
对比实施例206
除将细胞核裂解液、洗涤缓冲液成分Tris-HCl由10mM变更为100mM外，其余操作与对比实施例203完全一致。
结果显示：细胞核能够达到10x Genomics公司单细胞核测序要求。
对比实施例207
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
使用超速离心法分离纯化外泌体，其余操作与对比实施例190完全一致。
对比实施例208
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
使用Exosomal RNA Isolation Kit分离纯化外泌体，其余操作与对比实施例190完全一致。
对比实施例209
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
使用Norgen-Cell Culture Media Exosome Purification Mini Kit(60500)分离纯化外泌体，其余操作与对比实施例190完全一致。
对比实施例210
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
使用恩泽康泰-外泌体纯化试剂盒(Echo9101A-10ml)分离纯化外泌体，其余操作与对比实施例190完全一致。
对比实施例211
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
使用Vazyme公司VEX Exosome Isolation Reagent分离纯化外泌体，其余操作与对比实施例190完全一致。
对比实施例212
使用肝内胆管作为样本。采用酶解法的方式制备外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
使用omiget公司外泌体纯化试剂盒(磁珠型)分离纯化外泌体，其余操作与对比实施例190完全一致。
对比实施例213
使用小鼠心脏作为样本。除组织样本不同外，其余所有操作与本发明实施例1完全相同。
结果显示：采用本发明所述技术方法对小鼠心脏组织同时进行外泌体、单细胞悬液与细胞核悬液制备。结果显示小鼠心脏组织无法同时进行外泌体small RNA测序、单细胞测序和单细胞核测序。
对比实施例214
使用小鼠脾脏作为样本。除组织样本不同外，其余所有操作与本发明实施例1完全相同。
结果显示：采用本发明所述技术方法对小鼠脾脏组织同时进行外泌体、单细胞悬液与细胞核悬液制备。结果显示小鼠心脏组织无法同时进行外泌体small RNA测序、单细胞测序和单细胞核测序。
进一步地，根据本发明表1提供的关于本发明实施例1～2的实验结果，说明本发明所提供的实验方法在人肝内胆管组织中同时制备外泌体、单细胞悬液与单细胞核悬液，可以制备到300ng外泌体总RNA，98W细胞，220W细胞核，得到的结果能够满足small RNA测序、10x Genomics单细胞及单细胞核测序实验各项质量指标的要求，顺利完成同一肝内胆管组织外泌体+单细胞+单细胞核测序实验。(见图1～图7)。
表1本发明方法中基于同一肝内胆管组织同时制备外泌体、单细胞及细胞核悬液的实验结果
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本发明提出的一种可在同一人肝内胆管组织中同时进行外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液制备、同时进行small RNA测序、单细胞测序/单细胞核测序的方法，并通过一系列对比实验，如对比实施例1～214所示，表明本发明具有突出的实质性特点和显著进步。
本发明创造性地将外泌体small RNA测序与单细胞和单细胞核测序三者结合起来。由于制备单细胞核悬液的细胞核裂解缓冲液中的去污剂，会破坏磷脂双分子层，溶解胞质和细胞膜，对细胞损伤较大，可能会导致后续单细胞悬液制备时收集不到足量的完整的细胞，无法满足10x Genomics上机要求，以及可能会造成细胞外囊泡损伤，无法满足smallRNA测序要求。为此本发明采用先制备单细胞悬液及外泌体再制备单细胞核悬液的操作顺序，以便在同一组织中同时获得外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液。
对比实施例1～7按照10x Genomics制备细胞核方式制备了单细胞核悬液，然后将制备好的单细胞核悬液分别分装到7个15mL离心管中，置于37℃静置，模拟酶解过程中温度对细胞核悬液的影响。每隔5min，抽取一份单细胞核悬液，对细胞核悬液进行台盼蓝染色镜检以及RNA抽提质控。结果显示，随着时间的增加(5min，10min，15min，20min，25min，30min，35min)，单细胞核悬液细胞核碎片杂质比列、结团比例均有升高；且放置30min后，RNA主峰出现了些许偏移，放置35min后，细胞核RNA出现降解。综上所述，推测同一人肝内胆管组织中，要进行exo+scRNA-seq&snRNA-seq，在制备单细胞悬液时，37℃酶解时间一定要控制在35min内，且尽量不要超过30min，以此避免影响后续单细胞核悬液质量。
表2制备好的单细胞核悬液，37℃放置时间变化
根据对比实施例1～7的结果，要保证较高质量的单细胞核RNA完整性，酶解时间应控制在30分钟以内。接下来模拟了外泌体在37℃环境放置的变化过程，以确保囊泡质量。如对比实施例8～13所示，以外泌体RNA总量、外泌体NTA结果、外泌体TEM结果、外泌体zeta电位结果作为主要质控指标，综合进行比较和判定。对比实施例8～13按照文献中提供的组织分离外泌体的方法，使用QIAGEN试剂盒制备了人肝内胆管组织外泌体。然后将制备好的外泌体分别分装到6个1.5mL离心管中，置于37℃静置，模拟酶解过程中温度对细胞外囊泡的影响。每隔5min，抽取一份外泌体，对外泌体进行RNA抽提质控以及NTA/zeta电位检测。结果显示，随着时间的增加(5min，10min，15min，20min，25min，30min)，在25min后，外泌体RNA总量开始些许降低；且放置20min后，外泌体NTA与zeta电位检测结果显示，外泌体浓度有少量降低，zeta电位出现些许改变。综上所述，推测同一人肝内胆管组织中，要进行exo+scRNA-seq&snRNA-seq，如果使用酶解方法制备外泌体，37℃酶解时间一定要控制在25min内，且尽量不要超过20min，以此避免影响后续细胞外囊泡质量。
表3制备好的外泌体，37℃放置时间变化
根据外泌体small RNA测序和单细胞/单细胞核测序流程，首先需要尝试将三者制备的方法结合起来，实现能够在同一组织中同时制备到外泌体、单细胞悬液、单细胞核悬液，且均能满足上机测序要求。根据《Enrichment of extracellular vesicles fromtissues of the central nervous system by PROSPR》一文中提供的现有技术，以肝内胆管组织作为样本，使用均质法对组织破碎后，进行外泌体纯化。因此，首先尝试通过均质法，同时制备外泌体、单细胞悬液与单细胞核悬液，如对比实施例14～22所示，以细胞活率、细胞/细胞核总量、细胞/细胞核碎片比例、细胞/细胞核结团比例及外泌体总RNA量作为质控指标。对比实施例14结果显示，制备到的外泌体总RNA量可以达到small RNA测序要求，但细胞/细胞核悬液质量无法满足足10x Genomics上机要求。接下来对酶解配方进行了测试，如对比实施例14～22所示。对比实施例14～16采用了0.2％胶原酶Ⅱ对肝内胆管组织进行解离，分别验证了酶解时间(10min、20min、30min)。对比实施例17～19采用了0.2％胶原酶Ⅳ对肝内胆管组织进行解离，分别验证了酶解时间(10min、20min、30min)。对比实施例20～22采用了0.2％胶原酶Ⅱ+0.2％胶原酶Ⅳ酶对肝内胆管组织进行解离，分别验证了酶解时间(10min、20min、30min)。对比实施例14～22结果均显示，使用均质法虽可制备到满足smallRNA测序要求的外泌体，但无法制备到高质量的单细胞/单细胞核悬液，单细胞/单细胞核悬液细胞/细胞核数量不足，且碎片率较高,杂质较多。推测可能是因为均质法对细胞及细胞核具有一定的损伤，所以无法同时制备到符合上机要求的单细胞/单细胞核悬液。
表4使用均质法制备外泌体、单细胞及单细胞核悬液
接下来尝试用酶解法制备外泌体、单细胞、单细胞核悬液。如对比实施例23～191所示，依次确定了能够同时制备三种悬液的酶解配方及酶解时间。参照10x Genomics公司标准，以细胞/细胞核总量、细胞/细胞核碎片比例、细胞/细胞核结团比例以及细胞核RNA质量以及外泌体总RNA含量作为主要质控指标，综合进行比较和判定。对比实施例23～52采用单种酶配方(0.5％胶原酶D、0.5％胶原酶Ⅱ、0.3％胶原酶Ⅳ、0.1％透明质酸酶、0.2％木瓜蛋白酶、0.2％胰蛋白酶、)进行解离(5min、10min、15min、20min、25min、30min)，制备到的细胞核悬液可达到10x Genomics公司上机标准，但当酶解超过25min后，对细胞核RNA质控，发现细胞核RNA主峰出现偏移，综合对比实施例1～7结果推测可能因为37℃消化酶解时间过长对细胞核膜具有一定的损伤。与此同时对比实施例23～52均无法获得较好的单细胞悬液(细胞活率和细胞量无法满足10x Genomics公司上机标准)与外泌体(外泌体总RNA量不足，无法满足small RNA建库要求)，推测可能是解离时间较短，单种酶解离不够充分导致。但解离时间过长会导致制备到的细胞核悬液无法达到10x Genomics公司上机标准。由于单种酶配方均无法在25分钟内实现有效解离，获得高质量的单细胞悬液与外泌体。因此，接下来尝试着两种组合酶配方，希望能通过不同酶切位点的组合方式，来尽可能充分的解离，以避免单个酶解的时间太短导致解离不充分的缺陷。对比实施例59～148采用两种酶配方(0.5％胶原酶D+0.5％胶原酶Ⅱ、0.5％胶原酶D+0.3％胶原酶Ⅳ、0.5％胶原酶D+0.1％透明质酸酶、0.5％胶原酶D+0.2％木瓜蛋白酶、0.5％胶原酶D+0.2％胰蛋白酶、0.5％胶原酶Ⅱ+0.3％胶原酶Ⅳ，0.5％胶原酶Ⅱ+0.1％透明质酸酶，0.5％胶原酶Ⅱ+0.2％木瓜蛋白酶，0.5％胶原酶Ⅱ+0.2％胰蛋白酶，0.3％胶原酶Ⅳ+0.1％透明质酸酶，0.3％胶原酶Ⅳ+0.2％木瓜蛋白酶，0.3％胶原酶Ⅳ+0.2％胰蛋白酶，0.1％透明质酸酶+0.2％木瓜蛋白酶，0.1％透明质酸酶+0.2％胰蛋白酶，0.2％木瓜蛋白酶+0.2％胰蛋白酶)，进行解离(5min、10min、15min、20min、25min、30min)，结果显示制备到的细胞核悬液可达到10x Genomics公司上机标准，但超过但当酶解超过20min后，对细胞核RNA质控，发现细胞核RNA主峰出现偏移，综合对比实施例1～7结果推测可能因为37℃消化酶解时间过长对细胞核膜具有一定的损伤和复合酶本身对细胞核膜有伤害。与此同时两种酶配方无法在30min内实现有效的单细胞悬液与外泌体的制备。所以接下来尝试了3种酶结合的方式，希望能通过三种不同酶组合的方式，来尽可能在20min内充分的解离，以避免单个/两种酶，酶解的时间太短导致解离不充分的缺陷。对比实施例149～187采用三种酶配方(0.5％胶原酶D+0.5％胶原酶Ⅱ+0.3％胶原酶Ⅳ，0.5％胶原酶D+0.5％胶原酶Ⅱ+0.1％透明质酸酶，0.5％胶原酶D+0.5％胶原酶Ⅱ+0.2％木瓜蛋白酶，0.5％胶原酶D+0.5％胶原酶Ⅱ+0.1％透明质酸酶，0.5％胶原酶D+0.5％胶原酶Ⅱ+0.2％胰蛋白酶，0.5％胶原酶Ⅱ+0.1％透明质酸酶+0.2％木瓜蛋白酶，0.5％胶原酶Ⅱ+0.1％透明质酸酶+0.2％胰蛋白酶，0.1％透明质酸酶+0.2％木瓜蛋白酶+0.2％胰蛋白酶)进行解离(5min、10min、15min、20min)。结果显示对比实施例167可达到在同一肝内胆管组织中同时制备外泌体、单细胞悬液与单细胞核悬液。其余对比实施例均不可在20min内实现在同一肝内胆管组织中外泌体、单细胞、单细胞核悬液的制备。但目前制备到的单细胞悬液结团率较高，于是接下来尝试加入胰酶的方式来尽可能提高单细胞悬液的质量。对比实施例189～191分别在酶解后加入了0.2％胰蛋白酶室温静置2min、4min、6min。对比实施例189～191结果显示，加入胰蛋白酶后，结团率有所降低，推测可能是因为胰蛋白酶可以破坏细胞间连接，从而降低结团率。但当酶解时间超过4min后，细胞活率有所降低。按照10xGenomics公司标准，以细胞总量、碎片比例、结团比例、细胞核总量、细胞核碎片比例、细胞核结团率、细胞核RNA质量以及外泌体总RNA量作为主要质控指标，确定了制备单细胞悬液的配方。因此最终确定了制备单细胞悬液的方法，即将肝内胆管组织使用无菌剪刀剪碎后，加入8mL预冷的培养基，加入终浓度为0.5％的胶原酶Ⅱ(v/v)溶液、0.3％的胶原酶Ⅳ溶液、0.1％的透明质酸酶(v/v)溶液。上下颠倒混匀后，放入杂交炉中37℃消化酶解15min。消化结束后向离心管中加入0.2％(v/v)的胰酶溶液，上下颠倒混匀后，室温静置4min。
表5使用酶解法制备外泌体、单细胞及单细胞核悬液
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当使用酶解法能够同时制备外泌体、单细胞悬液、单细胞核悬液，且酶解配方确定后，接下来需要对细胞核悬液的制备和纯化进行摸索和优化。对比实施例192～196对制备完单细胞悬液及外泌体的剩余组织沉淀的预处理进行了比较。结果显示，当酶解后的剩余组织未经过洗涤直接进行单细胞核制备时，基本观察不到，且杂质碎片率较高，可能是由于酶解后残留的酶附着在剩余组织上，对核膜造成了损伤。将酶解后的剩余组织洗涤三次时，制备到的细胞核量最高，碎片率最低。洗涤4次与洗涤3次，并未有较大差别，且更长的洗涤时间增加了细胞核破碎的风险，所以最终确定了酶解后的剩余组织洗涤次数为3次。
表6酶解后的剩余组织洗涤次数比较
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对比实施例197～206对制备细胞核的方式进行了比较。由于使用10X方法对剩余组织制备细胞核后，细胞核悬液镜检结果显示碎片率稍高，推测可能是由于酶解法造成，酶解对细胞核的完整性稍有影响。所以对比实施例197～206对细胞核裂解液与洗涤缓冲液的成分进行了验证，看是否能提高细胞核悬液质量。首先细胞核裂解液最主要的成分为非离子型去污剂，所以接下来对比实施例197～198分别将10x制备单细胞核裂解液的主要成分0.1％～0.2％NP40换成了0.1％～0.2％TritonX-100、0.1％～0.2％吐温20。以细胞核总量、细胞核浓度、碎片杂质比例、结团比例，是否能够达到10x Genomics公司单细胞测序要求为标准对结果进行质控。结果显示，细胞核悬液碎片率依旧偏高，没有改善，推测单一的去污剂成分可能很难提高单细胞核悬液的质量，细胞核悬液中的碎片有一部分是细胞膜被破坏后产生的质膜碎片，可能需要比较强的去污剂成分破坏细胞膜碎片，进行单细胞核悬液的纯化，所以接下来尝试了复合去污剂成分。对比实施例199～201分别将10x制备单细胞核裂解液的主要成分0.1％～0.2％NP40换成了0.1％～0.2％TritonX-100+0.1％～0.2％NP40，0.1％～0.2％吐温20+0.1％～0.2％NP40，0.1％～0.2％TritonX-100+0.1％～0.2％吐温20。结果显示对比实施例200质控结果高于对比实施例199与201，所以最终确定了裂解液以去污剂TritonX-100+吐温20的组合方式作为主要成分。在确定了细胞核制备裂解液配方的基础上，接下来对比实施例202～205对细胞核裂解液主要成分去污剂浓度进行了验证。结果显示，随着去污剂浓度的提高，单细胞核悬液碎片率比对比实施例200有所降低。当使用浓度为0.3％～0.4％NP40+0.3％～0.4％吐温20时，单细胞核悬液质量偏差不大，基本相同。当对比实施例205使用浓度为0.5％NP400+0.5％吐温20时，单细胞核悬液碎片率开始较之前升高，推测可能是因为去污剂浓度过高，细胞核裂解过度而发生了破碎所导致。所以最终确定了裂解液去污剂的浓度为0.3％～0.4％NP40+0.3％～0.4％吐温20。此时，虽细胞核悬液质量与10X方法比较有所提高，但碎片率依旧稍有偏高，推测可能是由于细胞核裂解液与洗涤缓冲液中的缓冲环境导致的，Tris-HCl浓度过低，细胞膜破裂后释放出的细胞内容物无法被有效缓冲，导致缓冲液PH变化，引发细胞核膜表面蛋白变性，最终破坏细胞核结构。所以接下来尝试调整Tris-HCl浓度。对比实施例205～206将裂解液与洗涤缓冲液中10mM Tris-HCl分别换成了50mM Tris-HCl、100mM Tris-HCl。结果显示对比实施例205碎片率较低，对比实施例206碎片率较高，推测可能是因为Tris-HCl浓度过高可能会导致溶液渗透压改变，细胞核破裂。所以最终确定了Tris-HCl浓度为50mM。
表7制备单细胞核悬液方式比较
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在确定了肝内胆管组织中单细胞悬液及单细胞核悬液的制备方法后，接下来需要对肝内胆管组织外泌体分离纯化方法进行改进。由于目前尚未有专门针对组织外泌体分离的方法，我们接下来对肝内胆管组织外泌体不同分离方式进行了对比，以外泌体TEM、NTA检测结果、外泌体总RNA量和总RNA中的蛋白等杂质的“污染”(260/280)作为质控指标，如对比实施例207～212所示。方法包括了超速离心、磁珠法及柱式的膜亲和法等等。结果显示，Invitrogen试剂盒、QIAGEN试剂盒与超速离心法得到的外泌体浓度差别不大，但结合外泌体总RNA量和蛋白质污染等数据来看，Invitrogen试剂盒数据表现最好。综上，经过一系列对比，最终选择Invitrogen试剂盒作为分离纯化肝内胆管组织外泌体的方法。
表8分离纯化外泌体方式比较
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经以上对比实施例1～212确定了在人肝内胆管组织中同时制备外泌体、单细胞悬液、单细胞核悬液技术方案的基础上，对比实施例213～214使用该技术方案对其它几种类型的小鼠组织进行了重复实验。结果显示，均无法同时在小鼠组织中进行外泌体、单细胞悬液与单细胞核悬液的制备。
表9不同组织制备外泌体、单细胞悬液与单细胞核结果比较
综上所述，本发明提出的基于同一肝内胆管组织样本中同时进行外泌体、单细胞悬液及单细胞核悬液制备、同时进行small RNA测序、单细胞测序&单细胞核测序的方法，单细胞悬液制备方法(酶解配方、酶解的时间)，单细胞核悬液制备方法(酶解剩余组织洗涤次数，裂解液、洗涤缓冲液配方，裂解液浓度等)，外泌体(纯化分离方法)之间是一一对应的。使用本发明所述的实施例1与实施例2方法能够有效制备到高质量的(即总量高，碎片率及杂质偏低，细胞总量98W，细胞悬液碎片率4％，结团率4％，细胞核总量220W，细胞核悬液碎片率5％，结团率5％)单细胞&单细胞核悬液以及高质量纯净的外泌体，且获得单细胞悬液及单细胞核悬液能够满足单细胞测序实验要求，获得的外泌体能够满足small RNA测序要求。
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。