一种新型细胞核靶向的纳米粒子探针及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及生物纳米医用材料技术领域，更具体地说，它涉及一种新型细胞核靶向的纳米粒子探针及其制备方法与应用。

背景技术

细胞核是真核细胞中最大、最重要的亚细胞器，是细胞遗传和新陈代谢的活动中心，在细胞的代谢、生长、分化等过程中起着不可替代的作用。细胞核的异常也与很多生物过程密切相关，比如细胞凋亡，有丝分裂等过程。凋亡过程中的细胞核的形态明显出现畸变以及皱缩，核仁变大等形态学特征。而有丝分裂过程中的核膜会出现破裂、DNA进行自我复制等的现象。因此，开发高选择性、高灵敏度、高生物亲和性以及高稳定性的细胞核靶向荧光染料以准确对活细胞内的细胞核进行实时成像，对于探索与解决与细胞核相关的生物医学等基本问题具有重要的意义。

现有的市售细胞核染料探针是一种4,6-二脒基-2-苯基吲哚的化学染料，具有强烈的生物毒性，且稳定性较弱，易发生光漂白，斯托克斯位移小，成像信噪比较低，灵敏性弱，荧光发射波长短这些问题限制了其进一步发展。因此，开发一种具有良好的生物亲和性，高稳定性，良好成像信噪比，高靶向性的细胞核染料探针具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型细胞核靶向的纳米粒子探针及其制备方法与应用，可有效解决现有的细胞核染料探针因其分子量小，斯托克斯位移小，荧光发射波长短所导致的强烈的细胞毒性，成像信噪比较低，稳定性较弱，靶向性差的一系列问题。

本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种新型细胞核靶向的纳米粒子探针，所述纳米粒子探针由共轭聚合物、1,4-二偕胺肟苯和两亲性表面活性剂通过微流控复合而成，所述共轭聚合物具有荧光响应的π-π键共轭体系；所述1,4-二偕胺肟苯具备靶向DNA的化学结构；所述两亲性表面活性剂具备亲水端和疏水端包裹共轭聚合物和1,4-二偕胺肟苯自组装成稳定的球体纳米粒子；所述纳米粒子探针具备核壳结构，其核由共轭聚合物、1,4-二偕胺肟苯通过氢键作用形成，壳由所述两亲性表面活性剂自组装形成。

本发明进一步设置为：所述共轭聚合物结构式如式Ⅰ所示：

所述具备靶向DNA的化学结构的1,4-二偕胺肟苯结构式如式Ⅱ所示：

所述两亲性表面活性剂为Tween-20、PEG 8000、PEG 20000、Plurnoic-F127或AtlasG-1725。

本发明进一步设置为：所述共轭聚合物的分子量为5000-300000Da。

本发明进一步设置为：所述纳米粒子探针的粒径为10-300nm。

本发明还提供了该新型细胞核靶向的纳米粒子探针的制备方法：包括如下步骤：

(1)将水溶性荧光共轭聚合物、1,4-二偕胺肟苯和两亲性表面活性剂分别溶于超纯水中；

(2)使用注射泵将1,4-二偕胺肟苯和两亲性表面活性剂的水溶液先后注入水溶性荧光共轭聚合物的水溶液中并搅拌；

(3)搅拌结束后经透析和膜过滤得到纳米粒子探针。

本发明进一步设置为：所述共轭聚合物与1,4-二偕胺肟苯的摩尔比为1:1.0～3.0；所述共轭聚合物与两亲性表面活性剂的摩尔比为1:1.0～3.0。

本发明进一步设置为：所述搅拌时间为0.5-3h。

本发明进一步设置为：所述注射泵流速为1μL/s～100μL/s。

本发明进一步设置为：所述透析使用的透析袋孔径为1000-14000Da；所述膜过滤采用针式薄膜过滤器，所述针式薄膜过滤器孔径为0.22μm。

本发明还提供了该新型细胞核靶向的纳米粒子探针的应用：所述纳米粒子探针可在生物体细胞核内成像中应用。

综上所述，本发明具有以下有益效果：将具有荧光响应π-π键共轭体系的共轭聚合物、具有靶向DNA的化学结构的1,4-二偕胺肟苯和两亲性表面活性剂通过微流控自组装复合而成稳定的球体纳米粒子。该纳米粒子制备方法操作简单，稳定性高，可重复性好；在共聚焦生物成像时，具有高信噪比成像，较高的荧光强度，大斯托克斯位移，良好的生物亲和性，较高的DNA靶向能力；在细胞共聚焦荧光成像中表现出了优秀的成像能力和细胞核靶向性。填补了目前市场上细胞核靶向探针的匮乏，有比较大的市场发展前景，预估可带来可观的经济效益。

附图说明

图1为本发明实施例1制备的化合物Ⅰ的

图2为本发明实施例2制备的纳米粒子流程图；

图3为本发明实施例2在不同环境的粒径分布图；

图4为本发明实施例3在不同环境的粒径分布图；

图5为本发明实施例2的纳米粒子在PBS中的紫外吸收和荧光发射光谱；

图6为本发明实施例3的纳米粒子在PBS中的紫外吸收和荧光发射光谱；

图7为本发明实施例2和3纳米粒子的CCK-8细胞毒性柱状图；

图8为本发明实施例2和3纳米粒子的Hela细胞细胞核染色的激光共聚焦成像图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。

实施例1

实施例1提供了共轭聚合物Ⅰ的制备方法，其制备路线为

参考上述制备路线，包括以下步骤：

将装有20mmol对苯二酚、48mmol 1，6-二溴己烷和100mL 1，4-二恶烷的250mL圆底烧瓶加热至80℃，24小时。然后用200mL DCM稀释混合物，用饱和碳酸氢钠洗涤，用水和DCM萃取，用无水硫酸镁干燥，并在减压下浓缩以提供粗产物。通过快速柱色谱法(己烷∶DCM＝6:1)进一步纯化，得到7.12g黄色固体的中间体产物，产率为82％。将装有16.4mmol 1,4-双((5-溴戊基)氧基)苯和30mL Et

结构式(I)的结构鉴定：

核磁共振数据：

1

S-8；

式(I)化合物的

实施例2

实施例2提供了新型细胞核靶向的纳米粒子探针PNDP-F127的制备，其制备路线如图2所示，参考上述制备路线，包括以下步骤：

取50mM共轭聚合物Ⅰ的水溶液60μL于玻璃反应器中，加入磁子，加入3mL超纯水，称取0.01mmol 1,4-二偕胺肟苯溶于200μL的超纯水中，随后用1mL的无菌针式注射器吸取1,4-二偕胺肟苯的水溶液，安装在注射泵上，以5μL/s的流速注入玻璃反应器中，搅拌反应2h后称取0.29mmol Plurnoic-F127溶于200μL的超纯水中，随后用1mL的无菌针式注射器吸取Plurnoic-F127水溶液，安装在注射泵上，以5μL/s的流速注入玻璃反应器中，搅拌反应2h得到粗品细胞核靶向的纳米粒子水溶液。选取分子量为14000Da的半透膜将上述粗品进行透析纯化，装有纳米粒子水溶液的半透膜于2L烧杯中加入磁子，加入超纯水旋转透析，每隔4h换一次水，24h后透析结束，得到半粗品纳米粒子水溶液。将上述半粗品纳米粒子水溶液使用5mL无菌针式注射器吸取后通过0.22μm的针式过滤器得到纯品新型细胞核靶向的纳米粒子探针PNDP-F127。

实施例3

实施例3提供了新型细胞核靶向的纳米粒子探针PNDP-8K的制备，其制备路线如图2所示。

需要说明的是，本实施例与实施例2的区别在于两亲性表面活性剂种类的不同。

参考上述制备路线，包括以下步骤：

取50mM共轭聚合物Ⅰ的水溶液60μL于玻璃反应器中，加入磁子，加入3mL超纯水，称取0.01mmol 1,4-二偕胺肟苯溶于200μL的超纯水中，随后用1mL的无菌针式注射器吸取1,4-二偕胺肟苯的水溶液，安装在注射泵上，以5μL/s的流速注入玻璃反应器中，搅拌反应2h后称取0.49mmol PEG 8000溶于200μL的超纯水中，随后用1mL的无菌针式注射器吸取PEG8000的水溶液，安装在注射泵上，以5μL/s的流速注入玻璃反应器中，搅拌反应2h得到粗品细胞核靶向的纳米粒子水溶液。选取分子量为14000Da的半透膜将上述粗品进行透析纯化，装有纳米粒子水溶液的半透膜于2L烧杯中加入磁子，加入超纯水旋转透析，每隔4h换一次水，24h后透析结束，得到半粗品纳米粒子水溶液。将上述半粗品纳米粒子水溶液使用5mL无菌针式注射器吸取后通过0.22μm的针式过滤器得到纯品新型细胞核靶向的纳米粒子探针PNDP-8K。

工作原理：以下通过粒径分布试验、紫外吸收光谱、荧光光谱、CCK-8细胞毒性试验以及对Hela细胞细胞核染色的激光共聚焦成像试验来验证实施例2和实施例3所合成的纳米粒子探针的具体结构与实施效果。

试验例1粒径分布试验

将实施例2、3制得的纳米粒子探针水溶液分散在超纯水和PBS中，测得PNDP-F127和PNDP-8K在不同环境中(超纯水和PBS)的粒径分布如图3、4所示，可知PNDP-F127和PNDP-8K在不同的水溶液中均具有良好的分散性和单一粒径分布，PNDP-F127和PNDP-8K的平均粒径分别为134nm和140nm。

试验例2紫外吸收光谱

将实施例2、3制得的纳米粒子探针水溶液配置为1mM的PBS母液，把细胞核靶向的纳米粒子探针母液稀释为20μM的PBS溶液，扫描其紫外吸收值并绘制吸收曲线，实施例1的紫外吸收光谱如图5、图6所示。如图所示，实施例2和3有一个吸收峰，峰值接近在245nm附近。

试验例3荧光光谱

将实施例2、3制得的纳米粒子探针水溶液配置为1mM的PBS母液，把细胞核靶向的纳米粒子探针母液稀释为20μM的PBS溶液，测定其荧光光谱，得到其荧光发射曲线如图5、图6所示。在PBS溶液中，实施例2和3各自有一个最大发射峰，分别为545nm和570nm；可以看出，实施例2和3有着明显的斯托克斯位移，分别为295nm和330nm。

试验例4CCK-8细胞毒性试验

处于对数生长期的Hela细胞接种于96孔板中，每孔接种约10000个细胞，用含10％胎牛血清(FBS)、1％双抗的(青霉素-链霉素，1000KU/L)的DMEM(H)培养基在37℃和5％CO

试验例5对Hela细胞细胞核染色的激光共聚焦成像

将一定浓度的Hela细胞在35mm共聚焦培养皿培养过夜，用一定浓度的实施例2和3染色2h(1mL medium中加入1μL浓度为1mM的纳米粒子母液)，用1μL 0.5ug/ml DAPI染色0.5h后在激光共聚焦显微镜下用100％强度的激发光和发射滤光片对染料进行成像，结果如图8所示。由于纳米粒子探针中含有可以与DNA强力结合的1,4-二偕胺肟苯，所以该纳米粒子探针可以进行细胞核靶向，进行长时间的细胞核成像。此外该纳米粒子探针中的共轭聚合物具有较大的斯托克斯位移，较高的生物亲和性，使其具有背景荧光低，成像信噪比好，生物毒性小的优点。

本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。