瓯柑提取物在制备预防和/或治疗酒精性肝损伤的药物中的应用

技术领域

本发明属于药物制备技术领域，具体涉及瓯柑提取物在制备预防和/或治疗酒精性肝损伤的药物中的应用。

背景技术

近年来，随着全球酒精消费量的增加，高危饮酒已成为世界卫生保健的第五大风险因素，对人体多个器官系统造成病理生理后果。其中，机体摄入的酒精约90％在肝脏中进行氧化代谢，因此肝脏是酒精受损的主要器官。酒精性肝损伤(alcoholic liver injury，ALI)是由于酒精所致肝细胞功能受损的动态病理过程，随着其病理变化过程的加重，酒精性肝损伤可逐渐发展为酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝纤维化和酒精性肝硬化，甚至肝细胞癌。酒精性肝损伤已然成为威胁我国国民健康的重要隐患。

铁过载和氧化应激是导致肝脏生理性损伤和病理性转变的主要诱因。铁死亡是新近发现的一种铁依赖性的、脂质过氧化物集聚诱导的、与凋亡、自噬和坏死等传统细胞死亡不同的细胞程序性死亡方式，铁代谢紊乱、脂质过氧化及SLC7A11-GSH-GPX4轴失衡是铁死亡发生的“三大标志”。氧化应激贯穿酒精性肝损伤的始终，乙醇代谢通过多种来源产生活性氧(ROS)，可与多种细胞成分发生反应，并导致脂质过氧化、DNA突变和酶失活，从而导致肝细胞发生损伤。此外，微生物组近年来在酒精性肝损伤领域也备受关注。除了降低胃肠道的屏障功能，酒精会导致肠道内的微生态失调，肠道微生物的变化通过引起肝脏炎症，改变胆汁酸等多种方式促进ALI的发生和发展。抵御铁死亡、缓解氧化应激及肠道微生物失调对于减轻肝脏组织损伤具有重要意义。

由于尚无特效治疗方法，ALI的防治原则还以戒酒和营养支持为主。在全球公共卫生面临挑战的背景下，深度挖掘和研究天然产物对ALI的临床治疗具有重要科学意义。但目前仍缺乏有效的防治酒精性肝损伤的天然产物药物。

发明内容

本发明的目的在于提供瓯柑提取物在制备预防和/或治疗酒精性肝损伤的药物中的应用。本发明从氧化应激、铁死亡、肠道微生物等多个角度进行评价，发现了瓯柑提取物缓解酒精性肝损伤的作用效果，瓯柑提取物能够实现酒精性肝损伤的预防和/或治疗。

本发明提供了瓯柑提取物在制备预防和/或治疗酒精性肝损伤的药物中的应用。

本发明还提供了瓯柑提取物在制备改善酒精性肝损伤患者健康状况的药物中的应用。

本发明还提供了瓯柑提取物在制备改善酒精所致肝脏病变的药物中的应用。

本发明还提供了瓯柑提取物在制备改善酒精诱导的肝细胞损伤的药物中的应用。

本发明还提供了瓯柑提取物在制备缓解酒精诱导的血清代谢紊乱的药物中的应用。

本发明还提供了瓯柑提取物在制备抵御酒精诱导肝脏铁死亡和/或缓解酒精诱导肝脏氧化应激的药物中的应用。

优选的是，所述抵御铁死亡包括调节铁死亡相关基因和/或铁死亡相关蛋白，所述缓解酒精诱导肝脏氧化应激包括调节氧化应激相关基因和/或氧化应激相关蛋白；所述铁死亡相关基因包括Gpx4、Chac1、Acsl4和Fth1；所述铁死亡相关蛋白包括SLC7A11、GPX4和ACSL4；所述氧化应激相关基因包括Nrf2、Keap1、Cul3、Hmox1和Nqo1；所述氧化应激相关蛋白包括NRF2。

本发明还提供了瓯柑提取物在制备抑制酒精诱导的肠道菌群紊乱的药物中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述瓯柑提取物的制备方法，包括以下步骤：

将瓯柑果皮进行冻干、研磨，得到瓯柑粉末；

将所述瓯柑粉末与体积百分含量为95％的乙醇水溶液混合，超声，离心，得到沉淀和上清液；再将沉淀与体积百分含量为95％的乙醇水溶液混合，超声，离心；再取沉淀重复所述混合、超声和离心一次，合并上清液，去除乙醇，得到水相液体；

将所述水相液体进行固相萃取去杂，浓缩，得到瓯柑提取物。

本发明还提供了上述技术方案所述制备方法制备得到的瓯柑提取物，所述瓯柑提取物包括：3种黄烷酮-O-糖苷和9种多甲氧基黄酮；所述3种黄烷酮-O-糖苷为橙皮苷、新橙皮苷和枸橘苷)、所述9种多甲氧基黄酮为异甜橙黄酮、单羟基五甲氧基黄酮、甜橙黄酮、四甲氧基异黄芩素、川陈皮素、四甲氧基野黄芩苷、5,4'-二羟基-3,7,8,3'-四甲氧基黄酮、橘皮素和5-去甲基川陈皮素。

本发明提供了瓯柑提取物在制备预防和/或治疗酒精性肝损伤的药物中的应用。目前尚未见瓯柑提取物防治酒精性肝损伤的报道。本发明通过构建酒精性肝损伤动物模型和细胞模型，从氧化应激、铁死亡、肠道微生物等多个角度进行评价，发现了瓯柑提取物缓解酒精性肝损伤的作用效果。试验结果表明，瓯柑提取物能够改善酒精性肝损伤患者健康状况，改善酒精所致肝脏病变，改善酒精诱导的肝细胞损伤，缓解酒精诱导的血清代谢紊乱，抵御酒精诱导肝脏铁死亡和/或缓解酒精诱导肝脏氧化应激，抑制酒精诱导的肠道菌群紊乱。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明提供的瓯柑提取物的UPLC液相色谱图；

图2为瓯柑提取物对酒精喂养小鼠健康状况的影响结果图；其中，A为体重变化结果图，B为摄食量变化结果图，C为饮水量变化结果图，D为肝脏系数结果图，E为肾脏指数结果图，F为脑质量指数结果图；

图3为本发明提供的瓯柑提取物对酒精喂养小鼠肝脏病变的影响结果图；

图4为本发明提供的瓯柑提取物对酒精喂养小鼠血清标志物的影响结果图；其中，A为瓯柑提取物对酒精喂养小鼠血清标志物ALT的影响结果图；B为瓯柑提取物对酒精喂养小鼠血清标志物AST的影响结果图；C为瓯柑提取物对酒精喂养小鼠血清标志物HDL-C的影响结果图；D为瓯柑提取物对酒精喂养小鼠血清标志物LDL-C的影响结果图；E为瓯柑提取物对酒精喂养小鼠血清标志物TC的影响结果图；F为瓯柑提取物对酒精喂养小鼠血清标志物TG的影响结果图；

图5为本发明提供的瓯柑提取物对酒精喂养小鼠肝脏氧化应激指标的影响图；其中，A为瓯柑提取物对酒精喂养小鼠肝脏氧化应激指标Fe的影响结果图；B为瓯柑提取物对酒精喂养小鼠氧化应激指标MDA的影响结果图；C为瓯柑提取物对酒精喂养小鼠氧化应激指标GSH的影响结果图；D为瓯柑提取物对酒精喂养小鼠氧化应激指标SOD的影响结果图；E为瓯柑提取物对酒精喂养小鼠氧化应激指标CAT的影响结果图；F为瓯柑提取物对酒精喂养小鼠氧化应激指标GSH-Px的影响结果图；

图6为本发明提供的瓯柑提取物对酒精喂养小鼠肝脏铁死亡和氧化应激相关基因的影响结果图；

图7为本发明提供的瓯柑提取物对酒精喂养小鼠肝脏铁死亡和氧化应激相关蛋白的影响结果图；

图8为本发明提供的瓯柑提取物对酒精诱导的肠道菌群紊乱的抑制作用结果图；

图9为本发明提供的瓯柑提取物对酒精诱导AML12细胞损伤的抑制作用结果图。

具体实施方式

本发明提供了瓯柑提取物在制备预防和/或治疗酒精性肝损伤的药物中的应用。‘瓯柑’(Citrus reticulata cv.Suavissima)是浙江省传统特色水果，属于芸香科柑橘属的一个栽培变种，已有两千多年的栽培历史。其天然类黄酮种类和含量丰富，且在民间具有祛热生津、化痰止咳、清凉解毒等特殊食药用功能，有较高的开发利用价值。本发明发现，瓯柑提取物具有预防和/或治疗就进行肝损伤的作用。

本发明还提供了瓯柑提取物在制备改善酒精性肝损伤患者健康状况的药物中的应用。酒精摄入导致肝脏系数明显异常，瓯柑提取物能够显著降低肝脏系数。实施例结果表明，瓯柑提取物能够显著改善酒精喂养小鼠的健康状况。

本发明还提供了瓯柑提取物在制备改善酒精所致肝脏病变的药物中的应用。酒精会导致肝脏色泽相对暗淡、偏黄，瓯柑提取物干预后，肝脏形态与健康肝脏相近；而且，瓯柑提取物干预后，酒精所致肝细胞结构紊乱明显得到改善，空泡减少，肝索排列整齐。

本发明还提供了瓯柑提取物在制备改善酒精诱导的肝细胞损伤的药物中的应用。实施例结果表明，与对照组相比，乙醇孵育导致AML12细胞培养液中ALT、AST的酶活力显著提高，细胞内SOD酶活力显著降低。而瓯柑提取物与乙醇共孵育时，可以有效抑制以上酶活力的改变，且具有浓度依赖效应。

本发明还提供了瓯柑提取物在制备缓解酒精诱导的血清代谢紊乱的药物中的应用。瓯柑提取物能显著缓解酒精导致的释放入血的ALT、AST活性的提高，对酒精诱导的ALI具有保护作用；瓯柑提取物干预后，酒精诱导ALI血清中的HDL-C含量显著上升，LDL-C、TC、TG含量显著下降，说明瓯柑提取物能够有效缓解酒精诱导的脂肪堆积和脂质代谢紊乱。

本发明还提供了瓯柑提取物在制备抵御酒精诱导肝脏铁死亡和/或缓解酒精诱导肝脏氧化应激的药物中的应用。肝脏生化指标检测发现，瓯柑提取物处理能显著抑制酒精诱导的肝脏铁离子的积累，降低MDA含量，提高GSH、SOD、CAT、GSH-Px等内源性抗氧化剂或抗氧化酶的活性，从而缓解酒精诱导的肝脏脂质过氧化和抗氧化系统损伤，这说明瓯柑提取物具有显著缓解酒精诱导肝脏氧化应激的作用。与此同时，实施例还证明，瓯柑提取物还能显著调节酒精喂养小鼠铁死亡和氧化应激相关基因，显著调节酒精喂养小鼠铁死亡和氧化应激相关蛋白。

在本发明中，所述抵御铁死亡优选包括调节铁死亡相关基因和/或铁死亡相关蛋白，所述缓解酒精诱导肝脏氧化应激优选还包括调节氧化应激相关基因和/或氧化应激相关蛋白；所述铁死亡相关基因包括Hmox1、Nqo1、Gpx4、Chac1、Acsl4和Fth1；所述铁死亡相关蛋白包括SLC7A11(又称xCT)、GPX4和ACSL4；所述氧化应激相关基因包括Nrf2、Keap1和Cul3；所述氧化应激相关蛋白包括NRF2。

本发明还提供了瓯柑提取物在制备抑制酒精诱导的肠道菌群紊乱的药物中的应用。瓯柑提取物进行干预能够不同程度地逆转酒精导致的以下变化：肠道菌群多样性降低，sobs指数、chao指数、shannon指数降低，simpson指数升高。在属水平进行物种差异分析，瓯柑提取物干预能显著提高Akkermansia、Lacotobacillus、Bifidobacterium等公认有益菌的丰度，同时对Enterococcus、Romboutsia、Faecalibaculum、unclassified_f__Lachnospiraceae、norank_f__norank_o__Clostridia_UCG-014、norank_f__Erysipelotrichaceae、Turicibacter、norank_f__Muribaculaceae、Bacillus等微生物均能产生正向调节作用。

本发明还提供了上述技术方案所述瓯柑提取物的制备方法，包括以下步骤：

将瓯柑果皮进行冻干、研磨，得到瓯柑粉末；

将所述瓯柑粉末与体积百分含量为95％的乙醇水溶液混合，超声，离心，得到沉淀和上清液；再将沉淀与体积百分含量为95％的乙醇水溶液混合，超声，离心；再取沉淀重复所述混合、超声和离心一次，合并上清液，去除乙醇，得到水相液体；

将所述水相液体进行固相萃取去杂，浓缩，得到瓯柑提取物。

本发明将瓯柑果皮进行冻干、研磨，得到瓯柑粉末。本发明对所述冻干和研磨的方法没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的冷冻干燥机和研磨仪进行操作即可。

得到瓯柑粉末后，本发明将所述瓯柑粉末与体积百分含量为95％的乙醇水溶液混合，超声，离心，得到沉淀和上清液；再将沉淀与体积百分含量为95％的乙醇水溶液混合，超声，离心；再取沉淀重复所述混合、超声和离心一次，合并上清液，去除乙醇，得到水相液体。在本发明中，瓯柑粉末的质量与体积百分含量为95％的乙醇水溶液的体积比优选为1g:20mL。在本发明中，所述超声的时间优选为30min，所述超声的频率优选为60kHz，所述超声的功率优选为30W。在本发明中，所述离心的条件优选为5000rpm离心8min。在本发明中，去除乙醇优选使用旋转蒸发仪进行。

得到水相液体后，本发明将所述水相液体进行固相萃取去杂，浓缩，得到瓯柑提取物。在本发明中，所述固相萃取去杂的条件优选为：2柱体积(Bed volume，BV)甲醇活化柱子，2BV双蒸水平衡柱子，0.75BV水相液体上样，20BV双蒸水去除糖酸等杂质，1BV色谱甲醇洗脱。本发明所述浓缩优选使用真空离心浓缩仪进行。在本发明中，所述浓缩时的温度优选为30℃。

本发明还提供了上述技术方案所述制备方法制备得到的瓯柑提取物，所述瓯柑提取物包括：3种黄烷酮-O-糖苷和9种多甲氧基黄酮；所述3种黄烷酮-O-糖苷为橙皮苷、新橙皮苷和枸橘苷)、所述9种多甲氧基黄酮为异甜橙黄酮、单羟基五甲氧基黄酮、甜橙黄酮、四甲氧基异黄芩素、川陈皮素、四甲氧基野黄芩苷、5,4'-二羟基-3,7,8,3'-四甲氧基黄酮、橘皮素和5-去甲基川陈皮素。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的瓯柑提取物在制备预防和/或治疗酒精性肝损伤的药物中的应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

提取方法：

取瓯柑鲜果果皮，液氮充分冻干后，在冷冻干燥机(Scientz-100F)中-80℃下干燥72h至恒重，所得干样利用研磨仪(MM 400，Retsch)研磨(30Hz，1.5分钟)至粉末状。称取100g粉末，按照料液比1：20加入95％乙醇，使用超声波清洗器超声30min(超声频率60kHz，功率30W)后，5000rpm离心8min，收集上清液。重复提取三次，将上清液进行汇总。使用旋转蒸发仪去除乙醇，用水溶液将梨形瓶中残留物质转移至离心管中，得到水相液体。使用

检测方法：

称取0.1g粗提物粉末溶于1mL色谱甲醇，充分溶解后使用微孔滤膜(0.22μmporesize)过滤后加入液相小瓶中。使用UPLC-MS/MS进行物质检测，检测方法如下：

UPLC检测条件如下：以Waters BEH C18(Acquity UPLC，2.1×150mm)液相色谱柱为固定相；流动相为含有1％甲酸的乙腈(流动相A)和含有1％甲酸的水(流动相B)。梯度洗脱程序为：0～5min，20％A；5～10min，20～27％A；10～15min，27％A；15～25min，27～40％A；25～35min，40～60％A；35～40min，60～80％A；40～42min，80～100％A；42～45min，100～20％A；45～52min，20％A。扫描波长为280和330nm，流速为1mL/min，柱温为25℃，进样体积为10μL。

质谱条件：使用UPLC-Triple-TOF 5600+飞行时间液质联用仪，采用正负离子扫描模式；扫描范围：m/z 100-1500；雾化气(GS1)：55psi；雾化气(GS2)：55psi；气帘气(CUR)：35psi；离子源温度(TEM)：600℃(正)550℃(负)；离子源电压(IS)：5500V(正)-4500V(负)；一级扫描：去簇电压(DP)：100V；聚焦电压(CE)：10V；二级扫描：使用TOF MS～ProductIon～IDA模式采集质谱数据，CID能量为40±20eV，进样前，用CDS泵做质量轴校正,使质量轴误差小于2ppm。

检测结果如表1和图1所示，图1为瓯柑提取物的UPLC液相色谱图，其中，图1中的上图为扫描波长280nm下的UPLC色谱图，图1中的下图为扫描波长330nm下的UPLC色谱图。

表1基于UPLC-MS/MS技术检测瓯柑提取物中的主要类黄酮成分

实施例2

瓯柑提取物具有显著改善酒精喂养小鼠健康状况的作用

实验方法：

本实施例旨在以6～8周龄雄性C57BL/6J小鼠为实验对象，评价瓯柑提取物(Ougan，OG)对酒精诱导ALI小鼠健康状况的改善作用。

酒精性肝损伤动物模型建立

6～8周龄的雄性C57BL/6J小鼠被安置在动物设施中，于SPF级环境中饲养，可自由获取饲料和饮用水，温度保持在22±2℃，光暗周期12h。试验前，让小鼠适应环境1周。适应期结束后，将小鼠随机分为3组，每组10只，保证各组间小鼠初始体重无显著性差异，具体分组如下：正常对照组(Control)，模型组(Model)，瓯柑提取物干预组(Ougan)。具体试验操作如下：

(1)第1～2周为预防性给药阶段：

a.对照组：灌胃纯净水；

b.模型组：灌胃纯净水；

c.瓯柑提取物干预组：灌胃瓯柑提取物，剂量为200mg/kg·BW/天。

(2)第3周为急性酒精性肝损伤造模阶段：

a.对照组：灌胃纯净水；

b.模型组：先灌胃纯净水，1h后灌胃50％(v/v)乙醇水溶液，剂量为12mL/kg·BW/天；

c.瓯柑提取物干预组：先灌胃瓯柑提取物，剂量为200mg/kg·BW/天，并在1h后灌胃50％(v/v)乙醇水溶液，剂量为12mL/kg·BW/天。

每天观察各组小鼠的健康状况、摄食、饮水是否有异常。每天定时灌胃，每3天称一次小鼠体重，每天的灌胃量根据其体重进行调节。试验结束的前一天，对小鼠进行禁食处理。试验结束当天，安乐死小鼠，及时解剖取小鼠重要脏器组织进行相关指标测定。

实验结果如图2所示，图2为瓯柑提取物对酒精喂养小鼠健康状况的影响结果图。

如图2所示，酒精摄入导致小鼠摄食量急剧减少，小鼠体重迅速下降，但对饮水量无显著影响(图2中的A，图2中的B，图2中的C)。同时，酒精摄入造成小鼠肝脏系数明显异常。与模型组相比，瓯柑提取物能显著降低肝脏系数(p<0.05)(图2中的D)。瓯柑提取物干预对肾脏指数、脑质量指数无显著影响，因此该提取物对小鼠无显著毒性(图2中的E，图2中的F)。以上结果说明，瓯柑提取物具有显著改善酒精喂养小鼠健康状况的作用。

实施例3

瓯柑提取物具有显著改善酒精喂养小鼠肝脏病变的作用

实验方法：

本实施例旨在以6～8周龄雄性C57BL/6J小鼠为实验对象，评价瓯柑提取物(Ougan，OG)对酒精诱导ALI小鼠肝脏病变的改善作用。动物实验造模方法和瓯柑提取物干预方法见实施例1。试验结束当天，安乐死小鼠，及时解剖取小鼠肝脏组织进行拍照和染色检测。

肝脏组织学分析

各组小鼠肝脏样本经4％多聚甲醛固定24～48h后，经梯度酒精脱水和二甲苯透明，浸蜡包埋。使用石蜡切片机进行切片，厚度在4～8μm左右。将切完后的组织切片放入载玻片上使用40℃温水浸泡使组织充分伸展后，放入二甲苯中脱蜡，再放入梯度乙醇中进行脱水透明。随后用苏木素和伊红(Hematoxylin and eosin，H&E)分别对肝细胞核和细胞质进行染色。先用苏木素染液充分染色10min，自来水漂洗，1％的盐酸酒精分化数秒，水洗后0.6％氨水返蓝，流水冲洗。然后将切片加入伊红染液充分染色3min，水洗终止染色，再经梯度酒精脱水和二甲苯透明，中性树胶封片。最后，染色好的玻片在显微镜下观察并拍照。

实验结果如图3所示，图3为瓯柑提取物对酒精喂养小鼠肝脏病变的影响结果图。

如图3所示，通过酒精喂养造模后，模型组肝脏色泽相对暗淡、偏黄，瓯柑提取物干预后的肝脏形态与对照组相近。H&E染色检测小鼠肝脏病理发现，模型组肝细胞排列紊乱，肝细胞水肿、细胞质稀疏，部分细胞有脂肪空泡，伴少量炎症细胞浸润。瓯柑提取物干预后，肝细胞结构紊乱明显得到改善，空泡减少，肝索排列整齐。以上结果说明，瓯柑提取物具有显著改善酒精喂养小鼠肝脏病变的作用。

实施例4

瓯柑提取物具有显著缓解酒精诱导的血清代谢紊乱的作用

实验方法：

本实施例旨在以6～8周龄雄性C57BL/6J小鼠为实验对象，评价瓯柑提取物(Ougan，OG)对酒精诱导ALI小鼠血清代谢紊乱的调节作用。动物实验造模方法和瓯柑提取物干预方法见实施例1。试验结束当天，安乐死小鼠，及时解剖小鼠并收集血清进行检测。

血清生化指标检测

血清标志物的检测按照丙氨酸氨基转移酶(谷丙转氨酶/ALT/GPT)测试盒(赖氏法)、天门冬氨酸氨基转移酶(谷草转氨酶/AST/GOT)测试盒(微板法)、甘油三酯(TG)测定试剂盒(单试剂GPO-PAP法)、总胆固醇(TC/TCH)测定试剂盒(单试剂GPO-PAP法)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)测定试剂盒(双试剂直接法)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)测定试剂盒(双试剂直接法)说明书进行操作(以上试剂盒均购自南京建成生物工程研究所)。

实验结果如图4所示。图4为瓯柑提取物对酒精喂养小鼠血清标志物的影响图。

如图4所示，血清标志物检测发现，与模型组相比，瓯柑提取物能显著缓解酒精导致的释放入血的ALT、AST活性的提高(p<0.05)(图4中的A，图4中的B)，这提示瓯柑提取物对酒精诱导的ALI具有保护作用。瓯柑提取物干预后，酒精诱导ALI小鼠血清中的HDL-C含量显著上升，LDL-C、TC、TG含量显著下降(p<0.05)，有效缓解酒精诱导的脂肪堆积和脂质代谢紊乱(图4中的C，图4中的D，图4中的E，图4中的F)。以上结果说明，瓯柑提取物具有显著缓解酒精诱导的血清代谢紊乱的作用。

实施例5

瓯柑提取物具有显著缓解酒精诱导肝脏氧化应激的作用

实验方法：

本实施例旨在以6～8周龄雄性C57BL/6J小鼠为实验对象，评价瓯柑提取物(Ougan，OG)对酒精诱导ALI小鼠肝脏氧化应激的调节作用。动物实验造模方法和瓯柑提取物干预方法见实施例1。试验结束当天，安乐死小鼠，及时解剖小鼠取肝脏组织进行检测。

肝脏生化指标检测

肝组织生理生化指标的检测按照铁(Fe)比色法试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技有限公司)、丙二醛(MDA)测定试剂盒(TBA法)、还原型谷胱甘肽(GSH)测定试剂盒(微板法)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)测试盒(羟胺法)、过氧化氢酶(CAT)测定试剂盒(可见光法)(钼酸铵法)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)测定试剂盒(比色法)(南京建成生物工程研究所)说明书进行操作。

实验结果如图5所示。图5为瓯柑提取物对酒精喂养小鼠肝脏氧化应激指标的影响图。

如图5所示，肝脏生化指标检测发现，与模型组相比，瓯柑提取物处理能显著抑制酒精诱导的肝脏铁离子的积累(图5中的A)，降低MDA含量(图5中的B)，提高GSH、SOD、CAT、GSH-Px等内源性抗氧化剂或抗氧化酶的活性(p<0.05)(图5中的C，图5中的D，图5中的E，图5中的F)，从而缓解酒精诱导的肝脏脂质过氧化和抗氧化系统损伤。以上结果说明，瓯柑提取物具有显著缓解酒精诱导肝脏氧化应激的作用。

实施例6

瓯柑提取物具有显著调节酒精喂养小鼠铁死亡和氧化应激相关基因的作用实验方法：

本实施例旨在以6～8周龄雄性C57BL/6J小鼠为实验对象，评价瓯柑提取物(Ougan，OG)对酒精诱导ALI小鼠肝脏铁死亡和氧化应激相关基因表达的调节作用。动物实验造模方法和瓯柑提取物干预方法见实施例1。试验结束当天，安乐死小鼠，及时解剖取小鼠肝脏组织。

定量PCR检测基因表达

称取5～30mg经液氮研磨成粉末的肝脏组织，使用Trizol法按照Easy RNAExtraction Kit说明书(浙江易思得生物科技有限公司)提取总RNA，使用

表2 qRT-PCR检测所用引物

实验结果如图6所示，图6为瓯柑提取物对酒精喂养小鼠肝脏铁死亡和氧化应激相关基因的影响结果图。

如图6所示，qRT-PCR结果显示，与对照组相比，酒精摄入显著影响了小鼠肝脏铁死亡相关基因(包括Gpx4、Chac1、Acsl4和Fth1)和氧化应激相关基因(包括Nrf2、Keap1、Cul3、Hmox1和Nqo1)的表达。口服饲喂瓯柑提取物进行干预，不仅对肝组织氧化应激通路具有积极的调节作用，包括上调Nrf2、Hmox1、Nqo1等抗氧化酶基因的表达，下调Keap1、Cul3基因的表达(p<0.05)；还能显著影响铁死亡通路关键基因的表达，包括上调Gpx4的表达，下调Chac1、Acsl4、Fth1等基因的表达(p<0.05)。以上结果说明，瓯柑提取物具有显著调节酒精喂养小鼠铁死亡和氧化应激相关基因的作用。

实施例6

瓯柑提取物具有显著调节酒精喂养小鼠铁死亡和氧化应激相关蛋白的作用

实验方法：

本实施例旨在以6～8周龄雄性C57BL/6J小鼠为实验对象，评价瓯柑提取物(Ougan，OG)对酒精诱导ALI小鼠肝脏铁死亡和氧化应激相关蛋白表达的调节作用。动物实验造模方法和瓯柑提取物干预方法见实施例1。试验结束当天，安乐死小鼠，及时解剖取小鼠肝脏组织。

免疫印迹法检测蛋白表达

称取100mg经液氮研磨成粉末的肝脏组织，使用10倍体积的NP40裂解液(含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂)在冰上对肝组织进行裂解，使用组织匀浆机获得肝脏匀浆，离心取上清，即蛋白提取物。所获提取物使用增强型BCA蛋白质测定试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)测定蛋白浓度，将蛋白提取物用裂解液稀释至浓度相同。向蛋白样品中加入loading buffer(使其终浓度为1X)，100℃煮沸5min使蛋白质变性，分装待测。使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对蛋白进行分离，并利用快速湿转仪将凝胶上的蛋白电转移至硝酸纤维素滤膜(PVDF膜)之上。然后使用封闭液进行膜封闭操作以降低显色背景，紧接着进行一抗孵育、洗膜、二抗孵育、洗膜，使抗体特异性地结合到相应的蛋白成分上，抗体稀释浓度见表3，其中β-Actin为内参。抗体孵育后使用ECL试剂盒(武汉赛维尔生物科技有限公司)对PVDF膜进行处理，即加入1：1的溶液A(鲁米诺)和溶液B(过氧化氢)，覆盖PVDF膜，通过放射自显影在凝胶成像系统下观察蛋白印迹和拍照。蛋白印迹照片使用Image Lab对蛋白条带灰度进行分析。

表3蛋白印迹实验所用抗体及稀释浓度

实验结果如图7所示。图7为瓯柑提取物对酒精喂养小鼠肝脏铁死亡和氧化应激相关蛋白的影响结果图。

如图7所示，Western blot检测发现，与对照组相比，酒精摄入显著影响了小鼠肝脏铁死亡和氧化应激相关蛋白的表达，这些蛋白包括SLC7A11(xCT)、GPX4、ACSL4和NRF2。口服饲喂瓯柑提取物进行干预能显著逆转以上蛋白表达的变化，包括上调酒精喂养小鼠肝组织中GPx4和xCT的表达(p<0.05)，下调ACSL4蛋白表达水平，并提高肝组织中抗氧化因子NRF2的表达(p<0.05)。以上结果说明，瓯柑提取物具有显著调节酒精喂养小鼠铁死亡和氧化应激相关蛋白的作用。

实施例8

瓯柑提取物具有显著抑制酒精诱导的肠道菌群紊乱的作用

实验方法：

本实施例旨在以6～8周龄雄性C57BL/6J小鼠为实验对象，评价瓯柑提取物(Ougan，OG)对酒精诱导ALI小鼠肝脏肠道菌群紊乱的调节作用。动物实验造模方法和瓯柑提取物干预方法见实施例1。试验结束当天，安乐死小鼠，及时解剖取小鼠肠道内容物。

肠道微生物多样性分析

各组样品经基因组DNA抽提、PCR扩增和荧光定量后，进行Illumina文库构建和Illumina高通量测序。将测序得到的PEreads进行样本拆分后，根据测序质量对双端Reads进行质控和过滤，同时根据双端Reads之间的overlap关系进行拼接，获得质控拼接之后的优化数据。然后使用QIIME2平台通过序列降噪方法(DADA2)处理优化数据，获得ASV(Amplicon Sequence Variant)代表序列和丰度信息。ASV分类学分析参考silva138/16s_bacteria数据库，采用classify-sklearn(Naive Bayes)物种注释方法。基于ASV代表序列及丰度信息，进行物种分类学分析、群落多样性分析，以及物种差异分析、相关性分析、系统发育分析和功能预测分析等一系列的统计学或可视化分析。其中，Alpha多样性主要用于研究样本中的群落多样性，sobs指数和chao指数反映群落丰富度(Community richness)、shannon指数和simpson指数反映群落多样性(Community diversity)。

实验结果如图8所示。图8为瓯柑提取物对酒精诱导的肠道菌群紊乱的抑制作用结果图。

如图8所示，细菌微生物多样性分析发现，酒精摄入导致小鼠肠道菌群多样性降低。与对照组相比，模型组的sobs指数、chao指数、shannon指数均显著降低，simpson指数显著升高，口服饲喂瓯柑提取物进行干预能够不同程度地逆转这些改变(p<0.05)(图8中的A)。在属水平进行物种差异分析可知，瓯柑提取物干预能显著提高Akkermansia、Lacotobacillus、Bifidobacterium等公认有益菌的丰度，同时对Enterococcus、Romboutsia、Faecalibaculum、unclassified_f__Lachnospiraceae、norank_f__norank_o__Clostridia_UCG-014、norank_f__Erysipelotrichaceae、Turicibacter、norank_f__Muribaculaceae、Bacillus等微生物均能产生正向调节作用(图8中的B)。以上结果说明，瓯柑提取物具有显著抑制酒精诱导的肠道菌群紊乱的作用。

实施例9

瓯柑提取物具有显著改善酒精诱导AML12肝细胞损伤的作用

实验方法：

本实施例旨在以小鼠正常肝细胞系AML12为实验对象，评价瓯柑提取物(Ougan，OG)对酒精诱导肝细胞损伤的改善作用。

细胞培养和活力测定

AML12细胞使用DMEM/F12完全培养基(含10％胎牛血清)置于恒温恒湿培养箱中培养(37℃，5％CO

酒精性肝损伤细胞模型建立

AML12细胞长至对数生长期后接种在6孔细胞培养板中，细胞密度为6×10

细胞生化指标测定

处理结束后收集细胞培养上清液和细胞，其中收集好的细胞沉淀用PBS清洗1～2次，再加入0.3～0.5mL 0.1M PH7.4的等渗PBS缓冲液悬浮细胞，超声破碎后待测。细胞培养液中ALT、AST以及细胞中SOD等酶活力的检测参考实施例4和实施例5，使用商业试剂盒检测，按照说明书进行。

实验结果如图9所示。其中，图9为瓯柑提取物对酒精诱导AML12细胞损伤的抑制作用结果图。

如图9所示，当处理浓度≤100μg/mL时，瓯柑提取物(OG)对小鼠正常肝细胞系AML12的细胞活性没有显著抑制作用，细胞活性均在90％以上。因此，在后续细胞实验中，本发明选择25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL作为提取物处理浓度。与对照组相比，200mM乙醇孵育24h导致AML12细胞培养液中ALT、AST的酶活力显著提高，细胞内SOD酶活力显著降低。而瓯柑提取物与乙醇共孵育时，可以有效抑制以上酶活力的改变，且具有浓度依赖效应。以上结果说明，瓯柑提取物具有显著改善酒精诱导AML12肝细胞损伤的作用。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。