一种荧光标记粘土矿物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及环境功能材料和技术领域，尤其涉及一种荧光标记粘土矿物及其制备方法和应用。

背景技术

胶体粘土矿物(粒径为0.1～10μm)是土壤中的重要组成部分。由于粘土矿物具有较大的比表面积和丰富的表面电荷，其对土壤的离子吸附和交换具有重要的作用。同时，粘土矿物能够吸附污染物和营养元素，其在土壤中的迁移能够影响污染物和营养元素在土壤中的迁移和转化。当物理和化学条件适宜时，粒径较小的胶体粘土矿物会在土壤中发生迁移，携带污染物的粘土矿物可能会进一步污染地下水，而携带营养元素的粘土矿物发生迁移可能会造成养分的流失。研究粘土矿物在土壤中迁移对于土壤污染控制和修复以及养分元素生物的地球循环具有重要意义。

Wu等发现(Wu,S.,Liu,Y.,Bougoure,J.J.,et al.Organic matter amendmentand plant colonization drive mineral weathering,organic carbon sequestration,and water-stable aggregation in magnetite Fe ore tailings[J].EnvironmentalScience&Technology,2019,53(23):13720-13731)广泛存在于土壤中的粘土矿物不可避免地与土壤中的植物接触，但传统观点认为粘土矿物不能够直接被植物吸收利用。植物根系通过缠绕和吸附矿物，分泌小分子有机酸促进矿物颗粒的风化。Mitter(Mitter,N.,Worrall,E.,Robinson,K.et al.Clay nanosheets for topical delivery ofRNAi forsustainedprotection againstplant viruses.Nature Plants,2017,3:16207)研究表明，纳米级矿物颗粒可以通过叶面气孔进入植物体，喷施携带抗病毒RNA的纳米级层状矿物能够实现对植物的长效保护。此外，刘永红(刘永红.黏土/植酸酶复合物的制备及在饲料生产中的应用[D].淮阴工学院,2019.Gomes,C.S.F.,et al.Interactions of Clay and ClayMinerals with the Human Health[M].Minerals latu sensu and HumanHealth.Springer,2021.)认为由于粘土矿物具有结构特殊、稳定性好和价格便宜等优点，动物饲料中添加适量的粘土矿物可以为动物提供各类常量和微量元素，促进动物生长发育。粘土矿物由于具有较大的比表面积，且储量丰富、廉价易得，被大量应用于环境修复和生物医学等方面。但目前为止，植物能否吸收普遍存在于土壤中的粘土矿物颗粒仍不得而知。粘土矿物在动、植物体内的传输过程需要进一步探究。示踪矿物在动、植物体内的传输对于评估粘土矿物对生物和环境健康的影响是非常必要的。

荧光标记法是一种重要且常见的环境中颗粒物示踪技术，是研究颗粒物在动植物体内分布和富集的重要手段。此前的研究使用表面或层间吸附的方式将荧光标记物与矿物结合(Bur,A.J.,et al.Monitoring clay exfoliation during polymer/claycompounding using fluorescence spectroscopy[J].Transactions of the InstituteofMeasurement and Control,2007,29(5):403-416.)。但这种结合方式并不牢固，可能不适用于复杂生命体内的示踪研究。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种荧光标记粘土矿物及其制备方法和应用。本发明提供的荧光标记粘土矿物中矿物粘土和荧光物质结合牢固，能够用于复杂生命体体内示踪。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种荧光标记粘土矿物，包括粘土矿物和活化荧光物质；

所述粘土矿物和活化荧光物质通过硅烷试剂连接；

所述硅烷试剂为含氨基硅烷试剂；

所述活化荧光物质为连接有琥珀酰胺酯类化合物的荧光物质。

优选地，所述粘土矿物包括高岭石、蒙脱石和伊利石中的一种或多种。

优选地，所述含氨基硅烷试剂包括3-氨基丙基三甲氧基硅烷、3-氨基丙基三乙氧基硅烷、N-(2-氨乙基)-3-氨丙基三甲氧基硅烷或3-(2-氨基乙基氨基)丙基三甲氧基硅烷。

优选地，所述琥珀酰胺酯类化合物包括N-羟基琥珀酰亚胺酯、生物素-N-琥珀酰亚胺酯、5(6)-羧基荧光素-N-琥珀酰亚胺酯或丙烯酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯；所述琥珀酰亚胺酯类化合物和荧光染料通过共价键相连。

优选地，所述活化荧光物质的光谱范围为388nm～750nm。

本发明还提供了上述技术方案所述的荧光标记粘土矿物的制备方法，包括以下步骤：

将粘土矿物进行分散，得到粘土矿物分散液；

将所述粘土矿物分散液和硅烷试剂混合，进行硅烷化改性，得到改性粘土矿物；

将所述改性粘土矿物和活化荧光物质混合，进行酰胺化反应，得到所述荧光标记粘土矿物。

优选地，所述粘土矿物和硅烷试剂的用量比为5～10g：10～20mL；

所述硅烷化改性包括依次进行第一硅烷化改性和第二硅烷化改性；

所述第一硅烷化改性在搅拌回流的条件下进行，所述搅拌回流的搅拌速率为300～600r/min，时间为1～4小时；

所述第二硅烷化改性在室温搅拌的条件下进行，所述室温搅拌的时间为10～14小时。

优选地，所述粘土矿物和活化荧光物质的用量比为5～10g：200～600μg；

所述酰胺化反应的pH值为8～10，温度为20～40℃，时间为40～60小时。

本发明还提供了上述技术方案所述的荧光标记粘土矿物或上述技术方案所述的制备方法制得的荧光标记粘土矿物在示踪检测领域中的应用。

本发明提供了一种荧光标记粘土矿物，包括粘土矿物和活化荧光物质；所述粘土矿物和活化荧光物质通过硅烷试剂连接；所述硅烷试剂为含氨基硅烷试剂；所述活化荧光物质为连接有琥珀酰亚胺酯类化合物的荧光物质。本发明采用硅烷试剂将粘土矿物和活化荧光物质连接，相对于传统的标记技术，本发明的荧光标记粘土矿物中粘土矿物和活化荧光物质以共价键结合，这种稳固的结合方式可以确保荧光标记粘土矿物在复杂环境中活化荧光物质不易脱落并稳固在粘土矿物表面。

进一步地，本发明限定了所述含氨基硅烷试剂包括3-氨基丙基三甲氧基硅烷、3-氨基丙基三乙氧基硅烷、N-(2-氨乙基)-3-氨丙基三甲氧基硅烷或3-(2-氨基乙基氨基)丙基三甲氧基硅烷；本发明使用的硅烷试剂低毒，且活化荧光物具有生物相容性，两者结合使最终所得荧光标记粘土矿物可以运用到生物体内的粘土矿物的追踪。

附图说明

图1为实施例1所得荧光标记高岭石在可见光和荧光下的图片；

图2为实施例1所得荧光标记高岭石在激发波长610nm下的荧光光谱图；

图3为实施例1所得荧光标记高岭石和纯水的荧光强度随时间变化图；

图4为实施例1所得荧光标记高岭石的粒径分布图；

图5为实施例1所得荧光标记高岭石的zeta电位图；

图6为实施例2所得荧光标记蒙脱石在可见光和荧光下的图片；

图7为应用例1中荧光标记粘土矿物在砂土环境中的荧光显微镜图，其中，左图为荧光标记高岭石处理；右图为荧光标记蒙脱石处理；

图8为应用例2中用荧光标记高岭石追踪小麦根尖、侧根连接处和根基部中矿物分布的荧光显微镜图，其中，左图为根尖横切图，中图为侧根连接处横切图，右图为根基部横切图。

具体实施方式

本发明提供了一种荧光标记粘土矿物，包括粘土矿物和活化荧光物质；

所述粘土矿物和活化荧光物质通过硅烷试剂连接；

所述硅烷试剂为含氨基硅烷试剂；

所述活化荧光物质为连接有琥珀酰亚胺酯类化合物的荧光染料。

在本发明中，如无特殊说明，本发明所用原料均优选为市售产品。

本发明提供的荧光标记粘土矿物包括粘土矿物。在本发明中，所述粘土矿物优选包括高岭石、蒙脱石和伊利石中的一种或多种。

本发明提供的荧光标记粘土矿物包括活化荧光物质。在本发明中，所述活化荧光物质为连接有琥珀酰亚胺酯类化合物的荧光染料。在本发明中，所述琥珀酰亚胺酯类化合物优选包括N-羟基琥珀酰亚胺酯、生物素-N-琥珀酰亚胺酯、5(6)-羧基荧光素-N-琥珀酰亚胺酯或丙烯酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯。在本发明中，所述活化荧光物质的光谱范围优选为388nm～750nm。在本发明的具体实施例中，所述荧光染料具体优选为赛默飞世尔公司的Alexa Fluor

在本发明中，所述粘土矿物和活化荧光物质通过硅烷试剂连接；所述硅烷试剂为含氨基硅烷试剂。在本发明中，所述含氨基硅烷试剂优选包括3-氨基丙基三甲氧基硅烷、3-氨基丙基三乙氧基硅烷、N-(2-氨乙基)-3-氨丙基三甲氧基硅烷或3-(2-氨基乙基氨基)丙基三甲氧基硅烷，进一步优选为3-氨基丙基三乙氧基硅烷。

本发明还提供了上述技术方案所述的荧光标记粘土矿物的制备方法，包括以下步骤：

将粘土矿物进行分散，得到粘土矿物分散液；

将所述粘土矿物分散液和硅烷试剂混合，进行硅烷化改性，得到改性粘土矿物；

将所述改性粘土矿物和活化荧光物质混合，进行酰胺化反应，得到所述荧光标记粘土矿物。

本发明将粘土矿物进行分散，得到粘土矿物分散液。

在本发明中，所述粘土矿物的粒径优选为100nm～10μm。在本发明中，所述分散的试剂优选为醇溶剂，所述醇溶剂优选包括甲醇或乙醇。在本发明中，所述粘土矿物和分散的试剂的用量比优选为5～10g：20～40mL。

得到粘土矿物分散液后，本发明将所述粘土矿物分散液和硅烷试剂混合，进行硅烷化改性，得到改性粘土矿物。

在本发明中，所述粘土矿物和硅烷试剂的用量比优选为5～10g：10～20mL。

在本发明中，所述硅烷化改性优选包括依次进行第一硅烷化改性和第二硅烷化改性。在本发明中，所述第一硅烷化改性优选在搅拌回流的条件下进行，所述搅拌回流的搅拌速率优选为300～600r/min，进一步优选为400～500r/min；时间优选为2小时。所述第一硅烷化改性后，本发明优选还包括冷却至室温。在本发明中，所述第二硅烷化改性优选在室温搅拌的条件下进行，所述室温搅拌的时间为10～14小时。

所述硅烷化改性后，本发明优选还包括离心，将所得固体进行洗涤和再分散。在本发明中，所述洗涤的试剂优选为水，所述水优选为超纯水；所述洗涤的次数优选为3～6次。在本发明中，所述再分散的试剂优选为碳酸盐缓冲溶液；所述碳酸盐缓冲溶液的浓度优选为0.1～0.5mol/L；所述粘土矿物和碳酸盐缓冲溶液的用量比优选为5～10g：10～20mL。在本发明中，所述离心能够去除硅烷试剂。在本发明中，所述改性粘土矿物优选以改性粘土矿物分散液的形式存在。

得到改性粘土矿物后，本发明将所述改性粘土矿物和活化荧光物质混合，进行酰胺化反应，得到所述荧光标记粘土矿物。

在本发明中，所述粘土矿物和活化荧光物质的用量比优选为5～10g：200～600μg。

在本发明中，所述活化荧光物质优选以活化荧光物质溶液的形式使用，所述活化荧光物质溶液的浓度优选为10mg/mL。在本发明中，所述活化荧光物质溶液的溶剂优选为无水二甲基甲酰胺(DMF)或二甲亚砜(DMSO)。

在本发明中，所述酰胺化反应的pH值优选为8～10；温度优选为20～40℃；时间优选为40～60小时。在本发明中，所述酰胺化反应优选在振荡的条件下进行。

所述酰胺化反应后，本发明优选还包括依次进行离心纯化、洗涤和干燥。在本发明中，所述离心纯化的转速优选为6000r/min。在本发明中，所述洗涤的试剂优选为水，所述水优选为超纯水，所述洗涤的次数优选为5次。在本发明中，所述干燥的方式优选为冷冻干燥。

在本发明中，所述荧光标记粘土矿物优选以荧光标记粘土矿物分散液的形式使用，所述荧光标记粘土矿物分散液的浓度优选为100mg/mL。

本发明还提供了上述技术方案所述的荧光标记粘土矿物或上述技术方案所述的制备方法制得的荧光标记粘土矿物在示踪检测领域中的应用。

本发明对所述荧光标记粘土矿物的应用方式不做具体限定，本领域技术人员根据实际情况进行设置即可。

下面结合实施例对本发明提供的荧光标记粘土矿物及其制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

荧光标记高岭石的制备：

取5g高岭石(粒径为0.5～2μm)用20mL无水乙醇在三颈烧瓶中溶解，然后加入10mL3-氨基丙基三乙氧基硅烷，加上冷凝回流管，使用磁力搅拌器在450转/分钟的转速下进行搅拌回流2小时；冷却至室温后继续室温搅拌过夜；离心去除剩余的3-氨基丙基三乙氧基硅烷，用纯水清洗3遍，最后用10mL 0.1mol/L的碳酸盐缓冲溶液分散，加入30μL活化荧光物质溶液(浓度为10mg/mL，活化荧光物质为Alexa Fluor

对所得荧光标记高岭石进行性能测试：

对所得荧光标记高岭石进行显微镜观测：将荧光标记高岭石分散液滴加到载玻片上，使用激光共聚焦显微镜观察(激发波长：635nm)，结果参见图1，图1为所得荧光标记高岭石在可见光和荧光下的图片，图1中，左图为所得荧光标记高岭石在可见光下的图片，右图为所得荧光标记高岭石在荧光下的图片；从图1可以看出：荧光标记后的高岭石在激光共聚焦显微镜635nm的激发波长下具有很好的荧光特性。

测试荧光标记高岭石在指定波长范围内的荧光强度：使用荧光光谱仪测定荧光标记高岭石在激发光610nm下采集波长范围在600～800nm的荧光光谱图，结果参见图2，图2为所得荧光标记高岭石在激发波长610nm下的荧光光谱图，从图2可以看出：荧光标记高岭石在波长为620～650nm的范围内都具有较高的荧光强度。

使用荧光定量分析仪测定荧光标记高岭石的泄露情况，激发光源的中心波长为610nm，发射光源中心波长为690nm。使用纯水作为空白对照，将荧光标记高岭石超滤液与纯水进行比较，结果参见图3，图3为实施例1所得荧光标记高岭石和纯水的荧光强度随时间变化图，从图3可以看出：荧光标记高岭石的超滤液荧光强度与纯水无显著性差异，荧光标记高岭石具有很好的稳定性。

取100μL荧光标记高岭石分散液，稀释并定容到10mL离心管中，使用zeta电位仪测定荧光标记高岭石的水合粒径以及ζ电位，结果参见图4和图5。图4为所得荧光标记高岭石的粒径分布图，从图4可以看出：荧光标记矿物的水合粒径为962.4nm，PDI为0.225。图5为所得荧光标记高岭石的zeta电位图，从图5可以看出：荧光标记矿物Zeta电位为37.3±6.99mV。结果表明：荧光标记高岭石具有很好的分散性和稳定性。

实施例2

将实施例1中的高岭石替换为蒙脱石，其他步骤和参数重复实施例1，得到荧光标记蒙脱石。结果参见图6，图6为所得荧光标记蒙脱石在可见白光和荧光下的图片，图6中，左图为所得荧光标记蒙脱石在可见光下的图片，右图为所得荧光标记蒙脱石在荧光下的图片；从图6可以看出：荧光标记后的蒙脱石在激光共聚焦显微镜635nm的激发波长下具有很好的荧光特性，且荧光强度高于标记后的高岭石。

应用例1

荧光标记粘土矿物(荧光标记高岭石和荧光标记蒙脱石)用于示踪粘土矿物在石英砂中的迁移：

将荧光标记粘土矿物应用于研究微塑料对粘土矿物在石英砂(380～830μm)中迁移。通过土柱淋溶实验，获取不同情形下荧光矿物在砂柱中的滞留分布来分析其在多孔介质中的运移过程和影响机制。具体为：

选用内径为2.5cm，长度为20cm的透明(有机玻璃材质)填充柱，实验前编号并记录空填充柱重量；用0.01M NaOH和0.01M HCl分别浸泡石英砂24小时，然后超声30min，以去除吸附在石英砂表面的铁铝氧化物以及有机杂质等，最后用超纯水清洗至pH为中性，并在烘箱中(105℃)烘干备用。在填充柱中加入石英砂15cm，表面加入1g的荧光标记粘土矿物，尽可能保持表面平行且表面覆盖1cm石英砂，压实后称重，通过差值算出添加的石英砂的量，计算其孔隙率、孔隙体积。层析柱下端添加一层滤膜，以保证供液时溶液能均匀入渗到柱内，也可防止石英砂颗粒堵塞出水孔。完成填充后，通入超纯水4小时到填充柱中使其压实稳定。

使用蠕动泵以1mL/分钟的速度驱动淋滤液从土柱顶端流向土柱底端，来模拟强降雨过程(浓度为0.1mol/L含4.29μM H

在淋滤实验结束后开始静置土柱7天，然后分装土样。土柱厚度一共为20cm，从底端开始，每隔5cm取一段土样装入100mL玻璃瓶中，为避免破坏原始土层，最上层取0.3～1cm的土样，分别编号为10～15cm、5～10cm、1～5cm。

通过浮选法将荧光标记粘土矿物和石英砂分离，并使用激光共聚焦以及荧光光谱仪测定荧光标记粘土矿物在不同层以及淋滤液中的含量情况。

激光共聚焦显微镜显示石英砂层中部分荧光标记粘土矿物(10～15cm)的存在状态，如图7所示，图7为荧光标记粘土矿物在砂土环境中的荧光显微镜图，其中，左图为荧光标记高岭石处理；右图为荧光标记蒙脱石处理；从图7可以看出：荧光标记高岭石和荧光标记蒙脱石与石英砂发生异质团聚而影响其向地下迁移。

应用例2

荧光标记粘土矿物用于示踪粘土矿物在植物体内的迁移：

将实施例1中制备的荧光标记高岭石应用于追踪并定位植物对矿物颗粒的吸收研究。

以小麦为例，首先将小麦的种子在0.5％的次氯酸钠溶液浸泡消毒5分钟，然后用去离子水彻底清洗种子；室温下，在黑暗环境中萌发4天。将6株大小均匀的幼苗移入含有750mL营养液的培养盒中。

继续培养至小麦长出侧根(培养条件：光照/黑暗周期16/8小时，温度25±2℃，相对湿度65％)。然后更新营养液，并加入荧光标记高岭石分散液(500mg/L)继续培养。实验设置有荧光标记高岭石处理组和无荧光标记高岭石对照组，对照组用来扣除植物本身的自发荧光，每个处理设置两个重复。

24小时后用超纯水充分清洗干净小麦的根，取小麦的主根的根尖、侧根连接处和根基部，使用4％的琼脂包埋并使用振动切片机切出100μm厚度的半薄切片，使用激光共聚焦扫描显微镜在激发波长635nm下进行观察，每个样品至少重复3次。

通过共聚焦显微镜观察植物体内荧光标记高岭石的分布情况，如图8所示，图8为荧光标记高岭石追踪小麦根尖、侧根连接处和根基部中矿物分布的荧光显微镜图，其中，左图为根尖横切图，中图为侧根连接处横切图，右图为根基部横切图。从图8的左图可以看出：荧光标记高岭石仅粘附于小麦的根尖外表皮，并未进入根内；从图8的中图可以看出：荧光标记矿物出现在了小麦新生侧根的间隙中，说明荧光标记高岭石可以通过小麦的侧根间隙传递到植物体；从图8的右图可以看出，根基部维管柱中有微弱的荧光信号。这表明可以利用所制备的荧光标记高岭石示踪和研究植物对粘土矿物的吸收。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。