一种生物酶法催化合成假尿苷的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种生物酶法催化合成假尿苷的方法。

背景技术

假尿苷又名5-Β-D-核呋喃基尿嘧啶，是最早发现且峰度最高的一种RNA修饰，被称为“第五个碱基”，广泛存在于包括信使RNA(mRNA)、转运RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、小核RNA(small nuclear RNA，snRNA)和小核仁RNA(small nucleolar RNAs，snoRNA)在内的多种RNA中。它是尿苷的5位核糖异构体，其碱基与核糖之间不是通过C-N键而是极性更低的C-C键相连，这种异构化既不影响经典的碱基互补配对，还使N1位成为了质子供体，能够在RNA中形成特殊的二级结构。因此，掺入了假尿苷的mRNA免疫原性明显降低，稳定性提高，半衰期更长且翻译效率更高。由此可见，假尿苷替代在mRNA疫苗生产中具有良好的研究和应用前景，其合成方法引起广泛关注。

目前假尿苷主要依靠化学方法进行合成，该类方法合成技术难度大，存在步骤多、耗时久、收率低、用到大量不安全的易燃易爆试剂以及环境污染较大等不足，而生物合成假尿苷则可在一定程度上解决上述问题。但化学酶法合成假尿苷的方法使用了高浓度盐酸在高温条件下制备酶反应底物核糖-5’-磷酸，该过程依然存在潜在的危险和环境不友好等问题。与上述方法相比，微生物发酵法环境友好、成本低廉等优势，但是依然存在培养周期长、生长负担重、纯化过程复杂等问题。

因此，本领域的技术人员致力于开发一种步骤少、纯化简单、产品纯、产率高的酶法催化合成假尿苷的方法，能大规模生产，且不涉及易燃易爆化学品。

发明内容

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是如何开发一种步骤少、纯化简单、产品纯、产率高的酶法催化合成假尿苷的方法，能大规模生产，且不涉及易燃易爆化学品。

为实现上述目的，本发明提供了一种生物酶法催化合成假尿苷的方法，包括以下步骤：

步骤1、以胞苷一磷酸为底物制备假尿苷单磷酸；

步骤2、将步骤1得到的假尿苷单磷酸在嘧啶-5’-核苷酸酶作用下生成假尿苷。

进一步地，嘧啶-5’-核苷酸酶为YjjG，其编码基因序列如SEQ ID No.10所示。

进一步地，步骤1包括分步制备法和一锅制备法；分步制备法为以胞苷一磷酸为底物制备核糖-5’-磷酸和尿嘧啶，利用核糖-5’-磷酸和尿嘧啶制备假尿苷单磷酸；制备核糖-5’-磷酸和尿嘧啶的方法包括第一单酶反应法和第一串联催化反应法；一锅制备法包括第二单酶反应法和第二串联催化反应法。

进一步地，第一单酶反应法的步骤为：

步骤1.1、胞苷一磷酸经胞苷一磷酸水解酶作用生成核糖-5’-磷酸和胞嘧啶；

步骤1.2、反应体系为：Tris-Cl，pH7.0～8.0，步骤1.1得到的胞嘧啶，并加入终浓度为5μM的脱氨酶，37℃反应后得到含有尿嘧啶的反应液。

进一步地，第一串联催化反应法的步骤为：以胞苷一磷酸作为底物，使用胞苷一磷酸水解酶和脱氨酶一锅反应制备尿嘧啶，反应体系如下：Tris-Cl pH 7.0～8.0，胞苷一磷酸，并加入胞苷一磷酸水解酶和脱氨酶，37℃反应得到含有尿嘧啶的反应液。

进一步地，胞苷一磷酸水解酶为BlsM，其编码基因序列如SEQ ID No.1所示，脱氨酶为CodA，其编码基因序列如SEQ ID No.2所示。

进一步地，第二单酶反应法的步骤为：取含有尿嘧啶的反应液，分别加入假尿苷-5’-磷酸糖苷酶和MnCl

进一步地，第二串联催化反应法的步骤为：以胞苷一磷酸作为底物，使用胞苷一磷酸水解酶、脱氨酶和假尿苷-5’-磷酸糖苷酶一锅反应制备假尿苷单磷酸，反应体系如下：Tris-Cl pH 7.0～8.0，MnCl

进一步地，假尿苷-5’-磷酸糖苷酶为YeiN，其编码基因序列如SEQ ID No.7所示。

进一步地，步骤2还包括：将含有假尿苷单磷酸的反应液，分别加入嘧啶-5’-核苷酸酶和MnCl

进一步地，加入嘧啶-5’-核苷酸酶的终浓度为5μM。

进一步地，一种酶法催化合成假尿苷的方法，包括以下步骤：

步骤1)胞苷一磷酸经胞苷一磷酸水解酶作用生成核糖-5’-磷酸和胞嘧啶；

步骤2)制备尿嘧啶，即将步骤1得到的胞嘧啶在脱氨酶的作用下转化为尿嘧啶；

步骤3)制备假尿苷单磷酸，即将步骤2得到的尿嘧啶和步骤1得到的核糖-5’-磷酸在假尿苷-5’-磷酸糖苷酶作用下生成假尿苷单磷酸；

步骤4)步骤3得到的假尿苷单磷酸在嘧啶-5’-核苷酸酶作用下生成假尿苷。

进一步地，胞苷一磷酸水解酶为BlsM，其氨基酸序列如WP_208870406.1(NCBI登录号)所示。

进一步地，脱氨酶为CodA，其氨基酸序列如AKK16692.1(NCBI登录号)所示。

进一步地，假尿苷-5’-磷酸糖苷酶为YeiN，其氨基酸序列如AAC75226.1(NCBI登录号)所示。

进一步地，嘧啶-5’-核苷酸酶为YjjG，其氨基酸序列如AAC77327.1(NCBI登录号)所示。

进一步地，胞苷一磷酸与胞苷一磷酸水解酶反应温度为37℃，反应时间为1h～12h，反应pH为7.0～8.0。

进一步地，胞嘧啶与脱氨酶反应的温度为37℃，反应时间为1h～12h，反应pH为7.0～8.0。

进一步地，尿嘧啶、核糖-5’-磷酸和假尿苷-5’-磷酸糖苷酶反应的温度为37℃，反应时间为1h～12h，反应pH为7.0～8.0，该反应中加入MnCl

进一步地，假尿苷单磷酸与嘧啶-5’-核苷酸酶的反应温度为37℃，反应时间为1h～12h，反应pH为7.0～8.0,该反应中加入MnCl

优选为pH 7.5。

进一步地，目的产物假尿苷结构式如下：

进一步地，一种酶法催化合成假尿苷的方法包括：将胞苷一磷酸(CMP)在胞苷一磷酸水解酶的作用下生成核糖-5’-磷酸(R5P)和胞嘧啶(C)，后者在脱氨酶的作用下转化为尿嘧啶(U)，两步反应产物R5P和U经假尿苷-5’-磷酸糖苷酶催化形成假尿苷中间体化合物假尿苷单磷酸(psiMP)，并经嘧啶-5’-核苷酸酶催化反应得到终产物假尿苷。

进一步地，胞苷一磷酸水解酶来源于Streptomyces属细菌、Saccharothrix属细菌、Kitasatospora属细菌、Archangium属细菌、Paenibacillus属细菌；

优选来源于Streptomyces griseochromogenes、Streptoverticilliumrimofaciens、Saccharothrix sp.ST-888、Kitasatospora purpeofusca、Archangiumviolaceum或Paenibacillus apiarius。

进一步地，胞苷一磷酸水解酶来源于Streptomyces griseochromogenes，其氨基酸序列如WP_208870406.1(NCBI登录号)所示。

进一步地，假尿苷-5’-磷酸糖苷酶来源于Escherichia属细菌、Shigella属细菌、Klebsiella属细菌、Citrobacter属细菌。

优选来源于Escherichia coli、Shigella sonnei、Klebsiella oxytoca、Citrobacter koseri。

进一步地，假尿苷-5’-磷酸糖苷酶来源于Escherichia coli str.K-12，其氨基酸序列如AAC75226.1(NCBI登录号)所示。

进一步地，嘧啶-5’-核苷酸酶来源于Escherichia属细菌。

优选来源于Escherichia coli。

进一步地，嘧啶-5’-核苷酸酶来源于Escherichia coli str.K-12，其氨基酸序列如AAC77327.1(NCBI登录号)所示。

进一步地，胞苷一磷酸和胞苷一磷酸水解酶反应的温度为37℃。

进一步地，反应时间为0.5～4h，优选为1h或2h。

进一步地，反应pH为7.0～8.0，优选为pH 7.5。

进一步地，胞嘧啶与脱氨酶反应的温度为37℃。

进一步地，反应时间为10min～4h，优选为10min～1h。

进一步地，反应pH为7.0～8.0，优选为pH 7.5。

进一步地，胞苷一磷酸、胞苷一磷酸水解酶与脱氨酶串联催化反应的温度为37℃。

进一步地，反应时间为10min～2h，优选为10min～1h。

进一步地，反应pH为7.0～8.0，优选为pH 7.5。

进一步地，尿嘧啶、核糖-5’-磷酸和假尿苷-5’-磷酸糖苷酶反应的温度为37℃。

进一步地，反应时间为1h～12h，优选为3h～12h。

进一步地，反应pH为7.0～8.0，优选为pH 7.5。

进一步地，反应在MnCl

进一步地，胞苷一磷酸、胞苷一磷酸水解酶、脱氨酶与假尿苷-5’-磷酸糖苷酶串联催化反应的温度为37℃。

进一步地，反应时间为1h～12h，优选为3h～12h。

进一步地，反应pH为7.0～8.0，优选为pH 7.5。

进一步地，反应在MnCl

进一步地，假尿苷单磷酸与嘧啶-5’-核苷酸酶的反应温度为37℃。

进一步地，反应时间为1h～12h，优选为2h～6h。

进一步地，反应pH为7.0～8.0，优选为pH 7.5。

进一步地，反应在MnCl

在本发明的较佳实施方式1中，详细说明了酶法催化合成假尿苷的技术路线；

在本发明的较佳实施方式2中，详细说明了生物酶的制备过程；

在本发明的另一较佳实施方式3中，详细说明了核糖-5’-磷酸和胞嘧啶的制备过程；

在本发明的另一较佳实施方式4中，详细说明了尿嘧啶的制备过程；

在本发明的另一较佳实施方式5中，详细说明了假尿苷单磷酸的制备过程；

在本发明的另一较佳实施方式6中，详细说明了假尿苷的制备过程。

本发明有益的技术效果如下：

本发明采用生物酶法合成假尿苷，利用生物酶的催化反应原理，设计全新的假尿苷生产路线。过程中多步反应可一锅进行，整体步骤少；纯化过程简单，产品较纯；未涉及易燃易爆化学品，采用常规实验模式微生物完成实验，使用接近体温的温度完成实验，环境友好，对社会无危害。

胞苷一磷酸为常见化合物，市面价格便宜。本发明以胞苷一磷酸作为反应底物生成假尿苷，而假尿苷及其衍生物又是制备mRNA疫苗的重要原料，因此本申请提供的方法应用于制备mRNA疫苗的原料，大幅降低生产成本。

以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

附图说明

图1是本发明的一个较佳实施例1的酶法催化合成假尿苷的技术路线示意图；

图2是本发明的一个较佳实施例3的胞苷一磷酸被BlsM水解为胞嘧啶和核糖-5’-磷酸的HPLC检测色谱图；

图3是本发明的一个较佳实施例4的胞嘧啶被CodA转化为尿嘧啶的HPLC检测色谱图；

图4是本发明的一个较佳实施例4的胞苷一磷酸在BlsM和CodA一锅反应后转化为尿嘧啶的HPLC检测色谱图；

图5是本发明的一个较佳实施例5的YeiN反应生成假尿苷单磷酸的HPLC检测色谱图；

图6是本发明的一个较佳实施例5的胞苷一磷酸被BlsM、CodA和YeiN一锅反应后转化为假尿苷单磷酸的HPLC检测色谱图；

图7是本发明的一个较佳实施例6的YjjG反应生成假尿苷以及纯化后样品的HPLC检测色谱图。

具体实施方式

以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。

实施例1酶法催化合成假尿苷的技术路线

酶法催化合成假尿苷的技术路线图如图1所示，酶法催化合成假尿苷的方法，包括以下步骤：(1)胞苷一磷酸在胞苷一磷酸水解酶的作用下生成核糖-5’-磷酸和胞嘧啶；(2)胞嘧啶在脱氨酶存在的条件下生成尿嘧啶；(3)核糖-5’-磷酸和尿嘧啶在假尿苷-5’-磷酸糖苷酶存在的条件下反应，生成假尿苷单磷酸；(4)假尿苷单磷酸在嘧啶-5’-核苷酸酶存在的条件下反应，生成假尿苷。其中胞苷一磷酸水解酶为BlsM，脱氨酶为CodA，假尿苷-5’-磷酸糖苷酶为YeiN，嘧啶-5’-核苷酸酶为YjjG。

实施例2酶的制备

2.1胞苷一磷酸水解酶BlsM的制备

blsM的基因序列见SEQ ID No.1，以Streptomyces griseochromogenes基因组为模板，使用如下引物添加NdeI和XhoI酶切位点并扩增获得blsM的基因片段：

blsM-F：GCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGAACGTCATCAGCAGTGCGTCGGAGTCCGTC(SEQID NO:2)

blsM-R：TCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTCAGGGCGTTGCGGCCGGGTTGTTCAC(SEQID NO:3)

用NdeI和XhoI双酶切pET28a质粒获得载体片段。用胶回收试剂盒(OMEGA)回收片段blsM和载体pET28a后，使用同源重组试剂盒(诺唯赞)获得重组质粒pET28a-blsM，重组质粒经测序验证。

在大肠杆菌宿主BL21(DE3)中进行BlsM蛋白的异源表达。挑取携带表达载体的单克隆至含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，培养条件为37℃、220rpm，培养至OD600＝0.6-0.8后降温至16℃，并添加IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)至终浓度为0.2mM。再在16℃、220rpm培养条件下培养20小时诱导蛋白表达。

培养结束后，收集菌体，使用细胞压力破碎仪破碎菌体，通过镍柱亲和层析和分子筛纯化得到目的蛋白，并用Bradford蛋白浓度测定试剂盒进行定量，保存到-80℃冰箱中。

2.2脱氨酶CodA的制备

codA的基因序列见SEQ ID No.4，以Escherichia coli K12基因组为模板，使用如下引物添加NdeI和XhoI酶切位点并扩增获得codA的基因片段：

codA-F：GCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGTCGAATAACGCTTTACAAACAATT(SEQ ID NO:5)

codA-R：TCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTCAACGTTTGTAATCGATGGCTTCTGG(SEQ IDNO:6)

用NdeI和XhoI双酶切pET28a质粒获得载体片段。用胶回收试剂盒(OMEGA)回收片段codA和载体pET28a后，使用同源重组试剂盒(诺唯赞)获得重组质粒pET28a-codA，重组质粒经测序验证。

脱氨酶CodA的表达、纯化与浓度测定同2.1。

2.3假尿苷-5’-磷酸糖苷酶YeiN的制备

yeiN的基因序列见SEQ ID No.7，以Escherichia coli K12基因组为模板，使用如下引物添加NdeI和XhoI酶切位点并扩增获得yeiN的基因片段：

yeiN-F：GGTGCCGCGCGGCAGCCATATGAGCGAACTGAAAATTAGCC(SEQ ID NO:8)

yeiN-R：GGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTAGCCCGCCAGGCGCTGATATT(SEQ ID NO:9)

用NdeI和XhoI双酶切pET28a质粒获得载体片段。用胶回收试剂盒(OMEGA)回收片段yeiN和载体pET28a后，使用同源重组试剂盒(诺唯赞)获得重组质粒pET28a-yeiN，重组质粒经测序验证。

假尿苷-5’-磷酸糖苷酶YeiN的表达、纯化与浓度测定同2.1。

2.4嘧啶-5’-核苷酸酶YjjG的制备

yjjG的基因序列见SEQ ID No.10，以Escherichia coli K12基因组为模板，使用如下引物添加NdeI和XhoI酶切位点并扩增获得yjjG的基因片段：

yjjG-F：GCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGAAGTGGGACTGGATTTTCTTTGATG(SEQ ID NO:11)

yjjG-R：TCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTTACACAGGAGCTGCTCCAGTTCG(SEQ ID NO:12)

用NdeI和XhoI双酶切pET28a质粒获得载体片段。用胶回收试剂盒(OMEGA)回收片段yjjG和载体pET28a后，使用同源重组试剂盒(诺唯赞)获得重组质粒pET28a-yjjG，重组质粒经测序验证。

嘧啶-5’-核苷酸酶YjjG的表达、纯化与浓度测定同2.1。

实施例3核糖-5’-磷酸和胞嘧啶的制备

制备核糖-5’-磷酸和胞嘧啶的反应体系如下：50mM Tris-Cl pH 7.5，1mM CMP，并加入终浓度为5μM的实施例2.1制备的胞苷一磷酸水解酶BlsM。37℃反应一小时后，取样200μL，95℃加热15min猝灭反应并将蛋白沉淀，离心后取上清经0.22μm滤膜过滤后使用HPLC检测，以市售的胞苷一磷酸和胞嘧啶为对照。胞苷一磷酸被BlsM水解为胞嘧啶和核糖-5’-磷酸的HPLC检测结果如图2所示，样品中的胞苷一磷酸被完全水解并转化为核糖-5’-磷酸和胞嘧啶。

HPLC分析条件如下：

仪器：安捷伦公司，Agilent Technologies 1260Infinity；

色谱柱：安捷伦公司，ZORBAX SB-C18(4.6×250mm,5μM)；

检测波长：262nm；

流速：0.5mL/min；

流动相A：10mM三氯乙酸水溶液；

流动相B：色谱级甲醇；

洗脱梯度：10％流动相B等梯度洗脱15min。

实施例4尿嘧啶的制备

4.1CodA单酶反应

CodA制备尿嘧啶的反应体系如下：50mM Tris-Cl pH 7.5，1mM胞嘧啶，并加入终浓度为5μM的实施例2.2制备的脱氨酶CodA。37℃反应10min～1h后，取样200μL，95℃加热15min猝灭反应并将蛋白沉淀，离心后取上清经0.22μm滤膜过滤后使用HPLC检测，以市售的胞嘧啶和尿嘧啶为对照。胞嘧啶被CodA转化为尿嘧啶的HPLC检测结果如图3所示，样品中的胞嘧啶在10min即可被完全反应为尿嘧啶。HPLC检测方法同实施例3。

4.2BlsM和CodA串联催化反应

以胞苷一磷酸作为底物，使用BlsM和CodA一锅反应制备核糖-5’-磷酸和尿嘧啶的反应体系如下：50mM Tris-Cl pH 7.5，1mM CMP，并加入终浓度为5μM的实施例2.1和2.2制备的胞苷一磷酸水解酶BlsM和脱氨酶CodA。37℃反应1h后，取样200μL，95℃加热15min猝灭反应并将蛋白沉淀，离心后取上清经0.22μm滤膜过滤后使用HPLC检测，以市售的尿嘧啶为对照。胞苷一磷酸在BlsM和CodA一锅反应后转化为尿嘧啶的HPLC检测结果如图4所示，样品中的胞苷一磷酸被完全反应为尿嘧啶。HPLC检测方法同实施例3。

实施例5假尿苷单磷酸的制备

5.1YeiN单酶反应

取实施例4.2中反应液1mL，分别加入终浓度为5μM的实施例2.3制备的假尿苷-5’-磷酸糖苷酶YeiN和1mM MnCl

5.2BlsM+CodA+YeiN串联催化反应

以胞苷一磷酸作为底物，使用BlsM、CodA和YeiN一锅反应制备假尿苷单磷酸反应体系如下：50mM Tris-Cl pH 7.5，1mM MnCl

实施例6假尿苷的制备

取实施例5.1或5.2中反应液1mL，分别加入终浓度为5μM的实施例2.4制备的嘧啶-5’-核苷酸酶YjjG和1mM MnCl

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。