产L-苏氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及产L-苏氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用。

背景技术

L-苏氨酸是人和动物生长所必需的8种氨基酸之一，其广泛应用于饲料、食品添加及药物辅助材料制备等。目前L-苏氨酸主要通过微生物发酵生产，多种细菌可用于L-苏氨酸生产，如大肠杆菌、棒状杆菌属、沙雷氏菌属等的野生型诱导获得的突变株作为生产菌株。具体实例包括抗氨基酸类似物突变株或甲硫氨酸、赖氨酸、异亮氨酸等多种营养缺陷型(日本专利申请公开号224684/83；韩国专利申请公开号8022/87)。然而，传统诱变育种由于随机突变造成菌株生长缓慢及产生较多副产物，不易获得高产菌株。

随着全球苏氨酸需求量的不断增加，高产苏氨酸菌株的构建和改造尤为重要。2003年韩国CJ株式会社申请的中国专利CN03811059.8中，利用大肠杆菌，通过缺失苏氨酸操纵子序列的第-56至-18位的39bp序列，增强苏氨酸合成关键基因thrABC表达，苏氨酸生产力提高22％。Kwang Ho Lee(Kwang Ho Lee等,Systems metabolic engineering ofEscherichia coli for L-threonine production,Mol Syst Biol.2007；3:149)等利用系统代谢工程策略，通过突变编码天冬氨酸激酶I和III的基因thrA、lysC解除产物反馈抑制，通过敲除tdh及弱化ilvA来去除副产物甘氨酸、异亮氨酸，通过失活竞争途径基因metA和lysA为苏氨酸合成提供了更多前体等，最终获得的TH28C(pBRThrABCR3)菌株发酵50h可产酸82.4g/L，糖酸转化率39.3％。CN105543156A通过强化thrA*BC、敲除tdh获得MHZ-0213-3菌株，该菌株苏氨酸产量为4.2g/L、转化率约为8.9％，且无质粒负担。CN106635945A通过在大肠杆菌中强化pntAB基因和异源引入pyc基因获得MHZ-0215-2菌株，该菌株苏氨酸产量为12.4g/L、转化率约为16.2％且无质粒负担。其中pyc基因编码的丙酮酸羧化酶PCx可将丙酮酸催化生成苏氨酸合成的前体草酰乙酸。丙酮酸羧化酶的分子量为520000Da，由四个相同亚基组成，每个亚基的一个赖氨酸残基共价连接一个生物素辅基，生物素作为PCx的辅因子是丙酮酸羧化所必需的。但当pyc基因表达量进一步增加时，丙酮酸羧化酶的辅因子生物素不足将会大大限制改造菌株转化率的进一步提升。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型的产L-苏氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用。

本发明构思如下：本发明以MHZ-0215-2为出发菌株(参见ZL201611250306.8)，根据大肠杆菌中L-苏氨酸的代谢路径及出发菌株MHZ-0215-2的遗传背景，在其基因组上进行相关改造，强化菌株的生物素合成。具体包括生物素合成路径中关键基因的强化和过表达，例如，将生物素合成操纵子bioABFCD的表达加强，包括用强启动子替换原有启动子，或者增强RBS的强度以及在基因组上增加bioABFCD的拷贝数；解除BirA(DNA结合转录阻遏物/生物素-[乙酰-CoA-羧化酶]连接酶)对生物素合成操纵子bioABFCD的转录阻遏；另外，将上述两种改造方式组合，协同增加丙酮酸羧化酶(pyc基因编码)的辅因子生物素的供应，以进一步提高菌株生产苏氨酸的能力。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供产L-苏氨酸的基因工程菌，所述基因工程菌选自A～C中的任一种：

A、通过增强大肠杆菌中编码NCBI参考序列NC_000913.3(807968..812947)的基因bioABFCD，获得的基因增强菌株；

B、通过弱化大肠杆菌中编码NCBI参考序列NC_000913.3(4173082..4174047)的基因birA，获得的基因弱化菌株；

C、通过增强大肠杆菌中编码NCBI参考序列NC_000913.3(807968..812947)的基因bioABFCD，同时弱化大肠杆菌中编码NCBI参考序列NC_000913.3(4173082..4174047)的基因birA，获得的基因工程菌。

本发明中，bioABFCD是一个操纵子，5个基因连在一起，Gene ID分别为945376、945370、945384、945388和945387。Sequence：NC_000913.3(807968..812947,complement)。

增强的途径可选自以下1)～3)中的至少一种：

1)通过将强启动子与所述基因可操作地连接而增强；

2)通过增加染色体上所述基因的拷贝数而增强；

3)通过增加染色体上所述基因启动子的RBS序列的强度而增强。

所述弱化包括敲除或降低所述基因的表达。弱化的方法可选自诱变、定点突变、同源重组等中的至少一种。

所述强启动子可选自Ptac、Plac、Ptrp、Ptrc等。

定点突变的方法可选自S1～S3中的任一种：

S1、对基因birA进行定点突变，突变后基因birA编码蛋白的第57位氨基酸由G突变为S；

S2、对基因birA进行定点突变，突变后基因birA编码蛋白的第58位氨基酸由Y突变为F；

S3、对基因birA进行定点突变，突变后基因birA编码蛋白的第57位氨基酸由G突变为S，且第58位氨基酸由Y突变为F。

优选地，所述大肠杆菌为保藏编号为CGMCC No.13403的大肠杆菌MHZ-0215-2。

第二方面，本发明提供产L-苏氨酸的基因工程菌的构建方法，所述方法选自以下方案I～V，或任选的组合：

方案I、利用基因工程手段将强启动子Ptac与大肠杆菌中的基因bioABFCD可操作地连接；

方案II、利用基因工程手段增加大肠杆菌中基因bioABFCD的拷贝数；

方案III、利用基因工程手段增加大肠杆菌中基因bioABFCD启动子的RBS序列的强度；

方案IV、利用基因工程手段对大肠杆菌中的基因birA进行定点突变，突变后基因birA编码蛋白的第57位氨基酸由G突变为S；

方案V、利用基因工程手段对大肠杆菌中的基因birA进行定点突变，突变后基因birA编码蛋白的第58位氨基酸由Y突变为F。

优选地，所述方法可选自i～vi中的任一种：

i、利用基因工程手段将强启动子Ptac与大肠杆菌中的基因bioABFCD可操作地连接，同时对大肠杆菌中的基因birA进行定点突变，突变后基因birA编码蛋白的第57位氨基酸由G突变为S；

ii、利用基因工程手段将强启动子Ptac与大肠杆菌中的基因bioABFCD可操作地连接，同时对大肠杆菌中的基因birA进行定点突变，突变后基因birA编码蛋白的第58位氨基酸由Y突变为F；

iii、利用基因工程手段增加大肠杆菌中基因bioABFCD的拷贝数，同时对大肠杆菌中的基因birA进行定点突变，突变后基因birA编码蛋白的第57位氨基酸由G突变为S；

iv、利用基因工程手段增加大肠杆菌中基因bioABFCD的拷贝数，同时对大肠杆菌中的基因birA进行定点突变，突变后基因birA编码蛋白的第58位氨基酸由Y突变为F；

v、利用基因工程手段增加大肠杆菌中基因bioABFCD启动子的RBS序列的强度，同时对大肠杆菌中的基因birA进行定点突变，突变后基因birA编码蛋白的第57位氨基酸由G突变为S；

vi、利用基因工程手段增加大肠杆菌中基因bioABFCD启动子的RBS序列的强度，同时对大肠杆菌中的基因birA进行定点突变，突变后基因birA编码蛋白的第58位氨基酸由Y突变为F。

其中，方案I～V具体如下：

方案I包括：

(1)pTargetF-N20(tac-bioABFCD)质粒及Donor DNA-1的构建

a、以pTargetF质粒为模板，用pTF-sgRNA-F1/pTF-sgRNA-R1引物对，扩增出带有N20的pTF线性质粒，使用无缝组装ClonExpress试剂盒将此线性质粒37℃进行组装，随后转化Trans1-T1感受态细胞，获得pTargetF-N20(tac bioABFCD)质粒，并进行PCR鉴定及测序验证；

b、以W3110基因组为模板，用bioAtac-UF/bioAtac-UR1、bioAtac-UF/bioAtac-UR2引物对，扩增出含tac启动子的上游同源臂①；

c、以W3110基因组为模板，用PtacI-F/PtacI-R引物对扩增出tac启动子②；

d、以W3110基因组为模板，用bioBtac-DF1/bioBtac-DR、bioBtac-DF2/bioBtac-DR引物对，扩增出含tac启动子的下游同源臂③；

e、以①、②、③为模板，用bioAtac-UF/bioBtac-DR引物对，扩增出up-Ptac-down片段，命名为Donor DNA-1；

(2)感受态细胞制备及电转化

a、将pCas质粒电转入大肠杆菌MHZ-0215-2感受态细胞中；

b、挑取含有pCas质粒的MHZ-0215-2单菌落于5mL含卡那霉素和终浓度为10mM阿拉伯糖的LB试管中，30℃200r/min培养至OD

c、将(1)中构建得到的pTargetF-N20(tac-bioABFCD)质粒和Donor DNA-1同时电转入含有pCas质粒的MHZ-0215-2感受态细胞中，涂布于含壮观霉素和卡那霉素的LB平板上，30℃静置培养至单菌落可见；

(3)重组验证

a、用引物对bioAtac-F/bioBtac-R对上述单菌落进行菌落PCR验证；

b、用引物对bioAtac-F/bioBtac-R进行目的片段的扩增，扩增产物送测序，以验证序列的完整性；

(4)构建相关质粒丢失

a、挑取测序验证正确的单菌落接种于5mL含卡那霉素及终浓度为0.5mM IPTG的LB试管中，30℃过夜培养后划线于含卡那霉素的LB平板上；

b、挑取单菌落对点于含卡那霉素、壮观霉素LB平板和只含卡那霉素的LB平板上，30℃过夜培养，若在含卡那霉素、壮观霉素的LB平板上不能生长，在卡那霉素的LB平板上生长，表明pTargetF-N20(tac-bioABFCD)质粒已丢失；

c、挑取pTargetF-N20(tac-bioABFCD)质粒丢失的阳性菌落，接种于无抗LB试管中，42℃培养8h后划线于LB平板上，37℃过夜培养；

d、挑取单菌落对点于含卡那霉素LB平板和无抗LB平板上，若在含卡那霉素的LB平板上不能生长，在无抗LB平板上生长，表明pCas质粒丢失，得到产L-苏氨酸的基因工程菌，命名为MHZ-0215-3(Ptac-bioA/Ptac-BFCD)菌株；

方案II包括：

(1)pTargetF-N20(RBS bioABFCD)质粒及Donor DNA-2的构建

a、以pTargetF质粒为模板，用pTF-sgRNA-F1/pTF-sgRNA-R1引物对，扩增出带有N20的pTF线性质粒，使用无缝组装ClonExpress试剂盒将此线性质粒37℃进行组装，随后转化Trans1-T1感受态细胞，获得质粒pTargetF-N20(RBS bioABFCD)，并进行PCR鉴定及测序验证；

b、以W3110基因组为模板，用bioA-RBS-UF/bioA-RBS-UR引物对，扩增出含RBS的上游同源臂①；

c、以W3110基因组为模板，用bioAp-F/bioAp-R、bioAp-F/bioABp-R、bioAp-F/bioBp-R1、bioAp-F/bioBp-R2引物对扩增出含有RBS的bioA/bioB启动子②；

d、以W3110基因组为模板，用bioB-RBS-DF/bioB-RBS-DR引物对，扩增出含RBS的下游同源臂③；

e、以①、②、③为模板，用bioA-RBS-UF/bioB-RBS-DR引物对，扩增出up-RBS-down片段，命名为Donor DNA-2；

(2)感受态细胞制备及电转化

a、将pCas质粒电转入大肠杆菌MHZ-0215-2感受态细胞中；

b、挑取含有pCas质粒的MHZ-0215-2单菌落于5mL含卡那霉素和终浓度为10mM阿拉伯糖的LB试管中，30℃200r/min培养至OD

c、将(1)中构建得到的pTargetF-N20(RBS bioABFCD)质粒和Donor DNA-2同时电转入含有pCas质粒的MHZ-0215-2感受态细胞中，涂布于含壮观霉素和卡那霉素的LB平板上，30℃静置培养至单菌落可见；

(3)重组验证

a、用引物对bioA-RBS-F/bioB-RBS-R对上述单菌落进行菌落PCR验证；

b、将PCR鉴定正确的菌株用引物对bioA-RBS-F/bioB-RBS-R扩增，扩增产物送测序，以验证序列的完整性；

(4)构建相关质粒丢失

a、挑取测序验证正确的单菌落接种于5mL含卡那霉素及终浓度为0.5mM IPTG的LB试管中，30℃过夜培养后划线于含卡那霉素的LB平板上；

b、挑取单菌落对点于含卡那霉素、壮观霉素LB平板和只含卡那霉素的LB平板上，30℃过夜培养，若在含卡那霉素、壮观霉素的LB平板上不能生长，在卡那霉素的LB平板上生长，表明pTargetF-N20(RBS bioABFCD)质粒已丢失；

c、挑取pTargetF-N20(RBS bioABFCD)质粒丢失的阳性菌落，接种于无抗LB试管中，42℃培养8h后划线于LB平板上，37℃过夜培养；

d、挑取单菌落对点于含卡那霉素LB平板和无抗LB平板上，若在含卡那霉素的LB平板上不能生长，在无抗LB平板上生长，表明pCas质粒丢失，得到产L-苏氨酸的基因工程菌，命名为MHZ-0215-4(RBS-bioABFCD)菌株；

方案III包括：

(1)pTargetF-N20(IS1::bioABFCD)质粒及Donor DNA-3的构建

a、以pTargetF质粒为模板，用pTF-sgRNA-F2/pTF-sgRNA-R2引物对，扩增出带有N20的pTF线性质粒，使用无缝组装ClonExpress试剂盒将此线性质粒37℃进行组装，随后转化Trans1-T1感受态细胞，获得pTargetF-N20(IS1::bioABFCD)质粒，并进行PCR鉴定及测序验证；

b、以W3110基因组为模板，用bioABFCD2-UF/bioABFCD2-UR引物对，扩增出上游同源臂①；

c、以W3110基因组为模板，用bioABFCD2-F1/bioABFCD2-R1引物对扩增出bioABFCD操纵子上半段②；

d、以W3110基因组为模板，用bioABFCD2-F2/bioABFCD2-R2引物对，扩增出bioABFCD操纵子下半段③；

e、以W3110基因组为模板，用bioABFCD2-DF/bioABFCD2-DR引物对，扩增出下游同源臂④；

f、以①、②、③、④为模板，用bioABFCD2-UF/bioABFCD2-DR引物对，扩增出up-bioABFCD2-down片段，命名为Donor DNA-3；

(2)感受态细胞制备及电转化

a、将pCas质粒电转入大肠杆菌MHZ-0215-2感受态细胞中；

b、挑取含有pCas质粒的MHZ-0215-2单菌落于5mL含卡那霉素和终浓度为10mM阿拉伯糖的LB试管中，30℃200r/min培养至OD

c、将(1)中构建得到的pTargetF-N20(IS1::bioABFCD)质粒和Donor DNA-3同时电转入含有pCas质粒的MHZ-0215-2感受态细胞中，涂布于含壮观霉素和卡那霉素的LB平板上，30℃静置培养至单菌落可见；

(3)重组验证

a、用引物对bioABFCD2-F/bioABFCD2-R对上述单菌落进行菌落PCR验证；

b、将PCR鉴定正确的菌株用引物对bioA-RBS-F/bioB-RBS-R扩增，扩增产物送测序，以验证序列的完整性；

(4)构建相关质粒丢失

a、挑取测序验证正确的单菌落接种于5mL含卡那霉素及终浓度为0.5mM IPTG的LB试管中，30℃过夜培养后划线于含卡那霉素的LB平板上；

b、挑取单菌落对点于含卡那霉素、壮观霉素LB平板和只含卡那霉素的LB平板上，30℃过夜培养，若在含卡那霉素、壮观霉素的LB平板上不能生长，在卡那霉素的LB平板上生长，表明pTargetF-N20(IS1::bioABFCD)质粒已丢失；

c、挑取pTargetF-N20(IS1::bioABFCD)质粒丢失的阳性菌落，接种于无抗LB试管中，42℃培养8h后划线于LB平板上，37℃过夜培养；

d、挑取单菌落对点于含卡那霉素LB平板和无抗LB平板上，若在含卡那霉素的LB平板上不能生长，在无抗LB平板上生长，表明pCas质粒丢失，得到产L-苏氨酸的基因工程菌，命名为MHZ-0215-5(IS1::bioABFCD)菌株；

方案IV包括：

(1)pTargetF-N20(birA G57S)质粒及Donor DNA-4的构建

a、以pTargetF质粒为模板，用pTF-birA-sgRNA-F/pTF-birA-sgRNA-R引物对，扩增出带有N20的pTF线性质粒，使用无缝组装ClonExpress试剂盒将此线性质粒37℃进行组装，随后转化Trans1-T1感受态细胞，获得pTargetF-N20(birA G57S)质粒，并进行PCR鉴定及测序验证；

b、以W3110基因组为模板，用birAG57S-UF/birAG57S-UR引物对，扩增出上游同源臂①；

c、以W3110基因组为模板，用birAG57S-DF/birAG57S-DR引物对扩增出下游同源臂②；

d、以①、②为模板，用birAG57S-UF/birAG57S-DR引物对，扩增出up-down片段，命名为Donor DNA-4；

(2)感受态细胞制备及电转化

a、将pCas质粒电转入大肠杆菌MHZ-0215-2感受态细胞中；

b、挑取含有pCas质粒的MHZ-0215-2单菌落于5mL含卡那霉素和终浓度为10mM阿拉伯糖的LB试管中，30℃200r/min培养至OD

c、将(1)中构建得到的pTargetF-N20(birA G57S)质粒和Donor DNA-4同时电转入含有pCas质粒的MHZ-0215-2感受态细胞中，涂布于含壮观霉素和卡那霉素的LB平板上，30℃静置培养至单菌落可见；

(3)重组验证

a、用引物对birAG57S-F1/birAG57S-R对上述单菌落进行菌落PCR验证；

b、将PCR鉴定正确的菌株用引物对birAG57S-F/birAG57S-R扩增，扩增产物送测序，以验证序列的完整性；

(4)构建相关质粒丢失

a、挑取测序验证正确的单菌落接种于5mL含卡那霉素及终浓度为0.5mM IPTG的LB试管中，30℃过夜培养后划线于含卡那霉素的LB平板上；

b、挑取单菌落对点于含卡那霉素、壮观霉素LB平板和只含卡那霉素的LB平板上，30℃过夜培养，若在含卡那霉素、壮观霉素的LB平板上不能生长，在卡那霉素的LB平板上生长，表明pTargetF-N20(birA G57S)质粒已丢失；

c、挑取pTargetF-N20(birA G57S)质粒丢失的阳性菌落，接种于无抗LB试管中，42℃培养8h后划线于LB平板上，37℃过夜培养；

d、挑取单菌落对点于含卡那霉素LB平板和无抗LB平板上，若在含卡那霉素的LB平板上不能生长，在无抗LB平板上生长，表明pCas质粒丢失，得到产L-苏氨酸的基因工程菌，命名为MHZ-0215-6(birA G57S)菌株；

方案V包括：

(1)pTargetF-N20(birA Y58F)质粒及Donor DNA-5的构建

a、以pTargetF质粒为模板，用pTF-birA-sgRNA-F/pTF-birA-sgRNA-R引物对，扩增出带有N20的pTF线性质粒，使用无缝组装ClonExpress试剂盒将此线性质粒37℃进行组装，随后转化Trans1-T1感受态细胞，获得pTargetF-N20(birA Y58F)质粒，并进行PCR鉴定及测序验证；

b、以W3110基因组为模板，用birAG57S-UF/birAY58F-UR引物对，扩增出上游同源臂①；

c、以W3110基因组为模板，选用birAY58F-DF/birAG57S-DR引物对扩增出下游同源臂②；

d、以①、②为模板，用birAG57S-UF/birAG57S-DR引物对，扩增出up-down片段，命名为Donor DNA-5；

(2)感受态细胞制备及电转化

a、将pCas质粒电转入大肠杆菌MHZ-0215-2感受态细胞中；

b、挑取含有pCas质粒的MHZ-0215-2单菌落于5mL含卡那霉素和终浓度为10mM阿拉伯糖的LB试管中，30℃200r/min培养至OD

c、将(1)中构建得到的pTargetF-N20(birA Y58F)质粒和Donor DNA-5同时电转入含有pCas质粒的MHZ-0215-2感受态细胞中，涂布于含壮观霉素和卡那霉素的LB平板上，30℃静置培养至单菌落可见；

(3)重组验证

a、用引物对birAY58F-F1/birAG57S-R对上述单菌落进行菌落PCR验证；

b、将PCR鉴定正确的菌株用引物对birAG57S-F/birAG57S-R扩增，扩增产物送测序，以验证序列的完整性；

(4)构建相关质粒丢失

a、挑取测序验证正确的单菌落接种于5mL含卡那霉素及终浓度为0.5mM IPTG的LB试管中，30℃过夜培养后划线于含卡那霉素的LB平板上；

b、挑取单菌落对点于含卡那霉素、壮观霉素LB平板和只含卡那霉素的LB平板上，30℃过夜培养，若在含卡那霉素、壮观霉素的LB平板上不能生长，在卡那霉素的LB平板上生长，表明pTargetF-N20(birA Y58F)质粒已丢失；

c、挑取pTargetF-N20(birA Y58F)质粒丢失的阳性菌落，接种于无抗LB试管中，42℃培养8h后划线于LB平板上，37℃过夜培养；

d、挑取单菌落对点于含卡那霉素LB平板和无抗LB平板上，若在含卡那霉素的LB平板上不能生长，在无抗LB平板上生长，表明pCas质粒丢失，得到产L-苏氨酸的基因工程菌，命名为MHZ-0215-7(birA Y58F)菌株。

上述方案I～V中使用的引物见表1。

本发明中，对大肠杆菌进行基因组编辑，主要参考Jiang Y等报道的CRISPR-Cas9基因编辑技术(Multigene Editing in the Escherichia coli Genome via the CRISPR-Cas9 System,Jiang Y,Chen B,et al.Appl.Environ Microbiol,2015)。

本发明中，卡那霉素(Kanamycin)在培养基中的终浓度为50μg/mL，壮观霉素(spectinomycin)在培养基中的终浓度为50μg/mL。

第三方面，本发明提供按照上述方法构建得到的产L-苏氨酸的基因工程菌。

第四方面，本发明提供所述基因工程菌，或按照上述方法构建的基因工程菌在发酵生产L-苏氨酸中的应用。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明通过强化L-苏氨酸生产菌株的生物素合成，尤其是pyc基因得到强化的菌株，所采用的具体手段为强化bioABFCD基因(包括启动子强化、RBS序列强化、多拷贝)，解除birA基因转录阻遏，以及强化bioABFCD的同时解除birA转录阻遏。构建得到的产L-苏氨酸的基因工程菌，经发酵培养，L-苏氨酸产量可达20.2g/L，糖酸转化率可达23.8％。本发明同样适用于提高天冬氨酸家族氨基酸如天冬氨酸、赖氨酸、高丝氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸等的产量和糖酸转化率。此外，本发明也适用于其他以生物素作为辅因子的酶提高酶活从而增强氨基酸的合成路径。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW，Molecular Cloning:a Laboratory Manual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

以下实施例中所用试剂均可市购获得。本发明提供的高转化率苏氨酸生产菌种的亲代菌株为MHZ-0215-2，属于W3110(埃希氏菌属Escherichia)。大肠杆菌MHZ-0215-2保藏编号为CGMCC No.13403，参见ZL201611250306.8。

实施例中所用引物序列见表1。

表1

本发明中涉及的基因名称解释如下：

bioA：腺苷甲硫氨酸-8-氨基-7-氧壬酸氨基转移酶；

bioB：生物素合成酶；

bioF：8-氨基-7-氧代壬酸合酶；

bioC：丙二酰酰基载体蛋白甲基转移酶；

bioD：脱硫生物素合成酶；

birA：DNA结合转录阻遏物/生物素-[乙酰-CoA-羧化酶]连接酶；

pyc：丙酮酸羧化酶；

实施例1制备强化bioABFCD基因的菌株MHZ-0215-3(启动子强化)

(1)pTargetF-N20(tac-bioABFCD)质粒及Donor DNA-1构建

步骤1：以pTargetF质粒为模板(可参见Multigene Editing in the Escherichiacoli Genome via the CRISPR-Cas9 System,Jiang Y,Chen B,et al.Appl.EnvironMicrobiol,2015)，选用pTF-sgRNA-F1/pTF-sgRNA-R1引物对，扩增出带有N20的pTF线性质粒，使用无缝组装ClonExpress试剂盒将此线性质粒37℃进行组装，随后转化Trans1-T1感受态细胞，获得pTargetF-N20(tac-bioABFCD)，并进行PCR鉴定及测序验证；步骤2：以W3110基因组为模板，选用bioAtac-UF/bioAtac-UR1、bioAtac-UF/bioAtac-UR2引物对，扩增出含tac启动子的上游同源臂①；步骤3：以W3110基因组为模板，选用PtacI-F/PtacI-R引物对扩增出tac启动子②；步骤4：以W3110基因组为模板，选用bioBtac-DF1/bioBtac-DR、bioBtac-DF2/bioBtac-DR引物对，扩增出含tac启动子的下游同源臂③；步骤5：以①、②、③为模板，选用bioAtac-UF/bioBtac-DR引物对，扩增出up-Ptac-down片段，也称Donor DNA-1。

(2)感受态细胞制备及电转化

步骤1：将pCas质粒(可参见Multigene Editing in the Escherichia coliGenome via the CRISPR-Cas9 System,Jiang Y,Chen B,et al.Appl.EnvironMicrobiol,2015)电转入MHZ-0215-2感受态细胞中(转化方法及感受态制备方法均参照《分子克隆III》)；步骤2：挑取MHZ-0215-2(pCas)单菌落于5mL含卡那霉素和终浓度为10mM阿拉伯糖的LB试管中，30℃200r/min培养至OD

(3)重组验证

步骤1：使用引物对bioAtac-F/bioBtac-R对上述单菌落进行菌落PCR验证；步骤2：用引物对bioAtac-F/bioBtac-R进行目的片段的扩增，扩增产物送测序，以验证序列的完整性。

(4)构建相关质粒丢失

步骤1：挑取测序验证正确的单菌落接种于5mL含卡那霉素及终浓度为0.5mM IPTG的LB试管中，30℃过夜培养后划线于含卡那霉素的LB平板上；步骤2：挑取单菌落对点于含卡那霉素、壮观霉素LB平板和只含卡那霉素的LB平板上，30℃过夜培养，若在含卡那霉素、壮观霉素的LB平板上不能生长，在卡那霉素的LB平板上生长，表明pTargetF-N20(tac-bioABFCD)质粒已丢失；步骤3：挑取pTargetF-N20(tac-bioABFCD)质粒丢失的阳性菌落，接种于无抗LB试管中，42℃培养8h后划线于LB平板上，37℃过夜培养；步骤4：挑取单菌落对点于含卡那霉素LB平板和无抗LB平板上，若在含卡那霉素的LB平板上不能生长，在无抗LB平板上生长，表明pCas质粒丢失，得到MHZ-0215-3(Ptac-bioA/Ptac-BFCD)菌株。

实施例2制备bioABFCD基因RBS强化的菌株MHZ-0215-4(RBS-bioABFCD)

(1)pTargetF-N20(RBS bioABFCD)质粒构建及Donor DNA-2构建

步骤1：以pTargetF质粒为模板(可参见Multigene Editing in the Escherichiacoli Genome via the CRISPR-Cas9 System,Jiang Y,Chen B,et al.Appl.EnvironMicrobiol,2015)，选用pTF-sgRNA-F1/pTF-sgRNA-R1引物对，扩增出带有N20的pTF线性质粒，使用无缝组装ClonExpress试剂盒将此线性质粒37℃进行组装，随后转化Trans1-T1感受态细胞，获得pTargetF-N20(RBS bioABFCD)，并进行PCR鉴定及测序验证；步骤2：以W3110基因组为模板，选用bioA-RBS-UF/bioA-RBS-UR引物对，扩增出含RBS的上游同源臂①；步骤3：以W3110基因组为模板，选用bioAp-F/bioAp-R、bioAp-F/bioABp-R、bioAp-F/bioBp-R1、bioAp-F/bioBp-R2引物对扩增出含有RBS的bioA/bioB启动子②；步骤4：以W3110基因组为模板，选用bioB-RBS-DF/bioB-RBS-DR引物对，扩增出含RBS的下游同源臂③；步骤5：以①、②、③为模板，选用bioA-RBS-UF/bioB-RBS-DR引物对，扩增出up-RBS-down片段，也称DonorDNA-2。

(2)感受态细胞制备及电转化

步骤1：将pCas质粒(可参见Multigene Editing in the Escherichia coliGenome via the CRISPR-Cas9 System,Jiang Y,Chen B,et al.Appl.EnvironMicrobiol,2015)电转入MHZ-0215-2感受态细胞中(转化方法及感受态制备方法均参照《分子克隆III》)；步骤2：挑取MHZ-0215-2(pCas)单菌落于5mL含卡那霉素和终浓度为10mM阿拉伯糖的LB试管中，30℃200r/min培养至OD

(3)重组验证

步骤1：使用引物对bioA-RBS-F/bioB-RBS-R对上述单菌落进行菌落PCR验证；步骤2：将PCR鉴定正确的菌株用引物对bioA-RBS-F/bioB-RBS-R扩增，扩增产物送测序，以验证序列的完整性。

(4)构建相关质粒丢失

步骤1：挑取测序验证正确的单菌落接种于5mL含卡那霉素及终浓度为0.5mM IPTG的LB试管中，30℃过夜培养后划线于含卡那霉素的LB平板上；步骤2：挑取单菌落对点于含卡那霉素、壮观霉素LB平板和只含卡那霉素的LB平板上，30℃过夜培养，若在含卡那霉素、壮观霉素的LB平板上不能生长，在卡那霉素的LB平板上生长，表明pTargetF-N20(RBSbioABFCD)质粒已丢失；步骤3：挑取pTargetF-N20(RBS bioABFCD)质粒丢失的阳性菌落，接种于无抗LB试管中，42℃培养8h后划线于LB平板上，37℃过夜培养；步骤4：挑取单菌落对点于含卡那霉素LB平板和无抗LB平板上，若在含卡那霉素的LB平板上不能生长，在无抗LB平板上生长，表明pCas质粒丢失，得到MHZ-0215-4(RBS-bioABFCD)菌株。

实施例3制备强化bioABFCD基因的菌株MHZ-0215-5(多拷贝)

(1)pTargetF-N20(IS1::bioABFCD)质粒及Donor DNA-3构建

步骤1：以pTargetF质粒为模板(可参见Multigene Editing in the Escherichiacoli Genome via the CRISPR-Cas9 System,Jiang Y,Chen B,et al.Appl.EnvironMicrobiol,2015)，选用pTF-sgRNA-F2/pTF-sgRNA-R2引物对，扩增出带有N20的pTF线性质粒，使用无缝组装ClonExpress试剂盒将此线性质粒37℃进行组装，随后转化Trans1-T1感受态细胞，获得pTargetF-N20(IS1::bioABFCD)，并进行PCR鉴定及测序验证；步骤2：以W3110基因组为模板，选用bioABFCD2-UF/bioABFCD2-UR引物对，扩增出上游同源臂①；步骤3：以W3110基因组为模板，选用bioABFCD2-F1/bioABFCD2-R1引物对扩增出bioABFCD操纵子上半段②；步骤4：以W3110基因组为模板，选用bioABFCD2-F2/bioABFCD2-R2引物对，扩增出bioABFCD操纵子下半段③；步骤5：以W3110基因组为模板，选用bioABFCD2-DF/bioABFCD2-DR引物对，扩增出下游同源臂④；Step6：以①、②、③、④为模板，选用bioABFCD2-UF/bioABFCD2-DR引物对，扩增出up-bioABFCD2-down片段，也称Donor DNA-3。

(2)感受态细胞制备及电转化

步骤1：将pCas质粒(可参见Multigene Editing in the Escherichia coliGenome via the CRISPR-Cas9 System,Jiang Y,Chen B,et al.Appl.EnvironMicrobiol,2015)电转入MHZ-0215-2感受态细胞中(转化方法及感受态制备方法均参照《分子克隆III》)；步骤2：挑取MHZ-0215-2(pCas)单菌落于5mL含卡那霉素和终浓度为10mM阿拉伯糖的LB试管中，30℃200r/min培养至OD

(3)重组验证

步骤1：使用引物对bioABFCD2-F/bioABFCD2-R对上述单菌落进行菌落PCR验证；步骤2：将PCR鉴定正确的菌株用引物对bioA-RBS-F/bioB-RBS-R扩增，扩增产物送测序，以验证序列的完整性。

(4)构建相关质粒丢失

步骤1：挑取测序验证正确的单菌落接种于5mL含卡那霉素及终浓度为0.5mM IPTG的LB试管中，30℃过夜培养后划线于含卡那霉素的LB平板上；步骤2：挑取单菌落对点于含卡那霉素、壮观霉素LB平板和只含卡那霉素的LB平板上，30℃过夜培养，若在含卡那霉素、壮观霉素的LB平板上不能生长，在卡那霉素的LB平板上生长，表明pTargetF-N20(IS1::bioABFCD)质粒已丢失；步骤3：挑取pTargetF-N20(IS1::bioABFCD)质粒丢失的阳性菌落，接种于无抗LB试管中，42℃培养8h后划线于LB平板上，37℃过夜培养；步骤4：挑取单菌落对点于含卡那霉素LB平板和无抗LB平板上，若在含卡那霉素的LB平板上不能生长，在无抗LB平板上生长，表明pCas质粒丢失，得到MHZ-0215-5(IS1::bioABFCD)菌株。

实施例4制备解除BirA对bioABFCD基因的转录阻遏的菌株MHZ-0215-6(birA点突变G57S)

(1)pTargetF-N20(birA G57S)质粒及Donor DNA-4构建

步骤1：以pTargetF质粒为模板(可参见Multigene Editing in the Escherichiacoli Genome via the CRISPR-Cas9 System,Jiang Y,Chen B,et al.Appl.EnvironMicrobiol,2015)，选用pTF-birA-sgRNA-F/pTF-birA-sgRNA-R引物对，扩增出带有N20的pTF线性质粒，使用无缝组装ClonExpress试剂盒将此线性质粒37℃进行组装，随后转化Trans1-T1感受态细胞，获得pTargetF-N20(birA G57S)，并进行PCR鉴定及测序验证；步骤2：以W3110基因组为模板，选用birAG57S-UF/birAG57S-UR引物对，扩增出上游同源臂①；步骤3：以W3110基因组为模板，选用birAG57S-DF/birAG57S-DR引物对扩增出下游同源臂②；步骤4：以①、②为模板，选用birAG57S-UF/birAG57S-DR引物对，扩增出up-down片段，也称Donor DNA-4。

(2)感受态细胞制备及电转化

步骤1：将pCas质粒(可参见Multigene Editing in the Escherichia coliGenome via the CRISPR-Cas9 System,Jiang Y,Chen B,et al.Appl.EnvironMicrobiol,2015)电转入MHZ-0215-2感受态细胞中(转化方法及感受态制备方法均参照《分子克隆III》)；步骤2：挑取MHZ-0215-2(pCas)单菌落于5mL含卡那霉素和终浓度为10mM阿拉伯糖的LB试管中，30℃200r/min培养至OD

(3)重组验证

步骤1：使用引物对birAG57S-F1/birAG57S-R对上述单菌落进行菌落PCR验证；步骤2：将PCR鉴定正确的菌株用引物对birAG57S-F/birAG57S-R扩增，扩增产物送测序，以验证序列的完整性。

(4)构建相关质粒丢失

步骤1：挑取测序验证正确的单菌落接种于5mL含卡那霉素及终浓度为0.5mM IPTG的LB试管中，30℃过夜培养后划线于含卡那霉素的LB平板上；步骤2：挑取单菌落对点于含卡那霉素、壮观霉素LB平板和只含卡那霉素的LB平板上，30℃过夜培养，若在含卡那霉素、壮观霉素的LB平板上不能生长，在卡那霉素的LB平板上生长，表明pTargetF-N20(birAG57S)质粒已丢失；步骤3：挑取pTargetF-N20(birA G57S)质粒丢失的阳性菌落，接种于无抗LB试管中，42℃培养8h后划线于LB平板上，37℃过夜培养；步骤4：挑取单菌落对点于含卡那霉素LB平板和无抗LB平板上，若在含卡那霉素的LB平板上不能生长，在无抗LB平板上生长，表明pCas质粒丢失，得到MHZ-0215-6(birA G57S)菌株。

实施例5制备解除BirA对bioABFCD基因的转录阻遏的菌株MHZ-0215-7(birA点突变Y58F)

(1)pTargetF-N20(birA Y58F)质粒及Donor DNA-5构建

步骤1：以pTargetF质粒为模板(可参见Multigene Editing in the Escherichiacoli Genome via the CRISPR-Cas9 System,Jiang Y,Chen B,et al.Appl.EnvironMicrobiol,2015)，选用pTF-birA-sgRNA-F/pTF-birA-sgRNA-R引物对，扩增出带有N20的pTF线性质粒，使用无缝组装ClonExpress试剂盒将此线性质粒37℃进行组装，随后转化Trans1-T1感受态细胞，获得pTargetF-N20(birA Y58F)，并进行PCR鉴定及测序验证；步骤2：以W3110基因组为模板，选用birAG57S-UF/birAY58F-UR引物对，扩增出上游同源臂①；步骤3：以W3110基因组为模板，选用birAY58F-DF/birAG57S-DR引物对扩增出下游同源臂②；步骤4：以①、②为模板，选用birAG57S-UF/birAG57S-DR引物对，扩增出up-down片段，也称Donor DNA-5。

(2)感受态细胞制备及电转化

步骤1：将pCas质粒(可参见Multigene Editing in the Escherichia coliGenome via the CRISPR-Cas9 System,Jiang Y,Chen B,et al.Appl.EnvironMicrobiol,2015)电转入MHZ-0215-2感受态细胞中(转化方法及感受态制备方法均参照《分子克隆III》)；步骤2：挑取MHZ-0215-2(pCas)单菌落于5mL含卡那霉素和终浓度为10mM阿拉伯糖的LB试管中，30℃200r/min培养至OD

(3)重组验证

步骤1：使用引物对birAY58F-F1/birAG57S-R对上述单菌落进行菌落PCR验证；步骤2：将PCR鉴定正确的菌株用引物对birAG57S-F/birAG57S-R扩增，扩增产物送测序，以验证序列的完整性。

(4)构建相关质粒丢失

步骤1：挑取测序验证正确的单菌落接种于5mL含卡那霉素及终浓度为0.5mM IPTG的LB试管中，30℃过夜培养后划线于含卡那霉素的LB平板上；步骤2：挑取单菌落对点于含卡那霉素、壮观霉素LB平板和只含卡那霉素的LB平板上，30℃过夜培养，若在含卡那霉素、壮观霉素的LB平板上不能生长，在卡那霉素的LB平板上生长，表明pTargetF-N20(birAY58F)质粒已丢失；步骤3：挑取pTargetF-N20(birA Y58F)质粒丢失的阳性菌落，接种于无抗LB试管中，42℃培养8h后划线于LB平板上，37℃过夜培养；步骤4：挑取单菌落对点于含卡那霉素LB平板和无抗LB平板上，若在含卡那霉素的LB平板上不能生长，在无抗LB平板上生长，表明pCas质粒丢失，得到MHZ-0215-7(birA Y58F)菌株。

实施例6制备强化bioABFCD基因并同时引入birA基因点突变的菌株

按照实施例1-5的方法，对bioABFCD和birA两个位点进行不同改造方式的叠加，共获得6株改造菌(MHZ-0217-0～MHZ-0217-5)。

(1)MHZ-0217-0(Ptac-bioABFCD,birA G57S)菌株构建

步骤1：将pCas质粒(可参见Multigene Editing in the Escherichia coliGenome via the CRISPR-Cas9 System,Jiang Y,Chen B,et al.Appl.EnvironMicrobiol,2015)电转入MHZ-0215-3感受态细胞中(转化方法及感受态制备方法均参照《分子克隆III》)；步骤2：挑取MHZ-0215-3(pCas)单菌落于5mL含卡那霉素和终浓度为10mM阿拉伯糖的LB试管中，30℃200r/min培养至OD

(2)MHZ-0217-1(Ptac-bioABFCD,birA Y58F)菌株构建

步骤1：将pCas质粒(可参见Multigene Editing in the Escherichia coliGenome via the CRISPR-Cas9 System,Jiang Y,Chen B,et al.Appl.EnvironMicrobiol,2015)电转入MHZ-0215-3感受态细胞中(转化方法及感受态制备方法均参照《分子克隆III》)；步骤2：挑取MHZ-0215-3(pCas)单菌落于5mL含卡那霉素和终浓度为10mM阿拉伯糖的LB试管中，30℃200r/min培养至OD

(3)MHZ-0217-2(RBS-bioABFCD,birA G57S)菌株构建

步骤1：将pCas质粒(可参见Multigene Editing in the Escherichia coliGenome via the CRISPR-Cas9 System,Jiang Y,Chen B,et al.Appl.EnvironMicrobiol,2015)电转入MHZ-0215-4感受态细胞中(转化方法及感受态制备方法均参照《分子克隆III》)；步骤2：挑取MHZ-0215-4(pCas)单菌落于5mL含卡那霉素和终浓度为10mM阿拉伯糖的LB试管中，30℃200r/min培养至OD

(4)MHZ-0217-3(RBS-bioABFCD,birA Y58F)菌株构建

步骤1：将pCas质粒(可参见Multigene Editing in the Escherichia coliGenome via the CRISPR-Cas9 System,Jiang Y,Chen B,et al.Appl.EnvironMicrobiol,2015)电转入MHZ-0215-4感受态细胞中(转化方法及感受态制备方法均参照《分子克隆III》)；步骤2：挑取MHZ-0215-4(pCas)单菌落于5mL含卡那霉素和终浓度为10mM阿拉伯糖的LB试管中，30℃200r/min培养至OD

(5)MHZ-0217-4(IS1::bioABFCD,birA G57S)菌株构建

步骤1：将pCas质粒(可参见Multigene Editing in the Escherichia coliGenome via the CRISPR-Cas9 System,Jiang Y,Chen B,et al.Appl.EnvironMicrobiol,2015)电转入MHZ-0215-5感受态细胞中(转化方法及感受态制备方法均参照《分子克隆III》)；步骤2：挑取MHZ-0215-5(pCas)单菌落于5mL含卡那霉素和终浓度为10mM阿拉伯糖的LB试管中，30℃200r/min培养至OD

(6)MHZ-0217-5(IS1::bioABFCD,birA Y58F)菌株构建

步骤1：将pCas质粒(可参见Multigene Editing in the Escherichia coliGenome via the CRISPR-Cas9 System,Jiang Y,Chen B,et al.Appl.EnvironMicrobiol,2015)电转入MHZ-0215-5感受态细胞中(转化方法及感受态制备方法均参照《分子克隆III》)；步骤2：挑取MHZ-0215-5(pCas)单菌落于5mL含卡那霉素和终浓度为10mM阿拉伯糖的LB试管中，30℃200r/min培养至OD

实施例1-6所获得的产苏氨酸基因改造菌株如表2所示。

表2本发明构建的基因工程菌

实施例7产L-苏氨酸的基因工程菌的摇瓶发酵验证

步骤1:从冻存管中取MHZ-0215-2、MHZ-0215-3、MHZ-0215-4、MHZ-0215-5、MHZ-0215-6、MHZ-0215-7、MHZ-0217-0、MHZ-0217-1、MHZ-0217-2、MHZ-0217-3、MHZ-0217-4、MHZ-0217-5共12株，在LB平板上划线活化，37℃培养18-24h；步骤2:将菌体从平板上刮下一环，接种到装有50mL种子培养基(表3)的摇瓶中，37℃，转速90rpm，培养约5小时，使OD

表3种子培养基(g/L)

表4发酵培养基(g/L)

表5产苏氨酸基因工程菌生产力比较

注：*表示P值<0.01，表明其与对照相比有明显差异。

由表5可知，本发明提供的新型大肠杆菌基因工程菌，其L-苏氨酸产量均高于各自对照菌株，其中bioABFCD表达活性增强的菌株摇瓶糖酸转化率在18-19％之间，较出发菌提高1.6-2.7个百分点；birA解除转录阻遏的菌株同样摇瓶转化率在18-19％之间，较出发菌株提高2.2-3个百分点。由这两个位点改造的摇瓶发酵结果可以得出，生物素合成操纵子bioABFCD的表达加强或者解除BirA对bioABFCD的转录阻遏均可以明显提高L-苏氨酸的生产能力。

两个位点同时改造的菌株，摇瓶发酵转化率在21-24％之间，其L-苏氨酸的转化率进一步提升。其中表现最好的菌株MHZ-0217-4的产量为20.2g/L，转化率为23.8％，出发菌MHZ-0215-2的L-苏氨酸产量为13.8g/L，转化率为16.2％。MHZ-0217-4的L-苏氨酸产量较出发菌提高46.38％，转化率提高46.91％，可见，基因工程改造菌的L-苏氨酸生产能力明显优于MHZ-0214-2。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。