东北马鹿微卫星DNA遗传标记的筛选及应用

技术领域

本发明涉及动物资源学、分子生物学领域，具体地说涉及对欧洲马鹿基因组信息和中亚马鹿基因组信息进行比对分析获得东北马鹿STR遗传标记及其应用。

背景技术

鹿在我国民间一直有“鹿身百宝”之说，药用以及食用部分主是鹿血、鹿茸、鹿心、鹿胎、鹿鞭、鹿筋等，其中鹿血的应用范围最广；临床上多用于促进新陈代谢延缓衰老、增强免疫力。鹿血为鹿科动物梅花鹿或马鹿的膛血或茸血，是十分珍贵的中药材。马鹿亦称赤鹿，属偶蹄目(Artiodactyla)鹿科(Ceridae)鹿亚科(Cervinae)，分类学上分为三个独立物种，马鹿、欧洲马鹿和中亚马鹿，其中马鹿在我国分布有8个亚种，东北马鹿(Cervuselaphus xanthopygus)是马鹿中养殖开发较多的亚种，在我国经济动物养殖中占有重要地位。然而我国马鹿并无完整的基因组序列、遗传标记信息缺失，种属鉴定和个体识别研究均缺乏参考序列，这些现状限制了马鹿野生资源的保护、人工养殖繁育和鹿产品真伪的生物学鉴定等研究。

微卫星DNA(Microsatellite DNA)又称短串联重复序列(Short tandem repeat,STR)，是一类由1～6个碱基组成的重复序列，长度仅2bp-6bp，重复次数10-60次，总长度多在300bp以下，在真核生物基因组分布广泛，与其他遗传标记相比，微卫星具有多态性好、高灵敏度、结果准确、操作简单等优点，因而被开发成为遗传标记并得到了广泛的应用，尤其是法医学个人识别和亲权鉴定，其技术平台标准化水平高且成熟稳定。

2020年Hengxing Ba等人对中亚马鹿的全基因进行测序，获得基因组大小约为2.60G、由19,010个碱基组成，contigN50和scaffoldN50分别为275.5Kb和31.7Mb，共有34条染色体。2018年Nóra

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种基于欧洲马鹿基因组信息和中亚马鹿基因组信息进行比对分析筛选东北马鹿STR遗传标记的方法，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。

一种东北马鹿微卫星DNA遗传标记的筛选方法，具体过程如下：采用生物信息学分析欧洲马鹿基因组信息和中亚马鹿基因组信息从而获取东北马鹿微卫星遗传标记位点。从Hengxing Ba和Nóra

以CM41S16基因座为例，根据染色体CM008041.1的16018384-16018410位碱基序列两端的侧翼序列设计引物，引物序列如下：正向引物F:AGAGCAAGCACCGAAGTTCA，反向引物R:GCAAGTCCCTGGCCACTAAT。同理，其他引物也是采用同样的方法参照染色体上的具体位置的碱基序列进行设置。

表3.20对微卫星引物设置时参考信息*

*以NCBI Assembly:GCA_002197005.1序列信息为参考

微卫星引物有效性检验。

样本收集与DNA提取：东北马鹿血样取自吉林省长春市孙氏鹿业，采集鹿茸时收集新鲜血液，共计48份。每份5mL，ACD抗凝，-20℃保存。DNA的提取Chelex-100提取法。

将20对STR引物在1个东北马鹿DNA样本中进行扩增，检验STR引物的有效性。

20对微卫星引物在东北马鹿血样中的DNA扩增结果显示：在设置五个退火温度梯度的PCR反应程序中，4对引物没有扩增产物，16对引物有扩增产物。

选择具有代表性的4个STR基因座CM41 S16、CM12S18、CM13S76和CM31 S78在48个东北马鹿DNA样品进行扩增，同时对4个位点等位基因的PCR产物进行测序测定，结果显示与预测序列一致，观察结果显示具有较好的多态性，并且获得了4个STR基因座基因型频率，计算出各基因座群体遗传学多态性参数。

一种马鹿多态性微卫星分子标记组合，其特征在于，所述马鹿多态性微卫星分子标记的组合编号为CM41S16、CM12S18、CM13S76、CM31S78；编号为CM41S16的微卫星分子标记的重复序列为AAT，编号为CM12S18的微卫星分子标记的重复序列为AAAAT，编号为CM13S76的微卫星分子标记的重复序列为TG，编号为CM31S78的微卫星分子标记的重复序列为GT。微卫星分子标记CM41S16引物对序列为：正向引物F:AGAGCAAGCACCGAAGTTCA，反向引物R:GCAAGTCCCTGGCCACTAAT；微卫星分子标记CM12S18引物对序列为：正向引物F:TTGTGTTCCTCCCACCAAAA，反向引物R:CCTGAAGCCACTCTCCCTTG；微卫星分子标记CM13S76引物对序列为：正向引物F:ACAGAAATGTAGGGCTGGCC，反向引物R:GTTTCTCCTCTCCCCTCCCT；微卫星分子标记CM31S78引物对序列为：正向引物F:ACAGAGTGAAGACAGAGAGAG，反向引物R:CTTGAGAGCCCCTTGGACTG；

通过筛选，其中4对微卫星引物CM41S16、CM12S18、CM13S76和CM31S78在48个马鹿DNA样品中检测具有很好的多态性；群体遗传学参数中CM41S16、CM12S18、CM13S76及CM31S78分别检为5、5、8和6个等位基因，基因型15、15、36和21种，其中CM41S16等位基因频率分布范围为0.0417-0.3333；CM12S18等位基因频率分布范围为0.0729-0.3333；CM13S76等位基因频率分布范围为0.0833-0.2291；CM31S78等位基因频率分布范围为0.0625-0.3333；个体识别概率(DP)0.8396、0.9035、0.9584和0.9134,多态性信息量(PIC)分别为0.6206、0.7212、0.8281和0.7368。

本发明利用20对微卫星引物对东北马鹿的血样进行扩增，共筛选出16个新的微卫星遗传标记在马鹿基因组中有效扩增，可进一步用于马鹿的遗传学研究；通过进一步筛选获得4个遗传标记可用于马鹿物种鉴定和种质资源保护及优化遗传育种。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：东北马鹿基因组序列尚未完成测序，无法直接通过MISA软件等工具挖掘该物种的STR位点。本发明通过比较两个近缘物种(欧洲马鹿和中亚马鹿)基因组STR位点，筛选出可能在属内种间保守的STR序列。以东北马鹿基因组DNA为模板，验证这些欧洲马鹿和中亚马鹿种间保守的STR位点扩增引物在东北马鹿中应用的可能性，结果表明，通过分析近缘物种基因组DNA，实现了对基因组序列未知物种STR位点的特异性扩增，并应用于东北马鹿个体识别和遗传育种优化的开发。

附图说明

图1是8对微卫星引物聚丙烯酰胺凝胶电泳结果，M.50bp DNA ladder；1-5是相同DNA样品不同PCR扩增条件(退火温度依次为：55℃、57.5℃、60℃、62.5℃、65℃)。注：CM30S60、CM33S61、CM36S62、CM36S64扩增效果好，CM10S01、CM17S42、CM35S09、CM15S36没扩增产物。

图2是8对微卫星引物聚丙烯酰胺凝胶电泳结果，M.50bp DNA ladder；1～5是马鹿5个无亲缘关系的样品。注：CM12S03、CM16S38、CM41S75、CM41S17多态性差，CM13S76、CM33S61、CM21S50、CM30S60有多态性。

图3是4个STR基因座CM41S16、CM12S18、CM13S76和CM31S78具有较好多态性。

具体实施方式

一种马鹿微卫星DNA遗传标记的筛选方法，具体过程如下：

采用生物信息学分析欧洲马鹿基因组信息和中亚马鹿基因组信息从而获取马鹿微卫星。

从Hengxing Ba和Nóra

随机挑选了20个STR遗传标记进行e-PCR和PCR-PAGE实验验证。根据微卫星标记重复序列两端的侧翼序列设计引物。

表1.欧洲马鹿和中亚马鹿基因组及STR信息

表2.欧洲马鹿和中亚马鹿STR位点挖掘及比较分析

微卫星引物有效性检验；

收集样本并且提取DNA。东北马鹿血样取自吉林省长春市孙氏鹿业，采集鹿茸收集随机新鲜血液样品，共计48份。每份5mL，ACD抗凝，-20℃保存。DNA的提取Chelex-100提取法。

将20对STR引物在1个马鹿DNA样本中进行扩增，检验STR引物的有效性。PCR反应体系为20μL，梯度PCR反应程序为：98℃15s，95℃5s，50-62.5℃20s，72℃5s，共37个循环，72℃15s，将PCR产物以1.5μL上样量在含有0.01％ Gelred的1％的琼脂糖胶上进行电泳，在北京君意凝胶成像分析系统(JY04S-3C)拍照并分析结果。

20对微卫星引物在马鹿血样中的DNA扩增结果显示：在设置五个退火温度梯度的PCR反应程序中，4对引物没有扩增产物，16对引物有扩增产物，PCR反应条件如表4所示。

经过初步筛选，将挑选的引物(如表5所示)结合5个马鹿DNA进行扩增效率、大小范围和DNA多态性的初测；最终选择符合扩增效率高、产物长度150-300bp且有3个以上等位基因的STR遗传标记进行下一步群体遗传学调查。

表4.20对微卫星引物PCR反应条件

表5.13对微卫星引物

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其中16对引物的扩增结果有两种情况：一种是引物扩增目的条带的大小与预期设计的长度是否一致，16对引物扩增目的条带大小与预期设计长度一致；另一种是扩增的目的条带有无特异性扩增，4对引物有特异性扩增，12对引物无特异性扩增并且目的条带的大小与预期设计的一致。之后我们针对这16对引物在5个随机马鹿个体中的扩增结果进行分析:单条带占44％，双条带占25％，单条带和双条带共存占31％。通过结果显示75％(12/16)的引物可以继续下面的实验，25％(4/16)的引物还需要继续优化反应条件。最后我们得到了16对引物PCR反应的最适退火温度所占的比例，其中退火温度在57.5℃占的比例最高。下面从20对微卫星引物的扩增结果选择具有代表性的8对在图1展示。

部分微卫星位点具有明显的多态性。16对微卫星引物针对马鹿5个随机个体的血样DNA扩增结果显示：聚丙烯酰胺凝胶电泳显示13对微卫星可能会有多态性，其中8对微卫星电泳结果如图2所示，CM12S03、CM16S38、CM41S75、CM41S17多态性差，CM13S76、CM33S61、CM21S50、CM30S60有多态性。

我们选择具有代表性的4个STR基因座CM41 S16、CM12S18、CM13S76和CM31S78在48个样品进行扩增，同时对4个位点等位基因的PCR产物进行测序测定，结果显示与预测序列一致，见表6，观察结果显示具有较好的多态性。图3的凝胶电泳结果也显示具有较好的多态性。

表6CM41S16、CM12S18、CM13S76和CM31S78等位基因测序结果

步骤四：微卫星遗传标记群体遗传学多态性调查

经过对微卫星遗传标记的筛选，选择扩增效果较好的4个基因座CM41 S16、CM12S18、CM13S76、CM31S78在48个马鹿DNA样本中进行多态性的检测和调查，通过聚丙烯酰胺凝胶(T6C3)电泳检测。将PCR产物送往生工生物工程(上海)股份有限公司(简称：生工生物)进行纯化测序，进一步使用Chormas分析软件对测序结果与原始设计序列进行分析验证；并根据Buck-leton等在文章中详细论述了基因型频率、等位基因频率、观测杂合度(observed heterozy，Ho)、多态性信息含量(polymorphism information content，PIC)、个体识别率(power of discrimination，DP)等多态性参数的计算过程。

我们选择具有代表性的4个STR基因座CM41S16、CM12S18、CM13S76和CM31S78在48个样品进行扩增，同时对4个位点等位基因的PCR产物进行测序测定，结果显示与预测序列一致，见表6，观察结果显示具有较好的多态性，并且获得了4个STR基因座基因型频率、基因频率见表7-表11，计算出各基因座群体遗传学多态性参数见表12。

表7.CM41S16基因座的基因型频率

表8.CM12S18基因座的基因型频率

表9.CM13S76基因座的基因型频率

表10.CM31S78基因座的基因型频率

表11.4个STR基因座基因频率分布

表12.4个STR基因座群体遗传学数据

由于缺乏东北马鹿基因组信息无法进行特异性STR位点的分析，通过比较分析欧洲马鹿和中亚马鹿基因组STR位点的侧翼序列筛选在马鹿近缘物种中保守的STR位点，结果表明有16个引物在马鹿的基因组中能够有效扩增可以进一步研究，挑选其中4个多态性较好的引物，由于这4个引物是通过e-PCR和生物信息学分析得到的数据，所以我们又重新把PCR产物进行测序，测序结果显示与预测序列一致，序列结构清晰都是简单重复，核心序列依次是AAT、AAAAT、TG、GT等，等位基因的命名按照测序得到核心序列重复次数的多少进行命名，例如：核心序列的重复次数为5则等位基因的读数即为5，符合法医物证学中等位基因的命名原则，通过对等位基因的读数有利于数字化应用于鹿种群，并且通过对等位基因的读数可进一步计算等位基因频率、基因型频率、杂合度、多态性信息含量、个体识别率等群体遗传学参数，通过计算得出多态性信息含量的范围为0.6206～0.8281、累积个体识别率达99.9944％，说明这4个基因座具有很好的区分能力可以完全应用于马鹿的个体识别及遗传育种，也说明了通过利用比较基因组信息筛选STR位点是一种发现未知基因组的有效策略。

在合成的20对微卫星引物中共筛选出16对微卫星引物可以在鹿血样品中有效扩增，其中13对微卫星引物有多态性；将其中4对微卫星引物(CM41S16、CM12S18、CM13S76和CM31S78)在48个马鹿DNA样品中检测具有很好的多态性；群体遗传学参数中CM41S16、CM12S18、CM13S76及CM31S78分别检为5、5、8和6个等位基因，基因型15、15、36和21种，其中CM41S16等位基因频率分布范围为0.0417-0.3333；CM12S18等位基因频率分布范围为0.0729-0.3333；CM13S76等位基因频率分布范围为0.0833-0.2291；CM31S78等位基因频率分布范围为0.0625-0.3333；个体识别概率(DP)0.8396、0.9035、0.9584和0.9134,多态性信息量(PIC)分别为0.6206、0.7212、0.8281和0.7368。

CM41S16、CM12S18、CM13S78及CM31S76基因座的DNA序列分别如SEQ No.41、42、43、44所示。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。