一种微生物发酵提高柑橘皮渣多酚含量的方法

技术领域

本发明涉及柑橘皮渣的处理方法，特别涉及一种微生物发酵提高柑橘皮渣多酚含量的方法。

背景技术

中国柑橘产量位居世界第三，而江西是中国柑橘的主要产区。随着柑橘产量的不断增加，柑橘加工业不断的发展，加工过程中产生的废弃柑橘皮渣的量也随着增多，柑橘皮渣含有丰富的营养物质，所以开发新的对皮渣的利用方式既能提高柑橘产业的附加值，同时也能保护环境。柑橘皮渣虽然是柑橘产业加工过程中产生的副产物，但柑橘皮渣中仍然保留有丰富的功能活性和植物化学成分。其中柑橘皮渣便具有抗氧化活性，人体和动物体都会因为自身反应或者与外界接触而在体内产生大量的自由基，癌症、衰老或其它疾病大都与过量自由基的产生有关联，当机体内存在大量自由基会引起氧化应激导致肠道菌群紊乱，适量补充抗氧化剂能清除过量的自由基，调节机体氧化还原状态，对于肠道 菌群紊乱的改善可能具有重要意义。柑橘皮渣主要成分包括多酚类化合物和膳食 纤维等，多酚是一种能够促进机体健康的化合物，具有抗衰老、抗病毒、抗癌变 和预防高血压、高血脂以及增强免疫功能和改善肠道菌群等多种生物学活性，广泛应用在制药、生化、精细化工等各个领域。

目前，针对柑橘皮渣的利用主要有以下两种方式：一是提取和利用柑橘皮渣中营养物质和功能性物质，如果胶，香精油以及黄酮类物质；二是对柑橘皮渣进行微生物发酵，以皮渣为营养基质，利用微生物的正常代谢来生产乙醇等工业材料，或者制成动物饲料的添加剂，改善饲料的成分，提高动物对饲料的利用率。有研究做过柑橘皮渣发酵，但是将皮渣进行发酵后，再探索其对于肠道微生物的影响是没有研究成果的，因此，很需要一种用于提高柑橘皮渣多酚含量的方法，来更好的对柑橘皮渣进行利用。

发明内容

为了解决背景技术中存在的技术问题，本发明提出了一种微生物发酵提高柑橘皮渣多酚含量的方法，采取分别发酵的方式，添加干酪乳杆菌、康宁木霉、米曲霉进行发酵作用，能够显著提高发酵液中游离型的多酚类化合物。

本发明的技术解决方案是：

一种微生物发酵提高柑橘皮渣多酚含量的方法，其特殊之处在于：包括以下步骤：

步骤1）选取新鲜柑橘，经过榨汁取剩余的皮渣，破碎打浆；

步骤2）将破碎打浆后的皮渣储存于冰箱，温度-20 ℃，备用；

步骤3）处理好的柑橘皮渣置于无菌锥形瓶中，加入蒸馏水（g

步骤4）将混匀的皮渣液高温高压蒸汽灭菌，自然降温至室温；

步骤5）向皮渣液中分别接种微生物，用橡皮塞塞住锥形瓶口，置入摇床培养。

进一步的，微生物是干酪乳杆菌、康宁木霉、米曲霉三种微生物。

进一步的，干酪乳杆菌、康宁木霉、米曲霉三种微生物单独或按比例混合接种，发酵时间为1-7 d、接种量为1%- 6%、发酵温度为 25℃-40℃、发酵 pH 为3-7。

进一步的，干酪乳杆菌的发酵条件：发酵时间3 d、接种量3%、发酵温度36 ℃、发酵pH =5。

进一步的，康宁木霉的发酵条件：发酵时间2 d，接种量为 1%—3%、发酵温度28—30 ℃、发酵 pH =5。

进一步的，康宁木霉的发酵条件：发酵时间2 d，接种量为3%、发酵温度28℃、发酵pH =5。

进一步的，米曲霉的发酵条件：发酵时间2 d—3 d、接种量2%—3%、发酵温度28—30 ℃、发酵 pH =6.5。

进一步的，米曲霉的发酵条件：发酵时间2 d、接种量2%、发酵温度30 ℃、发酵 pH=6.5。

进一步的，采用高温高压蒸汽灭菌是采用121℃高温高压杀菌，时间20 min。

进一步的，步骤4）中室温为25℃—37℃。

本发明的有益效果是：本发明微生物发酵提高柑橘皮渣多酚含量的方法，采取分别发酵的方式，添加干酪乳杆菌进行发酵作用，能够显著提高发酵液中游离型的多酚类化合物。植物细胞壁主要是由纤维素和果胶成分所构成的，康宁木霉和米曲霉在发酵过程中能够产生各种酶，其中便包括果胶酶和纤维素酶，从而能够水解植物中的细胞壁，释放更多的活性物质，提高发酵液中多酚的含量。多酚含量，抗氧化能力得到提高，对肠道健康的相关指标有改善作用，如产气值，铵态氮和短链脂肪酸，还能够促进乳杆菌属在肠道内的表达，增加乳杆菌的数量，还可以抑制一些中性菌和有害菌的表达，最终起到改善肠道功能的作用。

附图说明

图1是干酪乳杆菌发酵过程中发酵液对多酚含量的变化影响示意图；

图2是康宁木霉发酵过程中发酵液对多酚含量的变化影响示意图；

图3是米曲霉发酵过程中发酵液对多酚含量的变化影响示意图；

图4是干酪乳杆菌发酵过程中发酵液对DPPH 自由基清除能力的变化影响示意图；

图5是康宁木霉发酵过程中发酵液对DPPH 自由基清除能力的变化影响示意图；

图6是米曲霉发酵过程中发酵液对DPPH 自由基清除能力的变化影响示意图；

图7是干酪乳杆菌发酵过程中发酵液对ABTS 自由基清除能力的变化影响示意图；

图8是康宁木霉发酵过程中发酵液对ABTS 自由基清除能力的变化影响示意图；

图9是米曲霉发酵过程中发酵液对ABTS 自由基清除能力的变化影响示意图；

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地说明，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种微生物发酵提高柑橘皮渣多酚含量的方法，包括以下步骤：

步骤1）选取新鲜柑橘，经过榨汁取剩余的皮渣，破碎打浆；

步骤2）将破碎打浆后的皮渣储存于冰箱，温度-20 ℃，备用；

步骤3）处理好的柑橘皮渣置于无菌锥形瓶中，加入蒸馏水（g

步骤4）将混匀的皮渣液采用121℃高温高压杀菌，时间20 min。灭菌后的柑橘皮渣混合液自然降温至 37 ℃左右；

步骤5）向皮渣液中分别接种干酪乳杆菌、康宁木霉、米曲霉三种微生物，用橡皮塞塞住锥形瓶口，置入摇床培养。

其中，干酪乳杆菌的发酵条件：发酵时间3 d、接种量3%、发酵温度36 ℃、发酵 pH=5；

康宁木霉的发酵条件：发酵时间2 d，接种量为 1%、发酵温度30 ℃、发酵 pH =5。

米曲霉的发酵条件：发酵时间2 d、接种量3%、发酵温度28℃、发酵 pH =6.5。

上述实施例发酵液中多酚含量最高。具体实验方法是：取柑橘皮渣发酵液 1 mL于离心管中，再加入 0.5 mL 50%的福林-酚试剂，常温下充分震荡混匀 2 min，随后向混合体系中加入 1 mL 7.5%的 Na

基于上述的实验方法，参见图1—图3，分别是干酪乳杆菌、康宁木霉以及米曲霉发酵时间、接种量、发酵温度、发酵 pH 对发酵过程中多酚含量的变化影响的具体实验数据。

由图1（a）—图1（d）可知，随着发酵时间的变化，柑橘皮渣发酵液中多酚含量是呈现先平缓后逐渐下降的，在发酵到第 3 d 时，其发酵液中多酚含量最高，而发酵时间越往后，总酚含量开始显著降低，这说明发酵菌在发酵后期开始利用了这一部分总酚以满足自身生长所需；随着接种量的增加，发酵液多酚含量呈现先上升后下降的趋势，当接种量为3%时，发酵液中多酚含量最高；随着发酵温度的身高，发酵液中多酚含量在 36 ℃时含量最高；随着发酵 pH 的增大，发酵液中多酚含量先上升后下降，在pH为5左右时，发酵液中多酚含量最高，这与干酪乳杆菌生长的最适 pH 相近。通过该单因素实验，可以得出干酪乳杆菌发酵皮渣过程中产多酚的最佳条件为发酵时间为3d，接种量为3%，发酵温度为36℃，发酵pH为 5。

由图2（a）—图3（d）可知，随着发酵时间的变化，柑橘皮渣发酵液中多酚含量是呈现先上升后逐渐下降的，在发酵到第2d 时，其发酵液中多酚含量最高，随着发酵时间的不断增加，溶液中多酚的含量越来越低；随着接种量的增加，发酵液多酚含量呈现逐渐下降的趋势，当接种量为1%时，发酵液中多酚含量最高；随着发酵温度的身高，发酵液中多酚含量在36℃时含量最高；随着发酵pH 的增大，发酵液中多酚含量先上升后下降，在pH为5左右时，发酵液中多酚含量最高。通过该单因素实验，可以得出康宁木霉发酵皮渣过程中当发酵时间为 2 d，接种量为 1%，发酵温度为 30 ℃，发酵pH 为 5，发酵液中多酚含量最高。

由图3（a）—图3（d）可知，随着发酵时间的变化，发酵液中多酚含量是呈现先上升后下降并最终趋于平缓的，在发酵到第2d 时，其发酵液中多酚含量最高；随着接种量的增加，发酵液多酚含量呈现先上升后下降的趋势，当接种量为 3%时，发酵液中多酚含量最高；随着发酵温度的身高，发酵液中多酚含量在28℃时含量最高，发酵效果最好；随着发酵 pH的增大，发酵液中多酚含量先上升后下降，在 pH为6.5左右时，发酵液中多酚含量最高。通过该单因素实验，可以得出米曲霉发酵皮渣过程中产多酚的最佳条件为发酵时间为 2 d，接种量为 3%，发酵温度为 28 ℃，发酵 pH 为 6.5。

实施例2

一种微生物发酵提高柑橘皮渣多酚含量的方法，包括以下步骤：

步骤1）选取新鲜柑橘，经过榨汁取剩余的皮渣，破碎打浆；

步骤2）将破碎打浆后的皮渣储存于冰箱，温度-20 ℃，备用；

步骤3）处理好的柑橘皮渣置于无菌锥形瓶中，加入蒸馏水（g

步骤4）将混匀的皮渣液采用121℃高温高压杀菌，时间20 min。灭菌后的柑橘皮渣混合液自然降温至 30℃左右；

步骤5）向皮渣液中分别接种干酪乳杆菌、康宁木霉、米曲霉三种微生物，用橡皮塞塞住锥形瓶口，置入摇床培养。

其中，干酪乳杆菌的发酵条件：发酵时间3 d、接种量3%、发酵温度36 ℃、发酵 pH=5；

康宁木霉的发酵条件：发酵时间2 d，接种量为 2%、发酵温度30 ℃、发酵 pH =5。

米曲霉的发酵条件：发酵时间3 d、接种量3%、发酵温度28℃、发酵 pH =6.5。

上述实施例中发酵液对DPPH 的自由基清除能力最强。具体实验方法是：取柑橘皮渣发酵液 1 mL 于 10 mL 离心管中，然后再加入 2 mL 的新配制的 DPPH 溶液（0.2mmol/L），充分震荡涡旋混合 2 min。随后将混合溶液置于室温下避光反应 20 min，然后测定其在 517nm 下的吸光值。每组实验均设置 3 个平行样品，并重复进行 3 次独立平行操作。

基于上述的实验方法，参见图4—图6，分别是干酪乳杆菌、康宁木霉以及米曲霉发酵时间、接种量、发酵温度、发酵 pH 对发酵过程中DPPH 的自由基清除能力的变化影响的具体实验数据。

由图4（a）—图4（d）可知，随着发酵时间的变化，柑橘皮渣发酵液对 DPPH 自由基的清除能力是呈现先上升后逐渐下降的，在发酵到第3 d 时，其发酵液中对 DPPH自由基的清除能力最强；随着接种量的增加，发酵液对 DPPH 自由基的清除能力呈现先上升后下降的趋势，当接种量为 3 %时，其发酵液中抗氧化能力最强；随着发酵温度的身高，发酵液对DPPH 自由基的清除能力在36 ℃时最强；随着发酵 pH 的增大，发酵液对DPPH 自由基的清除能力先上升后下降，在 pH 为 5左右时，其抗氧化能力最强。通过该单因素实验，可以得出干酪乳杆菌发酵皮渣过程中发酵液对 DPPH 自由基的清除能力最强时的发酵条件为发酵时间为 3 d，接种量为 3%，发酵温度为 36 ℃，发酵 pH 为 5。

由图5（a）—图5（d）可知，随着发酵时间的变化，发酵液对 DPPH 自由基的清除能力是呈先上升后下降的，在发酵到第2d时，其发酵液对 DPPH 自由基的清除能力最强；随着接种量的增加，发酵液对 DPPH 自由基的清除能力呈现先上升后下降的趋势；当接种量为2%时，其发酵液中抗氧化能力最强；随着发酵温度的身高，发酵液对 DPPH自由基的清除能力在 28 ℃ 时最强；随着发酵pH的增大，发酵液对 DPPH自由基的清除能力先上升后下降，在 pH 为 5 左右时，其抗氧化能力最强。通过该单因素实验，可以得出康宁木霉发酵皮渣过程中发酵液对 DPPH 自由基的清除能力最强时的发酵条件为发酵时间为 2 d，接种量为2%，发酵温度为 30 ℃，发酵 pH 为5。

由图6（a）—图6（d）可知，随着发酵时间的变化，发酵液对 DPPH 自由基的清除能力是呈现先上升后逐渐下降的，在发酵到第3d时，其发酵液对 DPPH 自由基的清除能力最强； 随着接种量的增加，发酵液对 DPPH 自由基的清除能力呈现先上升后下降的趋势，当接种量为 3%时，其发酵液抗氧化能力最强；随着发酵温度的身高，发酵液对 DPPH自由基的清除能力在 28 ℃时最强；随着发酵 pH 的增大，发酵液对 DPPH自由基的清除能力先上升后下降，在 pH 为 6.5 左右时，其抗氧化能力最强。通过该单因素实验，可以得出米曲霉发酵皮渣过程中发酵液对 DPPH 自由基的清除能力最强时的发酵条件为发酵时间为 3 d，接种量为3%，发酵温度为 28 ℃，发酵 pH为 6.5。

实施例3

一种微生物发酵提高柑橘皮渣多酚含量的方法，包括以下步骤：

步骤1）选取新鲜柑橘，经过榨汁取剩余的皮渣，破碎打浆；

步骤2）将破碎打浆后的皮渣储存于冰箱，温度-20 ℃，备用；

步骤3）处理好的柑橘皮渣置于无菌锥形瓶中，加入蒸馏水（g

步骤4）将混匀的皮渣液采用121℃高温高压杀菌，时间20 min。灭菌后的柑橘皮渣混合液自然降温至 25 ℃左右；

步骤5）向皮渣液中分别接种干酪乳杆菌、康宁木霉、米曲霉三种微生物，用橡皮塞塞住锥形瓶口，置入摇床培养。

其中，干酪乳杆菌的发酵条件：发酵时间3 d、接种量3%、发酵温度36 ℃、发酵 pH=5；

康宁木霉的发酵条件：发酵时间2 d，接种量为 3%、发酵温度28℃、发酵 pH =5。

米曲霉的发酵条件：发酵时间2 d、接种量2%、发酵温度30 ℃、发酵 pH =6.5。

上述实施例中，发酵液对 ABTS 自由基清除能力最强。具体实验方法是：首先将新配置的ABTS溶液（7.4 mol/L）与K

基于上述的实验方法，参见图7—图9，分别是干酪乳杆菌、康宁木霉以及米曲霉发酵时间、接种量、发酵温度、发酵 pH 对发酵过程中对 ABTS 自由基清除能力的变化影响的具体实验数据。

由图7（a）—图7（d）可知，随着发酵时间的变化，柑橘皮渣发酵液对 ABTS 自由基清除能力是呈现先上升后逐渐下降的，在发酵到第3d时，其发酵液中对 ABTS 自由基的清除能力最强；随着接种量的增加，发酵液对 ABTS 自由基的清除能力呈现先上升后下降的趋势，当接种量为 3%时，其发酵液中抗氧化能力最强；随着发酵温度的身高，发酵液对ABTS自由基的清除能力在36℃时最强；随着发酵pH 的增大，发酵液对ABTS 自由基清除能力先上升后下降，在 pH 为5左右时，其抗氧化能力最强。通过该单因素实验，可以得出干酪乳杆菌发酵皮渣过程中发酵液对ABTS自由基的清除能力最强时的发酵条件为发酵时间 3 d，接种量为3%，发酵温度为36 ℃，发酵 pH 为 5。

由图8（a）—图8（d）可知，随着发酵时间的变化，发酵液对 ABTS 自由基的清除能力是呈现先上升后逐渐下降的，在发酵到第2d左右时，其发酵液中对 ABTS自由基清除能力最强；随着接种量的增加，发酵液对 ABTS 自由基的清除能力呈现先上升后下降的趋势，当接种量为 3%时，其发酵液中抗氧化能力最强；随着发酵温度的身高，发酵液对 ABTS自由基的清除能力在 28 ℃时最强；随着发酵 pH 的增大，发酵液对ABTS自由基的清除能力先上升后下降，在 pH为5 时，其对ABTS 自由基的清除能力最强。通过该单因素实验，可以得出康宁木霉发酵皮渣过程中发酵液对ABTS自由基的清除能力最强时的发酵条件为发酵时间为 2d，接种量为 3%，发酵温度为 28 ℃，发酵 pH 为 5。

由图9（a）—图9（d）可知，随着发酵时间的变化，发酵液对 ABTS 自由基的清除能力是呈现先上升后缓慢下降的趋势，在发酵到第 3 d 左右时，其发酵液中抗氧化能力最强；随着接种量的增加，发酵液对 ABTS 自由基的清除能力呈现先上升后下降的趋势，当接种量为 2%时，其发酵液中对 ABTS 自由基的清除能力最强；随着发酵温度的升高，发酵液对ABTS自由基的清除能力在 30 ℃时最强；随着发酵pH的增大，发酵液对ABTS 自由基的清除能力呈先上升后下降的趋势，在pH为 6.5左右时，其抗氧化能力最强。通过该单因素实验，可以得出米曲霉发酵皮渣过程中发酵液对 ABTS 自由基的清除能力最强时的发酵条件为发酵时间为 2d，接种量为 2%，发酵温度为 30 ℃，发酵 pH 为 6.5。

其原理是干酪乳杆菌发酵过程中会产生水解酶、脱羧酶和还原酶等，这些酶产物的存在会导致柑橘皮渣中结合性多酚类化合物代谢，分解为游离性多酚和多种小分子化合物，从而会出现在发酵过程中多酚含量的变化。当发酵液中多酚含量上升时，因为乳杆菌代谢产生的酶水解体系中的结合性多酚，导致可检测游离性多酚增多，当多酚含量处于下降趋势时，是因为在整个发酵体系中多酚类化合物参与了促进乳酸菌生长的营养物质和抑制乳酸菌生长的抑菌物质之间的动态平衡，体系中过多积累的多酚类化合物或代谢产物对菌的生长发育起到抑制作用。康宁木霉和米曲霉在生长过程中会产生纤维素酶和果胶酶等，对植物细胞壁具有一定的水解作用，细胞壁的破坏会加速多酚类物质的溶出，增加发酵液中多酚的含量，而当多酚含量处于下降趋势时，这可能是因为微生物在发酵过程开始利用多酚类化合物来满足自身的生长所需。柑橘皮渣具有抗氧化活性主要是因为其具有多种功能活性物质，比如多酚，在发酵过程中发酵液对 DPPH 和 ABTS 自由基的清除能力是有一个变化的状态，当对DPPH 和 ABTS 自由基的清除能力处于上升状态时，这可能是由于发酵过程中发酵液中功能活性物质的增多，导致其能够清除超氧化物，通过提供质子参与从DPPH•向DPPH2 转换的还原反应、促进 ABTS+向 ABTS 转变，从而增大发酵液对 DPPH、ABTS自由基的清除能力。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。