从香紫苏醇微生物发酵液中富集和纯化香紫苏醇的方法

技术领域

本发明公开了一种从发酵液中富集和纯化香紫苏醇的方法。属于生物功能分子提取与纯化领域。

背景技术

香紫苏醇(Sclareol)是一种二萜类化合物，结构如下所示

目前较多的报道都是从香紫苏花序中提取分离天然的香紫苏醇。随着合成生物学的不断发展，利用合成生物学的方法生产香紫苏醇的技术不断成熟。但是对于微生物发酵法生产香紫苏醇的下游工作，即从发酵液中富集和纯化香紫苏醇的报道极少。专利(申请号202210267083.5)公开了一种从香紫苏醇发酵液中提取和纯化香紫苏醇的方法，但是，该工艺的分离对象为胞内产生的香紫苏醇，对于绝大多数胞外产香紫苏醇微生物的发酵液，由于发酵液成分的复杂性，其面对的待分离杂质也更加复杂，而目前缺乏相应的富集及纯化技术。

发明内容

本发明是针对上述存在的不足，提供一种从发酵液中富集、纯化香紫苏醇的方法。其具体内容为：

一种从香紫苏醇发酵液中富集和纯化香紫苏醇的方法，主要包括以下步骤：

(1)将发酵液以3000rpm-15000rpm的转速离心5-30min，除去上清液，收集下层沉淀；

(2)向沉淀中加入醇溶剂，在35-40摄氏度下搅拌2-4h用于香紫苏醇的提取，提取液离心固液分离后，沉淀再次用溶剂提取离心，反复提取离心，共提取离心3-5次，合并离心上清液，浓缩至干，得到提取物；

(3)向提取物中加入溶剂，50-60摄氏度加热溶解，过滤除去不溶物，滤液结晶，固液分离，得到结晶母液和纯化的香紫苏醇产品I；

(4)获得的结晶母液直接过硅胶层析柱，并依次用正己烷和乙酸乙酯进行洗脱，正己烷(体积ml)：硅胶(质量g)＝5～8:1，乙酸乙酯(体积ml)：硅胶(质量g)＝5～8:1，收集含香紫苏醇的组分，浓缩至干；

(5)干燥后含香紫苏醇组分的样品加入溶剂，50-60摄氏度加热溶解，过滤除去不溶物，滤液结晶，得到纯化的香紫苏醇产品II。

其中，步骤(1)的沉淀中主要含有菌体以及包括香紫苏醇在内的发酵液和代谢产物中非水溶性化合物，通过离心手段，可以快速将香紫苏醇进行富集；步骤(2)的目的是利用溶解度的差异，尽可能将沉淀中的香紫苏醇溶解在溶剂中，并阻止杂质的溶解。所使用的溶剂为乙醇体积分数为50％～100％的乙醇水溶液，较优的是70～90％的乙醇，最优的是80～85％乙醇；溶剂加入量为沉淀：溶剂(体积比)＝1:1～1:5，较优的为1:1.5～1:3，最优的为1:2～1:2.5。

步骤(3)的目的是利用结晶的手段获得高纯度香紫苏醇产品。其中结晶溶剂为石油醚或正己烷中的一种或二种，优选正己烷；溶剂加入量为提取物：溶剂(质量体积比)1:1.5～1:5，较优的为1:1.5～1:3，更优的为1:2～1:2.5；结晶温度为-5～20℃，较优的为5-15℃，更优的是11～12℃；结晶时间为1～20h，较优的是5～15h，更优的是10～12h。

步骤(4)中层析柱填料为硅胶，采用两种流动相进行洗脱，流动相I为正己烷，用于杂质的洗脱，正己烷(体积ml)：硅胶(质量g)＝5～8:1，低于5倍，杂质洗脱不彻底，高于8倍，浪费溶剂；流动相II为乙酸乙酯，用于目标物的洗脱，乙酸乙酯(体积ml)：硅胶(质量g)＝5～8:1，低于5倍，香紫苏醇会残留在柱中，高于8倍，浪费溶剂。步骤(4)中上样量为，样品(结晶母液中固体质量)：硅胶(质量比，g/g)＝1:3～1:10，优选1:4～1:8，更优的是1:5～1:6。

步骤(5)中溶剂为石油醚或正己烷中的一种，优选正己烷；溶剂加入量为提取物：溶剂(质量体积比)1:1.5～1:5，较优的为1:1.5～1:3，更优的为1:2～1:2.5；结晶温度为-5～20℃，较优的为5-15℃，更优的是11～12℃；结晶时间为1～20h，较优的是5～15h，更优的是10～12h。该步骤中获得的结晶母液可以按照步骤(4)和(5)工艺再次进行分离提纯，反复套用，直至全部分离。

经过本发明所述方法对发酵液富集和纯化后，产品I和II分别经过液相色谱分析测定，分析结果，产品I香紫苏醇的含量>97％，收率>70％；产品II香紫苏醇的含量>95％，收率>65％；综合产品I和II，总收率可达90％以上。

本发明的积极效果在于：

设计了一种从香紫苏醇发酵液上清中富集和纯化香紫苏醇的方法，该方法工艺过程步骤少，操作简单，所用溶剂简单、低毒、可循环利用，对环境友好。同时，收率高，发酵液中的香紫苏醇总回收率可达90％以上，大大降低生产成本，使得利用合成生物学手段生产香紫苏醇的工艺路线有可能实现产业化。

附图说明

图1为实施例2发酵液、产品I和产品II的液相色谱分析图(自上到下依次为：发酵液，产品II，产品I，质量含量为97.0％的标准品)。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及技术效果更加清楚明白，以下将对本发明的具体实施例进行描述。

实施例1

采用文献《酿酒酵母工程菌高密度培养生产香紫苏醇》(生物工程学报，2015，31(1):147-151)报道的酿酒酵母菌株S7进行香紫苏醇发酵。具体过程如下：接种S7单菌落到1L摇瓶中(含摇瓶培养基400ml)，200r/min，30度培养96h后获得种子液，再将其接种到50L发酵罐中。发酵罐内发酵罐培养基初始体积20L，温度30℃，通空气量100L/h，采用3mol/LNaOH溶液控制发酵罐培养基p H在5.0左右，通过调整搅拌转数控制溶解氧大于20％。发酵液中葡萄糖及生成的乙醇消耗完后开始用800g/L葡萄糖水溶液补料，使葡萄糖终浓度达到20g/L。当OD600达到50左右，采用补料-溶氧联动方式补料，当溶氧高于30％时，开始补料，达到35％时，停止补料，补料溶液为800g/L葡萄糖水溶液。培养196h后卸罐，搅匀后取样检测发酵液中香紫苏醇含量为820-1200mg/L。

其中摇瓶培养基成分为：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，水为溶剂；

发酵罐培养基成分为：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，磷酸二氢钾3g/L，水为溶剂。

实施例2

步骤1)取30L实施例1的发酵液，5000rpm离心15分钟，除去上清液，获得3000mL下层沉淀。

步骤2)沉淀用体积分数95％乙醇提取4次，每次用量3000mL，每次加入95％乙醇在35摄氏度下搅拌4h，然后离心固液分离；合并4次提取液，浓缩至干，得到44.4g提取物(香紫苏醇质量含量55.4％)。

步骤3)向提取物中加入66.6ml正己烷，55摄氏度加热溶解，过滤除去不溶物，滤液在20摄氏度下放置进行结晶，20h后，过滤晶体并用约30mL-10摄氏度冷正己烷洗涤，晶体经干燥后，得到纯化的香紫苏醇产品I18.3g(白色针状晶体)，经高效液相色谱分析，质量纯度为97.1％，单步质量收率达到72.2％。同时合并滤液及洗液，得到80ml结晶母液。

步骤4)将上述结晶母液(固体质量25.0g，含香紫苏醇6.84g)进行过柱分离。柱子为玻璃柱，装有200目硅胶75g，进样完毕后，先用375ml正己烷洗脱非极性杂质，再用375ml乙酸乙酯洗脱香紫苏醇，合并含香紫苏醇的组分，并浓缩至干，获得8.4g固体。

步骤5)向固体中加入12.6mL正己烷55摄氏度加热溶解，滤液在12摄氏度下放置进行结晶，12h后，过滤晶体并干燥，得到纯化的香紫苏醇产品II 4.74g(白色针状晶体)，经液相色谱分析，质量纯度为95.8％，单步质量收率达到66.4％。综合产品I和II，总收率达到90.7％。

实施例3

步骤1)取30L实施例1的发酵液，3000rpm离心30分钟，除去上清液，获得3000mL下层沉淀。

步骤2)沉淀用体积分数50％乙醇提取5次，每次用量13.5L，每次加入50％乙醇在40摄氏度下搅拌2h，然后离心固液分离；合并5次提取液，浓缩至干，得到51.4g提取物(香紫苏醇质量含量46.7％)。

步骤3)向提取物中加入257ml石油醚，50摄氏度加热溶解，过滤除去不溶物，滤液在-5摄氏度下放置进行结晶，1h后，过滤晶体并用约30mL-10摄氏度冷石油醚洗涤，晶体经干燥后，得到纯化的香紫苏醇产品I17.4g(白色针状晶体)，经高效液相色谱分析，质量纯度为97.0％，单步质量收率达到70.0％。同时合并滤液及洗液，得到260mL结晶母液。

步骤4)将上述结晶母液(固体质量33.2g，含香紫苏醇7.21g)进行过柱分离。柱子为玻璃柱，装有200目硅胶332g，进样完毕后，先用2656ml正己烷洗脱非极性杂质，再用2656ml乙酸乙酯洗脱香紫苏醇，合并含香紫苏醇的组分，并浓缩至干，获得8.1g固体。

步骤5)向固体中加入40.5ml石油醚50摄氏度加热溶解，滤液在20摄氏度下放置进行结晶，20h后，过滤晶体并干燥，得到纯化的香紫苏醇产品II 4.85g(白色针状晶体)，经液相色谱分析，质量纯度为97.2％，单步质量收率达到65.4％。综合产品I和II，总收率达到90.0％。

实施例4

步骤1)取30L实施例1的发酵液，15000rpm离心5分钟，除去上清液，获得2500ml下层沉淀。

步骤2)沉淀用体积分数90％的乙醇提取3次，每次用量10L，每次加入90％乙醇在38摄氏度下搅拌3h，然后离心固液分离；合并3次提取液，浓缩至干，得到46.5g提取物(香紫苏醇质量含量50.8％)。

步骤3)向提取物中加入200ml石油醚，55摄氏度加热溶解，过滤除去不溶物，滤液在4摄氏度下放置进行结晶，5h后，过滤晶体并用约30mL-10摄氏度冷石油醚洗涤，晶体经干燥后，得到纯化的香紫苏醇产品I17.5g(白色针状晶体)，经高效液相色谱分析，质量纯度为97.4％，单步质量收率达到72.1％。同时合并滤液及洗液，得到210ml结晶母液。

步骤4)将上述结晶母液(固体质量28.0g，含香紫苏醇6.58g)进行过柱分离。柱子为动态轴向压缩柱，装有400目硅胶84g，进样完毕后，先用420ml正己烷洗脱非极性杂质，再用420ml乙酸乙酯洗脱香紫苏醇，合并含香紫苏醇的组分，并浓缩至干，获得8.8g固体。

步骤5)向固体中再加入25ml石油醚60摄氏度加热溶解，滤液在-5摄氏度下放置进行结晶，1h后，过滤晶体并干燥，得到纯化的香紫苏醇产品II 4.40g(白色针状晶体)，经液相色谱分析，质量纯度为97.5％，单步质量收率达到65.1％。综合产品I和II，总收率达到90.3％。

实施例5(最佳条件)

步骤1)取30L实施例1的发酵液，5000rpm离心15分钟，除去上清液，获得3000ml下层沉淀。

步骤2)沉淀用体积分数85％乙醇提取4次，每次用量6L，每次加入85％乙醇在35摄氏度下搅拌4h，然后离心固液分离；合并4次提取液，浓缩至干，得到45.2g提取物(香紫苏醇质量含量54.4％)。

步骤3)向提取物中加入95ml正己烷，55摄氏度加热溶解，过滤除去不溶物，滤液在12度下放置进行结晶，12h后，过滤晶体并用-10摄氏度冷正己烷洗涤，晶体经干燥后，得到纯化的香紫苏醇产品I18.4g(白色针状晶体)，经高效液相色谱分析，质量纯度为98.2％，单步质量收率达到73.4％。同时合并滤液及洗液，得到105ml结晶母液。

步骤4)将上述结晶母液(固体质量26.2g，含香紫苏醇6.51g)进行过柱分离。柱子为动态轴向压缩柱，装有400目硅胶150g，进样完毕后，先用900ml正己烷洗脱非极性杂质，再用900ml乙酸乙酯洗脱香紫苏醇，合并含香紫苏醇的组分，并浓缩至干，获得6.8g固体。

步骤5)向固体中加入15ml正己烷55摄氏度加热溶解，滤液在11摄氏度下放置进行结晶，11h后，过滤晶体并干燥，得到纯化的香紫苏醇产品II 4.67g(白色针状晶体)，经液相色谱分析，质量纯度为97.8％，单步质量收率达到70.1％。综合产品I和II，总收率达到91.9％。

对比实施例1

步骤1)取30L实施例1的发酵液，5000rpm离心15分钟，除去上清液，获得3000mL下层沉淀。

步骤2)沉淀用无水乙醇提取4次，每次用量6L，每次加入无水乙醇在30摄氏度下搅拌5h，然后离心固液分离；合并4次提取液，浓缩至干，得到40.3g提取物(香紫苏醇质量含量53.1％)。

步骤3)向提取物中加入160ml丙酮，55度加热溶解，过滤除去不溶物，滤液在4度下放置进行结晶，4h后，过滤晶体并用约30ml-10度冷丙酮洗涤，晶体经干燥后，得到纯化的香紫苏醇产品I14.2(白色针状晶体)g，经高效液相色谱分析，纯度为95.5％，单步收率达到63.4％。同时合并滤液及洗液，得到175ml结晶母液。

步骤4)取上述结晶母液(固体质量26g，含香紫苏醇7.83g)进行过柱分离。柱子为动态轴向压缩柱，装有400目硅胶150g，进样完毕后，用1.5L溶剂洗脱，洗脱溶剂为120号溶剂：石油醚：丙酮＝3:1:1，合并含香紫苏醇的组分，并浓缩至干，得到纯化的香紫苏醇产品II 4.41g(淡黄色针状晶体)，经液相色谱分析，纯度为89.8％，单步收率达到50.5％。综合产品I和II，总收率81.9％。

对比实施例2

步骤1)取30L实施例1的发酵液，5000rpm离心15分钟，除去上清液，获得3000ml下层沉淀。

步骤2)沉淀用体积分数45％乙醇提取5次，每次用量3L，每次加入45％乙醇在40摄氏度下搅拌2h，然后离心固液分离；合并5次提取液，浓缩至干，得到62.4g提取物(香紫苏醇质量含量38.7％)。

步骤3)向提取物中加入350ml正己烷，50摄氏度加热溶解，过滤除去不溶物，滤液在25摄氏度下放置进行结晶，48h后，过滤晶体并用约30ml-10度冷正己烷洗涤，晶体经干燥后，得到纯化的香紫苏醇产品I12.2g(白色针状晶体)，经高效液相色谱分析，纯度为97.1％，单步收率达到49.0％。同时合并滤液及洗液，得到380ml结晶母液。

步骤4)将上述结晶母液(固体质量40g，含香紫苏醇12.3g)进行过柱分离。柱子为动态轴向压缩柱，装有400目硅胶100g，进样完毕后，先用500ml己烷洗脱非极性杂质，再用500ml乙酸乙酯洗脱香紫苏醇，合并含香紫苏醇的组分，并浓缩至干，获得15.8g固体。

步骤5)向固体中加入88ml正己烷溶解，滤液在-6度下放置进行结晶，0.5h后，过滤晶体并干燥，得到纯化的香紫苏醇产品II 6.62g(淡黄色针状晶体)，经液相色谱分析，纯度为85.8％，单步收率达到46.2％。综合产品I和II，总收率为72.6％。

实施例参数汇总表

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