长效重组LH融合蛋白及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及生物医药和动物繁殖技术领域，具体地说，涉及一种长效重组LH融合蛋白及其制备方法与应用。

背景技术

促黄体素(LH)是一种促性腺激素，其中猪促黄体素(Porcine luteinizinghormone，简称pLH)，是由猪脑垂体分泌的一种促性腺激素，由α和β两个糖基化亚基以非共价键方式连接形成异二聚体。哺乳动物的α亚基均相同或相似，β亚基由121个左右的氨基酸组成，存在很大的差异，不但有激素间特异性，且还有种间特异性，是激素生物活性和免疫活性的决定因素，故将β亚基称为特异亚基，能与靶器官受体结合。

根据1959年Falck提出的“两细胞-两促性腺激素”学说理论，促黄体素(LH)在卵泡发育过程中发挥着重要作用。在卵泡期刺激卵泡膜细胞合成雄激素，为雌激素的合成提供底物；排卵前使卵母细胞成熟并排卵，黄体期维持黄体功能。LH还在卵母细胞恢复减数分裂、前列腺素合成、孕酮合成等过程发挥重要的作用。在牛，猪方面已证实，pLH对雌性可促使卵巢血流加速，在促卵泡素作用的基础上引起卵泡排卵和促进黄体的形成；对雄性可刺激睾丸间质细胞合成和分泌睾酮。因此pLH对畜牧生产和经济动物繁殖具有重要价值。

动物繁殖领域中，牛、羊、鱼普遍使用人工合成的促黄体素释放激素(LH-RH，也称GnRH)及其类似物、绒促性素(HCG)或猪垂体组织中提取的LH。GnRH及其类似物能促使动物垂体前叶释放高水平LH和低水平促卵泡素(FSH)；HCG与LH相似性较高，能结合相同的LH/HCG受体(LHCGR)发挥生物学效应，LH的半衰期短(30min左右)，临床使用中会被很快代谢，HCG的半衰期较长(2-3天)，所以通常是通过HCG模拟LH峰，进行排卵诱导。

目前尚无重组兽用LH产品上市，畜用LH产品主要包括猪垂体提取的LH、人工合成的GnRH及其类似物和孕妇尿液中提取的HCG。猪垂体提取的LH，很难将猪FSH与LH分离造成纯化难度大、产能低、产品批次差异大，在实际应用中受到很大限制；人工合成的GnRH及其类似物作用于脑垂体促性腺细胞，刺激促黄体生成素LH和促卵泡刺激素FSH的合成与分泌，人工合成激素分子(式量，结构，元素等)与天然的不完全相同，长期大剂量的使用GnRH及其类似物会抑制排卵；孕妇尿液中提取的HCG可能引发卵巢过度刺激综合征(ovarianhyperstimulation syndrome，OHSS)。

因此由于存在猪垂体LH半衰期较短、GnRH易产生不良效应、HCG可能引起卵巢过度刺激综合征等问题，并且现有的物质的动物广谱性不好，无法使用一种蛋白同时广泛在多物种中使用，因此动物繁殖领域特别是经济动物需要长效的动物源LH。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明涉及一种融合蛋白，包括LHα亚基和LHβ亚基，所述LHα亚基和LHβ亚基连接方式为通过范德华力或连接元件进行连接。

所述LH的LHα亚基和LHβ亚基的来源可以为哺乳动物，包括但不限于猪、牛、羊、马、兔、猴、狗、猫、鼠、鱼，进一步的，鼠可以是大鼠、小鼠。示例性的，可以采用猪LHα亚基氨基酸序列

FPDGEFTMQGCPECKLKENKYFSKLGAPIYQCMGCCFSRAYPTPARSKKTML VPKNITSEATCCVAKAFTKATVMGNARVENHTECHCSTCYYHKS(SEQ IDNO.1)

以及猪LHβ亚基氨基酸序列

SRGPLRPLCRPINATLAAENEACPVCITFTTSICAGYCPSMVRVLPAALPPVPQP

VCTYRELSFASIRLPGCPPGVDPTVSFPVALSCHCGPCRLSSSDCGGPRAQPLACDRPLLPGLLFL(SEQ ID NO.2)

本发明还进一步提供了表达上述蛋白的核苷酸序列，核苷酸序列为发明人经过研究物种偏好性、哺乳动物进化树、哺乳动物基因序列同源性比对，经过密码子优化获得的。示例性的：

猪LHα亚基核苷酸序列

tttcccgatggcgagttcaccatgcagggatgtcctgagtgcaaactgaaggagaacaagtactttagcaaactgggagcaccaatctaccagtgtatgggatgttgcttcagtagagcttatcccactccagctaggtccaagaagaccatgctggtgcctaagaacattaccagtgaggccacctgttgtgtggccaaggcattcaccaaagctactgtcatgggtaatgccagggtggagaaccataccgagtgccactgttctacatgttactaccacaaatct(SEQ IDNO.3)

猪LHβ亚基核苷酸序列

agcagaggtccactcagacctctgtgcagacccataaacgctacactcgcagccgagaacgaggcatgtcctgtgtgcatcaccttcactacttcaatttgtgctggctactgccctagcatggttagggttctcccagccgcactgcctcctgtgcctcagcccgtctgtacctatcgcgaactgagcttcgcttctatcaggctccctggctgtccaccaggcgtcgatcccactgtgtccttcccagttgccctcagctgtcactgcggaccttgtagactgtcctcctccgactgtggaggaccacgcgcacagcctctggcttgcgaccggccactgctgcctgggctgctgtttctg(SEQ IDNO.4)

本发明还提供了对于蛋白例如LH蛋白或LH融合蛋白进行长效化的方法，方法在于使用长效化片段连接在上述LHα亚基或LHβ亚基的N端或C端，直接或间接通过连接元件进行连接，所述连接元件可以是融合蛋白中通常使用的Linker，例如GSlinker，又例如(GGGGS)

示例性的，CTP为人源序列，具体序列可以为SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ(SEQID NO.5)

示例性的，融合蛋白pLH-CTPβ亚基的设计序列如下

pLH-CTPβ亚基氨基酸序列

SRGPLRPLCRPINATLAAENEACPVCITFTTSICAGYCPSMVRVLPAALPPVPQPVCTYRELSFASIRLPGCPPGVDPTVSFPVALSCHCGPCRLSSSDCGGPRAQPLACDRPLLPGLLFLSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ(SEQ ID NO.6)

示例性的组合：

pLH-CTPβ亚基核苷酸序列

agcagaggtccactcagacctctgtgcagacccataaacgctacactcgcagccgagaacgaggcatgtcctgtgtgcat

caccttcactacttcaatttgtgctggctactgccctagcatggttagggttctcccagccgcactgcctcctgtgcctcagcc

cgtctgtacctatcgcgaactgagcttcgcttctatcaggctccctggctgtccaccaggcgtcgatcccactgtgtccttccc

agttgccctcagctgtcactgcggaccttgtagactgtcctcctccgactgtggaggaccacgcgcacagcctctggcttgc

gaccggccactgctgcctgggctgctgtttctgtccagctccagcaaagctcctcctccctcactgccttcaccttccagactgccagggccttccgatactcccatcctgccacaa(SEQ ID NO.7)

示例性的“pLH”蛋白表示SEQ ID NO.1所示的猪LHα亚基与SEQ ID NO.2所示的猪LHβ亚基通过范德华力连接的异二聚体蛋白“pLH-CTP”蛋白表示SEQ ID NO.1所示的猪LHα亚基与SEQ ID NO.6所示的pLH-CTPβ亚基通过范德华力连接的异二聚体蛋白

表达载体

本发明还提供了一种表达载体，所述表达载体可用于将克隆的基因载入，用于表达外源蛋白，所述表达载体包括但不限于pET20，pcDNA3.1，pCMV等，优选pcDNA3.1。

稳定转移细胞系

本发明还提供了一种稳定转移细胞系，包括但不限于HEK293、293、BHK、CHO细胞系等，用于导入上述表达载体。

进一步的，还包括将表达外源蛋白的稳定转移细胞进行培养，外源蛋白纯化、检测的过程。

剂型

本发明进一步提供了包含上述融合蛋白的组合物，所述组合物包括一些辅料，包括但不限于稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂、乳化剂、增效剂，剂型包括但不限于形式包括但不限于注射剂、片剂、丸剂、胶囊、悬浮剂、栓剂、乳剂、粉针剂。

所述组合物对动物的给予方式，包括但不限于注射、口服、灌胃、阴道栓塞，注射位置包括但不限于肌肉、皮下。

用途

本发明进一步提供了上述蛋白、融合蛋白，在促进动物繁殖中的用途，所述用途包括促进动物同期排卵、超数排卵、以及促进胚胎生成与发育的胚胎工程中的用途，所述动物包括但不限于猪、牛、羊、马、猴(恒河猴、食蟹猴等)、狗、猫、兔、鼠(大鼠、小鼠)、鱼等，但优选哺乳动物。所述LH融合蛋白的使用剂量，鼠、兔、鱼等动物的有效剂量为200-1000IU/kg，对于猪、牛、羊、马、狗、猫等动物的有效剂量为0.5-10IU/kg。使用频次为单次给药。并且进一步的，可以预防和治疗卵巢囊肿的产生。本发明提供了多种功能性验证实验，以不同方式进行给药，例如注射、阴栓等，实验证明在上述动物内能够实现促排卵、诱导胚胎发育的功能，并且不会引起卵巢囊肿。

进一步地，本发明还提供了组合使用的用途，但并非必须，例如将融合蛋白LH或LH-CTP与其他促进繁殖功能的物质、药物等进行组合使用，包括但不限于FSH、FSH-FC、FSH-CTP、猪垂体提取物(例如商业化产品Folltropin-v)、前列腺素、孕马血清促性腺激素(PMSG)等。

上述物质可在LH融合蛋白使用之前或之后使用均可，但优选在之前使用；例如PMSG、FSH可用于卵泡发育，配合LH融合蛋白的使用，能够起到促进繁殖功能的作用。然而剂量并非越高越好，剂量过高，会导致卵巢相关疾病，例如卵巢囊肿，因此适当物质、药物以及组合使用方案的选择能够有效保证动物维持卵巢的健康状态且促进繁殖功能。

进一步的，本发明还提供了上述LH融合蛋白在动物体内的卵巢囊肿的预防和/或治疗用途，以及在制备用于预防和/或治疗卵巢囊肿的药物中的用途。

一种包含前述重组LH蛋白、或前述的表达载体、或前述的稳定转染细胞系的试剂盒。

有益效果

1融合蛋白具备较强的哺乳动物广谱适用性

本发明通过对LH蛋白的序列进行物种基因同源性、进化树等比对方式，通过密码子偏好设计，创造性地表达了不同物种来源的LHα亚基、LHβ亚基、CTP三个融合蛋白元件，通过不同组合组成不同结构融合蛋白，通过动物实验验证，能够广泛在多种哺乳动物中使用，促进了超数排卵和胚胎工程。由于兽用制剂的广谱性提高，使得用于只需要使用一种制剂即可达到多种哺乳动物的同期排卵、超数排卵、促进繁殖、以及胚胎工程的多种功能，使用方面可以最大程度降低成本。2半衰期的提高减少了使用频次提供一种在哺乳动物中能够广谱适用的促进健康动物繁殖增产的融合蛋白，长效化方法虽然在现有技术中存在但并不是都能够适用本发明的融合蛋白。雌性动物卵泡发育和排卵是一个及其精细的生殖调控过程。对于LH，主要生理作用之一是诱导排卵，在正常动物体内，排卵前出现了激增的LH峰以诱导排卵，排卵后LH峰骤降。在动物繁殖生产应用，因无法预测天然LH峰到来的时间，通过多次给予LH或单次给予长效LH类药物，使药物浓度在较长时间内处于药效的阈值范围内，以达到诱导排卵的目的。然而，LH融合蛋白过长的半衰期影响受精卵着床。发明人创造性地通过反复验证，舍弃了Fc、白蛋白等长效蛋白片段，最终选择了人源CTP序列进行与LH蛋白组合使用，适当提高LH的半衰期，减少操作次数、节约试剂、降低成本，又避免因半衰期过长而影响受精卵的发育和着床。3促进健康动物繁殖、预防治疗卵巢囊肿多种功能的实现解决了现有技术中猪垂体LH半衰期较短、GnRH易产生不良效应、HCG可能引起卵巢过度刺激综合征等问题，提供了一种效果完善的促进动物繁殖增产的LH融合蛋白，并且广谱适应性较好、蛋白纯度高、活性较好、半衰期适当，且不会引起动物的卵泡囊肿，并具备预防和/或治疗卵巢囊肿的功能。并且进一步的，可选的可与其他促进动物繁殖的物质进行组合使用，组合方案能够有效保证动物卵巢维持健康状态且促进繁殖功能。

附图说明

图1pLH和pLH-CTP的SDS-PAGE电泳图。

实施例2中pLH和pLH-CTP的SDS-PAGE电泳图，A和C分别是pLH和pLH-CTP的变性电泳图；B和D分别是pLH和pLH-CTP的非变性电泳图。电泳显示pLH和pLH-CTP纯度均在95.0％左右。

图2pLH-CTP诱导小鼠排卵图。

实施例4中pLH-CTP诱导小鼠排卵图。pLH-CTP融合蛋白联合PMSG可以有效诱导雌鼠超数排卵，并且在一定剂量范围内排卵数量与剂量呈量效关系，5IU/只pLH-CTP融合蛋白处理组平均获卵数最多。

图3pLH-CTP治疗母猪卵巢囊肿的卵巢B超图

实施例8中pLH-CTP治疗母猪卵巢囊肿的卵巢B超图。左图为给药前囊肿母猪的卵巢B超图，卵巢中存在囊肿卵泡(卵泡直径在9mm以上)。右图为给药后6天囊肿母猪的卵巢B超图，可见囊肿卵泡已消退。表明pLH-CTP可治疗卵巢囊肿。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1pLH和pLH-CTP融合蛋白细胞系的制备

分别对pLH和pLH-CTP的蛋白序列进行密码子优化，经优化结果，pLHα亚基的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示，pLHβ亚基的核苷酸序列如SEQIDNO:4所示，pLH-CTPβ亚基的核苷酸序列如SEQIDNO:7所示。人工合成上述核苷酸，并分别构建于pcDNA3.1载体中，得到重组表达载体pcDNA3.1-pLHα、pcDNA3.1-pLHβ和pcDNA3.1-pLHβ-CTP；或者pcDNA3.1-启动子1-pLHα-启动子2-pLHβ和pcDNA3.1-启动子1-pLHα-启动子2-pLHβ-CTP，将上述重组载体线性化后分别电转转入CHO细胞中获得pLH、pLH-CTP的稳转细胞系。在细胞系中蛋白表达后可通过范德华力自然形成蛋白复合物pLHα：pLHβ和pLHα：pLHβ-CTP。

实施例2pLH和pLH-CTP融合蛋白的纯化

将表达pLH和pLH-CTP的稳转细胞在发酵罐中进行发酵培养，发酵液先经过两级深层过滤膜包去除细胞和细胞碎片，之后用0.22μm滤膜过滤，获得澄清的发酵液。

pLH发酵液纯化过程如下：第一步采用阳离子交换层析(纳微50SP)纯化，用平衡液(70mM PB，pH7.0)平衡至基线后上样，再用平衡液平衡至基线，用洗脱液(70mM PB，0.1MNaCl，pH7.0)洗脱，收集洗脱液。第二步采用疏水层析(GE Capto Phenyl ImpRes)纯化，用3M NaCl调节阳离子交换层析收集液电导与平衡液一致，用1M HCl调节pH值至7.0。用平衡液(0.5M NaCl,10mM Tris-HCl，pH 7.0)平衡，上样，再用平衡液平衡至基线，然后用洗脱液(10mM Tris-HCl，pH 7.0)洗脱，收集洗脱液。第三步采用分子筛(Chromdex 200PG)柱精细纯化，用平衡液(PBS)平衡，上样，之后用平衡液洗脱，收集得到纯化蛋白。对纯化的目的蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳(图1A和1B)，显示蛋白纯度在95.0％以上。

pLH-CTP发酵液纯化过程如下：第一步采用疏水层析(GE Capto Phenyl ImpRes)纯化，用3M(NH

实施例3pLH和pLH-CTP融合蛋白的活性检测

参考《中国药典》四部“1217黄体生成素生物检定法”，采用大鼠精囊增重法测定pLH和pLH-CTP的比活。

以尿促性素国家标准品为供试品标准品，根据尿促性素标示效价(203IU/支)、pLH(比活预估为8000IU/mg)和pLH-CTP(比活预估为8000IU/mg)的预估效价，分别配制成16、8和4IU/ml高、中、低3种浓度的标准品/供试品稀释液。选取54只日龄19-23日(或体重40-55g)、同一来源的雄性SD(Sprague Dawley)大鼠随机分成9组，每组6只。每日于大致相同的时间分别给每鼠皮下注入一种浓度的标准品溶液或供试品溶液0.5ml，每日1次，连续注入4次，于最后1次注入24小时后，将动物处死，称重，解剖，摘出整个前列腺，由前叶和精囊交界处剥离出精囊，去除附着的组织，用滤纸吸去周围的液体，直接称重并换算成每10g体重的精囊重。使用中检所《药典生物检定统计BS2000》软件计算，结果显示，pLH的比活约为9121IU/mg，是人药典尿促性素中LH比活要求(400IU/mg)的23倍，pLH-CTP的比活约为7453IU/mg，是LH比活要求(400IU/mg)的19倍。

实施例4pLH-CTP融合蛋白在小鼠超数排卵过程中的应用

选取40只3周龄未成年雌性小鼠，每只雌鼠腹腔注射5IU孕马血清促性腺激素(PMSG)后分为5组，包括阳性对照组、阴性对照组和3组pLH-CTP融合蛋白处理组，每组8只雌鼠。在PMSG注射后46-48小时进行促排卵处理，阳性对照组每只雌鼠腹腔注射5IU(200μl)hCG，阴性对照组每只雌鼠腹腔注射200μl生理盐水，对3组pLH-CTP融合蛋白处理组每组雌鼠分别注射2.5IU/只(167IU/kg)、5IU/只(333IU/kg)、10IU/只(667IU/kg)pLH-CTP融合蛋白。促排卵处理后14～16h进行取卵，并对卵子数量进行计数统计。

实验结果发现阴性对照组未有卵子排出，hCG阳性对照组雌鼠平均排卵34.4±10.7枚，而2.5IU/只pLH-CTP融合蛋白处理组雌鼠平均排卵38.8±11.8枚、5IU/只pLH-CTP融合蛋白处理组雌鼠平均排卵51.5±14.5枚、10IU/只pLH-CTP融合蛋白处理组雌鼠平均排卵43.0±16.9枚(表1和图1)。实验结果表明pLH-CTP融合蛋白联合PMSG可以有效诱导雌鼠超数排卵，并且在一定剂量范围内呈量效关系，5IU/只pLH-CTP融合蛋白处理组平均获卵数最多，表明5IU/只是小鼠最佳促排卵剂量。

表1不同处理小鼠超数排卵卵子数量

注：肩标不同字母表示差异显著(P<0.05)，相同字母表示差异不显著(P>0.05)。

实施例5pLH-CTP诱导母猪超数排卵

选择16头140～150日龄的初情期前三元杂交(长白×大白×杜洛克)母猪，随机分为阴性对照组、hCG组、pLH-CTP低剂量组和pLH-CTP高剂量组，每组4头母猪。对pLH-CTP低剂量组母猪肌注250IU(4IU/mg)pLH-CTP，对pLH-CTP高剂量组母猪肌注500IU(8IU/mg)pLH-CTP，对阴性对照组母猪肌注等体积生理盐水，对hCG组母猪肌注500IU(1ml)hCG。注射后5天处死母猪，摘取卵巢和输卵管于预温的生理盐水中，并快速运至实验室。使用灭菌的PBS冲洗输卵管获得卵母细胞，并记录卵母细胞数量。

结果显示(表2)，对母猪给予生理盐水，母猪因处于初情期前体内促性腺激素不足，只有2头母猪排卵，且排卵数极少。对母猪给予500IU hCG，母猪均排卵，总排卵数为51枚，排卵数为12.8±4.3枚/头，比阴性对照组排卵数高，表明给予hCG可以诱导母猪超数排卵，检测母猪卵巢，卵巢表面可见刚排卵后的红体，然而有1头母猪卵巢表面存在少量未排卵的囊肿大卵泡，卵泡直径大于10mm，表明hCG可以诱导母猪排卵，但可能引起母猪的卵泡囊肿。对母猪给予250IU pLH-CTP和500IU pLH-CTP，排卵数明显增多，250IU pLH-CTP组母猪排卵数(13.5±1.3枚/头)稍高于500IU hCG组，没有显著性差异，500IU pLH-CTP组母猪的排卵数(19.8±4.3枚/头)显著高于500IU hCG组和250IU pLH-CTP组，检查两组母猪的卵巢，两组母猪卵巢表面可见排卵后的红体，均没有大卵泡存在，表明排卵完全。

上述试验表明，对母猪给予pLH-CTP可以诱导母猪排卵，排卵数比hCG多，且对母猪是安全的，不会引起母猪的卵泡囊肿。

表2不同处理诱导初情期前母猪超数排卵数

注：肩标不同大小写字母表示差异显著(P<0.01)，相同字母表示差异显著(P<0.05)，没有相同字母表示差异不显著(P≥0.05)。

实施例6pLH-CTP融合蛋白在牛胚胎工程中的应用

选取15头西门塔尔青年母牛分为3组，包括阳性对照组(Folltropin-v，垂体猪FSH和LH混合物)和2组实验组(pFSH-FC融合蛋白联合不同剂量pLH-CTP融合蛋白处理，pFSH-FC融合蛋白来源为北京伟杰信生物科技有限公司合成)，每组5头母牛。15头母牛同时埋植含有孕激素的阴道栓(CIDR)，记为day0，在day5开始进行外源激素处理，阳性对照组在day5注射猪垂体提取的商业化产品Folltropin-v，总剂量为200mg，按照4:3:2:1的比例连续注射4天，每天打2针，共打8针；实验组仅在day5注射一次，pFSH-FC融合蛋白150μg，分别联合400IU和800IU pLH-CTP融合蛋白，共2组。各组在day7进行撤栓，并且上下午各注射一次0.6mg前列腺素PG，在day9进行观察发情和人工授精，day10进行第二次人工授精，day16进行冲胚，收集胚胎进行计数统计。

实验结果发现阴性对照组未获得胚胎，阳性对照组头均获得胚胎数为9.6±2.1枚，头均可用胚为6.6±2.0枚。而实验结果显示注射一次150μg pFSH-FC和400IU pLH-CTP融合蛋白实验组头均获得胚胎数为8.6±1.4枚，头均可用胚为5.8±1.5枚；150μg pFSH-FC和800IU pLH-CTP融合蛋白实验组头均获得胚胎数为11.8±2.6枚，头均可用胚为7.8±2.1枚(表3)。直肠检查牛卵巢，没有发现有未排卵的囊肿卵泡。表明pFSH-FC融合蛋白联合pLH-CTP融合蛋白可以有效促进母牛超数排卵，150μg pFSH-FC和800IU pLH-CTP融合蛋白实验组头均获得胚胎数和可用胚数高于其他组，可应用于牛的胚胎工程。

表3不同处理对牛超数排卵的作用效果

实施例7pLH-CTP融合蛋白提高母羊受胎效果的应用

选择60只成年母湖羊，随机分为空白对照组、pFSH-Fc组、pFSH-Fc+pLH-CTP低剂量组和pFSH-Fc+pLH-CTP高剂量组。于发情周期于一天给供体羊放置孕酮阴道栓并记为Day0，撤栓(Day13)同时肌内注射相应药品，对pFSH-Fc组母羊肌注10μgpFSH-Fc，对pFSH-Fc+LH-CTP低剂量组母羊肌注10μg pFSH-Fc和80IU LH-CTP，对pFSH-Fc+LH-CTP高剂量组母羊肌注10μg pFSH-Fc和160IU LH-CTP，对空白对照组母羊肌注等体积生理盐水。给药后公羊试情，并观察母观羊3天内的发情表现，以母羊接受以跨以为发情，给药后36h、48h定时人工输精，配种后30天查天天。

结果显示(表4)，给予10μg pFSH-Fc和80/160IU pLH-CTP可以提高母湖羊的受胎率，且成量效关系，10μg pFSH-Fc和80IU pLH-CTP组母羊的受胎率为53.3％，稍高于pFSH-Fc组(33.3％)和10μg pFSH-Fc单药组(46.7％)，10μgpFSH-Fc和160IU pLH-CTP组母羊的受胎率为80.0％，及其显著高于空白对照组(P<0.01)，高于10μg pFSH-Fc单药组。

上述结果表明，使用10μg pFSH-Fc和160IU pLH-CTP可以诱导母湖羊发情，提高母湖羊的受胎率，进而用于母羊的同期发情-定时输精中，提高母羊的繁殖生产效率。

表4不同处理对提高母湖羊受胎的作用效果

注：肩标不同大小写字母表示差异显著(P<0.01)，没有相同字母表示差异不显著(P≥0.05)。

实施例8pLH-CTP融合蛋白治疗母猪卵巢囊肿的应用

选择5头断奶发情未正常排卵，腹部B超检测存在卵泡囊肿(卵泡直径大于10mm)的经产母猪，肌内注射给予1500IU pLH-CTP，给药后每天腹部B超监测母猪的卵巢状态，结果显示给药后3天，囊肿卵泡开始消退，给药后6-7天60％(3/5)母猪卵泡囊肿完全消退(图3)。表明pLH-CTP可以治疗卵巢囊肿。