掌式一体化磁富集等温扩增检测设备及微生物检测方法

技术领域

本申请涉及微生物检测领域，特别是一种掌式一体化磁富集等温扩增检测设备及微生物检测方法。

背景技术

沙门氏菌属(Salmonella)是引起细菌性食物中毒的重要病原体之一，也是肠杆菌科中最复杂的菌属，属革兰氏阴性菌。沙门氏菌的多种血清型可以引起中毒，以鼠伤寒沙门菌、猪霍乱沙门菌和肠炎沙门菌最常见。沙门氏菌中毒的症状主要由急性肠胃炎为主，潜伏期一般为四至四十八小时，短期是数小时，长期是两天至三天，前期症状有恶心、头疼，全身乏力和发冷等，主要症状有呕吐、腹泻、腹疼，粪便以黄绿色水样便，有时带脓血和黏液，一般发热的温度在三十八摄氏度至四十摄氏度，重病人出现打寒战、惊厥、抽搐和昏迷的症状。传统的PCR检测方法需要PCR仪器的支持，只能在实验室中进行，难以及时、快速地进行检测。

环介导等温扩增方法(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一种可以在60～70℃开启扩增反应的核酸扩增技术，扩增时不依赖热循环仪器，非常适合开发对应的小型化现场检测设备。现有技术中出现了一些基于LAMP的检测装置，实现了沙门氏菌的现场检测。

但是，现场获取到的样品中可能含有很多杂质，会影响到沙门氏菌检测的灵敏度，此外，目前通用的LAMP检测装置在扩增显色之后依靠肉眼观察来判断检测结果，也容易影响到检测的准确度。

发明内容

本申请旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本申请提出一种掌式一体化磁富集等温扩增检测设备及微生物检测方法，掌式一体化磁富集等温扩增检测设备能够提高现场检测的准确度。

根据本申请提供的掌式一体化磁富集等温扩增检测设备，包括扩增盒、扩增架、加热元件、光源、混匀架和磁力元件，所述扩增盒形成有检测腔，所述扩增盒开设有与所述检测腔连通的观察口，所述观察口的外侧用于布置终端，所述终端用于获取并处理荧光图像，所述扩增架安放在所述检测腔内，所述扩增架包括用于容纳扩增管的第一安放孔，所述扩增架还包括通光孔和出光孔，所述通光孔和所述出光孔分别与所述第一安放孔连通，所述出光孔的位置与所述观察口相对应，所述加热元件安装在所述扩增架上，所述加热元件与所述扩增管传热连接，所述光源布置在所述检测腔内，所述光源与所述通光孔光路连接，所述光源用于激发所述荧光图像，所述混匀架可转动地安装在所述扩增盒的外侧，所述混匀架包括用于容纳离心管的第二安放孔，所述磁力元件安装在所述扩增盒的外侧。

根据本申请提供的掌式一体化磁富集等温扩增检测设备，至少具有如下技术效果：通过设置混匀架和磁力元件，掌式一体化磁富集等温扩增检测设备能够使用磁珠对现场采集到的样品进行富集和洗脱，提纯目标DNA，之后再通过扩增架进行扩增，通过终端对光源激发的荧光图像进行更加精准的分析判断，从而使得掌式一体化磁富集等温扩增检测设备能够提高现场检测的准确度，掌式一体化磁富集等温扩增检测设备将磁富集、LAMP以及荧光激发所需的结构集成在扩增盒上，便于携带和现场使用。

根据本申请的一些实施例，所述光源采用LED灯，所述LED灯的中心波长为495nm，所述掌式一体化磁富集等温扩增检测设备包括第一滤光片和第二滤光片，所述第一滤光片设置在所述光源和所述通光孔之间，所述第一滤光片为带通滤光片，所述第一滤光片的中心波长为498nm，所述第二滤光片设置在所述观察口，所述第二滤光片为高通滤光片，所述第二滤光片的起始波长为510nm。

根据本申请的一些实施例，所述检测腔包括第一腔室和第二腔室，所述第二腔室位于所述第一腔室的下方，所述第二腔室和所述第一腔室通过连通孔连通，所述光源安装在所述第二腔室，所述扩增架位于所述连通孔的上方，所述通光孔位于所述扩增架的底部。

根据本申请的一些实施例，所述通光孔沿竖直方向，所述出光孔沿水平方向。

根据本申请的一些实施例，所述扩增架和所述检测腔的表面为吸光表面。

根据本申请的一些实施例，所述扩增架采用金属材料，所述加热元件贴附在所述扩增架的外表面，所述第一安放孔的形状与所述扩增管的形状相对应。

根据本申请的一些实施例，所述加热元件和所述扩增架之间涂覆导热硅脂和/或粘贴导热胶带。

根据本申请的一些实施例，所述观察口位于所述扩增盒的顶部，所述掌式一体化磁富集等温扩增检测设备包括反射镜，所述反射镜位于从所述出光孔到所述观察口的光路上。

根据本申请提供的微生物检测方法，使用终端以及本申请所述的掌式一体化磁富集等温扩增检测设备，微生物检测方法包括以下步骤：

S1、制作偶联适配体的磁珠；

S2、加入待测样本进行目标DNA分离及洗脱；

S3、基于LAMP扩增所述目标DNA；

S4、数据采集与处理。

根据本申请的一些实施例，所述适配体的序列如SEQ ID NO.7所示。

根据本申请的一些实施例，所述适配体的使用浓度为1-100μM。

根据本申请的一些实施例，所述适配体的5’端修饰有生物素。

根据本申请的一些实施例，所述磁珠为表面修饰有链霉亲和素或亲和素的磁性纳米颗粒；优选地，所述磁性纳米颗粒为表面修饰有链霉亲和素的聚苯乙烯磁性纳米颗粒；优选地，所述磁性纳米颗粒的粒径为300-1000nm。

根据本申请的一些实施例，步骤S1的反应条件包括：温度24-30℃，时间1-2h。

根据本申请的一些实施例，所述适配体和所述磁珠的重量比为1：(1-2)，优选为1：1。

根据本申请的一些实施例，，所述步骤S2包括：

在离心管中加入待测样本溶液以及偶联所述适配体的所述磁珠，将所述离心管置于混匀架，启动所述混匀架使所述离心管内的混合液混匀以收集捕获的微生物；

将所述离心管置于磁力元件附近，磁分离所述磁珠以及所述混合液；

水浴加热得到所述目标DNA，将所述目标DNA转移至扩增管。

根据本申请的一些实施例，步骤S2中的收集捕获的微生物的反应条件包括：温度64-66℃，时间0.5-1h。

根据本申请的一些实施例，步骤S2中水浴条件包括：温度95℃，时间5～10min。

根据本申请的一些实施例，所述待测样本为包含微生物的食品、药品或环境样本。

根据本申请的一些实施例，所述微生物包括食源性致病菌；优选地，所述食源性致病菌包括鼠伤寒沙门氏菌。

根据本申请的一些实施例，所述步骤S3包括：

向所述扩增管加入LAMP反应体系，所述LAMP反应体系包括与所述微生物对应的引物探针组合物；

加热元件加热所述扩增管，进行LAMP反应，得到LAMP反应产物。

根据本申请的一些实施例，所述引物探针组合物包括：

引物：

正向外引物F3：序列如SEQ ID NO.2；

反向外引物B3：序列如SEQ ID NO.3所示；

正向内引物FIP：序列如SEQ ID NO.4所示；

反向内引物BIP：序列如SEQ ID NO.5所示；

正向环引物LF：序列如SEQ ID NO.6所示；

反向环引物LB：序列如SEQ ID NO.7所示；

探针：序列如SEQ ID NO.8所示。

根据本申请的一些实施例，所述F3、B3、FIP、BIP、LF、LB的摩尔比为10mM。

根据本申请的一些实施例，所述探针的3’端标记有BHQ-1，5’端标记有FAM。

根据本申请的一些实施例，所述LAMP反应体系包括：7-9mM的dNTPs、24-26mM的MgSO

根据本申请的一些实施例，所述LAMP反应体系还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照含有所述微生物的基因组DNA，所述阴性对照为空白的反应液。

根据本申请的一些实施例，所述LAMP反应的反应条件包括：温度64-66℃，时间30-60min。

根据本申请提供的微生物检测方法，至少具有如下技术效果：由于使用本申请提供的掌式一体化磁富集等温扩增检测设备，微生物检测方法适于现场操作，便于及时、快速地检测样品中的微生物，通过在LAMP反应之前先对采集到的样品进行磁富集，对目标DNA进行提纯，从而提高了LAMP反应的效果，进一步通过终端对荧光图像进行准确的分析判断，从而更加准确地评估检测结果，微生物检测方法提高了现场检测的准确度。

根据本申请的一些实施例，所述步骤S4包括：

光源激发所述LAMP反应产物；

终端获取对照组和实验组的所述扩增管的荧光图像；

基于所述对照组的所述荧光图像计算检测阈值，所述检测阈值等于

比较所述检测阈值和所述信号值，得到所述实验组的检测结果，可视化显示所述信号值、所述检测阈值和所述检测结果。

根据本申请的一些实施例，所述步骤S4包括：光源激发所述LAMP反应产物，肉眼观察所述扩增管的荧光变化，若出现绿色荧光，则待测样品中含有所述微生物。

附图说明

本申请的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1是本申请实施例的掌式一体化磁富集等温扩增检测设备的轴测示意图；

图2是本申请实施例的掌式一体化磁富集等温扩增检测设备的爆炸示意图；

图3是本申请实施例的掌式一体化磁富集等温扩增检测设备的剖视示意图；

图4是本申请实施例的扩增架的剖视示意图；

图5是本申请使用的终端的一个图形用户界面的示意图；

图6是本申请使用的终端的另一个图形用户界面的示意图；

图7是本申请鼠伤寒沙门氏菌的LAMP引物组合物的特异性实验；

图8是本申请鼠伤寒沙门氏菌的LAMP引物组合物的灵敏度实验的方法流程图；

图9是本申请鼠伤寒沙门氏菌的LAMP引物组合物的灵敏度实验；

图10是LAMP方法和磁分离LAMP方法检测鼠伤寒沙门菌的效果比对；图10a、图10c为LAMP方法的灵敏度；图10b、图10d为磁分离LAMP方法的灵敏度；

图11使用实际样品对磁分离LAMP与普通LAMP进行效果对比。

附图标记：

上盒体110、观察口111、第二滤光片112、中盒体120、反光镜121、第一滤光片122、下盒体130、开关131、旋钮132、第一腔室140、第二腔室150、第三腔室160、扩增架200、第一安放孔210、通光孔220、出光孔230、加热元件300、电机400、混匀架500、磁力元件600、扩增管710、终端900、第一显示区911、第二显示区912、第三显示区913、第一交互区921、第二交互区922、第三交互区923、第四交互区924、第四显示区931、第五显示区932、第六显示区933。

具体实施方式

下面详细描述本申请的实施例，实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本申请，而不能理解为对本申请的限制。

在本申请的描述中，需要理解的是，涉及到方位描述，例如上、下、前、后、左、右等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本申请和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本申请的限制。

在本申请的描述中，若干的含义是一个或者多个，多个的含义是两个以上，大于、小于、超过等理解为不包括本数，以上、以下、以内等理解为包括本数。如果有描述到第一、第二只是用于区分技术特征为目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量或者隐含指明所指示的技术特征的先后关系。

本申请的描述中，除非另有明确的限定，设置、安装、连接等词语应做广义理解，所属技术领域技术人员可以结合技术方案的具体内容合理确定上述词语在本申请中的具体含义。

参照图1和图2，根据本申请提供的掌式一体化磁富集等温扩增检测设备，包括扩增盒、扩增架200、加热元件300、光源、混匀架500和磁力元件600，扩增盒形成有检测腔，扩增盒开设有与检测腔连通的观察口111，观察口111的外侧用于布置终端900，终端900用于获取并处理荧光图像，扩增架200安放在检测腔内，扩增架200包括用于容纳扩增管710的第一安放孔210，扩增架200还包括通光孔220和出光孔230，通光孔220和出光孔230分别与第一安放孔210连通，出光孔230的位置与观察口111相对应，加热元件300安装在扩增架200上，加热元件300与扩增管710传热连接，光源布置在检测腔内，光源与通光孔220光路连接，光源用于激发荧光图像，混匀架500可转动地安装在扩增盒的外侧，混匀架500包括用于容纳离心管的第二安放孔，磁力元件600安装在扩增盒的外侧。

使用时，首先通过混匀架500、磁力元件600对采集到的样品进行提纯，随后通过扩增架200、加热元件300进行目标DNA的扩增，最后通过光源激发出荧光，通过终端900采集荧光图像，分析检测结果。

根据本申请提供的掌式一体化磁富集等温扩增检测设备，通过设置混匀架500和磁力元件600，掌式一体化磁富集等温扩增检测设备能够使用磁珠对现场采集到的样品进行富集和洗脱，提纯目标DNA，之后再通过扩增架200进行扩增，通过终端900对光源激发的荧光图像进行更加精准的分析判断，从而使得掌式一体化磁富集等温扩增检测设备能够提高现场检测的准确度，掌式一体化磁富集等温扩增检测设备将磁富集、LAMP以及荧光激发所需的结构集成在扩增盒上，便于携带和现场使用。

终端900具体可以包括但不限于具有图像采集功能的智能手机、平板电脑、笔记本电脑或台式电脑等。通常，终端包括有：处理器和存储器。其中，处理器可以采用DSP(Digital Signal Processing，数字信号处理)、FPGA(Field－Programmable Gate Array，现场可编程门阵列)、PLA(Programmable Logic Array，可编程逻辑阵列)中的至少一种硬件形式来实现。存储器至少用于存储以下计算机程序，其中，该计算机程序被处理器加载并执行之后，终端能够实现荧光图像的获取和分析处理。另外，存储器所存储的资源还可以包括操作系统和数据等，存储方式可以是短暂存储或者永久存储。其中，操作系统可以包括Windows、Unix、Linux等。数据可以包括但不限于图像数据、处理结果等。在一些实施例中，终端还可包括有显示屏、输入输出接口、通信接口、传感器、电源以及通信总线。

“传热连接”是指加热元件300产生的热量能够直接或间接地传递给扩增管710，进而加热扩增管710内的液体，促进LAMP反应的进行。

本申请中，荧光图像的质量很大程度上决定了检测的准确度，为此，根据本申请的一些实施例，光源采用LED灯，LED灯的中心波长为495nm，掌式一体化磁富集等温扩增检测设备包括第一滤光片122，第一滤光片122设置在光源和通光孔220之间，第一滤光片122为带通滤光片，第一滤光片122的中心波长为498nm。第一滤光片122能够过滤光源发出的杂光，从而对目标DNA进行针对性照射，提高荧光激发的质量。

进一步地，掌式一体化磁富集等温扩增检测设备包括第二滤光片112，第二滤光片112设置在观察口111，第二滤光片112为高通滤光片，第二滤光片112的起始波长为510nm。第二滤光片112能够滤去检测腔内存在的背景杂光，进一步提高终端900获取的荧光图像的质量。

为了从源头减少背景杂光，在一些实施例中，参照图3，检测腔包括第一腔室140和第二腔室150，第二腔室150位于第一腔室140的下方，第二腔室150和第一腔室140通过连通孔连通，光源安装在第二腔室150，扩增架200位于连通孔的上方，通光孔220位于扩增架200的底部。通过设计分隔的第一腔室140和第二腔室150，扩增架200盖在连通孔上方，从而使得光源发出的光线只能从经过连通孔和通光孔220射向扩增管710，而不会泄漏到第一腔室140的其它部位，避免光源的光线对荧光图像的获取产生干扰。

在一些实施例中，参照图4，通光孔220沿竖直方向，出光孔230沿水平方向。通光孔220和出光孔230的轴线相互垂直，使得从通光孔220射出的光线不会直接射入出光孔230，避免杂光对荧光图像的获取产生干扰。

在一些实施例中，扩增架200和检测腔的表面为吸光表面。吸光表面能削弱甚至消除反光，避免杂光对荧光图像的获取产生干扰。

本申请中，LAMP反应的质量也会影响到最终的检测质量，为此，需要精准地控制扩增管710的加热温度。根据本申请的一些实施例，扩增架200采用金属材料，加热元件300贴附在扩增架200的外表面，第一安放孔210的形状与扩增管710的形状相对应，第一安放孔210的内壁与扩增管710相接触。一方面，加热元件300不是直接与扩增管710相接触，而是通过扩增架200将热量传导给扩增管710，另一方面，第一安放孔210的形状与扩增管710对应，从而增大了扩增架200与扩增管710之间的接触面，进而提高加热的均匀性，减小扩增管710中不同部位的液体的温差。

在一些实施例中，加热元件300和扩增架200之间涂覆导热硅脂和/或粘贴导热胶带。导热硅脂和导热胶带都能够填平加热元件300和扩增架200表面的凹凸或孔隙，使得加热元件300和扩增架200之间的导热效率更高。

加热元件300可以采用带控制电路的PTC陶瓷加热片，或者其它具有温度调控功能的加热方案。

根据本申请的一些实施例，观察口111位于扩增盒的顶部，掌式一体化磁富集等温扩增检测设备包括反射镜121，反射镜121位于从出光孔230到观察口111的光路上。扩增盒的顶部形成平台，终端900可以方便地放置在平台上拍摄荧光图像，省去额外的固定结构。通过反射镜121调节光路，使荧光准确地从观察口111射出。

根据本申请提供的微生物检测方法，使用本申请提供的掌式一体化磁富集等温扩增检测设备，生物检测方法包括以下步骤：

S1、制作偶联适配体的磁珠；

S2、加入待测样本进行目标DNA分离及洗脱；

S3、基于LAMP扩增目标DNA；

S4、数据采集与处理。

根据本申请的一些实施例，适配体的序列如SEQ ID NO.7所示。

根据本申请的一些实施例，适配体的使用浓度为1-100μM。

根据本申请的一些实施例，适配体的5’端修饰有生物素。

根据本申请的一些实施例，磁珠为表面修饰有链霉亲和素或亲和素的磁性纳米颗粒；优选地，磁性纳米颗粒为表面修饰有链霉亲和素的聚苯乙烯磁性纳米颗粒；优选地，磁性纳米颗粒的粒径为300-1000nm。

根据本申请的一些实施例，步骤S1的反应条件包括：温度24-30℃，时间1-2h。

根据本申请的一些实施例，适配体和磁珠的重量比为1：(1-2)，优选为1：1。

在一些实施例中，步骤S2包括：

在离心管中加入样品溶液以及磁珠，将离心管置于混匀架500，启动混匀架500使离心管内的混合液混匀以收集捕获的微生物；

将离心管置于磁力元件600附近，磁分离磁珠以及混合液；

水浴加热得到目标DNA，将目标DNA转移至扩增管710。

根据本申请的一些实施例，步骤S2中的收集捕获的微生物的反应条件包括：温度64-66℃，时间0.5-1h。

根据本申请的一些实施例，步骤S2中水浴条件包括：温度95摄氏度，时间5～10min。

根据本申请的一些实施例，微生物包括食源性致病菌；优选地，食源性致病菌包括鼠伤寒沙门氏菌。

根据本申请的一些实施例，待测样本为包含微生物的食品、药品或环境样本。

由于使用本申请提供的掌式一体化磁富集等温扩增检测设备，本申请提供的微生物检测方法适于现场操作，便于及时、快速地检测样品中的微生物，通过在LAMP反应之前先对采集到的样品进行磁富集，对目标DNA进行提纯，从而提高了LAMP反应的效果，进一步通过终端对荧光图像进行准确的分析判断，从而更加准确地评估检测结果，微生物检测方法提高了现场检测的准确度。

在一些实施例中，步骤S3包括：

向扩增管加入LAMP反应体系，LAMP反应体系包括与微生物对应的引物探针组合物；

加热元件加热扩增管，进行LAMP反应，得到LAMP反应产物。

根据本申请的一些实施例，引物探针组合物包括：

引物：

正向外引物F3：序列如SEQ ID NO.2；

反向外引物B3：序列如SEQ ID NO.3所示；

正向内引物FIP：序列如SEQ ID NO.4所示；

反向内引物BIP：序列如SEQ ID NO.5所示；

正向环引物LF：序列如SEQ ID NO.6所示；

反向环引物LB：序列如SEQ ID NO.7所示；

探针：序列如SEQ ID NO.8所示。

根据本申请的一些实施例，F3、B3、FIP、BIP、LF、LB的摩尔比为10mM。

根据本申请的一些实施例，探针的3’端标记有BHQ-1，5’端标记有FAM。

根据本申请的一些实施例，LAMP反应体系包括：7-9mM的dNTPs、24-26mM的MgSO

可以理解的是，单位mM是mmol/L的简写。

根据本申请的一些实施例，LAMP反应体系还包括阳性对照和阴性对照，阳性对照含有微生物的基因组DNA，阴性对照为空白的反应液，即不包含待测细菌与待测细菌模板。

根据本申请的一些实施例，LAMP反应的反应条件包括：温度64-66℃，时间30-60min。

在一些实施例中，步骤S4包括：

光源激发LAMP反应产物；

终端900获取对照组和实验组的扩增管710的荧光图像；

基于对照组的荧光图像计算检测阈值，检测阈值等于

比较检测阈值和信号值，得到实验组的检测结果，可视化显示信号值、检测阈值和检测结果。

在一些实施例中，步骤S4包括：光源激发LAMP反应产物，肉眼观察扩增管710的荧光变化，若出现绿色荧光，则待测样品中含有微生物。

图5为终端900的结果显示图形用户界面，展示了终端900的一种可视化显示实施例，图5中包括第一显示区911、第二显示区912和第三显示区913，第一显示区911显示对照组的荧光图像，第二显示区912显示各个实验组的荧光图像，并在图像下方标注对应的检测结果，第三显示区913以柱状图的形式显示了各个实验组的信号值，并且以虚线表示检测阈值。采集到的对照组和实验组的荧光图像分别显示，并通过柱状图表现各个实验组的信号值以及检测阈值，从而清晰直观地了解检测结果。

图6为终端900的数据处理图形用户界面，图6中包括第一交互区921、第二交互区922、第三交互区923、第四交互区924。点按第一交互区921，可以选择本次进行检测分析的荧光图像，荧光图像会在第四显示区931显示；之后点按第二交互区922，在荧光图像中进一步选出作为对照组的荧光图像，对照组的荧光图像会在第五显示区932显示；随后点按第三交互区923，选出作为实验组的荧光图像，实验组的荧光图像会在第六显示区933显示；最后点按第四交互区924，终端900通过处理器计算相关数值，并自动跳转到结果显示图形用户界面。

下面参考图1至图5以一个具体的实施例详细描述根据本申请提供的掌式一体化磁富集等温扩增检测设备及微生物检测方法。值得理解的是，下述描述仅是示例性说明，而不是对本申请的具体限制。本具体的实施例也可以被上述相应的技术特征替换或与上述的技术特征结合。

掌式一体化磁富集等温扩增检测设备包括扩增盒，扩增盒包括上盒体110、中盒体120和下盒体130，中盒体120安装在下盒体130上，上盒体110安装在中盒体120上。上盒体110、中盒体120和下盒体130包围形成检测腔，中盒体120将检测腔分隔为第一腔室140和第二腔室150，第一腔室140和第二腔室150通过中盒体120上的连通孔连通。上盒体110能够和中盒体120分离从而暴露出第一腔室140。中盒体120和下盒体130之间还形成第三腔室160，第三腔室160内安装电源模块以及控制模块(图中未示出)。

掌式一体化磁富集等温扩增检测设备包括旋钮132、电机400、混匀架500和磁力元件600。电机400安装在上盒体110的侧面，混匀架500安装在电机400上，混匀架500包括用于容纳离心管(EP管)的第二安放孔，磁力元件600安装在上盒体110的顶部。旋钮132安装在下盒体130上，旋钮132、电源模块、控制模块以及电机400之间通信连接。

掌式一体化磁富集等温扩增检测设备包括开关131、扩增架200和加热元件300，扩增架200的材料为铝合金，表面氧化加工为黑色，扩增架200开设沿竖直方向的第一安放孔210、通光孔220以及沿水平方向的出光孔230，通光孔220和出光孔230分别与第一安放孔210连通，通光孔220位于扩增架200的底部，第一安放孔210的形状与扩增管710的形状相对应。加热元件300贴附在扩增架200的外表面，加热元件300和扩增架200之间涂覆导热硅脂和粘贴导热胶带。加热元件300采用PTC陶瓷加热片，开关131安装在下盒体130上，开关131、电源模块、控制模块以及加热元件300之间通信连接。

掌式一体化磁富集等温扩增检测设备包括光源、反光镜121、第一滤光片122、第二滤光片112，光源采用LED灯，LED灯的中心波长为495nm，光源安装在第二腔室150，第一滤光片122设置在光源和通光孔220之间，第一滤光片122为带通滤光片，第一滤光片122的中心波长为498nm。扩增架200安放在连通孔的上方，连通孔与通光孔220对应。上盒体110的顶部开设有观察口111，第二滤光片112设置在观察口111，第二滤光片112为高通滤光片，第二滤光片112的起始波长为510nm。中盒体120的材料采用耐温的黑色塑料，中盒体120形成倾斜的安装台，反光镜121安装在安装台上，从而将出光孔230射出的光反射至观察口111。

采用微生物检测方法使用掌式一体化磁富集等温扩增检测设备，微生物检测方法包括以下的步骤：

S1、制作偶联适配体的磁珠；

S2、加入待测样本进行目标DNA分离及洗脱；

S3、基于LAMP扩增目标DNA；

S4、数据采集与处理。

步骤S2包括：

在离心管中加入样品溶液以及偶联适配体的磁珠，将离心管置于混匀架500，启动混匀架500使离心管内的混合液混匀；

将离心管置于磁力元件600附近，磁分离磁珠以及混合液；

水浴加热得到目标DNA，将目标DNA转移至扩增管710。

步骤S3包括：

向扩增管加入LAMP反应体系，LAMP反应体系包括与微生物对应的引物组合物；

加热元件加热扩增管，进行LAMP反应，得到LAMP反应产物。

在一些实施例中，步骤S5包括：

光源激发LAMP反应产物；

终端900获取对照组和实验组的扩增管710的荧光图像；

基于对照组的荧光图像计算检测阈值，检测阈值等于

比较检测阈值和信号值，得到实验组的检测结果，可视化显示信号值、检测阈值和检测结果。

以下介绍本申请涉及的其它实施例：

实施例1

用于检测鼠伤寒沙门氏菌的LAMP引物组合物的特异性实验。

1.准备鼠伤寒沙门菌、金黄色葡萄球菌、志贺杆菌、单细胞增生李斯特菌、弯曲菌的基因模板作为特异性实验的对照组；

2.准备鼠伤寒沙门菌特异性引物(上海生工生物工程有限公司合成)、鼠伤寒沙门菌特异性探针(上海生工生物工程有限公司合成)、Bst DNA聚合酶(New England Biolabs,Inc.(Ipswich,MA,USA))、dNTP(北京全式金生物技术有限公司)、LAMP缓冲溶液(北京全式金生物技术有限公司)、MgSO

3.按以下体积配置LAMP反应体系(单位：μL)：

LAMP缓冲溶液：2.5，0.8-1.2mM；

MgSO

dNTPs：4，7-9mM；

FIP BIP：4，10mM；

LOOP：2，10mM；

F3 B3：0.5，10mM；

BST：1，9-11mM；

Syto9(或特异性探针)：0.25，10mM；

DNA模板：2.5

超纯水：6.75；

4.将LAMP反应体系配置好后使用CFX96实时PCR仪(Bio-Rad Laboratories Inc.(Hercules,CA,USA))进行64.7℃，1小时等温核酸扩增定量检测，观察扩增曲线。

引物探针组如表1所示。

表1

实验结果如图7所示，鼠伤寒沙门菌在17分钟左右起峰，而其他病原模板以及无模板对照均没有起峰。该结果显示，本引物组仅对鼠伤寒沙门菌有特异性。

实施例2

用于检测鼠伤寒沙门氏菌的LAMP引物组合物的灵敏度实验。检测方法流程图见图8。

1.将鼠伤寒沙门菌挑入10mL的LB肉汤中，在37℃恒温摇床中培养8～12小时；

2.取1mL培养好的鼠伤寒沙门菌放入离心机中高速(10000g)离心5分钟，去上清，再使用1mL的1×PBS溶液将沉淀复溶，震荡摇匀；

3.使用1×PBS溶液将细菌溶液进行10倍梯度稀释，并将每个梯度的菌液在麦康凯琼脂培养基上进行涂布平板计数，菌液放入4℃冰箱保存备用；

4.同时，准备100μM的适配体溶液(上海生工生物工程有限公司合成，5’biotin-TATGGCGGCGTCACCCGACGGGGACTTGACATTATGACAG-3’(SEQ ID NO.1))与等量链霉亲和素聚苯乙烯磁性微球(天津倍思乐技术研究中心，300nm,5mg/mL)反应45分钟；

5.生物素适配体与链霉亲和素聚苯乙烯磁性微球反应后使用PBST溶液(1×Phosphate Buffer Saline(PBS)containing 0.05％Tween 20(PBST))于磁分离架上洗涤2次；

6.使用等量封闭液(salmon sperm DNA 1mg/mL and yeast tRNA 0.1mg/mL)对链霉亲和素聚苯乙烯磁性微球封闭15分钟，之后使用PBST溶液洗涤两次，再加入等量PBS溶液复溶；

7.取各个梯度的100μL菌液分别与25μL磁珠溶液混合，反应1～2小时；

8.使用磁分离器移除上清液，加入40μL纯水复溶，放入95℃水浴锅5分钟进行细胞裂解，之后放入冰中5分钟进行DNA析出，得到待检测模板；

9.之后则进行实施例1中的核酸扩增步骤，获得扩增曲线，将步骤3得到的菌落计数结果(细菌的数量)与实验组一一对应，得到最终的敏感性结果。

结果显示，LAMP方法(图9)的线性关系较好，线性关系＞95％，而且，LAMP方法可以检测到5.5CFU/mL的鼠伤寒沙门菌，超过了大多数核酸检测方法。

对比例1

仅用LAMP方法，不结合适配体磁富集(或者结合其他适配体)，对鼠伤寒沙门氏菌进行检测，与实施例结果(靶基因浓度、纯度，检测灵敏度)进行比对。左边是LAMP方法，右边是磁分离LAMP方法。

1.将鼠伤寒沙门菌挑入10mL的LB肉汤中，在37℃恒温摇床中培养8～12小时；

2.取1mL培养好的鼠伤寒沙门菌放入离心机中高速(10000g)离心5分钟，去上清，再使用1mL的1×PBS溶液将沉淀复溶，震荡摇匀；

3.使用1×PBS溶液将细菌溶液进行10倍梯度稀释，并将每个梯度的菌液在麦康凯琼脂培养基上进行涂布平板计数；

4.将菌液放入95℃水浴锅5分钟进行细胞裂解，之后放入冰中5分钟进行DNA析出，得到待检测模板，之后进行核酸扩增，观察扩增曲线。

结果显示，普通LAMP方法仅能够测到550CFU/mL细菌，且线性关系差(图10a&图10c)，而磁分离LAMP则可以测到5.5CFU/mL，比传统方法灵敏度高两个数量级(100倍)，且线性关系好(R2>95％)(图10b&图10d)。

对比例2

使用10g的肉块样品对磁分离LAMP与普通LAMP进行效果对比，结果见图11。

结果显示，基于磁分离和LAMP的方法，利用适配体磁富集显著增加了靶基因的纯度和浓度，免去了传统的预增菌培养和冗杂的核酸提取过程，具备特异性强、准确性高、操作简单、成本低、不易失活等特点，本申请使用的微生物检测方法结合了磁富集以及LAMP，为快速检测鼠伤寒沙门氏菌提供了一个新的检测技术方案，易于大规模推广应用。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本申请的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本申请的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本申请的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本申请的范围由权利要求及其等同物限定。