一株保加利亚乳杆菌及其在发酵豆乳中的应用

技术领域

本发明属于豆乳发酵领域，提供一株保加利亚乳杆菌在豆乳发酵中的应用。

背景技术

豆乳是一种由大豆制成的植物性乳制品，富含植物蛋白质、不饱和脂肪酸、维生素和矿物质等营养成分，且不含胆固醇和乳糖，是一种高营养价值的植物蛋白饮料，被认为是潜在的乳制品替代品。发酵豆乳是以豆乳为载体，由乳酸菌发酵生产的植物性食品。乳酸菌发酵豆乳产生的生物活性化合物具有较强的营养价值，以及许多健康益处，包括降低致敏性

但是，常规的发酵豆乳存在一些不良风味，分为挥发性和非挥发性两类，挥发性气味化合物主要是由不饱和脂肪酸的酶和非酶氧化产生的，导致产生豆味、草味、脂肪味等异味；非挥发性化合物，如氢过氧化物、环氢过氧化物和二氢过氧化物，表现出苦味、涩味和金属味，会在大豆加工过程中迁移到最终产品中，对豆乳产品的风味产生负面影响。因此，如何提高发酵豆乳的品质，消除发酵豆乳中的不良风味，是本领域亟需攻克的问题。

发明内容

本申请从发酵剂角度出发，提供一株保加利亚乳杆菌(Lactobacillusbulgaricus)(全称德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus))，命名为保加利亚乳杆菌M-58，为豆乳发酵和生产提供一种新选择。

在第一个方面，本发明提供一株保加利亚乳杆菌M-58，其保藏编号为CGMCCNo.23965。

在第二个方面，提供本发明的保加利亚乳杆菌M-58在制备发酵豆乳中的应用。

在第三个方面，提供一种发酵豆乳的制备方法，包括使用本发明的保加利亚乳杆菌M-58作为发酵剂。

优选地，所述发酵方法包括：向豆乳中添加保加利亚乳杆菌M-58，在发酵温度下发酵一定时间；其中，所述方法还包括向豆乳中添加葡萄糖和/或蔗糖。

优选地，所述方法中，葡萄糖的添加量为1.0％～1.5％，蔗糖添加量分别为6.5％～7.0％，且葡萄糖和蔗糖的添加总量为8％；

优选地，所述豆乳的蛋白质含量为2.6％～3.0％；

接种量为4.0×10

发酵温度41～44℃，优选42.5℃；

发酵时间为10.9±0.33h。

在优选实施方式中，发酵条件为：葡萄糖添加量为1％，蔗糖添加量为7％，豆乳中蛋白质含量2.6％，接种量4.0×10

在一种优选实施方式中，所述方法为：将豆乳预热到65℃，加入一定比例水，使蛋白质含量达到2.6％，添加1％葡萄糖和7％蔗糖充分搅拌15min，30Mpa均质，再水浴加热至95℃5min，冷却至发酵温度42℃，接种4.0×10

在第四个方面，提供由本发明的制备方法制备得到的发酵豆乳。

本发明所述的保加利亚乳杆菌M-58，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.23965，保藏时间为2021年11月24日。

本发明的保加利亚乳杆菌M-58能够有效发酵豆乳，发酵后主要致豆腥味物质己醛和己醇含量较原豆乳均显著降低，试验组分别减少了80％和22％，同时，苯乙酮、乙酸异戊酯和苯甲酸异丙酯等具有芳香风味的物质含量增加，试验组分别增加了100％、152％、44％，为发酵豆乳带来了各种水果、花香和奶香等特征风味，有效地掩盖了豆腥味。本发明的保加利亚乳杆菌能够作为豆乳发酵剂的潜在选择。

附图说明

图1为不同葡萄糖添加量对发酵时间的影响结果图；不同小写字母表示不同葡萄糖添加量下的豆乳发酵时间具有显著性差异(P<0.05)；

图2为不同蛋白质含量对豆乳发酵时间的影响结果图；不同小写字母表示不同蛋白质添加量下的豆乳发酵时间具有显著性差异(P<0.05)；

图3为不同接种量对发酵时间的影响结果图；不同小写字母表示不同接种量下的豆乳发酵时间具有显著性差异(P<0.05)；

图4为不同发酵温度对发酵时间的影响结果图；不同小写字母表示不同发酵温度下的豆乳发酵时间具有显著性差异(P<0.05)；

图5为豆乳发酵过程背散射光和稳定性指数图，其中，(a)为对照组，(b)为试验组；

图6为豆乳发酵过程中固液平衡值(SLB，图6a)、流动因子(FI，图6b)、宏观粘度指数(MVI，图6c)、弹性因子(EI，图6d)变化结果图；

图7为贮藏期间发酵豆乳pH值及滴定酸度变化图；

图8为贮藏期间发酵豆乳粘度(上图)和持水力(下图)变化图；

图9为试验组、对照组与原料乳的游离氨基酸差异倍数条形图，其中，(a)为试验组，(b)为对照组。

具体实施方式

本发明探究了保加利亚乳杆菌M-58对豆乳发酵特性和贮藏特性的影响，并采用SPME-GC-MS检测发酵豆乳中的挥发性风味物质，结合感官评价综合分析发酵豆乳风味特征，以及保加利亚乳杆菌M-58去除发酵豆乳中豆腥味的作用效果。同时利用LC-MS分析发酵豆乳中的非挥发性代谢产物，评估差异代谢物的功能特性。为发酵豆乳产品的研发提供一定的参考，为优质发酵豆乳产业化提供基础研究数据支持。

在本发明中，糖添加量x％表示每100ml未发酵豆乳添加xg糖；蛋白质含量y％表示每100ml未发酵豆乳中蛋白质为yg。

材料与方法

如无特殊说明，以下实施例中使用的试剂和仪器均为本领域常规试剂和仪器，可以通过商购方式获得。所使用的方法为常规方法，本领域技术人员根据实施记载的内容，可以毫无疑义地知道如何进行所述方案并获得相应的结果。

实施例中所用材料：

保加利亚乳杆菌M-58，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.23965，保藏时间为2021年11月24日；

商业发酵剂904-vege(嗜热链球菌+保加利亚乳杆菌)，科汉森(中国)有限公司；

纯豆乳(蛋白质质量含量为4％)，达利食品集团有限公司；

蔗糖、葡萄糖，福晨(天津)化学试剂有限公司；

MRS固体培养基、M17固体培养基，上海易利生物科技有限公司；

2-氯苯丙氨酸、甲酸(色谱纯)，Thermo Fisher；甲醇(色谱纯)、乙腈(色谱纯)，Merck。

实施例中所用的主要仪器设备信息如表1所示。

表1主要仪器设备

实施例一：菌株的筛选和鉴定

1、乳酸菌的分离纯化

德式保加利亚乳杆菌M-58于2009年分离自自然发酵酸牦牛乳。在无菌操作下，对发酵酸牦牛乳进行10倍梯度稀释，选取合适稀释度涂布于MRS平板上，37℃培养24h，挑取单菌落在MRS平板上反复划线分离至菌落纯，将乳酸菌疑似菌斜面保存，备用。

2、乳酸菌的鉴定

2.1形态特征的鉴定

将斜面保存的乳酸菌疑似菌分别涂布于酸化MRS培养基上，观察其菌落形态和个体形态特征，初步分离出乳杆菌。

2.2生理生化特征的鉴定

通过革兰染色、过氧化氢酶试验、硝酸盐还原试验、产吲哚试验、葡萄糖产气试验、明胶液化试验、硫化氢产生试验、运动试验、10℃生长试验、45℃生长试验、pH4.5生长试验，鉴定出乳杆菌。

2.3碳水化合物发酵产酸试验

在PY基础培养基中分别加入葡萄糖1.0g、果糖1.0g、麦芽糖1.0g、蔗糖1.0g、半乳糖1.0g、山梨醇1.0g、乳糖1.0g、海藻糖1.0g、菊糖1.0g、甘露醇1.0g、水杨苷1.0g，将乳杆菌按3％分别接种，观察反应情况，鉴定出保加利亚乳杆菌。

3乳酸菌优良菌株的筛选

3.1初筛

将鉴定的菌株活化后按3％的接种量分别接种于脱脂乳培养基中，41℃培养，观察其凝乳时间、乳清析出情况和组织状态，初筛出优良保加利亚乳杆菌。

3.2复筛

将初筛菌按3％的接种量分别接种于脱脂乳培养基中，41℃培养，测定其产酸能力、后酸化能力、产香能力、产黏能力、分解蛋白质能力和保健能力，复筛出本试验所需的保加利亚乳杆菌。

4检测方法

总酸的测定采用NaOH滴定法；黏度用数显黏度计直接测定；氨基酸态氮的测定采用甲醛滴定法；乳酸菌含量的测定采用平板菌落计数法，并进行革兰染色和过氧化氢酶试验。

经鉴定，本试验的菌株为保加利亚乳杆菌，命名为保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)M-58。将保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)M-58保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23965。

实施例二：葡萄糖和蔗糖添加量实验

豆乳中主要可溶性糖为棉籽糖和水苏糖，起始碳源较少，发酵速率慢，为了促进菌株生长，缩短发酵时间，采用添加葡萄糖代替部分蔗糖来提升发酵速度。确定发酵豆乳中总添加糖量为8.0％(100ml未发酵豆乳中添加8g糖)，将葡萄糖添加量设计为0.0％、0.5％、1.0％、1.5％和2.0％，则蔗糖的添加量对应为8.0％、7.5％、7.0％、6.5％和6.0％，分析不同比例蔗糖和葡萄糖添加量对保加利亚乳杆菌M-58发酵豆乳时间的影响。本实验中，M-58的接种量为3.0×10

保加利亚乳杆菌对豆乳中低聚糖的利用率低，发酵速率慢，发酵初向豆乳中加入适量葡萄糖和蔗糖，可以有效促进菌株生长。如图1所示，当保加利亚乳杆菌M-58发酵豆乳中添加葡萄糖1.5％和蔗糖6.5％时，试验组豆乳体系可达最大产酸速率，发酵速度最快；添加葡萄糖1.0％和蔗糖7.0％时，发酵时间与葡萄糖1.5％组没有显著性差异(P＜0.05)。考虑葡萄糖成本高于蔗糖，所以选择添加葡萄糖1.0％和蔗糖7.0％作为后续豆乳发酵碳源的补充。

实施例三：豆乳中蛋白质含量对M-58发酵豆乳的影响

保加利亚乳杆菌M-58接种量为3.0×10

实施例四：不同接种量对发酵的影响

在温度为41.0℃、豆乳中蛋白质含量为2.8％的条件下，分别考察接种量为1.0×10

实施例五：发酵温度对发酵时间的影响

在保加利亚乳杆菌M-58接种量为4.0×10

实施例六：响应面试验设计

在单因素试验的基础上，以接种量(X

表2：Box-Behnken响应面试验因子与水平

以发酵时间最短为优化目标，根据Design-Expert软件运行结果，在蛋白质含量、接种量和发酵温度的共同影响下，豆乳发酵最佳条件为：蛋白质含量2.6％，接种量4.0×10

实施例七：发酵豆乳的制备

以保加利亚乳杆菌M-58发酵豆乳为试验组，商业发酵剂发酵豆乳为对照组，除接种菌株不同，其他发酵条件都相同。纯豆乳预热到65℃，加入一定比例水，使蛋白质含量达到2.6％，添加1％葡萄糖和7％蔗糖充分搅拌15min，30Mpa均质，再水浴加热至95℃5min，冷却至发酵温度42℃，试验组接种4.0×10

对发酵乳进行一系列检测。各试验的样品每组均至少测定三次平行。采用SPSS进行统计学分析，2组间的数据比较采用独立样本T检验进行分析，3组或者3组以上数据比较采用单因素方差分析，显著性水平设置为0.05；采用Origin Lab 2021、Design Expert 11进行作图。

1、豆乳发酵过程中Turbiscan稳定性测定

使用Turbiscan进行监测，取20mL接种后的基料于专用上样瓶中，保证瓶壁无挂液，液面无气泡，放置测定槽中，发酵过程中将温度设置为发酵温度，每15min采集1次数据，测定至发酵终点。

Turbiscan是一种分析颗粒体系的光学技术，通过样品中不同角度和位置的散射光强度来测量颗粒物质的大小和浓度。以样品初始值为对照，样品与背散射光的差值即变化率(ΔBS)，ΔBS变量越大，稳定性越差。利用TurbisoftLab 2.0软件，根据蛋白质粒子聚集和动态迁移的背散射变化计算稳定性指数(Turbiscan Stability Index，TSI)。TSI综合反映样品在整个放置时间浓度和颗粒粒径的变化幅度，变化幅度越大，体系越不稳定。由图5可知，试验组和对照组ΔBS整体上升，变量分别为9％和11％，这些变化是由于平均颗粒尺寸的增加，表现为聚集的失稳过程。发酵期间两组样品TSI值都呈上升趋势，说明发酵过程中蛋白质聚集物正在促进形成凝胶结构，其中对照组＞试验组，表明试验组更加稳定，与ΔBS显示稳定性大小一致。说明本发明的保加利亚乳杆菌M-58作为发酵剂，可以使得发酵豆乳的体系更稳定。

2、豆乳发酵过程中微流变学参数测定

使用光学微流变仪进行监测，取20mL接种后的基料于专用上样瓶中，随后放入微流变样品槽中，温度设置为发酵温度，监测发酵过程中的弹性因子、黏度因子、固液平衡值和流动因子指标，每5s采集一次数据，测定至发酵终点。

发酵可以改善豆乳的质地和流变性能，固液平衡值(Solid Liquid Balance，SLB)在0～0.5范围内表示发酵乳具有更多的弹性固体特征，在0.5～1范围内则表示发酵乳具有更多的粘性液体特征。流动因子(Fluidity Index，FI)的高低反映颗粒运动的快慢，FI值越高，发酵乳中颗粒运动越快。由图6(a)和6(b)可知，试验组前5.5h和对照组发酵前3.5h SLB值和FI值均处于波动状态，SLB值在0.5～1之间，样品为液体特征，此时没有形成凝胶结构。试验组在5.5h和对照组3.5h时SLB值和FI值出现拐点且都垂直下降，表明蛋白开始迅速聚集，粘度增大，即到达凝胶点。发酵结束后，对照组SLB值稳定为0.2左右，样品表现为固体特征，试验组SLB值略有上升，呈弱凝胶结构。

宏观粘度指数(Macroscopic Viscosity Index，MVI)表征样品粘度，弹性因子(Elastic Index，EI)表征样品弹性特征。由图6(c)(d)可知，试验组前5.5h和对照组前3.5h粘弹性基本不变，两组样品在5.5h和3.5h时MVI值和EI值出现拐点且迅速升高，这与SLB值和FI值显示变化结果相同。

本实验结果表明，以M-58作为发酵剂，波动时间较长，此过程蛋白先遇酸凝固后经分解变稀，使得豆乳更易被吸收利用。

3、发酵豆乳贮藏期间pH值和滴定酸度的测定

pH值测定：采用pH计直接测定。

滴定酸度测定：按照国标GB5009.239—2016中“酚酞指示剂法”测定。

结果如图7所示。试验组和对照组到达发酵终点的pH值分别为4.59和4.57，滴定酸度分别为43°T和48°T，对照组酸度较高，可能是因为对照组比试验组单菌株发酵活菌数高，乳酸菌代谢速率较快。贮藏1～14d，两组发酵豆乳样品滴定酸度有显著性差异(P＜0.05)，贮藏21d结束时两组样品pH值在4.30左右，滴定酸度在60°T左右。保加利亚乳杆菌M-58产酸速度较慢，能够防止后熟过程后严重的酸化现象。

4、发酵豆乳贮藏期间粘度、持水力的测定

粘度测定：将发酵豆乳样品恢复至室温后，采用粘度仪4#转子进行测定。

持水力测定：称取发酵豆乳样品20.00g，放置于有定性滤纸的漏斗中，室温放置120min后收集滤液并立即称重。计算方法：持水力(％)＝1-(滤液质量g/样品质量g)×100％

粘度会影响发酵豆乳最基本的感官属性。贮藏期间两组发酵豆乳样品粘度呈先上升后下降趋势。持水力反映了凝胶内部结构的致密程度，两组发酵豆乳样品在贮藏前14d持水力一直呈上升趋势，之后有小幅下降，与粘度变化一致。两组样品粘度与持水力在各个时期都有显著性差异(P＜0.05)，试验组粘度较低，但是其稳定性较好，说明使用保加利亚乳杆菌M-58发酵的豆乳形成了更稳定的网络结构。

5、固相微萃取与气相色谱-质谱联用测定

本试验采用SPME-GC-MS测定原豆乳与两组发酵豆乳样品中发酵结束时的挥发性风味物质，利用差异代谢物倍数(Fold Change，FC)表示代谢物含量的变化情况。具体条件如表3所示：

表3：气相色谱与质谱试验参数

共检测出142种挥发性风味物质，包括醛类化合物(12种)、酮类化合物(11种)、酯类化合物(42种)、酸类化合物(8种)、醇类化合物(23种)、烃类化合物(16种)、杂环和芳烃类化合物(13种)、萜类和胺类以及酚类化合物(17种)。

其中，己醛是豆腥味挥发性物质的最主要成分，SPME-GC-MS测定两组发酵豆乳样品中己醛含量较原豆乳均显著降低，试验组降低了80％，这是由于豆乳经乳酸菌发酵可将羰基化合物转化为酮、醇类和有机酸，表明乳酸菌发酵可明显减轻豆乳的豆腥味。

对比原豆乳，发酵后试验组和对照组中酮类化合物含量明显上调的主要有苯乙酮、2-己酮、对甲氧基苯乙酮和1-(3-羟苯基)-乙酮等。试验组和对照组苯乙酮含量分别增加了100％和72％，这些物质共同赋予发酵豆乳不同的水果香气。乙酸异戊酯和苯甲酸异丙酯等具有芳香风味的物质含量增加，试验组、对照组分别增加了152％、44％和180％、56％，这表明保加利亚乳杆菌M-58发酵的豆乳较商业发酵剂904-vege发酵的豆乳会产生更浓的水果香气。

6、液相色谱-质谱联用测定

利用液相色谱-质谱联用测定发酵豆乳中游离氨基酸的含量和形态。

样品检测条件：色谱柱为Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18 1.8μm，2.1mm*100mm。流动A为水相，B相为乙腈；仪器柱温为40℃；流速为0.40mL/min；进样量2μL。

豆乳发酵后游离氨基酸的差异倍数代谢结果如图9所示，经保加利亚乳杆菌M-58和商业发酵剂发酵后的豆乳中，不同游离氨基酸含量显著增加，与原豆乳对比最高都可以增加10倍以上。

另一方面，发酵豆乳中的有机酸可赋予豆乳特殊的风味、促进肠道蠕动和抑制有害菌的繁殖，试验组和对照组中琥珀酸含量与原料豆乳对比有所提高，分别提高了76％和41％。