用于检测活性氧的染液、试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及检测试剂领域，尤其是涉及一种用于检测活性氧的染液、试剂盒及其应用。

背景技术

细胞在有氧呼吸的过程中，一部分氧不能被完全还原，生成了具有强氧化作用的活性氧(reactive oxygen species，ROS)，包括超阴离子、羟自由基、过氧化氢等，同时细胞内存在一套抗氧化酶类，包括超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶等能够清除代谢过程中不断产生的ROS，使细胞内ROS的水平处于一个相对稳定的状态。当细胞内的ROS水平失衡，ROS可引起脂类的过氧化，蛋白质的变性，DNA的断裂等等，可参与一系列炎症和变性疾病的形成。

活性氧ROS检测可以利用荧光探针进行检测。如DCFH-DA(2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯)本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH(2',7'-二氯二氢荧光素)生成有荧光的DCF(氧化型二氯荧光黄)。检测DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。

活性氧ROS检测使用的探针对环境温度敏感，容易氧化分解，降低荧光信号，配制试剂保存较为困难，给检测产品的制备和检测操作带来困难，因此，如何改进活性氧ROS检测使用的探针的热稳定性是目前有待解决的问题。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供热稳定剂在制备用于检测活性氧的染液中的应用以及基于该应用获得的用于检测活性氧的染液，通过向染液中添加主要为糖类物质和/或醇类物质的热稳定剂，提升了探针热稳定性，便于保存，缓解了现有技术中存在的含有活性氧ROS检测使用的探针的试剂中，探针热稳定性不佳的问题。本发明的另一目的在于提供一种活性氧检测试剂盒及应用。

为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：

第一方面，提供了一种用于检测活性氧的染液，包括用于检测活性氧的探针和热稳定剂；所述用于检测活性氧的探针包括MitoSOX红色线粒体超氧化物荧光探针和/或2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯；

所述热稳定剂包括α-环糊精、蔗糖、葡萄糖、甘油和β-环糊精中的一种或几种的组合。

可选的实施方式中，所述染液中，α-环糊精和β-环糊精的浓度分别独立的为10～50mg/mL。

可选的实施方式中，所述染液中，α-环糊精的浓度为12.5～40mg/mL，进一步优选为40mg/mL。

可选的实施方式中，所述染液中，蔗糖和葡萄糖的浓度分别独立的为10～200mg/mL。

可选的实施方式中，所述染液中，甘油的浓度为0.1～1mL/mL。

可选的实施方式中，所述染液还包括缓冲组分和金属离子。

可选的实施方式中，所述染液包括MitoSOX红色线粒体超氧化物荧光探针0.05～1μg/mL、2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯0.1～1.5μg/mL和α-环糊精10～50mg/mL。

第二方面，还提供了热稳定剂在制备用于检测活性氧的染液中的应用，所述用于检测活性氧的染液包括MitoSOX红色线粒体超氧化物荧光探针和/或2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯。

所述热稳定剂包括α-环糊精、蔗糖、葡萄糖、甘油和β-环糊精中的一种或几种的组合。

可选的实施方式中，所述染液用于基于流式技术检测样本。

第三方面，还提供了一种活性氧检测试剂盒，该试剂盒包括分别独立包装的上述的用于检测活性氧的染液和缓冲试剂。

可选的实施方式中，所述缓冲试剂包括磷酸盐缓冲液。

第四方面，还提供了上述的用于检测活性氧的染液，或上述的试剂盒在如下任一项中的应用：

(a)非诊断和治疗目的的基于流式技术检测样本；

(b)用于制备体外诊断试剂；所述体外诊断试剂用于检测活性氧含量异常引起的疾病。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明发现一些糖类物质和醇类物质作为热稳定剂可以提升MitoSOX红色线粒体超氧化物荧光探针和2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯的热稳定性，基于该构思本发明提供了糖类物质和醇类物质在制备用于检测活性氧的染液中的应用，以及基于该应用制备的用于检测活性氧的染液。其中糖类物质和醇类物质包括α-环糊精、蔗糖、葡萄糖、甘油和β-环糊精中的一种或几种的组合。

通过向染液中添加上述热稳定剂，降低了环境温度对MitoSOX红色线粒体超氧化物荧光探针和2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯的荧光信号的影响，提升了探针在液体试剂中的热稳定性，无需冻干，便于保存，且对荧光信号无影响。经过对比实验，添加热稳定剂与不添加热稳定剂的染液在37℃的条件下放置7d后进行实验，添加热稳定剂染液中的探针明显对热有更好的稳定性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为效果例1中对照组流式细胞检测结果图；

图2为效果例1中实施例1试剂盒流式细胞检测结果图；

图3为效果例1中实施例2试剂盒流式细胞检测结果图；

图4为效果例1中实施例3试剂盒流式细胞检测结果图；

图5为效果例1中实施例4试剂盒流式细胞检测结果图；

图6为效果例1中实施例5试剂盒流式细胞检测结果图；

图7为效果例1中实施例6试剂盒流式细胞检测结果图；

图8为效果例1中对比例1试剂盒流式细胞检测结果图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

MitoSOX红色线粒体超氧化物荧光探针(MitoSOX Red MitochondrialSuperoxide Indicator)是二氢乙定(dihydroethidum，DHE)的一种阳离子衍生物，是一种特别设计的高度特异性检测活细胞线粒体超氧化物。MitoSOX红色线粒体超氧化物荧光探针可特异性靶向线粒体，从而选择性检测线粒体内的超氧化物。该探针可透过活细胞膜，并选择性进入线粒体。一旦进入线粒体，该探针即可被超氧化物氧化发出红色荧光。

2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯是一种细胞可渗透的非荧光探针，2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯是在细胞内脱酯化并经氧化转化为具有强荧光的2,7-二氯荧光素。

现有的活性氧检测技术常用MitoSOX红色线粒体超氧化物荧光探针和2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯作为荧光探针，但是这两种探针对环境温度敏感，容易受热分解，降低荧光信号，配制溶液保存较为困难。某些糖类物质和醇类物质能够在高温、高寒、干燥失水等恶劣的条件下在细胞表面形成特殊的保护膜，或者形成空腔，使被保护物质结构不被破坏，从而提高被保护物质的热稳定性。发明人发现通过染液中添加α-环糊精、蔗糖、葡萄糖、甘油和β-环糊精中的一种或几种的组合可以提升MitoSOX红色线粒体超氧化物荧光探针和2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯的热稳定性，便于液体保存保存，无需冻干储存。

基于上述发现，第一方面，提供了一种用于检测活性氧的染液，包括用于检测活性氧的探针和热稳定剂；其中所述用于检测活性氧的探针包括MitoSOX红色线粒体超氧化物荧光探针和/或2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯。热稳定剂包括α-环糊精、蔗糖、葡萄糖、甘油和β-环糊精中的一种或几种的组合。

本发明实验发现，上述热稳定剂对MitoSOX红色线粒体超氧化物荧光探针和2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯的热稳定性均能提高，因此所述用于检测活性氧的染液可以含有上述两种探针的任意一种，也可以同时含有上述两种探针。可选的实施方式中，所述用于检测活性氧的染液是联合染液，包括MitoSOX红色线粒体超氧化物荧光探针和2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯。

本发明提供的用于检测活性氧的染液中的热稳定剂对荧光信号无影响，其可用于本领域任选的以检测荧光信号来判断样本状态的方法中，本发明对荧光信号的检测手段不做限制。可选的实施方式中，所述用于检测活性氧的染液用于基于流式技术的检测方法中。

本发明提供的用于检测活性氧的染液中的MitoSOX红色线粒体超氧化物荧光探针和2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯的浓度不做限制，本领域技术人员可以根据检测荧光信号的手段和设备进行选择。

可选的实施方式中，当用于检测活性氧的染液用于基于流式技术的检测时，MitoSOX红色线粒体超氧化物荧光探针的浓度为0.05～1μg/mL，例如可以为但不限于0.05、0.1、0.2、0.5、0.8或1μg/mL，或前述任意两点之间的范围值。

可选的实施方式中，当用于检测活性氧的染液用于基于流式技术的检测时，2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯的浓度为0.1～1.5μg/mL，例如可以为但不限于0.1、0.5、1或1.5μg/mL，或前述任意两点之间的范围值。

可选的实施方式中，用于检测活性氧的染液中的热稳定剂包括α-环糊精，所述染液中α-环糊精的浓度分别独立的为10～50mg/mL，例如可以为但不限于10、15、20、30、35、40或50mg/mL，或前述任意两点之间的范围值。优选地，α-环糊精的浓度为12.5～40mg/mL，进一步优选为30～40mg/mL，更进一步优选为40mg/mL。

可选的实施方式中，用于检测活性氧的染液中的热稳定剂包括β-环糊精，所述染液中β-环糊精的浓度分别独立的为10～50mg/mL，例如可以为但不限于10、15、20、30、35、40或50mg/mL，或前述任意两点之间的范围值。

可选的实施方式中，用于检测活性氧的染液中的热稳定剂包括蔗糖，所述染液中蔗糖的浓度为10～200mg/mL，例如可以为但不限于10、50、100、150或200mg/mL，或前述任意两点之间的范围值，优选为200mg/mL蔗糖。

可选的实施方式中，用于检测活性氧的染液中的热稳定剂包括葡萄糖，所述染液中葡萄糖的浓度为10～200mg/mL，例如可以为但不限于10、50、100、150或200mg/mL，或前述任意两点之间的范围值，优选为200mg/mL葡萄糖。

可选的实施方式中，用于检测活性氧的染液中的热稳定剂包括甘油，所述染液中甘油的浓度为0.1～1mL/mL，例如可以为但不限于0.1、0.3、0.5、0.8或1mL/mL，或前述任意两点之间的范围值，优选为0.5mL/mL。

可选的实施方式中，所述用于检测活性氧的染液还包括缓冲组分和金属离子。

可选的实施方式中，所述缓冲盐包括但不限于构成如下缓冲液的缓冲组分：磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、Bis-Tris缓冲液、Tris-HCl缓冲液、HEPES缓冲液、PIPES缓冲液、MOPS缓冲液、Tricine缓冲液、TEA缓冲液、甘氨酸-盐酸缓冲液、邻苯二甲酸-盐酸缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、酸钠-碳酸氢钠缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、氯化钾-盐酸缓冲液、PBS或PBST中的一种或多种。可选的实施方式中，所述缓冲组分包括磷酸盐和碳酸盐。

可选的实施方式中，所述金属离子包括镁离子和钙离子。可选的实施方式中，所述镁离子由含有镁离子的盐提供，例如但不限于硫酸镁。可选的实施方式中，所述钙离子由含有钙离子的盐提供，例如但不限于氯化钙。

可选的实施方式中，所述用于检测活性氧的染液为包含两种探针的联合染液，包括MitoSOX红色线粒体超氧化物荧光探针0.05～1μg/mL、2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯0.1～1.5μg/mL和α-环糊精10～50mg/mL。

可选的实施方式中，所述用于检测活性氧的染液为包含两种探针的联合染液，所述染液包括MitoSOX红色线粒体超氧化物荧光探针0.152μg/mL、2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯0.244μg/mL、α-环糊精0.04g/mL、葡萄糖1μg/mL、NaCl 8μg/mL、Na

基于前述的发现通过染液中添加热稳定剂可以提升MitoSOX红色线粒体超氧化物荧光探针和2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯的热稳定性这一构思。第二方面，本发明还提供了热稳定剂在制备用于检测活性氧的染液中的应用，所述用于检测活性氧的染液包括MitoSOX红色线粒体超氧化物荧光探针和/或2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯；所述热稳定剂包括α-环糊精、蔗糖、葡萄糖、甘油和β-环糊精中的一种或几种的组合。

可选的实施方式中，所述应用包括在配制含有MitoSOX红色线粒体超氧化物荧光探针和/或2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯的染液时，在染液中加入α-环糊精、蔗糖、葡萄糖、甘油和β-环糊精中的一种或几种的组合。

可选的实施方式中，当用于检测活性氧的染液用于基于流式技术的检测时，MitoSOX红色线粒体超氧化物荧光探针的浓度为0.05～1μg/mL。

可选的实施方式中，当用于检测活性氧的染液用于基于流式技术的检测时，2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯的浓度为0.1～1.5μg/mL。

可选的实施方式中，用于检测活性氧的染液中的热稳定剂包括α-环糊精，所述染液中α-环糊精的浓度分别独立的为10～50mg/mL。

可选的实施方式中，用于检测活性氧的染液中的热稳定剂包括β-环糊精，所述染液中β-环糊精的浓度分别独立的为10～50mg/mL。

可选的实施方式中，用于检测活性氧的染液中的热稳定剂包括蔗糖，所述染液中蔗糖的浓度为10～200mg/mL。

可选的实施方式中，用于检测活性氧的染液中的热稳定剂包括葡萄糖，所述染液中葡萄糖的浓度为10～200mg/mL。

可选的实施方式中，用于检测活性氧的染液中的热稳定剂包括甘油，所述染液中甘油的浓度为0.1～1mL/mL。

可选的实施方式中，所述用于检测活性氧的染液为包含两种探针的联合染液，包括MitoSOX红色线粒体超氧化物荧光探针和2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯。

可选的实施方式中，用于检测活性氧的染液用于基于流式技术检测样本。

第三方面，还提供了一种活性氧检测试剂盒，该试剂盒包含分别独立包装的用于检测活性氧的染液和缓冲试剂。可选的实施方式中，所述缓冲试剂包括磷酸盐缓冲液。

可以理解的是，所述试剂盒还可选地包含本领域可接受的其他的检测试剂或耗材，包括但不限于缓冲试剂、阴性对照、阳性对照、空白对照、洗脱试剂、样本处理液、稀释液和溶剂中的一种或多种等。本领域技术人员可以根据所述试剂盒所适用的检测手段，根据本领域的一般知识配制其他试剂或耗材。

可选的实施方式中，所述试剂盒中的染液为包含两种探针的联合染液，包括MitoSOX红色线粒体超氧化物荧光探针和2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯。可选的实施方式中，所述联合染液中的热稳定剂包括α-环糊精。

第四方面，上述的用于检测活性氧的染液，或上述的活性氧检测试剂盒在如下任一项中的应用：

(a)非诊断和治疗目的的基于流式技术检测样本；

(b)用于制备体外诊断试剂；所述体外诊断试剂用于检测和活性氧含量异常引起的疾病。

下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

实施例1

实施例1提供了一种用于流式检测的试剂盒，包含染液和缓冲试剂。

(1)缓冲试剂按照如下配制：称取58g Na

(2)染液按照如下配制：称取0.244g 2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)、0.152g红色线粒体超氧化物荧光探针(MitoSOX Red Mitochondrial SuperoxideIndicator)、40gα-环糊精、8gNaCl、0.126gNa

(3)将配置好的每一组分分别分装后，缓冲液、染液组装为试剂盒。

实施例2

实施例2提供了一种用于流式检测的试剂盒，包含染液和缓冲试剂，与实施例1的区别仅在于将染液中的40mg/mL的α-环糊精替换为200mg/mL的蔗糖。

实施例3

实施例3提供了一种用于流式检测的试剂盒，包含染液和缓冲试剂，与实施例1的区别仅在于将染液中的40mg/mL的α-环糊精替换为200mg/mL的葡萄糖。

实施例4

实施例4提供了一种用于流式检测的试剂盒，包含染液和缓冲试剂，与实施例1的区别仅在于将染液中的40mg/mL的α-环糊精替换为0.5mL/mL的甘油。

实施例5

实施例5提供了一种用于流式检测的试剂盒，包含染液和缓冲试剂，与实施例1的区别仅在于染液中的α-环糊精的浓度为30mg/mL。

实施例6

实施例6提供了一种用于流式检测的试剂盒，包含染液和缓冲试剂，与实施例1的区别仅在于染液中的α-环糊精的浓度为12.5mg/mL。

对比例1

对比例1提供了一种用于流式检测的试剂盒，包含染液和缓冲试剂，与实施例1的区别仅在于不含有α-环糊精。

(1)缓冲试剂按照如下配制：称取58g Na

(2)染液按照如下配制：称取0.244g 2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)、0.152g红色线粒体超氧化物荧光探针(MitoSOX Red Mitochondrial SuperoxideIndicator)、8gNaCl、0.126g Na

(3)将配置好的每一组分分别分装后，缓冲液、染液组装为试剂盒。

效果例1

将上述实施例1～6和对比例1的试剂盒中的染液在37℃的条件下放置7d；将实施例1的试剂盒中的染液在2～8℃的条件下存放作为对照组。

将实施例1～6和对比例1，以及对照组的试剂盒按照下述步骤进行流式检测：

(1)样本稀释：取1×10

(2)染色：取上述精子悬液，加入2μl染液，37℃避光孵育15min。

(3)检测：避光条件下，取上述精子悬液，上机进行检测。

实验结果：对照组的流式细胞检测结果如图1所示，实施例1～6的流式细胞检测结果分别如图2～7所示，对比例1的流式细胞检测结果如图8所示。图1～8中，a为流式细胞检测结果散点图，b为流式细胞检测结果密度图，c为流式细胞检测结果红光直方图，d为流式细胞检测结果绿光直方图。

比较图1～8可以看出：

(1)对比红光直方图可以看出，MitoSOX红色线粒体超氧化物荧光探针在不添加α-环糊精37℃加速7d的情况下，荧光信号大幅下降。α-环糊精、葡萄糖、蔗糖和甘油能够在一定程度上提高MitoSOX红色线粒体超氧化物荧光探针的热稳定性，其中α-环糊精的效果最佳。

(2)对比绿光直方图可以看出，2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯荧光探针在不添加α-环糊精37℃加速7d的情况下，荧光信号有大幅位移，极不稳定；α-环糊精、葡萄糖和甘油能够在一定程度上提高2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯荧光探针的热稳定性，其中α-环糊精的效果最佳。

综上所述，在添加α-环糊精、葡萄糖、蔗糖和甘油后染液中的MitoSOX红色线粒体超氧化物荧光探针和2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯对热稳定性明显比不添加α-环糊精更高。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。