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用于人类乳突病毒的DNA疫苗及其使用方法

文献发布时间：2024-04-18 19:58:30

技术领域

本发明涉及DNA疫苗，特别是针对HPV相关疾病的疫苗，更具体地，其涉及通过密码子优化来改良DNA疫苗。

背景技术

人类乳突病毒(Human papillomavirus,HPV)是在几种人类癌症中常见到的病原体，包括子宫颈癌、肛门癌、阴茎癌、阴门癌、阴道癌和头颈癌。目前针对HPV的疫苗，如

接种去氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid,DNA)疫苗是一种通过注射含有编码一种或多种抗原的DNA序列的基因工程质体来预防感染或治疗疾病的技术。在理论上，DNA疫苗比传统疫苗更具有优势，包括在制造上的安全性、速度和可预测性、温度稳定性、设计的灵活性、以及诱导更广泛的免疫反应类型的能力。尽管有着上述优点，但是一般来说，DNA疫苗在动物体内诱导强烈的抗原特异性免疫反应方面是具有困难的。举例来说，具有HPVE6和E7基因的DNA疫苗的免疫原性可能很差，因为病毒已经演化出了逃避宿主识别的机制，其包括E6/E7的低表现量。因此，用来增强DNA疫苗免疫原性的许多不同策略已经过了试验，其包括改进载体的设计、抗原密码子的优化、使用传统佐剂和分子佐剂、电穿孔(electroporation,EP)、分子佐剂的共同表现和首次接种-加强策略(L.Li andN.Petrovsky,Expert Rev Vaccines.2016；15(3):313-29)。

密码子的优化是指利用同义突变来增加所欲的基因(例如DNA疫苗中的抗原表现基因)的蛋白质表现的方法。然而，密码子的优化并非总是与DNA疫苗功效呈正相关。许多研究表明，稀有密码子可能并不总是为速率决定步骤，并且频繁使用的密码子也不能保证蛋白质产量的增加。此外，编码区不仅指定胺基酸序列，而且通常还包含重叠的遗传信息，其中包括可以影响蛋白质折叠的RNA二级结构。这表示同义密码子可能会改变蛋白质的构象和功能(L.Li and N.Petrovsky,Expert Rev Vaccines.2016；15(3):313-29,V.P.Mauroand S.A.Chappell,Methods Mol Biol.2018；1850:275-288)。因此，通过密码子的优化来增强DNA疫苗中编码抗原的表现可能会导致无法预料的有害结果，故需要仔细考虑。此外，更难以预测包含密码子优化序列的DNA疫苗是否可以达到所需的免疫原性。

有鉴于上述原因，提供一种疗效更好的DNA疫苗以治疗HPV相关疾病的需求尚未得到满足。然而，通过密码子优化来提高DNA疫苗针对HPV相关疾病的功效仍然是非常無法预测的，因此仍然是此领域中有待解决的问题。

发明内容

在本发明涉及的一些实施例中，提供一种DNA疫苗，其用于具有人类乳突病毒(human papillomavirus,HPV)相关疾病的个体。所述DNA疫苗可包括DNA构筑体，其包括融合基因。所述融合基因可为所述DNA构筑体的子片段，并且包括优化的HPV子序列，所述优化的HPV子序列编码至少一HPV抗原。所述优化的HPV子序列可包括以下一或多个:HPV-16E6表现基因，其记载于SEQ ID NO:1，HPV-16E7表现基因，其记载于SEQ ID NO:2，HPV-18E6表现基因，其记载于SEQ ID NO:3，以及HPV-18E7表现基因，其记载于SEQ ID NO:4。

在一些实施例中，所述融合基因可进一步包括编码免疫刺激剂的子序列。

在一些实施例中，所述免疫刺激剂可为70千道耳顿(kilodalton,kDa)的热休克蛋白(70kDa heat shock protein,HSP70)或人类钙网蛋白(human calreticulin(CRT)protein)。

在一些实施例中，所述优化的HPV子序列包括所述HPV-16E6、所述HPV-16E7、所述HPV-18E6和所述HPV-18E7表现基因，以及所述融合基因包括SEQ ID NO:5。

在一些实施例中，所述融合基因可进一步包括优化的信息序列，所述融合基因可包括SEQ ID NO:6。

本发明的另一方面提供一种治疗有HPV相关疾病的个体的方法。所述方法包括将前述的DNA疫苗施用于所述个体。

在一些实施例中，所述方法进一步包括将表现HPV-16和HPV-18的E6和E7的重组痘苗病毒(vaccinia virus)施用于所述个体，其中所述DNA疫苗作为首次接种疫苗(primingvaccine)施用于所述个体，所述表现HPV-16和HPV-18的E6和E7的重组痘苗病毒作为追加疫苗(boosting vaccine)施用于所述个体。

在一些实施例中，所述表现HPV-16和HPV-18的E6和E7的重组痘苗病毒是TA-HPV。

在一些实施例中，所述TA-HPV的给药剂量范围为1×10

在一些实施例中，所述DNA疫苗的给药剂量范围为每名个体100微克至每名个体20毫克。

附图说明

为了能够以详细理解本发明所记载特征的方式，可以通过参考实施方式对以上简要概括本发明进行更具体的描述，其中一些在实施方式被图式所绘示。然而，要注意的是，图式仅显示出了本发明的典型实施方式，因此不应被认为是对其范围的限制，因为本发明可以接受其他同样有效的实施方式。

图1是根据本发明的实施例呈现的DNA构筑体的示意图。

图2是西方点墨(western blot)图，其根据本发明的实施例呈现以pBI-1、pBI-10.1、pBI-11或pBI-12转染的人胚肾(Human Embryonic Kidney,HEK)293细胞中的HPV抗原表现量。

图3A及3B是长条图，其根据本发明的实施例比较对照组、pBI-10.1组、pBI-11组和pBI-12组的IFN-γ

图4A是根据本发明的实施例呈现的实验设计的示意图，其用于比较由各种DNA构筑体产生的HPV-16E7-特异性CD8

图4B是长条图，其根据本发明的实施例，比较每3×10

图5A是根据本发明的实施例呈现的体内肿瘤治疗实验的实验设计的示意图，其使用HPV-16E6/E7

图5B是长条图，其根据本发明的实施例呈现周边血液单核细胞(peripheralblood mononuclear cells,PBMCs)中HPV-16E7-特异性CD8

图5C是长条图，其根据本发明的实施例呈现PBMCs中HPV-18E6特异性CD8

图5D是曲线图，其根据本发明的实施例呈现在体内肿瘤治疗实验中未处理的小鼠和用pBI-10.1、pBI-11或pBI-12处理的小鼠中的TC-1肿瘤体积。

图5E是Kaplan-Meier存活曲线，其根据本发明的实施例呈现在体内肿瘤治疗实验中未处理的小鼠和用pBI-10.1、pBI-11或pBI-12处理的小鼠的存活率。

根据惯例，所描述的各种特征不是按比例绘制的，而是为了强调与本发明相关的特征而绘制的。相同的元件符号在整个图式和文本中表示相同的元件。

具体实施方式

以下将参考图式更全面地描述本发明，其中示出了本发明的示例性实施方式。然而，本发明可以以许多不同的形式体现，并且不应被解释为限制于此阐述的示例性实施方式。反而，提供这些示例性实施方式是为了使本发明详细且完整，并将本发明的范围充分传达给本领域通常知识者。相同的图式标号代表相同的元件。

本发明中的各词汇仅用于描述特定示例性实施方式，且并非限制本发明的内容。除非内文有特别指明，在此所使用的单数形式“一”以及“所述”也包含复数形式。本文使用的术语“包含”或“包括”或“具有”，是指明存在一特征、区域、整数、步骤、操作、元件、及/或组件，但不排除存在或添加更多其他特征、区域、整数、步骤、操作、元件、组件、及/或其群组。

除非另外定义，本文所使用的所有术语(包含技术及科学术语)可被具有本发明所属技术领域通常知识者理解成相同含义。还应当理解，所述术语，例如在常用词典中定义的那些，应被解释为具有与本发明相关技术的内文一致的意涵，除非在此明确定义，其将不会被解释为理想化或过于正式的意义。

本发明的DNA疫苗是提供给患有人乳突病毒(human papillomavirus,HPV)相关疾病的个体。患有HPV相关疾病的个体可以是患有但不限于疣、乳头状瘤、上皮内瘤变、阴茎癌、阴道癌、外阴癌、肛门癌、口咽癌、非黑色素瘤皮肤癌、结膜癌或宫颈癌的哺乳动物(例如，人类、小鼠等)。

DNA疫苗可以包括DNA构筑体，所述DNA构筑体含有融合基因，其中融合基因包括人乳突病毒(HPV)子序列，所述子序列的密码子被优化。DNA疫苗在本文所述的上下文中也可以称为优化的DNA疫苗。

可提供一种合成的融合基因，其包括至少一种密码子被优化的编码HPV抗原的子序列(例如优化的HPV子序列)。具体而言，优化的HPV子序列可以包括以下中的一种或多种:记载于SEQ ID NO:1的HPV-16E6表现基因，其编码HPV-16E6抗原；记载于SEQ ID NO:2的HPV-16E7表现基因，其编码HPV-16E7抗原；记载于SEQ ID NO:3的HPV-18E6表现基因，其编码HPV-18E6抗原，和记载于SEQ ID NO:4的HPV-18E7表现基因，其编码HPV-18E7抗原。

在一些实施例中，融合基因可以克隆到pNGVL4a质体，所述pNGVL4a质体是作为载体，以提供DNA构筑体，因此融合基因可以为DNA构筑体的一个子片段。在其他的实施例中，可用替代的和/或额外的质体提供本文所述的载体。

在一些实施例中，DNA疫苗还可以包括一成分，例如佐剂，以在接种疫苗的个体中产生更强的免疫反应。

在一些实施例中，DNA疫苗可以作为首次接种疫苗施打，并且表现HPV-16和HPV-18两者的E6和E7的重组痘苗病毒可以作为加强疫苗随后施打，以提供联合疗法，所述联合疗法可用于异源首次接种-加强方案(heterologous prime-boost regimen)以增强个体对于HPV相关疾病的免疫反应。例如，DNA疫苗的给药剂量范围为每名个体100微克至每名个体20毫克，表现HPV-16和HPV-18的E6和E7的重组痘苗病毒的给药剂量范围为1×10

在一些实施例中，表现HPV-16和HPV-18的E6和E7的重组痘苗病毒可以是TA-HPV。TA-HPV是一种重组痘苗病毒疫苗，其表现HPV16型和18型的致癌基因E6和E7。HPV-16和HPV-18致癌基因E6和E7可以在痘苗病毒Wyeth株基因体中的中性位点的p7.5和H6启动子控制下以头对头方向插入(L.K,Borysiewicz et al,Lancet.,1996Jun 1；347(9014):1523-7)。对于HPV-16和HPV-18基因，可以改变E6终止密码子以产生E6/E7融合开读框(open readingframe)，并引入定义的突变以使E7中的Rb结合位点失去活性。TA-HPV可在1×10

DNA疫苗的DNA构筑体的例子描述如下。图1绘示了四种不同的DNA构筑体(pBI-1、pBI-10.1、pBI-11和pBI-12)。每个DNA构筑体包括融合基因，所述融合基因包括编码信息肽的子序列(在图1中表示为“S”)、编码免疫刺激剂(例如，图1中的HSP70)的子序列和编码一个或多个HPV抗原的子序列(例如，HPV-16E7(或图1中的E7

在一些实施例中，pBI-1为包含融合基因的DNA构筑体，其具有记载于SEQ ID NO:8的核苷酸序列，所述融合基因包括:编码信息肽的子序列、编码HPV-16E7表现基因的“解毒”形式的HPV子序列，以及编码HSP70的子序列。术语“解毒”是指HPV致癌基因(例如，E6或E7)DNA通过突变修饰以表现无法进行致癌转化的蛋白质。在一些实施例中，pBI-10.1是包含融合基因的DNA构筑体，其具有记载于SEQ ID NO:7的核苷酸序列，所述融合基因包括:编码信息肽的子序列；编码“解毒”形式的HPV-16E7表现基因、“解毒”形式的HPV-18E7表现基因、“解毒”形式的HPV-16E6表现基因和“解毒”形式的HPV-18E6表现基因的HPV子序列；和编码HSP70的子序列。

为了增加HPV抗原的表现量并且进一步获得针对HPV相关疾病具有安全性和较高免疫原性的DNA疫苗，分别编码HPV-16E6、HPV-16E7、HPV-18E6和HPV-18E7的优化的HPV子序列可以通过突变和密码子优化设计来表现不能致癌转化的蛋白质。优化的HPV-16E6表现基因可以包括记载于SEQ ID NO:1的核苷酸序列。优化的HPV-16E7表现基因可以包括记载于SEQ ID NO:2的核苷酸序列。优化的HPV-18E6表现基因可以包括记载于SEQ ID NO:3的核苷酸序列。优化的HPV-18E7表现基因可以包括记载于SEQ ID NO:4的核苷酸序列。

DNA构筑体可被设计为包含融合基因，所述融合基因可包含编码至少一种HPV抗原的优化的HPV子序列，所述优化的HPV子序列是选自:记载于SEQ ID NO:1的HPV-16E6表现基因；记载于SEQ ID NO:2的HPV-16E7表现基因；记载于SEQ ID NO:3的HPV-18E6表现基因和记载于SEQ ID NO:4中的HPV-18E7表现基因。在一些实施例中，pBI-11具有记载于SEQ IDNO:5的核苷酸序列，其是包含融合基因的DNA构筑体，所述融合基因包括:编码信息肽的子序列；优化的HPV子序列，其编码SEQ ID NO:2所示的HPV-16E7表现基因、SEQ ID NO:4所示的HPV-18E7表现基因、SEQ ID NO:1所示HPV-16E6表现基因和SEQ ID NO:3所示的HPV-18E6表现基因；以及编码HSP70的子序列。在一些实施例中，pBI-12具有记载于SEQ ID NO:6的核苷酸序列，其是包含融合基因的DNA构筑体，所述融合基因包括:优化的信息序列，其编码信息肽；优化的HPV子序列，其编码SEQ ID NO:2所示的HPV-16E7表现基因、SEQ ID NO:4所示的HPV-18E7表现基因、SEQ ID NO:1所示的HPV-16E6表现基因和SEQ ID NO:3所示的HPV-18E6表现基因；以及编码HSP70的子序列。

实施例1:HPV DNA疫苗构筑体的设计和合成。

pBI-1DNA构筑体在先前已有相关描述，其为pNGVL4a-SigE7(detox)HSP70(C.Trimpleet al.Vaccine 2003,21:4036-4042)。在一实施例中，pBI-10.1DNA构筑体是来自Gibson assembly，其DNA片段是由Bio Basic(Markham,ON,Canada)合成的，所述片段编码融合蛋白，所述融合蛋白包含信息肽、HPV-16E7(detox)、HPV-18的E7(detox)、HPV-16E6(detox)和HPV-18E6(detox)以及HSP70的5’部分(至Tth111I位点)，其5’处为EcoRI和Kozak位点，3’处为Tth111I位点。将合成的DNA片段克隆到pBI-1中，替换EcoRI和Tth111I间的片段，并符合HSP70的读框(in frame with HSP70)。

与pBI-10.1类似，pBI-11DNA构筑体包括合成的DNA片段，其编码信息肽、HPV-16E7、HPV-18E7、HPV-16E6、HPV-18E6和HSP70的融合蛋白，但pBI-11中，HPV-16E7、HPV-18E7、HPV-16E6和HPV-18E6的表现基因进一步进行了密码子优化。pBI-12DNA构筑体也包括合成的DNA片段，其编码信息肽、HPV-16E7、HPV-18E7、HPV-16E6、HPV-18E6和HSP70的融合蛋白，但pBI-12中的信息肽、HPV-16E7、HPV-18E7、HPV-16E6和HPV-18E6表现基因都进一步进行了密码子优化。将pBI-11或pBI-12的合成DNA片段克隆到pBI-1中，以替换EcoRI和Tth111I间的片段，并符合HSP70的读框(in frame with HSP70)。

如图1所示，各个DNA构筑体的合成DNA片段中的基因要么对基因表现进行了优化(图1，片段101)，要么经过解毒而突变(图1，片段102)，要么为天然的乳突病毒序列(图1，片段103)。

实施例2:HPV抗原的表现量借由密码子优化而提高。

为了确定各个以DNA构筑体转染的细胞能适当的产生编码的抗原，而进行了西方点墨分析。用10微克(μg)的pBI-1、pBI-10.1、pBI-11或pBI-12DNA构筑体的其中之一转染HEK 293细胞。转染48小时后，收集细胞裂解物(cell lysates)以用于西方点墨法分析，其结果示于图2。pBI-1、pBI-10.1、pBI-11或pBI-12在预制Tris-HCl蛋白凝胶(LifeTechnology,Rockville,MD,USA)上分离，然后转移到硝酸纤维素膜(

结果如图2所示，所有DNA构筑体均显示融合蛋白表现出含有HPV-16E7抗原。与转染pBI-10.1的细胞相比，转染pBI-11和pBI-12的细胞有更高的HPV-16E7表现量，表示通过优化pBI-11和pBI-12中的HPV子序列成功提高了HPV-16E7的表现量。

此外，在以pBI-10.1、pBI-11或pBI-12转染的细胞中检测到HPV-16E6和/或HPV-18E6。相比之下，转染pBI-11和pBI-12的细胞中HPV-16E6和/或HPV-18E6的表现量高于转染pBI-10.1的细胞，表示优化pBI-11和pBI-12中的HPV子序列使细胞能够提高HPV-16E6和HPV-18E6表现量。

综合结果表明，pBI-11和pBI-12中优化的HPV子序列能够使得HPV抗原表现量升高。

实施例3:以pBI-11或pBI-12转染的细胞能够增强MHC I类分子对HPV抗原肽的呈现。

为了比较以pBI-10.1、pBI-11或pBI-12DNA构筑体转染的细胞的HPV抗原呈现能力，而进行了体外T细胞活化测定。

以pBI-10.1、pBI-11或pBI-12DNA构筑体转染293-D

结果如图3A和3B所示，与用pBI-10.1转染的细胞相比，用pBI-11或pBI-12转染的细胞能够活化更多的HPV-16E7肽(aa49-57)-特异性CD8

实施例4:pBI-11和pBI-12增强HPV-16E7-特异性CD8

为了比较接种pBI-10.1、pBI-11或pBI-12的小鼠的免疫反应，而进行体内T细胞活化检测(in vivo T cell activation assay)。

图4A是实验设计的示意图。给予6至8周大的雌性C57BL/6小鼠(从TaconicBiosciences(Germantown,NY)购买的)肌肉注射25微克(μg)/小鼠的pBI-1、pBI-10.1、pBI-11或pBI-12DNA构筑体，并以每隔7天，共3次的方式接种。在最后一次接种疫苗的一周后，收集脾细胞以用于分析CD8

结果如图4B所示，接种pBI-11和pBI-12的小鼠均显示出比接种pBI-10.1的小鼠显著更高的E7-特异性CD8

根据融合蛋白表现量和体内T细胞活化试验的数据，其显示出与转染pBI-10.1的细胞相比，转染pBI-11或pBI-12的细胞中HPV抗原的表现量增强了，这是由于密码子的优化有助于在接种疫苗的小鼠中对HPV抗原产生更有效的T细胞媒介的免疫反应。

实施例5:pBI-11DNA构筑体在表现HPV-16E6/E7的肿瘤模型(TC-1)中引发治疗性抗肿瘤反应。

为了解本发明的DNA构筑体产生针对HPV相关疾病的治疗性抗肿瘤作用的能力，而以HPV-16E6/E7

图5A是实验设计的示意图。在第0天，对6至8周大的雌性C57BL/6小鼠皮下注射2×10

在最后一次接种的一周后，收集PBMC以进行四聚体染色。关于四聚体染色，首先用纯化的抗-小鼠CD16/32染色小鼠的PBMC，然后用FITC-接合的抗-小鼠CD8a和PE-接合的HPV-16E7(aa 49-57)肽H-2D

每周两次通过触诊和数位卡尺测量肿瘤的生长情况。使用公式[最大直径×(垂直直径)

图5B和5C表明，与未处理的小鼠相比，以pBI-10.1处理的带有肿瘤的小鼠显示出HPV-16E7特异性和HPV-18E6特异性CD8

综上所述，与没有优化的HPV子序列的DNA疫苗相比，本发明的DNA疫苗具有优化的HPV子序列，其编码HPV-16E6(SEQ ID NO:1)、HPV-16E7(SEQ ID NO:2)、HPV-18E6(SEQ IDNO:3)和/或HPV-18E7(SEQ ID NO:4)，显著地诱导HPV抗原表现量提升和提高免疫反应。令人惊讶的是，本发明的优化的HPV子序列成功地实现了在体内更强的抗原特异性免疫反应，并进一步转化为更有效的抗肿瘤功效。

本领域技术人员将容易地观察到，在保有本发明的教示的同时，可以对装置和方法进行多种修改和改造。因此，上述发明应被解释为仅受所附申请专利范围的界线的限制。

序列表

<110>牧周•乔•马

<120>用于人类乳突病毒的DNA疫苗及其使用方法

<130>CN133032

<160>8

<170>PatentIn version 3.5

<210>SEQ ID NO:1

<211>459

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>优化的HPV16 E6(detox)DNA序列

<400>1

atgcaccaga agaggacagc catgttccag gacccccagg agcggccgag gaagctgccc60

caactgtgca ccgagctgca gacaaccatc cacgacatca tcctggagtg cgtgtactgc 120

aagcagcagc tgctgaggag agaggtctac gattttgcct ttagagacct gtgcattgtg 180

taccgggatg gcaacccata cgccgtgggg gataaatgtt tgaagtttta cagcaagatt 240

tctgagtaca gacattactg ttattccctg tacggaacta cactggagca gcagtacaac 300

aagcccctgt gcgatctgct gattagatgc attaacggcc agaagccact gtgccctgag 360

gagaagcaga gacatctgga taagaagcag cggttccata acattagagg aagatggaca 420

ggcaggtgca tgtcatgctg cagaagctcc aggaccagg459

<210>SEQ ID NO:2

<211>294

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>优化的HPV16 E7(detox)DNA序列

<400>2

atgcacgggg atacacccac actgcacgag tacatgctgg atctgcagcc cgagaccacc60

gacctgtacg gctacggcca gctgaacgat tccagcgagg aggaggatga gattgacggg 120

cccgccggcc aggccgagcc cgatagggcc cactacaaca tcgtgacatt ctgctgcaag 180

tgcgatagca ccctgaggct gtgcgtccag agcacccacg tggacatcag gacactggag 240

gacctgctga tgggcaccct ggggatcgtg gggcccatct gcagccagaa gccc 294

<210>SEQ ID NO:3

<211>459

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>优化的HPV18 E6(detox)DNA序列

<400>3

atgcaccaga agaggacagc catgttccag gacccccagg agcggccgag gaagctgccc60

caactgtgca ccgagctgca gacaaccatc cacgacatca tcctggagtg cgtgtactgc 120

aagcagcagc tgctgaggag agaggtctac gattttgcct ttagagacct gtgcattgtg 180

taccgggatg gcaacccata cgccgtgggg gataaatgtt tgaagtttta cagcaagatt 240

tctgagtaca gacattactg ttattccctg tacggaacta cactggagca gcagtacaac 300

aagcccctgt gcgatctgct gattagatgc attaacggcc agaagccact gtgccctgag 360

gagaagcaga gacatctgga taagaagcag cggttccata acattagagg aagatggaca 420

ggcaggtgca tgtcatgctg cagaagctcc aggaccagg459

<210>SEQ ID NO:4

<211>315

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>优化的HPV18 E7(detox)DNA序列

<400>4

atgcacggcc ctaaggccac cctgcaggac atcgtgctgc acctggagcc tcagaacgag60

atccccgtgg acctgctggg gcacggccag ctgtccgatt ccgaggagga gaacgatgag 120

attgacggag tgaaccacca gcacctgcct gctaggaggg ccgaacccca gcggcacaca 180

atgctgtgca tgtgttgcaa gtgtgaggcc cggatcgagc tggtggtgga gagctcagcc 240

gatgacctgc gggccttcca gcagctgttc ctgaacacac tgagctttgt ggggccctgg 300

tgcgccagcc agcag315

<210>SEQ ID NO:5

<211>3422

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223> pBI-11 DNA序列

<400>5

atggcggccc ccggcgcccg gcggccgctg ctcctgctgc tgctggcagg ccttgcacat60

ggcgcctcag cactctttga ggatctaatc atgcacgggg atacacccac actgcacgag 120

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ga 3422

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<213>人工序列

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