CD4的抗原结合构建体

技术领域

在此描述的实施方式总体上涉及抗原结合构建体(如，抗体及其片段)，包括结合至CD4的微抗体(minibody)、cys-双价抗体(cys-diabody)、scFv等，以及它们的使用方法。

序列表的引用

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背景技术

CD4(分化簇4)是膜糖蛋白，其是T细胞亚类的特异性标记。CD4与T细胞受体(TCR)一起充当共受体以识别MHC II类细胞的抗原呈递。CD4行使功能以启动或增强T细胞活化的早期阶段。

发明内容

本文提供的一些实施方式涉及抗原结合构建体，如，抗体，包括抗体片段，其包括：SEQ ID NO:2中的HCDR1的HCDR1；SEQ ID NO:2中的HCDR2的HCDR2；SEQ ID NO:2中的HCDR3的HCDR3；SEQ ID NO:4中的LCDR1的LCDR1；SEQ ID NO:4中的LCDR2的LCDR2；以及SEQ IDNO:4中的LCDR3的LCDR3。在一些实施方式中，抗原结合构建体还包括在本文提供的一个或多个框架区中的一个或多个点突变或残基。

本文提供的一些实施方式涉及抗原结合构建体，如，抗体，包括抗体片段，其包括：SEQ ID NO:2中的HCDR1的HCDR1；SEQ ID NO:2中的HCDR2的HCDR2；SEQ ID NO:2中的HCDR3的HCDR3；SEQ ID NO:4中的LCDR1的LCDR1；SEQ ID NO:4中的LCDR2的LCDR2；SEQ ID NO:4中的LCDR3的LCDR3；以及至少一个选自由以下各项组成的VH框架残基：SEQ ID NO:2中序列第1位的谷氨酰胺；SEQ ID NO:2中序列第5位的缬氨酸；SEQ ID NO:2中序列第9位的丙氨酸；SEQ ID NO:2中序列第11位的缬氨酸；SEQ ID NO:2中序列第13位的赖氨酸；SEQ ID NO:2中序列第44位的精氨酸；SEQ ID NO:2中序列第46位的谷氨酸；SEQ ID NO:2中序列第65位的谷氨酰胺；SEQ ID NO:2中序列第66位的甘氨酸；SEQ ID NO:2中序列第67位的精氨酸；SEQID NO:2中序列第68位的缬氨酸；SEQ ID NO:2中序列第69位的苏氨酸；SEQ ID NO:2中序列第87位的精氨酸；SEQ ID NO:2中序列第88位的丝氨酸。

本文提供的一些实施方式涉及抗原结合构建体，如，抗体，包括抗体片段，其包括：SEQ ID NO:2中的HCDR1的HCDR1；SEQ ID NO:2中的HCDR2的HCDR2；SEQ ID NO:2中的HCDR3的HCDR3；SEQ ID NO:4中的LCDR1的LCDR1；SEQ ID NO:4中的LCDR2的LCDR2；SEQ ID NO:4中的LCDR3的LCDR3；以及至少一个VL框架残基，选自由以下各项组成的组：SEQ ID NO:4中序列第1位的谷氨酸；SEQ ID NO:4中序列第13位的亮氨酸；SEQ ID NO:4中序列第18位的精氨酸；SEQ ID NO:4中序列第20位的苏氨酸；SEQ ID NO:4中序列第21位的亮氨酸；SEQ ID NO:4中序列第22位的丝氨酸；SEQ ID NO:4中序列第41位的谷氨酰胺；SEQ ID NO:4中序列第42位的丙氨酸；SEQ ID NO:4中序列第57位的异亮氨酸；SEQ ID NO:4中序列第59位的天冬氨酸；SEQ ID NO:4中序列第70位的苯丙氨酸；SEQ ID NO:4中序列第71位的苏氨酸；SEQ IDNO:4中序列第77位的亮氨酸；SEQ ID NO:4中序列第79位的脯氨酸；SEQ ID NO:4中序列第84位的缬氨酸；以及SEQ ID NO:4中序列第99位的甘氨酸。

本文提供的一些实施方式涉及抗原结合构建体，如，抗体，包括抗体片段，其包括：SEQ ID NO:2中的HCDR1的HCDR1；SEQ ID NO:2中的HCDR2的HCDR2；SEQ ID NO:2中的HCDR3的HCDR3；SEQ ID NO:4中的LCDR1的LCDR1；SEQ ID NO:4中的LCDR2的LCDR2；SEQ ID NO:4中的LCDR3的LCDR3；至少一个选自由以下各项组成的VH框架残基：SEQ ID NO:2中序列第1位的谷氨酰胺；SEQ ID NO:2中序列第5位的缬氨酸；SEQ ID NO:2中序列第9位的丙氨酸；SEQID NO:2中序列第11位的缬氨酸；SEQ ID NO:2中序列第13位的赖氨酸；SEQ ID NO:2中序列第44位的精氨酸；SEQ ID NO:2中序列第46位的谷氨酸；SEQ ID NO:2中序列第65位的谷氨酰胺；SEQ ID NO:2中序列第66位的甘氨酸；SEQ ID NO:2中序列第67位的精氨酸；SEQ IDNO:2中序列第68位的缬氨酸；SEQ ID NO:2中序列第69位的苏氨酸；SEQ ID NO:2中序列第87位的精氨酸；SEQ ID NO:2中序列第88位的丝氨酸；以及至少一个VL框架残基，选自由以下各项组成的组：SEQ ID NO:4中序列第1位的谷氨酸；SEQ ID NO:4中序列第13位的亮氨酸；SEQ ID NO:4中序列第18位的精氨酸；SEQ ID NO:4中序列第20位的苏氨酸；SEQ ID NO:4中序列第21位的亮氨酸；SEQ ID NO:4中序列第22位的丝氨酸；SEQ ID NO:4中序列第41位的谷氨酰胺；SEQ ID NO:4中序列第42位的丙氨酸；SEQ ID NO:4中序列第57位的异亮氨酸；SEQ ID NO:4中序列第59位的天冬氨酸；SEQ ID NO:4中序列第70位的苯丙氨酸；SEQ IDNO:4中序列第71位的苏氨酸；SEQ ID NO:4中序列第77位的亮氨酸；SEQ ID NO:4中序列第79位的脯氨酸；SEQ ID NO:4中序列第84位的缬氨酸；以及SEQ ID NO:4中序列第99位的甘氨酸。

在一些实施方式中，抗原结合构建体特异性地结合至CD4。在一些实施方式中，抗原结合构建体消耗CD4 T细胞。在一些实施方式中，抗原结合构建体包含如本文中所描述的可检测标记。在一些实施方式中，抗原结合构建体包含如本文中所描述的治疗剂。

本文提供的一些实施方式涉及抗原结合构建体，如，抗体，包括抗体片段，其包括可变重链结构域(VH)，其中，VH包含SEQ ID NO:2中的氨基酸序列。

本文提供的一些实施方式涉及抗原结合构建体，如，抗体，包括抗体片段，其包括可变轻链结构域(VL)，其中，VL包含SEQ ID NO:4中的氨基酸序列。

本文提供的一些实施方式涉及抗原结合构建体，如，抗体，包括抗体片段，其包括：SEQ ID NO:2的可变重链结构域(VH)；以及SEQ ID NO:4的可变轻链结构域(VL)。

本文提供的一些实施方式涉及抗原结合构建体，如，抗体，包括抗体片段，其中，抗原结合构建体是全长抗体。

本文提供的一些实施方式涉及结合至CD4的人源化微抗体。在一些实施方式中，微抗体可以包含SEQ ID NO:5、6、7或8的氨基酸序列。本文提供的一些实施方式涉及编码如在此所描述的抗原结合构建体(例如，CD4抗体或抗体片段)的核酸序列。在一些实施方式中，核酸序列包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的核酸序列(如图9或图10所示)。

本文提供的一些实施方式涉及结合至CD4的人源化cys-双价抗体。在一些实施方式中，人源化cys-双价抗体包含SEQ ID NO:11、12、13、14、15、16、17或18的氨基酸序列。在一些实施方式中，cys-双价抗体可以包含可变重链结构域(VH)和可变轻链结构域(VL)，其中，从N端至C端是VH、VL。在一些实施方式中，cys-双价抗体可以包含可变重链结构域(VH)和可变轻链结构域(VL)，其中，从N端至C端是VL、VH。

在一些实施方式中，抗原结合构建体可以包含铰链区。在一些实施方式中，铰链区可以包含SEQ ID NO:34、35、36或37的氨基酸序列。

在此的一些实施方式涉及抗原结合构建体，如，抗体，包括抗体片段，其中，抗原结合构建体包含多肽，多肽包含含有连接至可变轻链结构域(VL)的可变重链结构域(VH)的单链可变片段(scFv)。在一些实施方式中，抗原结合构建体是微抗体或双价抗体。

本文提供的一些实施方式涉及抗原结合构建体，如，抗体，包括抗体片段，其包括以下各项中的至少两个：SEQ ID NO:2中序列第1位的谷氨酰胺；SEQ ID NO:2中序列第5位的缬氨酸；SEQ ID NO:2中序列第9位的丙氨酸；SEQ ID NO:2中序列第11位的缬氨酸；SEQID NO:2中序列第13位的赖氨酸；SEQ ID NO:2中序列第44位的精氨酸；SEQ ID NO:2中序列第46位的谷氨酸；SEQ ID NO:2中序列第65位的谷氨酰胺；SEQ ID NO:2中序列第66位的甘氨酸；SEQ ID NO:2中序列第67位的精氨酸；SEQ ID NO:2中序列第68位的缬氨酸；SEQ IDNO:2中序列第69位的苏氨酸；SEQ ID NO:2中序列第87位的精氨酸；SEQ ID NO:2中序列第88位的丝氨酸；SEQ ID NO:4中序列第1位的谷氨酸；SEQ ID NO:4中序列第13位的亮氨酸；SEQ ID NO:4中序列第18位的精氨酸；SEQ ID NO:4中序列第20位的苏氨酸；SEQ ID NO:4中序列第21位的亮氨酸；SEQ ID NO:4中序列第22位的丝氨酸；SEQ ID NO:4中序列第41位的谷氨酰胺；SEQ ID NO:4中序列第42位的丙氨酸；SEQ ID NO:4中序列第57位的异亮氨酸；SEQ ID NO:4中序列第59位的天冬氨酸；SEQ ID NO:4中序列第70位的苯丙氨酸；SEQ IDNO:4中序列第71位的苏氨酸；SEQ ID NO:4中序列第77位的亮氨酸；SEQ ID NO:4中序列第79位的脯氨酸；SEQ ID NO:4中序列第84位的缬氨酸；SEQ ID NO:4中序列第99位的甘氨酸。

本文提供的一些实施方式涉及抗原结合构建体，如，抗体，包括抗体片段，其包括以下各项中的至少三种：SEQ ID NO:2中序列第1位的谷氨酰胺；SEQ ID NO:2中序列第5位的缬氨酸；SEQ ID NO:2中序列第9位的丙氨酸；SEQ ID NO:2中序列第11位的缬氨酸；SEQID NO:2中序列第13位的赖氨酸；SEQ ID NO:2中序列第44位的精氨酸；SEQ ID NO:2中序列第46位的谷氨酸；SEQ ID NO:2中序列第65位的谷氨酰胺；SEQ ID NO:2中序列第66位的甘氨酸；SEQ ID NO:2中序列第67位的精氨酸；SEQ ID NO:2中序列第68位的缬氨酸；SEQ IDNO:2中序列第69位的苏氨酸；SEQ ID NO:2中序列第87位的精氨酸；SEQ ID NO:2中序列第88位的丝氨酸；SEQ ID NO:4中序列第1位的谷氨酸；SEQ ID NO:4中序列第13位的亮氨酸；SEQ ID NO:4中序列第18位的精氨酸；SEQ ID NO:4中序列第20位的苏氨酸；SEQ ID NO:4中序列第21位的亮氨酸；SEQ ID NO:4中序列第22位的丝氨酸；SEQ ID NO:4中序列第41位的谷氨酰胺；SEQ ID NO:4中序列第42位的丙氨酸；SEQ ID NO:4中序列第57位的异亮氨酸；SEQ ID NO:4中序列第59位的天冬氨酸；SEQ ID NO:4中序列第70位的苯丙氨酸；SEQ IDNO:4中序列第71位的苏氨酸；SEQ ID NO:4中序列第77位的亮氨酸；SEQ ID NO:4中序列第79位的脯氨酸；SEQ ID NO:4中序列第84位的缬氨酸；SEQ ID NO:4中序列第99位的甘氨酸。

本文提供的一些实施方式涉及抗原结合构建体，如，抗体，包括抗体片段，其包括所有以下各项：SEQ ID NO:2中序列第1位的谷氨酰胺；SEQ ID NO:2中序列第5位的缬氨酸；SEQ ID NO:2中序列第9位的丙氨酸；SEQ ID NO:2中序列第11位的缬氨酸；SEQ ID NO:2中序列第13位的赖氨酸；SEQ ID NO:2中序列第44位的精氨酸；SEQ ID NO:2中序列第46位的谷氨酸；SEQ ID NO:2中序列第65位的谷氨酰胺；SEQ ID NO:2中序列第66位的甘氨酸；SEQID NO:2中序列第67位的精氨酸；SEQ ID NO:2中序列第68位的缬氨酸；SEQ ID NO:2中序列第69位的苏氨酸；SEQ ID NO:2中序列第87位的精氨酸；SEQ ID NO:2中序列第88位的丝氨酸；SEQ ID NO:4中序列第1位的谷氨酸；SEQ ID NO:4中序列第13位的亮氨酸；SEQ ID NO:4中序列第18位的精氨酸；SEQ ID NO:4中序列第20位的苏氨酸；SEQ ID NO:4中序列第21位的亮氨酸；SEQ ID NO:4中序列第22位的丝氨酸；SEQ ID NO:4中序列第41位的谷氨酰胺；SEQ ID NO:4中序列第42位的丙氨酸；SEQ ID NO:4中序列第57位的异亮氨酸；SEQ ID NO:4中序列第59位的天冬氨酸；SEQ ID NO:4中序列第70位的苯丙氨酸；SEQ ID NO:4中序列第71位的苏氨酸；SEQ ID NO:4中序列第77位的亮氨酸；SEQ ID NO:4中序列第79位的脯氨酸；SEQ ID NO:4中序列第84位的缬氨酸；SEQ ID NO:4中序列第99位的甘氨酸。

在一些方面，提供了一种包含以下各项的抗原结合构建体：SEQ ID NO:2中的HCDR1的HCDR1；SEQ ID NO:2中的HCDR2的HCDR2；SEQ ID NO:2中的HCDR3的HCDR3；SEQ IDNO:4中的LCDR1的LCDR1；SEQ ID NO:4中的LCDR2的LCDR2；SEQ ID NO:4中的LCDR3的LCDR3；以及至少一个选自由以下各项组成的VH框架残基：SEQ ID NO:2中序列第1位的谷氨酰胺；SEQ ID NO:2中序列第5位的缬氨酸；SEQ ID NO:2中序列第9位的丙氨酸；SEQ ID NO:2中序列第11位的缬氨酸；SEQ ID NO:2中序列第13位的赖氨酸；SEQ ID NO:2中序列第44位的精氨酸；SEQ ID NO:2中序列第46位的谷氨酸；SEQ ID NO:2中序列第65位的谷氨酰胺；SEQ IDNO:2中序列第66位的甘氨酸；SEQ ID NO:2中序列第67位的精氨酸；SEQ ID NO:2中序列第68位的缬氨酸；SEQ ID NO:2中序列第69位的苏氨酸；SEQ ID NO:2中序列第87位的精氨酸；SEQ ID NO:2中序列第88位的丝氨酸。

在一些方面，提供了一种包含以下各项的抗原结合构建体：SEQ ID NO:2中的HCDR1的HCDR1；SEQ ID NO:2中的HCDR2的HCDR2；SEQ ID NO:2中的HCDR3的HCDR3；SEQ IDNO:4中的LCDR1的LCDR1；SEQ ID NO:4中的LCDR2的LCDR2；SEQ ID NO:4中的LCDR3的LCDR3；以及至少一个VL框架残基，选自由以下各项组成的组：SEQ ID NO:4中序列第1位的谷氨酸；SEQ ID NO:4中序列第13位的亮氨酸；SEQ ID NO:4中序列第18位的精氨酸；SEQ ID NO:4中序列第20位的苏氨酸；SEQ ID NO:4中序列第21位的亮氨酸；SEQ ID NO:4中序列第22位的丝氨酸；SEQ ID NO:4中序列第41位的谷氨酰胺；SEQ ID NO:4中序列第42位的丙氨酸；SEQID NO:4中序列第57位的异亮氨酸；SEQ ID NO:4中序列第59位的天冬氨酸；SEQ ID NO:4中序列第70位的苯丙氨酸；SEQ ID NO:4中序列第71位的苏氨酸；SEQ ID NO:4中序列第77位的亮氨酸；SEQ ID NO:4中序列第79位的脯氨酸；SEQ ID NO:4中序列第84位的缬氨酸；SEQID NO:4中序列第99位的甘氨酸。

在一些方面，提供了编码本文提供的微抗体的核酸序列，核酸序列包含SEQ IDNO:9或SEQ ID NO:10中的核酸序列。

在一些方面，提供了包含以下各项的微抗体或cys-双价抗体：SEQ ID NO:2中的HCDR1的HCDR1；SEQ ID NO:2中的HCDR2的HCDR2；SEQ ID NO:2中的HCDR3的HCDR3；SEQ IDNO:4中的LCDR1的LCDR1；SEQ ID NO:4中的LCDR2的LCDR2；SEQ ID NO:4中的LCDR3的LCDR3；以及以下各项中的至少一个：SEQ ID NO:2中序列第1位的谷氨酰胺；SEQ ID NO:2中序列第2位的缬氨酸；SEQ ID NO:2中序列第4位的亮氨酸；SEQ ID NO:2中序列第24位的丙氨酸；SEQ ID NO:2中序列第25位的丝氨酸；SEQ ID NO:2中序列第34位的甲硫氨酸；SEQ ID NO:2中序列第35位的组氨酸；SEQ ID NO:2中序列第46位的谷氨酸；SEQ ID NO:2中序列第47位的色氨酸；SEQ ID NO:2中序列第48位的异亮氨酸；SEQ ID NO:2中序列第49位的甘氨酸；SEQ ID NO:2中序列第50位的丙氨酸；SEQ ID NO:2中序列第51位的亮氨酸；SEQ ID NO:2中序列第61位的天冬酰胺；SEQ ID NO:2中序列第64位的苯丙氨酸；SEQ ID NO:2中序列第70位的异亮氨酸；SEQ ID NO:2中序列第72位的精氨酸；SEQ ID NO:2中序列第79位的丙氨酸；SEQ ID NO:2中序列第97位的苏氨酸；SEQ ID NO:2中序列第98位的精氨酸；SEQ ID NO:4中序列第1位的谷氨酸；SEQ ID NO:4中序列第2位的异亮氨酸；SEQ ID NO:4中序列第4位的亮氨酸；SEQ ID NO:4中序列第6位的谷氨酰胺；SEQ ID NO:4中序列第34位的色氨酸；SEQ IDNO:4中序列第35位的酪氨酸；SEQ ID NO:4中序列第45位的亮氨酸；SEQ ID NO:4中序列第46位的亮氨酸；SEQ ID NO:4中序列第47位的异亮氨酸；SEQ ID NO:4中序列第67位的甘氨酸；SEQ ID NO:4中序列第70位的苯丙氨酸；SEQ ID NO:4中序列第97位的苯丙氨酸。

在一些方面，提供了一种包含以下各项的抗原结合构建体：SEQ ID NO:2中的HCDR1的HCDR1；SEQ ID NO:2中的HCDR2的HCDR2；SEQ ID NO:2中的HCDR3的HCDR3；SEQ IDNO:4中的LCDR1的LCDR1；SEQ ID NO:4中的LCDR2的LCDR2；SEQ ID NO:4中的LCDR3的LCDR3；以及以下各项的至少一个：SEQ ID NO:2中序列第1位的谷氨酰胺；SEQ ID NO:2中序列第20位的缬氨酸；SEQ ID NO:2中序列第38位的精氨酸；SEQ ID NO:2中序列第40位的丙氨酸；SEQ ID NO:2中序列第44位的精氨酸；SEQ ID NO:2中序列第60位的酪氨酸；SEQ ID NO:2中序列第68位的缬氨酸；SEQ ID NO:2中序列第70位的异亮氨酸；SEQ ID NO:2中序列第72位的精氨酸；SEQ ID NO:2中序列第74位的苏氨酸；SEQ ID NO:4中序列第1位的谷氨酸；SEQID NO:4中序列第11位的亮氨酸；SEQ ID NO:4中序列第13位的亮氨酸；SEQ ID NO:4中序列第19位的丙氨酸；SEQ ID NO:4中序列第21位的亮氨酸；SEQ ID NO:4中序列第57位的异亮氨酸；SEQ ID NO:4中序列第70位的苯丙氨酸；SEQ ID NO:4中序列第77位的亮氨酸；SEQ IDNO:4中序列第79位的脯氨酸；SEQ ID NO:4中序列第84位的缬氨酸；SEQ ID NO:4中序列第99位的甘氨酸。

在一些方面，提供了一种包含以下各项的抗原结合构建体：SEQ ID NO:2中的HCDR1的HCDR1；SEQ ID NO:2中的HCDR2的HCDR2；SEQ ID NO:2中的HCDR3的HCDR3；SEQ IDNO:4中的LCDR1的LCDR1；SEQ ID NO:4中的LCDR2的LCDR2；SEQ ID NO:4中的LCDR3的LCDR3；以及以下各项中的至少一个：

a)包含以下各项中的至少一个的VH：E1Q、Q5V、T9A、V10E、L11V、A12K、R13K、Q19K、M20V、K38R、R40A、Q46E、T59、N61、K65Q、D66G、K67R、A68V、K69T、L70I、A72R、V73D、T87R、N88S、S91T、T115L或L116V；

b)包含以下各项中的至少一个的VL：Q1E、I10T、M11L、A13L、K18R、V19A、A20T、M21L、T22S、S41Q、S42A、V57I、V59D、I62S、S69D、Y70F、S71T、M77L、A79P、A82、T84V、A99G或L106I；

c)a)的VH和b)的VL；

d)a)、b)和c)中的任一项，其中，VH与SEQ ID NO:2的同一性为至少80％；

e)a)、b)和c)中的任一项，其中，VL与SEQ ID NO:4的同一性为至少80％；

f)a)、b)和c)中的任一项，其中，VH与SEQ ID NO:2的同一性为至少80％；以及a)、b)和c)中的任一项，其中，VL与SEQ ID NO:4的同一性为至少80％；

g)具有T59、N61或两者的VH，其中，VH是人源化VH；

h)具有A82的VL，其中，VL是人源化VL；

i)根据g)的VH和根据h)的VL；

j)具有Q46E的VH；

k)具有Q46E的VH，其中，

i)VH与SEQ ID NO:2的同一性为至少80％

ii)VL与SEQ ID NO:4的同一性为至少80％

iiii)VH与SEQ ID NO:2的同一性为至少80％，并且VL与SEQ ID NO:4的同一性为至少80％；

l)具有T115L、L116V中的至少一个的VH；

m)具有S41Q、A99G或L106I中的至少一个的VL；

n)具有T115L、L116V中的至少一个的VH和具有S41Q、A99G或L106I中的至少一个的VL；或者

o)l)、m)或n)，其中，

i)VH与SEQ ID NO:2的同一性为至少80％

ii)VL与SEQ ID NO:4的同一性为至少80％

iiii)VH与SEQ ID NO:2的同一性为至少80％，并且VL与SEQ ID NO:4的同一性为至少80％。

在一些方面，提供了结合至人CD4的人源化微抗体，其中，人源化微抗体包含：SEQID NO:2中的HCDR1的HCDR1；SEQ ID NO:2中的HCDR2的HCDR2；SEQ ID NO:2中的HCDR3的HCDR3；SEQ ID NO:4中的LCDR1的LCDR1；SEQ ID NO:4中的LCDR2的LCDR2；SEQ ID NO:4中的LCDR3的LCDR3；以及以下各项中的至少一个：

a)具有T59、N61或两者的VH，其中，VH是人源化VH，其中，VH与SEQ ID NO:2的同一性为至少80％，并且VL与SEQ ID NO:4的同一性为至少80％；

b)VL-VH取向(氨基至羧基)的VH和VL；

c)具有A99G的VL；

d)具有T59、N61或两者的VH，

e)具有A99G的VL和ii)具有T59、N61或两者的VH，

f)具有T59、N61或两者的VH，其中，VH是人源化VH，其中，VH与SEQ ID NO:2的同一性为至少80％，并且VL与SEQ ID NO:4的同一性为至少80％，并且其中，VL包含A99G；或者

g)包含T59、N61或两者的VH，其中，VH是如根据SEQ ID NO:2的编号方式编号的人源化VH，以及如根据SEQ ID NO:4的编号方式编号的包含A99G的VL。

在一些方面，提供了治疗受试者的方法，该方法包括：提供患有CD4相关病症的受试者；以及施用受试者有效量的人源化微抗体或抗原结合构建体或微抗体或cys-双价抗体，以便减少来自CD4相关病症的至少一个症状。

在一些方面，提供了人源化微抗体或抗原结合构建体或微抗体或cys-双价抗体在制备用于治疗CD4相关病症的药物的用途。

在一些方面，提供了人源化微抗体或抗原结合构建体或微抗体或cys-双价抗体用作药物。

在一些方面，提供了人源化微抗体或抗原结合构建体或微抗体或cys-双价抗体用于以下各项中的至少一个：检测、诊断、手术、分期(staging)、治疗、治疗监测、疾病进展监测和监测疗法(monitoring therapy)。

在一些方面，提供了人源化微抗体或抗原结合构建体或微抗体或cys-双价抗体，用于在以下各项中的至少一个中使用：CD4相关病症的检测、诊断、手术、分期、治疗、治疗监测、疾病进展监测以及监测治疗。

附图说明

图1描绘了嵌合体和人源化IAB41变体与HPB-ALL细胞的流式细胞术结合分析的结果。SEQ ID NO:5是人源化IAB41-1(Hu-IAB41-1)。

图2描绘了与未缀合的微抗体相比较，去铁胺缀合的人源化抗人CD4微抗体与HPB-ALL细胞的流式细胞术结合分析的结果。Df-Hu-IAB41-1包括来自SEQ ID NO:5的序列，连同Df螯合剂。

图3示出了抗CD4抗原结合构建体VH和VL序列的一些实施方式。SEQ ID NO:2和SEQID NO:4包括针对IAB41-1的VH和VL序列(并且两者都包括在SEQ ID NO:5中)。

图4示出了针对微抗体的氨基酸序列的一些实施方式。

图5示出了针对微抗体的氨基酸序列的一些实施方式。

图6示出了针对微抗体的氨基酸序列的一些实施方式。

图7示出了针对微抗体的氨基酸序列的一些实施方式。

图8示出了编码微抗体的核酸序列的一些实施方式。

图9示出了编码微抗体的核酸序列的一些实施方式。

图10示出了针对cys-双价抗体的氨基酸序列的一些实施方式。

图11示出了针对cys-双价抗体的氨基酸序列的一些实施方式。

图12示出了针对cys-双价抗体的氨基酸序列的一些实施方式。

图13示出了针对cys-双价抗体的氨基酸序列的一些实施方式。

图14示出了针对cys-双价抗体的氨基酸序列的一些实施方式。

图15示出了针对cys-双价抗体的氨基酸序列的一些实施方式。

图16示出了针对cys-双价抗体的氨基酸序列的一些实施方式。

图17示出了针对cys-双价抗体的氨基酸序列的一些实施方式。

图18示出了针对微抗体的铰链区的氨基酸序列的一些实施方式。

图19提供了本文提供的一些抗原结合构建体的重链序列的注释序列比对。如所指示的，X表示CDR的多个实施方式的位置。实心框标记如由North B.et al,J Mol Biol2011；406:228-56限定的CDR区。加下划线的残基是如由Chotia限定的CDR区。以较暗的阴影突出显示的残基是在小鼠与人源化构建体之间不同的框架残基。

图20提供了本文提供的一些抗原结合构建体的轻链序列的注释序列比对。X表示CDR的多个实施方式的位置，如所指示的。实心框标记如由North B.et al,J Mol Biol2011；406:228-56限定的CDR区。加下划线的残基是如由Chotia限定的CDR区。X表示CDR的不同实施方式的位置，如所指示的。以较暗阴影突出显示的残基是小鼠与人源化构建体之间不同的框架残基。

图21提供了人CD4的氨基酸序列。

具体实施方式

在此描述的是抗原结合构建体，包括抗体及其片段，如，cys-双价抗体和微抗体。在一些实施方式中，这些构建体结合至CD4。此类抗原结合构建体可以用于检测靶分子(CD4和/或CD4+细胞，例如，某些类别的T细胞)的存在、定位和/或量。此类抗原结合构建体还可以用于将治疗剂靶向表达靶分子的细胞。在一些实施方式中，抗原结合构建体本身可以是治疗剂(不需要另外的有效负载)。在一些实施方式中，提供了用于使用抗原结合构建体(包括抗体和构建体，如，cys-双价抗体和/或微抗体)检测靶分子(或“靶标”)的存在或不存在的方法。在一些实施方式中，提供了使用用于治疗目的抗原结合构建体的方法。提供以下限定用于应用的上下文。以下这些限定和多种实施方式是对多种实施方式的更详细说明。

病症的“处理(treating)”或“治疗(treatment)”可以指预防病症、减缓病症的发作和/或发展速率、降低发展病症的风险、预防和/或延迟与病症相关的症状的发展、减少或结束与病状相关联的症状、生成病症的完全或部分消退或它们的一些组合。术语“预防”不要求绝对禁止病症(disorder)或疾病。

本文提供的关于治疗或处理的任何选择或实施方式还可以应用于化合物在制备用于治疗病症的药物中的用途。

“治疗有效量”或“治疗有效剂量”是在受试者中产生所期望的治疗效果(如，预防、治疗靶病症、延迟病症和/或症状的发作、和/或减轻与病症相关的症状)的量。该量会根据多种因素而变化，多种因素包括但不限于治疗化合物的特征(包括活性、药代动力学、药效动力学以及生物利用度)、受试者的生理状况(包括年龄、性别、疾病类型和阶段、一般身体状况、对给定剂量的响应性、以及药物类型)、一个或多个药学上可接受的载体在制剂中的性质、和/或施用途径。鉴于本公开，临床和药理学领域的技术人员将能够通过常规实验(例如，通过监测受试者施用化合物的反应并且相应地调整剂量)来确定治疗有效量。如需更多指导，请参见Remington:The Science and Practice of Pharmacy 21.sup.st Edition,Univ.of Sciences in Philadelphia(USIP),Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia,Pa.,2005。

术语“抗原结合构建体”包括所有种类的抗体，包括其结合片段并且包括微抗体和/或双价抗体和/或cys-双价抗体。还包括包含1、2、3、4、5和/或6个CDR的构建体。在一些实施方式中，在传统抗体中，这些CDR可以分布在其适当的框架区之间。在一些实施方式中，CDR可以包含在重链和/或轻链可变区内。在一些实施方式中，CDR可以在重链和/或轻链内。在一些实施方式中，CDR可以在单肽链内。在一些实施方式中，CDR可以在共价连接在一起的两个或更多个肽内。在一些实施方式中，它们可以由二硫键共价连接在一起。在一些实施方式中，它们可以经由连接分子或部分(moiety)连接。在一些实施方式中，抗原结合蛋白是非共价的，如，双价抗体和单价scFv。除非本文另外指出，本文所描述的抗原结合构建体结合至所指出的靶分子。术语“靶标”或“靶分子”表示CD4蛋白。CD4蛋白的实施例是本领域已知的。本文提供的对抗原结合构建体的任何参考不仅指作为属的分子类别，而且还具体地考虑属于该类别的构建体的任何一个或多个物种(以任何组合形式)，例如，微抗体、双价抗体、cys-双价抗体、抗体等。

术语“抗体”包括但不限于免疫球蛋白的基因工程化的或以其他方式修饰的形式，如，体内抗体、嵌合抗体、全人源抗体、人源化抗体、抗体片段以及异源缀合抗体(例如，双特异性抗体、双价抗体、三抗体、四抗体等)。术语“抗体”包括cys-双价抗体和微抗体。术语抗体包括工程化scFv、微抗体、纤维化结构域、纳米抗体、亲和体、环肽和cys-双价抗体抗体片段。在一些实施方式中，这些构建体能够结合并且特异性地靶向人CD4。

因此，除非另外明确指出，否则在此关于“抗体”提供的每个实施方式也被设想为cys-双价抗体和/或微抗体实施方式。术语“抗体”包括免疫球蛋白家族的多肽或包含免疫球蛋白的片段的多肽，该免疫球蛋白的片段能够非共价地、可逆地并且以特异性方式结合对应的抗原。示例性抗体结构单元包含四聚体。在一些实施方式中，全长抗体可以由两个相同的多肽链对组成，每对具有一个通过二硫键连接的“轻”链和一个“重”链。所识别的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及无数的免疫球蛋白可变区基因。对于全长链，轻链被分类为κ或λ。对于全长链，重链被分类为γ、μ、α、δ或ε，其进而分别限定免疫球蛋白类别IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。每条链的N端限定了主要负责抗原识别的约100至110个或更多个氨基酸的可变区。术语可变轻链(VL)和可变重链(VH)分别指轻链和重链的这些区。如在本申请中所使用的，“抗体”涵盖抗体及其片段的所有变体。因此，在这个概念的范围内是具有相同结合特异性的全长抗体、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体(scFv)、Fab、Fab’以及这些片段的多聚体形式(例如，F(ab’)2)。在一些实施方式中，抗体特异性地结合至所期望的靶标。

“互补性决定域”或“互补性决定区”(CDR)可互换地指VL和VH的高变区。CDR是具有针对此类靶蛋白的特异性的抗体链的靶蛋白结合位点。在一些实施方式中，在每个VL和/或VH中存在构成可变结构域的约15％至20％的三个CDR(CDR1至3，从N端顺序地编号)。CDR在结构上与靶蛋白的表位互补并且因此直接负责结合特异性。VL或VH的剩余延伸，即所谓的框架区(FR)，表现出在氨基酸序列中的较少的变体(Kuby,Immunology,第4版，第4章，W.H.Freeman&Co.,New York,2000)。

CDR和框架区的位置可以使用本领域中不同的熟知的定义来限定(Wu,T.T.,E.A.Kabat.1970.An analysis of the sequences of the variable regions of BenceJones proteins and myeloma light chains and their implications for antibodycomplementarity.J.Exp.Med.132:211-250；Kabat,E.A.,Wu,T.T.,Perry,H.,Gottesman,K.,and Foeller,C.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,5thed.,NIH Publication No.91-3242,Bethesda,MD)，Chothia定义(Chothia and Lesk,J.Mol.Biol.,196:901-917(1987)；Chothia et al.,Nature,342:877-883(1989)；Chothiaet al.,J.Mol.Biol.,227:799-817(1992)；Al-Lazikani et al.,J.Mol.Biol.,273:927-748(1997))，ImMunoGeneTics数据库(IMGT)限定(在万维网imgt.org，Giudicelli,V.,Duroux,P.,Ginestoux,C.,Folch,G.,Jabado-Michaloud,J.,Chaume,D.and Lefranc,M.-P.IMGT/LIGM-DB,the

术语“结合特异性决定簇(binding specificity determinant)”或“BSD”可互换地是指在确定抗体的结合特异性所必需的互补性决定区内的最小连续或非连续氨基酸序列。最小结合特异性决定簇可以在一个或多个CDR序列内。在一些实施方式中，最小结合特异性决定簇位于抗体的重链和轻链的CDR3序列的一部分或全长内(即，仅由其确定)。在一些实施方式中，重链可变区的CDR3对于抗原结合构建体特异性是足够的。

如本文所使用的，“抗体可变轻链”或“抗体可变重链”是指分别包含VL或VH的多肽。内源VL由基因区段V(可变)和J(连接)编码，并且内源VH由V、D(多样性)和J编码。VL或VH中的每一个包括CDR以及框架区。在本申请中，抗体可变轻链和/或抗体可变重链可以时不时地统称为“抗体链”。这些术语涵盖含有不破坏VL或VH的基本结构的突变的抗体链，如本领域技术人员将容易认识到的。在一些实施方式中，考虑了全长重链和/或轻链。在一些实施方式中，仅重链和/或轻链的可变区被认为存在。

抗体可以作为完整的免疫球蛋白或作为通过用各种肽酶分解产生的许多片段而存在。因此，例如，胃蛋白酶分解铰链区中二硫键以下的抗体以产生F(ab)’2，Fab’的二聚体，其本身是由二硫键与VH-CH1连接的轻链(VLCL)。可以在温和条件下还原F(ab)’2以破坏铰链区中的二硫键，从而将F(ab)’2二聚体转化成Fab’单体。Fab’单体是具有铰链区的一部分的Fab。(Paul,Fundamental Immunology 3d ed.(1993))。虽然就完整抗体的消化而言限定了各种抗体片段，但技术人员将理解，此类片段可以化学地或通过使用重组DNA方法从头合成。因此，如本文所使用的术语“抗体”还包括通过修饰完整抗体产生的抗体片段，或使用重组DNA方法从头合成的那些(例如，单链Fv)或使用噬菌体、酵母或哺乳动物细胞识别的那些(参见例如McCafferty et al.,Nature 348:552-554(1990))，或通过杂交瘤技术(Tomita M,Tsumoto K,Immunotherapy.Mar 2011,3(3):371-80)识别的那些，或通过B细胞克隆识别的那些(Tiller T.,Single B cell antibody technologies.NewBiotechnol.2011；28:453-457)。

为了制备单克隆抗体或多克隆抗体，可以使用本领域已知的任何技术(参见，例如，Kohler&Milstein,Nature 256:495-497(1975)；Kozbor et al.,Immunology Today 4:72(1983)；Cole et al.,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,pp.77-96.AlanR.Liss,Inc.1985；Advances in the production of human monoclonal antibodiesShixia Wang,Antibody Technology Journal 2011:1 1-4；J Cell Biochem.2005Oct 1；96(2):305-13；Recombinant polyclonal antibodies for cancer therapy；Sharon J,Liebman MA,Williams BR；and Drug Discov Today.2006Jul,11(13-14):655-60，Recombinant polyclonal antibodies:the next generation of antibodytherapeutics？,Haurum JS)。用于生产单链抗体的技术(美国专利号4,946,778)可以适于产生针对本发明的多肽的抗体。同样，转基因小鼠或其他生物体(如，其他哺乳动物)可以用于表达完全人类单克隆抗体。或者，噬菌体、酵母或哺乳动物细胞展示技术可以用于识别对所选抗原的高亲和力结合物(参见例如McCafferty et al.,supra；Marks et al.,Biotechnology,10:779-783,(1992))。

用于人源化非人源抗体的方法是本领域熟知的。通常，人源化抗体具有从非人类的来源引入其中的一个或多个氨基酸残基。这些非人源氨基酸残基通常称为输入残基，其通常取自输入可变结构域。在一些实施方式中，可以采用术语“供体”和“受体”序列。人源化可以基本上按照Winter和合作者的方法进行(参见例如Jones et al.,Nature 321:522-525(1986)；Riechmann et al.,Nature 332:323-327(1988)；Verhoeyen et al.,Science239:1534-1536(1988)和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992))，通过用啮齿类动物CDR或CDR序列取代人源抗体的对应序列。因此，此类人源化抗体是嵌合抗体(美国专利号4,816,567)，其中，基本上小于完整的人源可变结构域被来自非人类物种的对应序列取代。实际上，人源化抗体典型地是其中一些互补性决定区(“CDR”)残基和可能的一些框架(“FR”)残基被来自啮齿类动物抗体中的类似位点的残基取代的人抗体。

“嵌合抗体”是抗体分子，其中(a)恒定区或其一部分被改变、替换或交换，使得抗原结合位点(可变区)连接至不同或改变的类别的恒定区、效应子功能和/或物种或赋予嵌合抗体(例如，酶、毒素、激素、生长因子和药物)新特性的完全不同的分子；或(b)可变区或其部分被具有不同或改变的抗原特异性的可变区改变、替换或交换。

抗体还包括一个或多个免疫球蛋白链，这些免疫球蛋白链与其他蛋白质化学缀合或表达为融合蛋白。在一些实施方式中，抗原结合构建体可以是单价scFv构建体。在一些实施方式中，抗原结合构建体可以是双特异性构建体。双特异性或双功能抗体是具有两个不同的重链/轻链对和两个不同的结合位点的人工杂合抗体。本发明的其他抗原结合片段或抗体部分包括二价scFv(双价抗体和cys-双价抗体)、双特异性scFv抗体(其中抗体分子识别两个不同表位)、单结合结构域(sdAb或纳米抗体)、以及微抗体。

术语“抗体片段”包括但不限于单独的或与其他分子组合的一个或多个抗体的抗原结合片段，包括但不限于Fab’、F(ab’)2、Fab、Fv、rIgG(还原IgG)、scFv片段(单价、三价等)、单结构域片段(纳米抗体)、肽抗体、微抗体、双价抗体和cys-双价抗体。术语“scFv”是指单链Fv(“片段可变”)抗体，其中传统的双链抗体的重链和轻链的可变结构域已经被连接以形成一条链。

药学上可接受的载体可以是药学上可接受的材料、组合物或载体，其涉及将感兴趣的化合物从身体的一个组织、器官或部分携带或者运输至身体的另一组织、器官或部分。例如，载体可以是液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或封装材料或它们的一些组合。载体的每种组分是“药学上可接受的”，因为它与配制品的其他成分是相容的。它还必须适合于与其可能遇到的任何组织、器官或身体部分接触，这意味着它必须不带有毒性、刺激、过敏反应、免疫原性或任何其他过度超过其治疗效益的并发症的风险。在此描述的药物组合物可以通过任何适合的施用途径进行施用。施用途径可以指本领域已知的任何施用途径，包括但不限于气雾剂、肠内、鼻、眼、口服、肠胃外、直肠、透皮(例如局部乳膏或软膏、贴剂)或阴道。“经皮”施用可以使用局部乳膏或软膏或通过经皮贴剂来完成。“胃肠外”是指通常与注射相关的施用途径，包括眶下、输注、动脉内、囊内、心脏内、真皮内、肌内、腹膜内、肺内、脊柱内、胸骨内、鞘内、子宫内、静脉内、蛛网膜下、囊下、皮下、经粘膜或经气管。在一些实施方式中，抗原结合构建体可以在介入或切除期间作为局部施用在手术中进行递送。

微抗体是一种抗体形式，它具有比全长抗体更小的分子量，同时保持针对抗原的二价结合特性。由于其较小的尺寸，微抗体在靶向肿瘤组织时具有从系统更快的清除和增强的渗透。由于强靶向的能力与快速清除相结合，微抗体对于细胞毒性/放射性有效负荷的诊断成像和递送是有利的，对此延长的循环时间可能导致对患者给药或剂量测定不利。

当在上下文中使用其来描述抗原之间的相互作用时，短语“特异性(或选择性)结合”，例如，蛋白质是指抗体或抗体衍生的结合剂，是指决定蛋白质和其他生物制剂的异质群体中抗原的存在的结合反应，例如在生物样品中，例如血液、血清、血浆或组织样品。因此，在指定的免疫测定条件下，在一些实施方式中，具有特定结合至特异性的抗体或结合剂与特定抗原结合至少是背景的两倍，并且基本上不以显著量与样品中存在的其他抗原结合。在此类条件下与抗体或结合剂的特异性结合可能需要针对特定蛋白质的特异性选择抗体或试剂。可以使用多种免疫测定形式来选择与特定蛋白质具有特异性免疫反应性的抗体。例如，常规地使用固相ELISA和流式细胞术免疫测定来选择与蛋白质具有特异性免疫反应性的抗体(参见，例如，Harlow&Lane,Using Antibodies,ALaboratory Manual(1998)，关于可以用于确定特异性免疫反应性的免疫测定形式和条件的描述)。典型地，特异性或选择性结合反应将产生超过背景信号至少两倍并且更典型地超过背景至少10至100倍的信号。

术语“平衡解离常数(KD，M)”是指解离速率常数(kd，时间

当应用于核酸或蛋白时，术语“分离的”表示核酸或蛋白基本上不含在天然状态下与其缔合的其他细胞组分。在一些实施方式中，它可以是干燥溶液或水溶液。可以使用分析化学技术(如，聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法(HPLC))确定纯度和均匀性。在制备中存在的主要种类的蛋白质是基本上纯化的。具体地，分离的基因与开放阅读框分离，该开放阅读框位于基因侧翼并且编码除目标基因之外的蛋白质。术语“纯化的”表示核酸或蛋白质在电泳凝胶中基本上产生条带。在一些实施方式中，这可以表示核酸或蛋白质是在体内条件下存在的分子的至少85％纯，更优选至少95％纯，并且最优选至少99％纯。

术语“核酸”或“多核苷酸”是指处于单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其聚合物。除非明确限制，该术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，这些天然核苷酸具有与参比核酸相似的结合特性并且以与天然存在的核苷酸相似的方式被代谢。除非另外指明，特定的核酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)、等位基因、直向同源物、SNP、和互补序列以及明确指明的序列。具体而言，简并密码子取代可以通过生成其中一个或多个所选(或所有)密码子的第三位置被混合的碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现(Batzer et al.,Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka et al.,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；和Rossolini et al.,Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994))。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物。这些术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。

术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些以及稍后被修饰的那些氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸酯和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构的化合物，即，与氢、羧基、氨基和R基团结合的α-碳，例如，高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。此类类似物具有修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或修饰的肽主链，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构但是以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的化合物。

“保守修饰变体”适用于氨基酸序列和核酸序列两者。就特定核酸序列而言，保守修饰变体是指编码相同或基本相同氨基酸序列的那些核酸，或其中核酸不编码氨基酸序列，是指基本相同的序列。由于遗传密码的简并性，大量功能相同的核酸编码任何给定的蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在丙氨酸由密码子指定的每个位置，密码子可以被改变为所描述的任何对应的密码子，而不改变编码的多肽。此类核酸变体是“沉默变体”，它们是保守修饰变体的一个物种。本文中编码多肽的每个核酸序列还描述核酸的每个可能的沉默变体。本技术领域人员将认识到，核酸中的每个密码子(除了AUG，其通常是甲硫氨酸的唯一密码子，和TGG，其通常是色氨酸的唯一密码子)可以被修饰以产生功能上相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每种沉默变体隐含在每种所描述的序列中。

关于氨基酸序列，技术人员将认识到对核酸、肽、多肽或蛋白质序列的单个取代、缺失或添加(其改变、添加或缺失编码序列中的单个氨基酸或小百分比氨基酸)是“保守修饰变体”，其中改变导致氨基酸化学上相似的氨基酸被取代。提供功能类似氨基酸的保守替代表是本领域中众所周知的。此类保守修饰变体是除本发明的多态性变体、种间同源物、以及等位基因之外，并且不排除它们。

以下八组各自包含彼此保守取代的氨基酸：1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；以及8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(参见例如Creighton,Proteins(1984))。

可以通过在比较窗口上比较两个最佳比对的序列来确定“序列同一性百分比”，其中，为了两个序列的最佳比对，与不包含添加或缺失的参考序列(例如，本发明的多肽)相比，比较窗口中的多核苷酸序列的部分可以包含添加或缺失(即，空位)。百分比是通过确定相同核酸碱基或氨基酸残基存在于两个序列中的位置的数目以产生匹配位置的数目来计算的，将匹配位置的数目除以比较窗口中位置的总数，并将结果乘以100以得到序列同一性百分比。

在两个或更多个核酸或多肽序列的背景下，术语“相同的”或百分比“同一性”是指作为相同序列的两个或更多个序列或子序列。当在比较窗口或指定区域(如使用以下序列比较算法中的一个或通过手动比对和目视检查所测量的)上比较和比对最大对应时，如果两个序列具有指定百分比的相同的氨基酸残基或核苷酸(例如，在指定区域上，或者当未指定时，在参考序列的整个序列上，序列同一性为70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)，则两个序列是“基本上一致的”。本文提供的一些实施方式提供了分别与本文例示的多肽或多核苷酸基本上相同的多肽或多核苷酸。可选地，同一性存在于至少约15、25或50个核苷酸长度的区域上，或更优选在100至500或1000或更多个核苷酸长度的区域上，或在参考序列的全长上。就氨基酸序列而言，同一性或基本同一性可以存在于长度为至少5、10、15或20个氨基酸，可选地长度为至少约25、30、35、40、50、75或100个氨基酸，可选地长度为至少约150、200或250个氨基酸，或在参考序列的全长上。关于较短的氨基酸序列，例如，20个或更少的氨基酸的氨基酸序列，在一些实施方式中，当根据在此定义的保守取代，一个或两个氨基酸残基被保守取代时，存在基本上的一致性。

对于序列比较，通常一个序列充当参考序列，测试序列与参考序列进行比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入到计算机中，必要时指定子序列坐标，并且指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数，或可以指定替代参数。然后序列比较算法基于程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。

如在此所使用的，“比较窗口”包括指代选自由以下各项组成的组的多个连续位置中的任一个位置的区段，该组由以下各项组成：从20至600，通常约50至约200，更通常约100至约150，其中在最佳比对两个序列后，可以将序列与相同数目的连续位置的参考序列进行比较。用于比较的序列比对方法是本领域公知的。用于比较的最佳序列比对可以例如通过Smith和Waterman的局部同源性算法来进行(Adv.Appl.Math.2:482c(1970))，通过Needleman和Wunsch的同源比对算法(J.Mol.Biol.48:443(1970))，通过Pearson和Lipman(Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85:2444(1988))，通过这些算法(Wisconsin GeneticsSoftware Package中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,Wis.)的计算机化实施，或通过人工比对和视觉检查(参见例如Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology(1995增补))。

适于确定序列同一性百分比和序列相似性百分比的算法的两个实施例是BLAST和BLAST 2.0算法，其分别描述于Altschul et al.(1977)Nuc.Acids Res.25:3389-3402和Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215:403-410。用于进行BLAST分析的软件可通过National Center for Biotechnology Information公开获得。该算法涉及首先通过识别查询序列中长度为W的短词来识别高分序列对(HSP)，当与数据库序列中相同长度的词比对时，这些词要么匹配要么满足某个正值阈值评分T。T被称为邻近词评分阈值(Altschul etal.，同上)。这些初始相邻词命中充当用于启动搜索以发现包含它们的较长HSP的种子。词命中沿着每个序列在两个方向上延伸，只要累积的比对评分可以增加。对于核苷酸序列，使用参数M(一对匹配残基的奖励评分)计算累积评分；总是>0)和N(用于不匹配残基的罚分；总是＜0)。对于氨基酸序列，使用评分矩阵计算累积评分。当累积比对分数从其最大实现值下降数量X时，停止词命中在每个方向上的延伸；由于一个或多个负评分残基比对的累积，累积评分变为零或以下；或者到达任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X确定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用字长(W)为11、期望值(E)或10、M＝5、N＝-4以及两条链的比较作为默认值。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用字长3、期望值(E)10和BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff and Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915)比对(B)为50，期望值(E)为10，M＝5，N＝-4，并对两条链比较。

BLAST算法还对两个序列之间的相似性进行统计分析(参见例如Karlin andAltschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5787)。由BLAST算法提供的一种相似性测定是最小总和概率(P(N))，这提供了两个核苷酸或氨基酸序列之间将发生偶然匹配的概率指示。例如，如果测试核酸与参考核酸的比较中的最小总和概率小于约0.2，更优选小于约0.01，并且最优选小于约0.001，则认为核酸与参考序列相似。

两个核酸序列或多肽基本相同的指示是第一核酸编码的多肽与针对第二核酸编码的多肽产生的抗体发生免疫交叉反应，如下所描述。例如，如果测试核酸与参考核酸的比较中的最小总和概率小于约0.2，更优选小于约0.01，并且最优选小于约0.001，则认为核酸与参考序列相似。两个核酸序列基本上相同的另一指示是这两个分子或它们的互补物在严格条件下彼此杂交，如下所描述。两个核酸序列基本相同的另一指示是相同的引物可以用于扩增序列。

术语“受试者”、“患者”和“个体”可互换地指正在检查和/或治疗的实体。这可以包括例如哺乳动物，例如人类或非人类灵长类哺乳动物。哺乳动物也可以是实验室哺乳动物，例如小鼠、大鼠、兔、仓鼠。在一些实施方式中，哺乳动物可以是农业哺乳动物(例如，马、绵羊、牛、猪、骆驼)或家养哺乳动物(例如，犬、猫)。

术语“治疗上可接受的量”或“治疗有效剂量”可互换地指足以影响所期望的结果的量。在一些实施方式中，治疗上可接受的量不诱导或引起不期望的副作用。治疗上可接受的量可以通过首先施用低剂量，并且然后递增地增加剂量直到达到所期望的效果来确定。

如本文所使用的术语“实施方式”表示不同组分或排列以及元素的分组和组合。术语不一定表示离散的发明。即，可以设想，对于各种要求保护的组合，使用本文提供的指导，本文提供的各种实施方式可以彼此组合。

本文描述了结合至靶的抗原结合构建体。抗原结合构建体是包括特异性结合至靶分子或与靶分子具有免疫反应性的免疫球蛋白或免疫球蛋白相关分子的一个或多个部分的分子。对于本文提供的所有抗原结合构建体，在相同的背景下，微抗体、双价抗体和/或cys-双价抗体排列各自被具体地考虑。

在一些实施方式中，本文提供的任何人源化微抗体或抗原结合构建体或cys-双价抗体(包括SEQ ID NO:5-8中的一个或多个，例如，5)可以用可检测标记进行标记，如，本文提供的一个或多个正电子发射体，例如

在一些实施方式中，抗原结合构建体包含SEQ ID NO:2中的HCDR1的重链CDR1(HCDR1)；SEQ ID NO:2中的HCDR2的重链CDR2(HCDR2)；SEQ ID NO:2中的HCDR3的重链CDR3(HCDR3)；SEQ ID NO:3中的LCDR1的轻链CDR1(LCDR1)；SEQ ID NO:3中的LCDR2的轻链CDR2(LCDR2)；和/或SEQ ID NO:3中的LCDR3的轻链CDR3(LCDR3)。在一些实施方式中，抗原结合构建体包括以上CDR中的6、5、4、3、2或1个。在一些实施方式中，抗原结合构建体特异性地结合至靶分子。在一些实施方式中，抗原结合构建体与具有本文提供的CDR的一个或多个抗体竞争结合。在一些实施方式中，抗原结合构建体是人源或人源化的。在一些实施方式中，抗原结合构建体包括可检测标记。在一些实施方式中，抗原结合构建体包括治疗剂。

在一些实施方式中，抗原结合构建体是二价的。二价抗原结合构建体可以包括至少第一抗原结合结构域，(例如，第一scFv)和至少第二抗原结合结构域(例如，第二scFv)。在一些实施方式中，二价抗原结合构建体是多聚体，其包括至少两个单体，例如至少2、3、4、5、6、7或8个单体，其各自具有抗原结合结构域。在一些实施方式中，抗原结合构建体是微抗体。在一些实施方式中，抗原结合构建体是双价抗体，包括例如cys-双价抗体。scFv和/或微抗体和/或cys-双价抗体可以包括本文提供的CDR和重链可变区和/或轻链可变区实施方式中的任何一个。

在一些实施方式中，抗原结合构建体具有SEQ ID NO:2中的重链可变区的重链可变区。在一些实施方式中，该抗原结合构建体具有包括与SEQ ID NO:2具有至少约80％同一性的序列的重链可变区，例如至少约80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在一些实施方式中，保持SEQ ID NO:2内的CDR，而其他残基可以改变。在一些实施方式中，抗原结合构建体如图4中所示，或包括与MAX16H5(SEQ ID NO:2或4中的任一者或两者中)相比在IAB41中所示的差异中的任何一者或多者。在一些实施方式中，与MAX16H5相比，抗原结合构建体具有在IAB41中示出的差异中的至少1、2、3、4、5、6、7或更多个差异。在一些实施方式中，它具有足够的差异以提供与IAB41相同水平的结合和/或特异性和/或产生。在一些实施方式中，抗原结合构体具有至少与IAB41相同水平的结合和/或特异性和/或产生的50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或100％。

在一些实施方式中，抗原结合构建体具有包括SEQ ID NO:4的轻链可变区。在一些实施方式中，抗原结合构建体具有包括与SEQ ID NO:4具有至少约80％同一性的序列的重链可变区，例如至少约80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在一些实施方式中，保持SEQ ID NO:4内的CDR，而其他残基可以改变。

本文提供的一些实施方式包括与本文提供的一个或多个抗原结合构建体竞争结合至靶分子的抗原结合构建体。在一些实施方式中，竞争性抗原结合构建体与参考抗原结合构建体结合靶分子上的相同表位。在一些实施方式中，参考抗原结合构建体结合至靶分子的第一表位，并且竞争抗原结合构建体结合至靶分子的第二表位，但干扰参考抗原结合构建体与靶分子的结合，例如通过空间阻断参考抗原结合构建体的结合，或通过诱导靶分子中的构象变化。在一些实施方式中，第一表位与第二表位重叠。在一些实施方式中，对于scFv、微抗体和/或双价抗体，本文提供的任何重链可变区可以与在此的任何轻链可变区组合。

在一些实施方式中，微抗体和cys-双价抗体形式对于诊断成像和某些治疗应用具有有利的药代动力学特征，同时保持亲本抗体的高结合亲和力和特异性。与用全长亲本抗体成像相比，这些片段的药代动力学是更期望的，因为它们能够靶向抗原并且然后快速清除用于快速高对比度成像的系统。在一些实施方式中，微抗体和cys-双价抗体的较短血清半衰期在一定范围的时间内允许发生成像，微抗体注射后约8至48小时和cys-双价抗体注射后2至24小时。快速的血清清除和更好的组织穿透可以允许当天成像，在临床上为患者护理管理提供了显著的优势。

在一些实施例中，提供了包含SEQ ID NO:2中的HCDR1的HCDR1、SEQ ID NO:2中的HCDR2的HCDR2、SEQ ID NO:2中的HCDR3的HCDR3、SEQ ID NO:4中的LCDR1的LCDR1、SEQ IDNO:4中的LCDR2的LCDR2和SEQ ID NO:4中的LCDR3的LCDR3的抗原结合构建体。在一些实施方式中，可以采用如图19和图20中所示的任何CDR。具有这些CDR的抗原结合构建体(其可以是例如微抗体或cys-双价抗体)还可以包括以下排列中的一个或多个(如在a)至n)中提供的)。

a)至少一个VH框架残基，选自由以下各项组成的组：SEQ ID NO:2中序列第1位的谷氨酰胺；SEQ ID NO:2中序列第5位的缬氨酸；SEQ ID NO:2中序列第9位的丙氨酸；SEQ IDNO:2中序列第11位的缬氨酸；SEQ ID NO:2中序列第13位的赖氨酸；SEQ ID NO:2中序列第44位的精氨酸；SEQ ID NO:2中序列第46位的谷氨酸；SEQ ID NO:2中序列第65位的谷氨酰胺；SEQ ID NO:2中序列第66位的甘氨酸；SEQ ID NO:2中序列第67位的精氨酸；SEQ ID NO:2中序列第68位的缬氨酸；SEQ ID NO:2中序列第69位的苏氨酸；SEQ ID NO:2中序列第87位的精氨酸；以及SEQ ID NO:2中序列第88位的丝氨酸。

b)至少一个VL框架残基，选自由以下各项组成的组：SEQ ID NO:4中序列第1位的谷氨酸；SEQ ID NO:4中序列第13位的亮氨酸；SEQ ID NO:4中序列第18位的精氨酸；SEQ IDNO:4中序列第20位的苏氨酸；SEQ ID NO:4中序列第21位的亮氨酸；SEQ ID NO:4中序列第22位的丝氨酸；SEQ ID NO:4中序列第41位的谷氨酰胺；SEQ ID NO:4中序列第42位的丙氨酸；SEQ ID NO:4中序列第57位的异亮氨酸；SEQ ID NO:4中序列第59位的天冬氨酸；SEQ IDNO:4中序列第70位的苯丙氨酸；SEQ ID NO:4中序列第71位的苏氨酸；SEQ ID NO:4中序列第77位的亮氨酸；SEQ ID NO:4中序列第79位的脯氨酸；SEQ ID NO:4中序列第84位的缬氨酸；以及SEQ ID NO:4中序列第99位的甘氨酸。

c)与b)组合的a)。

d)以下各项中的至少一个：SEQ ID NO:2中序列第1位的谷氨酰胺；SEQ ID NO:2中序列第2位的缬氨酸；SEQ ID NO:2中序列第4位的亮氨酸；SEQ ID NO:2中序列第24位的丙氨酸；SEQ ID NO:2中序列第25位的丝氨酸；SEQ ID NO:2中序列第34位的甲硫氨酸；SEQ IDNO:2中序列第35位的组氨酸；SEQ ID NO:2中序列第46位的谷氨酸；SEQ ID NO:2中序列第47位的色氨酸；SEQ ID NO:2中序列第48位的异亮氨酸；SEQ ID NO:2中序列第49位的甘氨酸；SEQ ID NO:2中序列第50位的丙氨酸；SEQ ID NO:2中序列第51位的亮氨酸；SEQ ID NO:2中序列第61位的天冬酰胺；SEQ ID NO:2中序列第64位的苯丙氨酸；SEQ ID NO:2中序列第70位的异亮氨酸；SEQ ID NO:2中序列第72位的精氨酸；SEQ ID NO:2中序列第79位的丙氨酸；SEQ ID NO:2中序列第97位的苏氨酸；SEQ ID NO:2中序列第98位的精氨酸；SEQ ID NO:4中序列第1位的谷氨酸；SEQ ID NO:4中序列第2位的异亮氨酸；SEQ ID NO:4中序列第4位的亮氨酸；SEQ ID NO:4中序列第6位的谷氨酰胺；SEQ ID NO:4中序列第34位的色氨酸；SEQID NO:4中序列第35位的酪氨酸；SEQ ID NO:4中序列第45位的亮氨酸；SEQ ID NO:4中序列第46位的亮氨酸；SEQ ID NO:4中序列第47位的异亮氨酸；SEQ ID NO:4中序列第67位的甘氨酸；SEQ ID NO:4中序列第70位的苯丙氨酸；SEQ ID NO:4中序列第97位的苯丙氨酸。

e)以下各项中的至少一个：SEQ ID NO:2中序列第1位的谷氨酰胺；SEQ ID NO:2中序列第20位的缬氨酸；SEQ ID NO:2中序列第38位的精氨酸；SEQ ID NO:2中序列第40位的丙氨酸；SEQ ID NO:2中序列第44位的精氨酸；SEQ ID NO:2中序列第60位的酪氨酸；SEQ IDNO:2中序列第68位的缬氨酸；SEQ ID NO:2中序列第70位的异亮氨酸；SEQ ID NO:2中序列第72位的精氨酸；以及SEQ ID NO:2中序列第74位的苏氨酸。

f)以下各项中的至少一个：SEQ ID NO:4中序列第1位的谷氨酸；SEQ ID NO:4中序列第11位的亮氨酸；SEQ ID NO:4中序列第13位的亮氨酸；SEQ ID NO:4中序列第19位的丙氨酸；SEQ ID NO:4中序列第21位的亮氨酸；SEQ ID NO:4中序列第57位的异亮氨酸；SEQ IDNO:4中序列第70位的苯丙氨酸；SEQ ID NO:4中序列第77位的亮氨酸；SEQ ID NO:4中序列第79位的脯氨酸；SEQ ID NO:4中序列第84位的缬氨酸；以及SEQ ID NO:4中序列第99位的甘氨酸。

g)与f)组合的e)。

h)以下各项中的至少一个：SEQ ID NO:2中序列第1位的谷氨酰胺；SEQ ID NO:2中序列第2位的缬氨酸；SEQ ID NO:2中序列第4位的亮氨酸；SEQ ID NO:2中序列第24位的丙氨酸；SEQ ID NO:2中序列第25位的丝氨酸；SEQ ID NO:2中序列第34位的甲硫氨酸；SEQ IDNO:2中序列第35位的组氨酸；SEQ ID NO:2中序列第46位的谷氨酸；SEQ ID NO:2中序列第47位的色氨酸；SEQ ID NO:2中序列第48位的异亮氨酸；SEQ ID NO:2中序列第49位的甘氨酸；SEQ ID NO:2中序列第50位的丙氨酸；SEQ ID NO:2中序列第51位的亮氨酸；SEQ ID NO:2中序列第61位的天冬酰胺；SEQ ID NO:2中序列第64位的苯丙氨酸；SEQ ID NO:2中序列第70位的异亮氨酸；SEQ ID NO:2中序列第72位的精氨酸；SEQ ID NO:2中序列第79位的丙氨酸；SEQ ID NO:2中序列第97位的苏氨酸；SEQ ID NO:2中序列第98位的精氨酸；

i)以下各项中的至少一个：SEQ ID NO:4中序列第1位的谷氨酸；SEQ ID NO:4中序列第2位的异亮氨酸；SEQ ID NO:4中序列第4位的亮氨酸；SEQ ID NO:4中序列第6位的谷氨酰胺；SEQ ID NO:4中序列第34位的色氨酸；SEQ ID NO:4中序列第35位的酪氨酸；SEQ IDNO:4中序列第45位的亮氨酸；SEQ ID NO:4中序列第46位的亮氨酸；SEQ ID NO:4中序列第47位的异亮氨酸；SEQ ID NO:4中序列第67位的甘氨酸；SEQ ID NO:4中序列第70位的苯丙氨酸；以及SEQ ID NO:4中序列第97位的苯丙氨酸。

j)与i)组合的h)。

k)图3中的小鼠序列与人源化序列之间的比对中不同的框架残基中的任何一个或多个。

l)图4、图20和/或图21中的人源化序列的Vernier区中的残基中的任何一个或多个，其中人源化序列不同于小鼠序列。

m)a)至l)中的任何一个或多个中记载的残基中的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16个或更多个。

n)a)至l)中的任何一个中记载的残基的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。

虽然参考SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4，但上述参考(除非上下文另外指明)是用于残基定位。因此，除非另有说明，参考特定残基不需要序列中任何其他残基的存在。

在一些实施方式中，抗原结合构建体(如，微抗体、双价抗体或cys-双价抗体)包含：SEQ ID NO:2中的HCDR1的HCDR1；SEQ ID NO:2中的HCDR2的HCDR2；SEQ ID NO:2中的HCDR3的HCDR3；SEQ ID NO:4中的LCDR1的LCDR1；SEQ ID NO:4中的LCDR2的LCDR2；SEQ IDNO:4中的LCDR3的LCDR3；以及以下各项中的至少一个：

a)包含以下各项中的至少一个的VH：E1Q、Q5V、T9A、V10E、L11V、A12K、R13K、Q19K、M20V、K38R、R40A、Q46E、T59、N61、K65Q、D66G、K67R、A68V、K69T、L70I、A72R、V73D、T87R、N88S、S91T、T115L或L116V；以及

b)包含以下各项中的至少一个的VL：1E、10T、11L、13L、18R、19A、20T、21L、22S、41Q、42A、57I、59D、62S、69D、70F、71T、77L、79P、A82、84V、99G或106I。

CDR可以是本领域技术人员所理解的任何CDR，包括在此所讨论的CDR和/或包括附图中所示的任何CDR。

在一些实施方式中，抗原结合构建体包含：SEQ ID NO:2中的HCDR1的HCDR1；SEQID NO:2中的HCDR2的HCDR2；SEQ ID NO:2中的HCDR3的HCDR3；SEQ ID NO:4中的LCDR1的LCDR1；SEQ ID NO:4中的LCDR2的LCDR2；SEQ ID NO:4中的LCDR3的LCDR3；以及以下各项中的至少一个：

a)包含以下各项中的至少一个的VH：E1Q、Q5V、T9A、V10E、L11V、A12K、R13K、Q19K、M20V、K38R、R40A、Q46E、T59、N61、K65Q、D66G、K67R、A68V、K69T、L70I、A72R、V73D、T87R、N88S、S91T、T115L或L116V，和

b)包含以下各项中的至少一个的VL：Q1E、I10T、M11L、A13L、K18R、V19A、A20T、M21L、T22S、S41Q、S42A、V57I、V59D、I62S、S69D、Y70F、S71T、M77L、A79P、A82、T84V、A99G或L106I。尽管残基以特定位置和起始氨基酸和最终氨基酸表示，但这不表示氨基酸位置的过程或其他历史过程背景的产物。相反，起始氨基酸表示在其他构建体中存在什么氨基酸，并且最终氨基酸表示在指定的构建体中实际存在什么氨基酸残基。因此，本公开对于不同的命名(如，E1Q、1Q、Q1)不存在差异，第1位是谷氨酰胺、第1位的谷氨酰胺或其他此类命名。所有此类命名仅表示构建体的第1位是谷氨酰胺(并且没有历史或方法方面由术语表示)。命名E1Q偶尔用于提供这种特定构建体如何不同于其他构建体(例如，可以在第1位具有谷氨酸的构建体)的另外的背景。

在一些实施方式中，抗原结合构建体包括具有a)E1Q、Q5V、T9A、V10E、L11V、A12K、R13K、Q19K、M20V、K38R、R40A、Q46E、T59、N61、K65Q、D66G、K67R、A68V、K69T、L70I、A72R、V73D、T87R、N88S、S91T、T115L或L116V中的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27个的VH，和/或具有Q1E、I10T、M11L、A13L、K18R、V19A、A20T、M21L、T22S、S41Q、S42A、V57I、V59D、I62S、S69D、Y70F、S71T、M77L、A79P、A82、T84V、A99G或L106I中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23个的VL。在一些实施方式中，在两条链中的所有这些点突变与SEQ ID NO:2和SEQID NO:4中的CDR(HCDR1至3和LCDR1至3)中的1、2、3、4、5或6个一起存在。

在一些实施方式中，抗原结合构建体包含具有T59、N61或两者的VH，其中，VH是人源化VH。在一些实施方式中，抗原结合构建体包含具有A82的VL，其中，VL是人源化VL。在一些实施方式中，抗原结合构建体包含具有T59、N61或两者的VH，其中，VH是人源化VH；并且其中，抗原结合构建体包含具有A82的VL，其中，VL是人源化VL。在一些实施方式中，抗原结合构建体包含SEQ ID NO:5。在一些实施方式中，人源化微抗体包含具有T59、N61或两者的VH，其中，VH是人源化VH，其中，VH与SEQ ID NO:2的同一性为至少80％。在一些实施方式中，人源化微抗体包含与SEQ ID NO:4的同一性为至少80％的VL，并且其中，VL包含A99G。在一些实施方式中，人源化微抗体包含具有T59、N61或两者的VH，其中，VH是人源化VH，其中，VH与SEQ ID NO:2的同一性为至少80％；并且其中，人源化微抗体包含与SEQ ID NO:4的同一性为至少80％的VL，并且其中，VL包含A99G。在一些实施方式中，人源化微抗体包含含有T59、N61或两者的VH，其中，VH是如根据SEQ ID NO:2的编号方式编号的人源化VH。

在一些实施方式中，人源化微抗体包含含有A99G，如根据SEQ ID NO:4的编号方式编号的。在一些实施方式中，人源化微抗体包含含有T59、N61或两者的VH，其中，VH是如根据SEQ ID NO:2的编号方式编号的人源化VH。并且其中，人源化微抗体包含含有如根据SEQ IDNO:4的编号方式编号的A99G的VL。在一些实施方式中，人源化微抗体包含SEQ ID NO:5。

在一些实施方式中，抗原结合构建体包含：SEQ ID NO:2中的HCDR1的HCDR1；SEQID NO:2中的HCDR2的HCDR2；SEQ ID NO:2中的HCDR3的HCDR3；SEQ ID NO:4中的LCDR1的LCDR1；SEQ ID NO:4中的LCDR2的LCDR2；SEQ ID NO:4中的LCDR3的LCDR3；以及以下各项中的至少一个：

a)包含以下各项中的至少一个的VH：E1Q、Q5V、T9A、V10E、L11V、A12K、R13K、Q19K、M20V、K38R、R40A、Q46E、T59、N61、K65Q、D66G、K67R、A68V、K69T、L70I、A72R、V73D、T87R、N88S、S91T、T115L或L116V，和/或

b)包含以下各项中的至少一个的VL：Q1E、I10T、M11L、A13L、K18R、V19A、A20T、M21L、T22S、S41Q、S42A、V57I、V59D、I62S、S69D、Y70F、S71T、M77L、A79P、A82、T84V、A99G或L106I，和/或

c)a)的VH和b)的VL，和/或

d)a)、b)和c)中的任一项，其中，VH与SEQ ID NO:2的同一性为至少80％，和/或

e)a)、b)和c)中的任一项，其中，VL与SEQ ID NO:4的同一性为至少80％，和/或

f)a)、b)和c)中的任一项，其中，VH与SEQ ID NO:2的同一性为至少80％；以及a)、b)和c)中的任一项，其中，VL与SEQ ID NO:4的同一性为至少80％，和/或

g)具有T59、N61或两者的VH，其中，VH是人源化VH，和/或

h)具有A82的VL，其中，VL是人源化VL，和/或

i)根据g)的VH和根据h)的VL，和/或

j)具有Q46E的VH，和/或

k)具有Q46E的VH，其中，

i)VH与SEQ ID NO:2的同一性为至少80％

ii)VL与SEQ ID NO:4的同一性为至少80％

iiii)VH与SEQ ID NO:2的同一性为至少80％，并且VL与SEQ ID NO:4的同一性为至少80％，和/或

l)具有T115L、L116V中的至少一个的VH，和/或

m)具有S41Q、A99G或L106I中的至少一个的VL，和/或

n)具有T115L、L116V中的至少一个的VH和具有S41Q、A99G或L106I中的至少一个的VL，和/或

o)l)、m)或n)，其中，

i)VH与SEQ ID NO:2的同一性为至少80％

ii)VL与SEQ ID NO:4的同一性为至少80％

iiii)VH与SEQ ID NO:2的同一性为至少80％，并且VL与SEQ ID NO:4的同一性为至少80％。

在一些实施方式中，抗原结合构建体(包括例如双价抗体、微抗体或cys-双价抗体)可以包括如下的重链和轻链：a)包含以下各项中的至少一个的VH：1Q、5V、9A、10E、11V、12K、13K、19K、20V、38R、40A、46E、T59、N61、65Q、66G、67R、68V、69T、70I、72R、73D、87R、88S、91T、115L或116V；以及b)包含以下各项中的至少一个的VL：1E、10T、11L、13L、18R、19A、20T、21L、22S、41Q、42A、57I、59D、62S、69D、70F、71T、77L、79P、82、84V、99G或106I。如本文所描述，编号表示图20和图21中的对应位置。在一些实施方式中，这些构建体结合至CD4。在其他实施方式中，这些构建体可以简单地是具有这些特定序列并且不需要功能性的氨基酸(或编码它们的核酸)。

在一些实施方式中，用于任何以上选择(a至o)的抗原结合构建体是微抗体。

在抗原结合构建体(例如，微抗体)的一些实施方式中，VH与SEQ ID NO:2的同一性为至少90％，VL与SEQ ID NO:4的同一性为至少90％，或VH和VL分别与SEQ ID NO:2和SEQID NO:4的同一性为至少90％。在一些实施方式中，VH与SEQ ID NO:2的同一性为至少95％，VL与SEQ ID NO:4的同一性为至少95％，或VH和VL分别与SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4的同一性为至少95％。在一些实施方式中，VH与SEQ ID NO:2的同一性为至少99％，VL与SEQ IDNO:4的同一性为至少99％，或VH和VL分别与SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4的同一性为至少99％。在一些实施方式中，与SEQ ID NO:2、4或2和4的同一性是91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或更高。在一些实施方式中，与SEQ ID NO:2和/或4同一性是至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高，并且这些CDR与SEQ ID NO:2和/或4中的CDR相同，或这些CDR变化不超过1、2或3个保守突变。

在抗原结合构建体(例如，微抗体)的一些实施方式中，VH与SEQ ID NO:2相同，VL与SEQ ID NO:4相同，或VH和VL分别与SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4相同。

在抗原结合构建体(例如，微抗体)的一些实施方式中，抗原结合构建体结合至CD4。在一些实施方式中，CD4是人CD4。在一些实施方式中，人CD4具有如图21中所示的氨基酸序列(如SEQ ID NO:44)。

在一些实施方式中，提供了结合至人CD4的人源化微抗体。人源化微抗体包含：SEQID NO:2中的HCDR1的HCDR1；SEQ ID NO:2中的HCDR2的HCDR2；SEQ ID NO:2中的HCDR3的HCDR3；SEQ ID NO:4中的LCDR1的LCDR1；SEQ ID NO:4中的LCDR2的LCDR2；SEQ ID NO:4中的LCDR3的LCDR3；以及以下各项中的至少一个：

a)具有T59、N61或两者的VH，其中，VH是人源化VH，其中，VH与SEQ ID NO:2的同一性为至少80％，并且VL与SEQ ID NO:4的同一性为至少80％；

b)处于VL-VH取向(氨基至羧基)的VH和VL(并且可以可选地是SEQ ID NO:2和4的序列)；

c)具有A99G的VL；

d)具有T59、N61或两者的VH，

e)i)具有A99G的VL和ii)具有T59、N61或两者的VH，

f)具有T59、N61或两者的VH，其中，VH是人源化VH，其中，VH与SEQ ID NO:2的同一性为至少80％，并且VL与SEQ ID NO:4的同一性为至少80％，并且其中，VL包含A99G，和/或

g)包含T59、N61或两者的VH，其中，VH是如根据SEQ ID NO:2的编号方式编号的人源化VH，以及如根据SEQ ID NO:4的编号方式编号的包含A99G的VL。

在一些实施方式中，提供了结合至人CD4的抗原结合构建体。抗原结合构建体包含：SEQ ID NO:2中的HCDR1的HCDR1；SEQ ID NO:2中的HCDR2的HCDR2；SEQ ID NO:2中的HCDR3的HCDR3；SEQ ID NO:4中的LCDR1的LCDR1；SEQ ID NO:4中的LCDR2的LCDR2；SEQ IDNO:4中的LCDR3的LCDR3；以及以下各项中的至少一个：

a)具有T59、N61或两者的VH，其中，VH是人源化VH，其中，VH与SEQ ID NO:2的同一性为至少80％，并且VL与SEQ ID NO:4的同一性为至少80％；

b)处于VL-VH取向(氨基至羧基)的VH和VL(并且可以可选地是SEQ ID NO:2和4的序列)；

c)具有A99G的VL；

d)具有T59、N61或两者的VH，

e)i)具有A99G的VL和ii)具有T59、N61或两者的VH，

f)具有T59、N61或两者的VH，其中，VH是人源化VH，其中，VH与SEQ ID NO:2的同一性为至少80％，并且VL与SEQ ID NO:4的同一性为至少80％，并且其中，VL包含A99G；和/或

g)包含T59、N61或两者的VH，其中，VH是如根据SEQ ID NO:2的编号方式编号的人源化VH，以及如根据SEQ ID NO:4的编号方式编号的包含A99G的VL。

在一些实施方式中，提供了结合人CD4的人源化微抗体(或抗原结合构建体)。人源化微抗体(或抗原结合构建体)包含以下各项中的至少一个：

a)具有T59、N61或两者的VH，其中，VH是人源化VH，其中，VH与SEQ ID NO:2的同一性为至少80％，并且VL与SEQ ID NO:4的同一性为至少80％；

b)处于VL-VH取向(氨基至羧基)的VH和VL(并且可以可选地是SEQ ID NO:2和4的序列)；

c)具有A99G的VL；

d)具有T59、N61或两者的VH，

e)具有A99G的VL和ii)具有T59、N61或两者的VH，

f)具有T59、N61或两者的VH，其中，VH是人源化VH，其中，VH与SEQ ID NO:2的同一性为至少80％，并且VL与SEQ ID NO:4的同一性为至少80％，并且其中，VL包含A99G；和/或

g)包含T59、N61或两者的VH，其中，VH是如根据SEQ ID NO:2的编号方式编号的人源化VH，以及如根据SEQ ID NO:4的编号方式编号的包含A99G的VL。

在一些实施方式中，结合至人CD4的微抗体(人源化的或以其他方式)可以具有VL-VH的取向(与VH-VL相反)。在一些实施方式中，这种排列允许具有优越分布方面的构建体。在一些实施方式中，构建体将具有优异的药效动力学、药效学、清除率和/或生产行为。本文提供的任何抗原结合构建体、微抗体或使用方法可以按其中构建体处于VL-VH取向的排列来采用。在一些实施方式中，VH-VL取向为以下各项中至少一个提供了改善：生产产率、溶解度、制剂、聚集倾向或EC50。在一些实施方式中，VL-VH取向为以下各项中至少一个提供了改善：生产产率、溶解度、制剂、聚集倾向或EC50。

在抗原结合构建体(例如微抗体)的一些实施方式中，还包含含有SEQ ID NO:34、35、36或37中的氨基酸序列的铰链区。

在抗原结合构建体(例如，微抗体)的一些实施方式中，对于a)至f)，对于VH，存在以下各项中的至少两个：E1Q、Q5V、T9A、V10E、L11V、A12K、R13K、Q19K、M20V、K38R、R40A、Q46E、T59、N61、K65Q、D66G、K67R、A68V、K69T、L70I、A72R、V73D、T87R、N88S、S91T、T115L或L116V，和/或对于VL，存在以下各项中的至少两个：Q1E、I10T、M11L、A13L、K18R、V19A、A20T、M21L、T22S、S41Q、S42A、V57I、V59D、I62S、S69D、Y70F、S71T、M77L、A79P、A82、T84V、A99G或L106I。在一些实施方式中，存在这些残基中的至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个，或它们的全部。在一些实施方式中，在构建体内存在至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的这些残基。

在抗原结合构建体(例如，微抗体)的一些实施方式中，微抗体共价连接至可检测标记。在抗原结合构建体(例如，微抗体)的一些实施方式中，可检测标记是

在一些实施方式中，抗原结合构建体可以是双价抗体。双价抗体可以包括第一多肽链，其包括与第一多肽链上的轻链可变结构域(V

在一些实施方式中，接头的适当长度促进第一多肽链与第二多肽链的互补结构域之间的链配对并且可以促进具有两个功能性抗原结合位点的二聚体分子的组装。因此，在一些实施方式中，双价抗体是二价的。在一些实施方式中，双价抗体可以是半胱氨酸连接的双价抗体(Cys-Db)。

在一些实施方式中，接头可以是肽。在一些实施方式中，接头可以是促进这种组装的任何适合的长度，例如长度在1与20个氨基酸之间，如，5个和10个氨基酸。如在此进一步描述的，一些cys-双价抗体可以包括长度为5至8个氨基酸的肽接头。在一些实施方式中，接头不需要制备自或仅制备自氨基酸，并且可以包括例如修饰的氨基酸(参见，例如，Increased Resistance of Peptides to Serum Proteases by Modification of theirAmino Groups,Rossella Galati,Alessandra Verdina,Giuliana Falasca,and AlbertoChersi,(2003)Z.Naturforsch,58c,558-561)。在一些实施方式中，接头的长度可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个氨基酸。在一些实施方式中，接头的长度可以是从2至30埃，例如2.5至27埃。在一些实施方式中，接头的长度可以是从2至60埃。

在一些实施方式中，抗原结合构建体包括人源化cys-双价抗体。人源化cys-双价抗体可以包括单链可变片段(scFv)，该单链可变片段包括连接至可变轻(V

在一些实施方式中，人源化cys-双价抗体的scFv具有V

抗体可变区可以通过如在此所描述的接头连接在一起。在一些实施方式中，接头是GlySer接头。

在一些实施方式中，cys-双价抗体包括可检测标记。

在一些实施方式中，cys-双价抗体包括一对单体。每个单体可以包括多肽。在一些实施方式中，这些单体的多肽是相同的(例如，cys-双价抗体可以是同源二聚体)。在一些实施方式中，这些单体的多肽是不同的(例如，cys-双价抗体可以是异源二聚体)。

在一些实施方式中，抗原结合构建体可以包括SEQ ID NO:11(参见图10)。在一些实施方式中，该单体的多肽包括与SEQ ID NO:11具有至少约80％的同一性的序列，例如至少约80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。

在一些实施方式中，保持CDR序列(例如，图20和图21)并且允许序列的其余部分变化。

在一些实施方式中，抗原结合构建体可以包括SEQ ID NO:12(参见图11)。在一些实施方式中，单体的多肽包括与SEQ ID NO:12具有至少约80％同一性的序列，例如至少约80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。

在一些实施方式中，保持CDR序列(例如，如图20和图21中所指示)并且允许序列的其余部分变化。

在一些实施方式中，抗原结合构建体可以包括SEQ ID NO:13(参见图12)。在一些实施方式中，单体的多肽包括与SEQ ID NO:13具有至少约80％同一性的序列，例如至少约80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。

在一些实施方式中，保持CDR序列(例如，如图20和图21中所指示)并且允许序列的其余部分变化。

在一些实施方式中，抗原结合构建体可以包括SEQ ID NO:14(参见图13)。在一些实施方式中，单体的多肽包括与SEQ ID NO:14具有至少约80％同一性的序列，例如至少约80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。

在一些实施方式中，保持CDR序列(例如，如图20和图21中所指示)并且允许序列的其余部分变化。

在一些实施方式中，抗原结合构建体可以包括SEQ ID NO:15(参见图14)。在一些实施方式中，单体的多肽包括与SEQ ID NO:15具有至少约80％同一性的序列，例如至少约80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。

在一些实施方式中，保持CDR序列(例如，如图20和图21中所指示)并且允许序列的其余部分变化。

在一些实施方式中，抗原结合构建体可以包括SEQ ID NO:16(参见图15)。在一些实施方式中，单体的多肽包括与SEQ ID NO:16具有至少约80％同一性的序列，例如至少约80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。

在一些实施方式中，保持CDR序列(例如，如图20和图21中所指示)并且允许序列的其余部分变化。

在一些实施方式中，抗原结合构建体可以包括SEQ ID NO:17(参见图16)。在一些实施方式中，单体的多肽包括与SEQ ID NO:17具有至少约80％同一性的序列，例如至少约80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。

在一些实施方式中，保持CDR序列(例如，如图20和图21中所指示)并且允许序列的其余部分变化。

在一些实施方式中，抗原结合构建体可以包括SEQ ID NO:18(参见图17)。在一些实施方式中，单体的多肽包括与SEQ ID NO:18具有至少约80％同一性的序列，例如至少约80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。

在一些实施方式中，保持CDR序列(例如，如图20和图21中所指示)并且允许序列的其余部分变化。

在一些实施方式中，半胱氨酸彼此交联。在一些实施方式中，半胱氨酸被还原，并且因此，形成半胱氨酸的这些尾部彼此不形成二硫键。在一些实施方式中，“尾部形成”半胱氨酸中的一个或多个与一个或多个可检测标记物(如，荧光探针)形成共价键。

如本领域的普通技术人员将理解的，虽然本公开总体上提及“cys-双价抗体”，但是可以采用替代性安排来实现相同或相似的末端。在一些实施方式中，可以使用任何共价可修饰的部分代替半胱氨酸中的一个或多个。例如，这可以包括GlySer接头、GlyLeu接头和/或短标记之后的插入半胱氨酸。在一些实施方式中，可以经由卷曲螺旋或亮氨酸拉链来建立连接。在一些实施方式中，“尾部”本身可以在其末端上包括官能团，这样使得它可以选择性地结合至所期望的残基和/或在每个多肽的末端的位置，代替二硫键本身。在一些实施方式中，共价可修饰的部分可以直接连接至重链或轻链多肽的末端，而不是在两个多肽链之间提供空间的尾部，但是两个共价可修饰的部分可以通过接头连接。

在一些实施方式中，提供了结合靶分子的嵌合cys-双价抗体。在一些实施方式中，嵌合cys-双价抗体包含V

在一些实施方式中，本文提供的任何构建体(包括标注为cys-双价抗体实施方式的那些排列)可以作为scFv实施方式来提供。在此类实施方式中，构建体仍可以在尾部上包括半胱氨酸，但简单地不是交联的。在其他实施方式中，构建体不需要在尾部或根本在尾部具有半胱氨酸。

在一些实施方式中，对于单个抗体，重链和轻链可变结构域可以不同的方式相关联。出于这个原因，使用不同的接头长度允许构象柔性和运动范围以确保二硫键的形成。

在一些实施方式中，这两个接头长度可以是在(并且包括)约1至50个氨基酸之间的某处，例如2个氨基酸至15个氨基酸、2个氨基酸至14个氨基酸、3个氨基酸至13个氨基酸、4个氨基酸至10个氨基酸或5个氨基酸至8个氨基酸。在一些实施方式中，双价抗体对内的每个接头可以是相同的长度。在一些实施方式中，对内的每个接头可以具有不同的长度。在一些实施方式中，可以使用接头长度对的任何组合，只要它们允许和/或促进期望的组合。在一些实施方式中，可以使用修饰的氨基酸。

在一些实施方式中，接头是GlySer接头。GlySer接头可以是富含Gly和/或Ser残基的多肽。在一些实施方式中，GlySer接头的至少约40％(例如，至少约40％、50％、60％、70％、80％或90％)的氨基酸残基是Gly、Ser或Gly和Ser的组合。在一些实施方式中，GlySer接头是至少约2个氨基酸长，例如至少约3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35或40个氨基酸长。

在一些实施方式中，在双价抗体的C端添加半胱氨酸。这种半胱氨酸可以允许双价抗体复合物形成共价半胱氨酸键并且提供可供使用的硫残基用于功能性部分(如，放射性标记)的位点特异性缀合的选项。在一些实施方式中，改变抗体本身的末端以便含有半胱氨酸。在一些实施方式中，在C端添加尾部序列，例如(Gly-Gly-Cys)。在一些实施方式中，半胱氨酸尾序列允许cys-双价抗体的两个单体彼此形成二硫键。在一些实施方式中，半胱氨酸尾序列允许cys-双价抗体与可检测部分(如，可检测标记和/或治疗剂)形成二硫键。半胱氨酸尾的巯基可以在所需功能部分(例如可检测标记和/或治疗剂)的位点特异性缀合之前被轻微还原。在一些实施方式中，尾部为至少约1个氨基酸长，例如至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35或40个氨基酸长。

在一些实施方式中，尾部长度为3至8个氨基酸。在一些实施方式中，尾部可以和/或包括卷曲螺旋和/或亮氨酸拉链。如上所描述，在一些实施方式中，半胱氨酸位于C端；然而，这不要求半胱氨酸位于最后的c端氨基酸。相反，这表示半胱氨酸可以是位于蛋白质C端的任何残基的一部分。

在一些实施方式中，两个C端之间的连接选择可以通过半胱氨酸来实现，用于直接和/或间接的交联。

在一些实施方式中，抗原结合构建体包含含有SEQ ID NO:5中的氨基酸序列的微抗体。在一些实施方式中，微抗体与所指出的序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％一致。在一些实施方式中，CDR是保守的，而其他残基改变。在一些实施方式中，1、2、3、4、5或6个CDR中的1、2、3、4、5个残基可以变化。在一些实施方式中，微抗体包含图5至图8中任一个或多个所示的一个或多个氨基酸。

在一些实施方式中，抗原结合构建体包含含有SEQ ID NO:2和/或4中的氨基酸序列微抗体。在一些实施方式中，微抗体与所指出的序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％一致。在一些实施方式中，CDR是保守的，而其他残基改变。在一些实施方式中，1、2、3、4、5或6个CDR中的1、2、3、4、5个残基可以变化。在一些实施方式中，可以采用本文中表示的任何实施方式作为微抗体排列。

在一些实施方式中，抗原结合构建体包含含有SEQ ID NO:6中的氨基酸序列的微抗体。在一些实施例中，该微抗体与所指出的序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％一致。在一些实施方式中，CDR是保守的，而其他残基改变。在一些实施方式中，1、2、3、4、5或6个CDR中的1、2、3、4、5个残基可以变化。

在一些实施方式中，抗原结合构建体包含含有SEQ ID NO:7中的氨基酸序列的微抗体。在一些实施方式中，微抗体与所指出的序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％一致。在一些实施方式中，CDR是保守的，而其他残基改变。在一些实施方式中，1、2、3、4、5或6个CDR中的1、2、3、4、5个残基可以变化。

在一些实施方式中，抗原结合构建体包含含有SEQ ID NO:8中的氨基酸序列的微抗体。在一些实施方式中，微抗体与所指出的序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％一致。在一些实施方式中，CDR是保守的，而其他残基改变。在一些实施方式中，1、2、3、4、5或6个CDR中的1、2、3、4、5个残基可以变化。

如在此所描述的“微抗体”包括同源二聚体，其中，每个单体是通过接头(如，铰链序列)连接至人IgG1 C

在一些实施方式中，铰链序列是人工铰链序列。在一些实施方式中，铰链序列可以是来自这四类中的任何一个或多个的IgG铰链。人工铰链序列可以包括人IgG1铰链和GlySer接头序列的一部分。适合的铰链序列还可以如在WIPO专利公开WO 2017027325中公开的找到，将其通过引用以其全文结合在此。

在一些实施方式中，人工铰链序列包括人IgG1铰链的大约前14或15个残基，随后是接头序列。在一些实施方式中，接头可以是本文提供的那些中的任何一种。在一些实施方式中，接头可以是长度为6、7、8、9或10个氨基酸的GlySer接头序列。在一些实施方式中，人工铰链序列包括IgG1铰链的大约前15个残基，随后是长度为约10个氨基酸的GlySer接头序列。在一些实施方式中，C

在一些实施方式中，微抗体scFv序列可以包括CDR和/或FR，和/或与在此描述的双价抗体序列相似和/或相同的可变区序列。在一些实施方式中，微抗体scFv具有与在此描述的cys-双价抗体的scFv一致的序列(CDR、CDR、6个CDR的全集、重链可变区、轻链可变区、重链和轻链可变区等)。

在一些实施方式中，微抗体具有与本文提供的微抗体序列至少约80％同一性的可变链区。scFv可以具有V

在一些实施方式中，微抗体的每个单体从N端至C端包括以下元素：(a)包括连接至VL结构域的VH结构域并且结合至靶分子的scFv序列，(b)包含人IgG1铰链区的铰链延伸结构域，以及(c)人源IgG C

在一些实施方式中，抗原结合构建体的多肽可以由核酸编码并且在体内或体外表达，或者可以化学合成这些肽。因此，在一些实施方式中，提供了编码抗原结合构建体的核酸。在一些实施方式中，核酸编码cys-双价抗体或微抗体的一个部分或单体。在一些实施方式中，核酸编码两个或更多个单体，例如至少2个单体。编码多个单体的核酸可以包括至少两个单体之间的核酸切割位点，可以编码两个或更多个单体之间的转录或翻译起始位点，和/或可以编码两个或更多个单体之间的蛋白水解靶位点。

在一些实施方式中，表达载体包含编码如在此公开的抗原结合构建体的核酸。在一些实施方式中，表达载体包括用于哺乳动物表达的pcDNA3.1

在一些实施方式中，编码至少一种微抗体单体的核苷酸序列包含SEQ ID NO:9和10中的至少一个。在一些实施方式中，核苷酸序列可以是编码本文提供的任何一种抗原结合构建体的核苷酸序列。在一些实施方式中，序列是在严格条件下与SEQ ID NO:9和/或10杂交的序列。

在一些实施方式中，提供了表达在此描述的抗原结合构建体中的至少一个的细胞系。在一些实施方式中，哺乳动物细胞系(例如，CHO-K1细胞系)是产生微抗体、cys-双价抗体或如在此所描述的其他抗体的表达系统。在一些实施方式中，本文所描述的微抗体、cys-双价抗体和其他抗体或抗体片段是非糖基化的，并且不需要哺乳动物表达系统，因为这样的翻译后修饰是不需要的。因此，在一些实施方式中，使用多种多样的哺乳动物或非哺乳动物表达系统中的一个或多个来产生在此公开的抗原结合构建体(例如，抗CD4微抗体和cys-双价抗体)，包括但不限于哺乳动物表达系统(例如，CHO-K1细胞)、细菌表达系统(例如，大肠杆菌(E.Coli)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis))、酵母表达系统(例如，毕赤酵母属(Pichia)、酿酒酵母(S.cerevisiae))或任何其他已知的表达系统，包括无细胞表达系统(Shaorong C.；Curr Protoc Mol Biol.(2014)；108:16.30.1-16.30.11.)。其他系统可以包括昆虫细胞和/或植物细胞。

在一些实施方式中，抗原结合构建体包括至少一个修饰。示例性修饰包括但不限于通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护/阻断基团的衍生化、蛋白水解裂解和与细胞配体或其他蛋白质的连接修饰的抗原结合构建体。许多化学修饰中的任何一种可以通过已知技术进行，包括但不限于特定化学切割、乙酰化、甲酰化和衣霉素的代谢合成。在一些实施方式中，衍生物可以包含一个或多个非天然氨基酸。

在一些实施方式中，抗原结合构建体缀合至另一种物质以形成抗靶缀合物。在此描述的缀合物可以通过将抗原结合构建体与脂质、碳水化合物、蛋白质或其他原子和分子连接的已知方法来制备。在一些实施方式中，缀合物通过使用适合的键或键的位点特异性缀合来形成。位点特异性缀合更有可能保持抗原结合构建体的结合活性。物质可以经由二硫键形成在还原的抗原结合构建体的铰链区处缀合或附接。例如，在scFv片段的C端引入半胱氨酸残基(如，可以引入在此描述的cys-双价抗体中的那些)允许位点特异性硫醇反应性在远离抗原结合位点的位点处缀合至多种多样的试剂。用于形成缀合物的其他连接或键可以包括但不限于共价键、非共价键、硫化物键、腙键、肼键、酯键、酰氨基键和氨基键、亚氨基键、缩氨硫脲(thiosemicabazone)键、缩氨脲键、肟键和碳碳键。

在一些实施方式中，修饰的抗原结合构建体缀合至可检测标记。如本文所使用的，“可检测标记”包括可用于诊断、检测或可视化靶分子、细胞、组织、器官等的位置和/或量的原子、分子或化合物。可以根据本文的实施方式使用的可检测标记包括但不限于放射性物质(例如，放射性同位素、放射性核素、放射性药物、放射性标记或放射性示踪剂)、染料、造影剂、荧光化合物或分子、生物发光化合物或分子、酶和增强剂(例如，顺磁性离子)。此外，一些纳米颗粒，例如量子点和金属纳米颗粒(以下描述)可以适合用作检测剂。在一些实施方式中，可检测标记是吲哚花青绿(ICG)。

根据本文的实施方式可以用作可检测标记的示例性放射性物质包括，但不限于

当可检测标记是放射性金属或顺磁性离子时，在一些实施方式中，标记可以与具有长尾的试剂反应，该长尾具有附接至长尾的一个或多个螯合基团用于结合这些离子。长尾可以是一种聚合物，如，聚赖氨酸、多糖或具有侧基的其他衍生的或可衍生的链，这些侧基可以结合到螯合基团上以便结合这些离子。可以根据本文的实施方式使用的螯合基团的实施例包括但不限于乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、DOTA、NOTA、NOGADA、NETA、去铁胺(DfO)、卟啉、聚胺、冠醚、双缩氨硫脲、聚肟、以及类似基团。螯合物可以通过允许与分子形成键的基团连接至抗原结合构建体，其中免疫反应性损失最小并且聚集和/或内部交联最小。当与在此描述的抗原结合构建体和载体一起使用时，当与非放射性金属(如锰、铁和钆)络合时，相同的螯合物对于MRI是有用的。大环螯合物(如，NOTA、NOGADA、DOTA和TETA)分别与多种金属和放射性醛一起使用，包括但不限于镓、钇和铜的放射性核素。可以使用其他环型螯合物(如，大环聚醚)，其对于稳定结合放射性核素(如，RAIT的镭-223)是感兴趣的。在某些实施方式中，螯合部分可以用于将PET显像剂(如，铝-

可以用作根据本公开的实施方式的可检测标记的示例性造影剂包括，但不限于：泛影酸钡(barium,diatrizoate)、乙碘油、柠檬酸镓、双碘酞酸(iocarmic acid)、碘西他酸(iocetamic acid)、碘达胺(iodamide)、碘肥胺(iodipamide)、碘沙酸(iodoxamic acid)、碘古酰胺(iogulamide)、碘海醇(碘己基，iohexyl)、碘帕醇(iopamidol)、碘番酸(iopanoicacid)、碘普西酸(ioprocemic acid)、碘西法酸(iosefamic acid)、碘丝酸(iosericacid)，碘砜葡胺(iosulamide meglumine)、iosemetic acid、碘酞硫(iotasul)、碘替酸(iotetric acid)、碘他拉酸(iothalamic acid)、碘曲西酸(iotroxic acid)、碘克沙酸(ioxaglic acid)、羟泛影酸(ioxotrizoic acid)、碘泊酸盐(ipodate)、葡甲胺、甲泛葡胺(metrizamide)、甲泛影酸(metrizoate)、丙碘酮(propyliodone)、氯化铊(thallouschloride)或它们的组合。

可以用作根据本公开的实施方式的可检测标记的生物发光和荧光化合物或分子和染料包括，但不限于荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、OREGON GREEN

根据本公开的实施方式，可以用作可检测标记的酶包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶或β-内酰胺酶。此类酶可以与色原、荧光化合物或发光化合物组合使用以生成可检测信号。

在一些实施方式中，抗原结合构建体缀合至纳米颗粒。术语“纳米颗粒”是指其尺寸以纳米测量的微观颗粒，例如具有至少一个小于约100nm的尺寸的颗粒。纳米颗粒可以用作可检测的物质，因为它们足够小以散射可见光而不是吸收可见光。例如，金纳米颗粒具有显著的可见光消光特性并且在溶液中呈现深红色至黑色。因此，包括缀合至纳米颗粒的抗原结合构建体的组合物可以用于受试者中T细胞的体内成像。在尺寸范围的小端，纳米颗粒通常被称为簇。已经形成了金属、电介质和半导体纳米颗粒以及杂化结构(例如，核壳纳米颗粒)。纳米球、纳米棒和纳米柱仅是已经生长的一些形状。半导体量子点和纳米晶体是另外类型的纳米颗粒的实施例。此类纳米级颗粒，当缀合至抗原结合构建体时，可以用作成像剂用于如在此所描述的T细胞的体内检测。在一些实施方式中，抗原结合构建体缀合或包含在颗粒和/或脂质体中或在颗粒和/或脂质体内。在一些实施方式中，这些脂质体可以用于超声成像。

在一些实施方式中，抗原结合构建体与治疗剂缀合。如本文所使用的，“治疗剂”是在癌症、炎症、其他疾病病症的治疗中或在以其他方式抑制免疫应答(例如，器官移植中的免疫抑制)中有用的原子、分子或化合物。治疗剂的实施例包括但不限于药物、化疗剂、治疗性抗体和抗体片段、毒素、放射性同位素、酶(例如，在抗原结合构建体结合的位点处将前药切割成细胞毒性剂的酶)、核酸酶、激素、免疫调节剂、反义寡核苷酸、螯合剂、硼化合物、光敏剂和染料、以及纳米颗粒。

当与治疗剂结合时，抗原结合构建体可以用于靶向与呈现CD4抗原的细胞相关的疾病，或吸引CD4+T细胞的疾病。这些疾病包括肿瘤，例如实体瘤和源自T辅助细胞的癌症，包括但不限于外周T细胞淋巴瘤和相关的恶性病症。CD4抗原还与多种自身免疫性疾病相关，例如白癜风、I型糖尿病、类风湿性关节炎、克罗恩病、炎性肠病、溃疡性结肠炎。CD4抗原还与多种神经退行性疾病(如，帕金森病和多发性硬化症)相关。CD4抗原还与多种心血管疾病相关，如，缺血性心力衰竭。CD4抗原还与人类免疫缺陷病毒(HIV)和移植物抗宿主病(GvHD)相关联。用治疗剂选择性靶向带有CD4的细胞还可以对自身炎症疾病具有影响。

化疗剂在性质上通常是细胞毒性的或细胞抑制性的，并且可以包括烷化剂、抗代谢物、抗肿瘤抗生素、拓扑异构酶抑制剂、有丝分裂抑制剂激素疗法、靶向疗法以及免疫疗法。在一些实施方式中，可以用作依照本公开的实施方式的可检测标记的化疗剂包括，但不限于：13-顺式视黄酸、2-氯脱氧腺苷、5-氮杂胞苷、5-氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、放线菌素D、阿霉素、阿地白介素、阿仑单抗、阿利维甲酸、全反式维甲酸、α-干扰素、六甲蜜胺、甲氧蝶呤、氨磷汀、阿那格雷、阿那曲唑、阿拉伯糖基胞嘧啶、三氧化二砷、安吖啶、氨基喜树碱、氨鲁米特、天冬酰胺酶、氮杂胞苷、卡米特芽孢杆菌(BCG)、苯达莫司汀、贝伐单抗、贝沙罗汀、比卡鲁胺、硼替佐米、博来霉素、白消安、甲酰四氢叶酸钙、嗜橙菌因子、卡培他滨、卡培替尼、卡铂、卡莫司汀、西妥昔单抗、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、可的松、环磷酰胺、阿糖胞苷、达贝泊汀α、达沙替尼、道诺霉素(daunomycin)、地西他滨、地尼白介素(denileukin diftitox)、地塞米松(dexamethasone)、地塞米松(dexasone)、地拉佐生、更生霉素、柔红霉素(daunorubicin)、达卡巴嗪、多西他赛、多柔比星、多西氟尿啶、恩尿嘧啶(eniluracil)、表柔比星、依泊汀α、埃罗替尼、依维莫司、依西美坦、雌莫司汀、依托泊苷、非格司汀、氟甲睾酮、氟维司群、黄酮吡醇、氟尿苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、氟他胺、吉非替尼、吉西他滨、吉妥珠单抗奥佐米星(gemtuzumab ozogamicin)、戈舍瑞林、粒细胞集落刺激因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、六甲基三聚氰胺、氢化可的松羟基脲、替伊莫单抗、干扰素α、白细胞介素-2、白细胞介素-11、异维甲酸、伊沙匹隆、伊达比星、甲磺酸伊马替尼、异环磷酰胺、伊立替康、拉帕替尼、来那度胺、来曲唑、亚叶酸、亮丙瑞林、脂质体Ara-C、洛莫司汀、氮芥、甲地孕酮、美法仑、巯基嘌呤、美司钠、甲氨蝶呤、甲基泼尼松龙、丝裂霉素C、米托坦、米托蒽醌、奈拉滨、尼鲁米特、奥曲肽、奥普瑞金、奥沙利铂、紫杉醇、帕米膦酸盐、培美曲塞、帕尼单抗、PEG干扰素、培门冬酶(pegaspargase)、聚乙二醇化非格司亭、PEG-L-天冬酰胺酶、喷司他丁、普卡霉素、泼尼松龙、泼尼松、丙卡巴肼、雷洛昔芬、利妥昔单抗、罗米司亭、雷利曲塞、沙西他滨(sapacitabine)、沙格司亭、沙铂、索拉非尼、舒尼替尼、司莫司汀、链佐星(streptozocin)、他莫昔芬、替加氟、替加氟-尿嘧啶、西罗莫司脂化物(temsirolimus)、替莫唑胺、替尼泊苷、沙利度胺、硫鸟嘌呤、噻替派、托泊替康、托瑞米芬、托西莫单抗、曲妥珠单抗、维甲酸、曲米曲酯、阿柔比星、长春新碱、长春花碱、长春地辛、长春瑞滨、伏立诺他或唑来膦酸。

可以根据本公开的实施方式使用的另外可检测标记包括但不限于蓖麻毒素、相思豆毒素、核糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶I、葡萄球菌肠毒素A、美洲商陆抗病毒蛋白、白树毒素、白喉毒素、假单胞菌外毒素、以及假单胞菌内毒素。

在一些实施方式中，纳米颗粒、颗粒、和/或脂质体在治疗应用中用作药物载体，当缀合至抗原结合构建体时，这些药物载体将化疗剂、激素治疗剂、放疗剂、毒素或本领域已知的任何其他细胞毒性或抗癌剂递送至在细胞表面上过表达靶标的癌细胞。

在一些实施方式中，提供了试剂盒。在一些实施方式中，试剂盒包括如在此描述的抗原结合构建体。在一些实施方式中，试剂盒包括编码如在此所描述的抗原结合构建体的核酸。在一些实施方式中，试剂盒包括产生如本文所描述的抗原结合构建体的细胞系。在一些实施方式中，试剂盒包括如在此所描述的可检测标记。在一些实施方式中，试剂盒包括如在此所描述的治疗剂。在一些实施方式中，试剂盒包括缓冲液。在一些实施方式中，试剂盒包括阳性对照，例如CD4、CD4+细胞或其片段。在一些实施方式中，试剂盒包括阴性对照，例如基本上不含CD4的表面或溶液。在一些实施方式中，试剂盒包括包装。在一些实施方式中，试剂盒包括说明书。

在一些实施方式中，抗原结合构建体可以用于在体内和/或在体外检测靶分子的存在或不存在。因此，一些实施方式包括检测靶标的存在或不存在的方法。方法可以包括将抗原结合构建体应用于样品。方法可以包括检测抗原结合构建体与靶分子CD4的结合或不结合。在一些实施方式中，可以应用具有可检测标记的抗原结合构建体来简单地监测CD4水平和/或分布。在一些实施方式中，它可以应用于患有或疑似患有CD4相关疾病或病症的受试者。这些疾病可以包括肿瘤(如，实体瘤)和源自T辅助细胞的癌症，包括但不限于外周T细胞淋巴瘤和相关的恶性病症。这些疾病还可以包括自身免疫性疾病，如，白癜风、I型糖尿病、类风湿性关节炎、克罗恩病、炎性肠病、溃疡性结肠炎。这些疾病还可以包括神经退行性障碍，如，帕金森病和多发性硬化症；以及心血管疾病，如，缺血性心力衰竭；以及人类免疫缺陷病毒(HIV)和移植物抗宿主病(GvHD)。

在一些实施方式中，如本文所描述的抗原结合构建体在体内应用于样品。可以将抗原结合构建体施用受试者。在一些实施方式中，受试者是人类。在一些实施方式中，受试者是非人类哺乳动物，例如大鼠、小鼠、豚鼠、仓鼠、兔、狗、猫、牛、马、山羊、绵羊、驴、猪、猴或猿。在一些实施方式中，将抗原结合构建体输注到受试者中。在一些实施方式中，输注是静脉内的。在一些实施方式中，输注是腹膜内的。在一些实施方式中，抗原结合构建体被非直接或局部(如在介入或术中应用的情况下)应用于受试者。在一些实施方式中，将包含抗原结合构建体的胶囊施用至受试者，例如口服或腹膜内。在一些实施方式中，选择抗原结合构建体以降低受试者的免疫原性应答的风险。例如，对于人类受试者，抗原结合构建体可以如在此所描述被人源化。在一些实施方式中，在体内应用抗原结合构建体之后，将样品或样品的一部分从宿主中去除。在一些实施方式中，抗原结合构建体在体内应用，在体内孵育如在此所描述的一段时间，并且取出样品用于体外分析，例如，体外检测结合到如在此所描述的靶分子或其不存在的抗原结合构建体。

在一些实施方式中，在体外将抗原结合构建体应用于样品。在一些实施方式中，从受试者及时地收获样品，例如活组织检查。在一些实施方式中，在从受试者收获后孵育样品。在一些实施方式中，样品是固定的。在一些实施方式中，样品包括整个器官和/或组织。在一些实施方式中，样品包括一个或多个全细胞。在一些实施方式中，样品来自细胞提取物，例如裂解物。在一些实施方式中，将溶液中的抗原结合构建体添加到样品中的溶液。在一些实施方式中，将溶液中的抗原结合构建体添加到不含溶液的样品(例如冻干样品)中，从而重构样品。在一些实施方式中，将冻干的抗原结合构建体添加至包含溶液的样品中，从而重构抗原结合构建体。

在一些实施方式中，抗原结合构建体可选地与样品一起温育。抗原结合构建体可以孵育不超过约10天的时间，例如不超过约10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天、3天、2天或1天，或不超过约23小时，例如不超过约23小时、22小时、21小时、20小时、19小时、18小时、17小时、16小时、15小时、14小时、13小时、12小时、11小时、10小时、9小时、8小时、7小时、6小时、5小时、4小时、3小时、2小时、1小时、0.75小时、0.5小时、0.25小时或0.1小时，包括列出的值的任何两个之间的范围。在一些实施方式中，孵育是在施用抗原结合构建体的受试者内。在一些实施方式中，孵育在孵育箱内。在一些实施方式中，将培养箱保持在固定温度下，例如约21℃、室温、25℃、29℃、34℃、37℃或40℃。

在一些实施方式中，未结合至靶标的抗原结合构建体可选地从样品中去除。在一些实施方式中，洗涤样品。洗涤样品可以包括去除包含未结合的抗原结合构建体的溶液，并且添加不包含抗原结合构建体的溶液，例如缓冲溶液。在一些实施方式中，例如通过抽吸、移液、泵送或引流包含未结合的抗原结合构建体的溶液并且添加不包含抗原结合构建体的溶液来洗涤体外样品。在一些实施方式中，洗涤体内样品，例如通过向不含抗原结合构建体的受试者溶液给予，或通过洗涤局部抗原结合构建体施用的位点。在一些实施方式中，洗涤进行至少两次，例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20次。在一些实施方式中，在一个或多个洗涤之后，从样品中去除至少约50％的未结合的抗体，例如至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或更高。

在一些实施方式中，未结合的抗原结合构建体从样品中消除。在将抗原结合构建体施加到样品上之后，结合到靶标上的抗原结合构建体与未结合到靶标上的抗原结合构建体达到平衡，这样使得在应用抗原结合构建体之后的某一时间，结合到靶标上的抗原结合构建体的量基本上不增加。在这段时间之后，可以消除至少部分量的未结合至靶标的抗原结合构建体。在一些实施方式中，未结合的抗原结合构建体通过递送抗体或片段的受试者的代谢或其他身体过程消除。在一些实施方式中，通过添加破坏或去稳定化未结合的抗原结合构建体的试剂(例如蛋白酶或中和抗体)来消除未结合的抗原结合构建体。在一些实施方式中，在应用抗原结合构建体之后1天，已经消除了所应用的至少约30％的抗原结合构建体，例如至少约30％、40％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.9％。在一些实施方式中，在应用抗原结合构建体之后2天，已经消除至少约40％的所应用的抗原结合构建体，例如至少约40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.9％。

在一些实施方式中，检测靶标CD4的存在或不存在。靶标的存在或不存在可以基于样品中抗原结合构建体的存在或不存在来检测。在从样品中去除和/或消除抗原结合构建体(例如，通过洗涤和/或代谢消除)之后，样品中剩余的抗原结合构建体可以指示靶标的存在，而样品中抗原结合构建体的不存在可以指示靶标的不存在。

在一些实施方式中，抗原结合构建体包括如在此所描述的可检测标记。因此，抗原结合构建体的存在可以通过检测可检测标记来推断。

在一些实施方式中，使用二级抗原结合构建体来检测抗原结合构建体。二级抗原结合构建体可以特异性地结合至抗原结合构建体。例如，第二抗原结合构建体可以包括针对抗体的宿主类型或针对抗原结合构建体本身的多克隆或单克隆抗体、双价抗体、微抗体等。二级抗原结合构建体可以缀合至如在此所描述的可检测标记。二级抗原结合构建体可以应用于样品。在一些实施方式中，二级抗原结合构建体以与抗原结合构建体基本相同的方式应用于样品。例如，如果抗原结合构建体输注到受试者中，则二级抗原结合构建体也可以输注到受试者中。

在一些情况下，使用全长抗体用于成像不是最佳的，因为在施用后它们可能需要计划超过1周成像时间，这是由于全长抗体的长血清半衰期。因此，在一些实施方式中，通过使用本文提供的抗原结合构建体，可以在施用后将成像时间计划小于一周(例如，1、2、3、4、5、6或7天或更少)。

在一些实施方式中，抗原结合构建体对于免疫疗法的T细胞定位成像是有用的。这在过继性免疫疗法中可能尤其相关，过继性免疫疗法是一种疗法形式，其中患者自身的T细胞在体外被操纵并且重新引入到患者中。对于这种形式的治疗，T细胞的成像对于确定治疗的状态是有用的。因此，在一些实施方式中，本文提供的抗原结合构建体可以用于免疫疗法中的T细胞的成像。

在一些实施方式中，这些抗原结合构建体允许检测人CD4，该人CD4是在T细胞亚群的表面上发现的特异性生物标志，用于免疫系统的诊断成像。CD4的成像允许体内检测T细胞定位。T细胞定位的变化可以反映免疫应答的进展，并且可以由于各种治疗或甚至疾病状态而随时间发生。在一些实施方式中，CD4的存在有助于调节抗肿瘤免疫应答。CD4的活化状态可以在确定抗肿瘤免疫应答的结果中起重要作用。

提供了一种用于涉及小分子的免疫细胞的亚型成像的替代的基于靶标的方法。例如，用于内源性免疫系统的诊断成像的一种方法已经涉及使用小分子示踪剂，这些小分子示踪剂检测细胞的代谢途径的变化，如，

在一些实施方式中，基于CD4抗体的成像允许描绘体内肿瘤上表达的细胞表面标记。对于这些描述存在各种应用，包括原发性和转移性肿瘤检测、治疗组中的患者分期和分层、确定放射免疫疗法剂量和受体占用、和/或评估对治疗法的响应。在一些实施方式中，这些方法或技术中的任一种可以采用本文提供的抗原结合构建体中的一个或多个。

抗CD4免疫正电子发射断层摄影术(PET)具有非侵入性地监测辅助和细胞毒性T细胞扩增和定位的能力，并且具有检测增强的T细胞再增殖的潜力。因此，在一些实施方式中，本文提供的任何一个或多个抗原结合构建体可以用于PET。

在一些实施方式中，提供了一种用于监测CD4在受试者体内的分布的方法。方法可以包括提供本文提供的任何人源化微抗体或抗原结合构建体或cys-双价抗体(包括SEQ IDNO:5-8中的一个或多个，例如，5)。构建体可以包括可检测标记，例如像本文提供的一个或多个正电子发射体、

在一些实施方式中，人源化微抗体或抗原结合构建体可以用作药物。在一些实施方式中，人源化微抗体或抗原结合构建体或微抗体或cys-双价抗体可以用于在以下各项中的至少一个中使用：检测、诊断、手术、分期、治疗、治疗监测、疾病进展监测以及监测疗法。在一些实施方式中，提供了人源化微抗体或抗原结合构建体或微抗体或cys-双价抗体用于在以下各项中的至少一个中使用：CD4相关病症的检测、诊断、手术、分期、治疗、治疗监测、疾病进展监测以及监测治疗。

在一些实施方式中，通过正电子发射断层摄影术(PET)检测抗原结合构建体的结合或不结合。

抗原结合构建体可以用于将治疗分子(例如细胞毒素)靶向靶阳性细胞，如，表达CD4的细胞。因此，一些实施方式包括将治疗剂靶向靶阳性细胞的方法。方法可以包括向受试者施用如在此所描述的抗原结合构建体。受试者可以是有需要的受试者，例如需要消除或中和至少一些目标阳性细胞的受试者。在一些实施方式中，抗原结合构建体包括至少一种如在此所描述的治疗剂。在一些实施方式中，治疗剂可以经由共价键(如，二硫键)直接缀合至抗原结合构建体。在一些实施方式中，受试者可以受益于CD4阳性细胞向另一细胞或试剂的定位。

可选地，在施用包含至少一种治疗剂的抗原结合构建体之前和/或之后，确定患者的靶阳性细胞的数量和/或定位。例如，在施用前确定靶阳性细胞的数量和/或定位可以指示患者是否可能受益于靶阳性细胞的中和和/或消除。在施用后确定靶阳性细胞的数量和/或定位可以指示靶阳性细胞是否在患者中消除。

在一些实施方式中，本文提供的任何抗原结合构建体可以用于治疗受试者的方法中。方法可以包括提供患有CD4相关病症的受试者；以及向受试者施用有效量的抗原结合构建体(如本文提供)，以便减少来自CD4相关病症的至少一个症状。这些疾病可以包括肿瘤，例如实体瘤，和源自T辅助细胞的癌症，包括但不限于外周T细胞淋巴瘤和相关的恶性病症。这些疾病还可以包括自身免疫性疾病，如，白癜风、I型糖尿病、类风湿性关节炎、克罗恩病、炎性肠病、溃疡性结肠炎。这些疾病还可以包括神经退行性障碍，如，帕金森病和多发性硬化症；以及心血管疾病，如，缺血性心力衰竭；以及人类免疫缺陷病毒(HIV)和移植物抗宿主病(GvHD)。在一些实施方式中，抗原结合构建体连接至治疗剂，如，毒素，其可以杀死抗原结合构建体靶向并结合的细胞。在一些实施方式中，可以使用抗原结合构建体而不是疗法来诊断或监测疑似患有这些病症中的一个或多个的受试者(例如，通过本文提供的任何方法)。

一些实施方式包括人CD4的检测，其是在T细胞亚群的表面上发现的用于免疫系统的诊断成像的特异性生物标志物。靶分子的成像可以允许体内检测T细胞定位。T细胞定位的变化可以反映免疫应答的进展，并且可以由于各种治疗性治疗或疾病状态(如，感染)而随时间发生。例如，成像T细胞定位可以用于免疫疗法。过继性免疫疗法是疗法形式，其中患者自身的T细胞在体外被操纵并且重新引入到患者中。对于这种形式的治疗，T细胞的成像可以用于监测和/或确定治疗的状态。因此，在一些实施方式中，监测靶分子的定位可以用于分析药物开发中的作用机制、功效和/或安全性和/或可以帮助疾病的临床管理。

在一些实施方式中，特异性结合至靶标的抗原结合构建体的CDR已经被调节至微抗体和cys-双价抗体排列。

在一些实施方式中，抗CD4抗原结合构建体可以是特异性靶向人CD4+T细胞的成像剂。在一些实施方式中，这些抗CD4片段可以直接结合并且检测表达CD4的T细胞的特定亚类的定位。在一些实施方式中，能够交联CD4的工程化片段可以增强通过T细胞受体的信号传导并且增强受试者清除病毒病原体并响应肿瘤抗原和疫苗的能力。

在一些实施方式中，微抗体和cys-双价抗体形式具有用于诊断成像的所期望的药物代谢动力学特征，同时保持亲本抗体的高结合亲和力和特异性。与用全长亲本抗体成像相比，这些片段清除得快得多；然而它们能够靶向抗原用于快速高对比度成像。相同的有利的药物代谢动力学特性对于靶向免疫应答是有利的，从而允许更受控制的T细胞刺激并且防止过度刺激(例如，细胞因子风暴)的不希望的作用。在临床前模型中，微抗体和cys-双价抗体的较短的血液半衰期允许对于微抗体在注射后约16至20小时或16至24小时和对于cys-双价抗体在注射后2至6小时进行最佳成像。同一天成像可以在诊所中提供关于患者护理管理的显著优点。

在一些实施方式中，这些抗原结合构建体可以是诊断成像剂(在用适当的放射性同位素，如，碘-124、Cu-64或Zr-89(用于PET成像)或荧光团(用于荧光成像)标记之后)。作为临床显像剂，这些CD4抗原结合构建体可以帮助监测治疗并且用作患者选择工具。

在一些实施方式中，抗原结合构建体可以用于其中需要高度特异性和高亲和力结合CD4的应用。在诊断成像之外，取决于不同官能团的连接，这些片段可以用于不同的目的。

通过附着适当的红外或荧光染料，这些构建体可以用作用于图像引导的术中手术和内窥镜检测的靶向剂。

在一些实施方式中，除了对附接至片段的官能团的修饰之外，通过使用双特异性片段(其中片段能够结合2种不同的抗原)，有可能将CD4+细胞集合在一起成为第二抗原。双特异性全长抗体已经用于癌症免疫疗法以将免疫系统的细胞毒性细胞带至肿瘤细胞。因此，此类实施方式也被考虑用于适当的抗原结合构建体。

在一些实施方式中，CD4特异性抗原结合蛋白可以经由螯合或直接缀合结合至放射性标记。在一些实施方式中，放射性标记的CD4特异性结合蛋白可以用于分类或选择用于临床试验的人类受试者，推荐或确定人类受试者对于治疗性治疗的资格，预测对人类受试者的治疗的响应，和/或分析或检测人类受试者中带有CD4的细胞群体的迁移和/或分布模式的变化。

本文提供的不同元素和实施方式的另外的、非限制性编号排列如下(它可以按多种原样组合)：

1.一种抗原结合构建体，包含：

SEQ ID NO:2中的HCDR1的HCDR1；

SEQ ID NO:2中的HCDR2的HCDR2；

SEQ ID NO:2中的HCDR3的HCDR3；

SEQ ID NO:4中的LCDR1的LCDR1；

SEQ ID NO:4中的LCDR2的LCDR2；

SEQ ID NO:4中的LCDR3的LCDR3；以及

至少一个选自由以下各项组成的组的VH框架残基：

SEQ ID NO:2中序列第1位的谷氨酰胺；

SEQ ID NO:2中序列第5位的缬氨酸；

SEQ ID NO:2中序列第9位的丙氨酸；

SEQ ID NO:2中序列第11位的缬氨酸；

SEQ ID NO:2中序列第13位的赖氨酸；

SEQ ID NO:2中序列第44位的精氨酸；

SEQ ID NO:2中序列第46位的谷氨酸；

SEQ ID NO:2中序列第65位的谷氨酰胺；

SEQ ID NO:2中序列第66位的甘氨酸；

SEQ ID NO:2中序列第67位的精氨酸；

SEQ ID NO:2中序列第68位的缬氨酸；

SEQ ID NO:2中序列第69位的苏氨酸；

SEQ ID NO:2中序列第87位的精氨酸；

SEQ ID NO:2中序列第88位的丝氨酸。

2.一种抗原结合构建体，包含：

SEQ ID NO:2中的HCDR1的HCDR1；

SEQ ID NO:2中的HCDR2的HCDR2；

SEQ ID NO:2中的HCDR3的HCDR3；

SEQ ID NO:4中的LCDR1的LCDR1；

SEQ ID NO:4中的LCDR2的LCDR2；

SEQ ID NO:4中的LCDR3的LCDR3；以及

至少一个选自由以下各项组成的组的VL框架残基：

SEQ ID NO:4中序列第1位的谷氨酸；

SEQ ID NO:4中序列第13位的亮氨酸；

SEQ ID NO:4中序列第18位的精氨酸；

SEQ ID NO:4中序列第20位的苏氨酸；

SEQ ID NO:4中序列第21位的亮氨酸；

SEQ ID NO:4中序列第22位的丝氨酸；

SEQ ID NO:4中序列第41位的谷氨酰胺；

SEQ ID NO:4中序列第42位的丙氨酸；

SEQ ID NO:4中序列第57位的异亮氨酸；

SEQ ID NO:4中序列第59位的天冬氨酸；

SEQ ID NO:4中序列第70位的苯丙氨酸；

SEQ ID NO:4中序列第71位的苏氨酸；

SEQ ID NO:4中序列第77位的亮氨酸；

SEQ ID NO:4中序列第79位的脯氨酸；

SEQ ID NO:4中序列第84位的缬氨酸；

SEQ ID NO:4中序列第99位的甘氨酸。

3.编号排列2所述的抗原结合构建体，还包含至少一个选自由以下各项组成的组的VH框架残基：

SEQ ID NO:2中序列第1位的谷氨酰胺；

SEQ ID NO:2中序列第5位的缬氨酸；

SEQ ID NO:2中序列第9位的丙氨酸；

SEQ ID NO:2中序列第11位的缬氨酸；

SEQ ID NO:2中序列第13位的赖氨酸；

SEQ ID NO:2中序列第44位的精氨酸；

SEQ ID NO:2中序列第46位的谷氨酸；

SEQ ID NO:2中序列第65位的谷氨酰胺；

SEQ ID NO:2中序列第66位的甘氨酸；

SEQ ID NO:2中序列第67位的精氨酸；

SEQ ID NO:2中序列第68位的缬氨酸；

SEQ ID NO:2中序列第69位的苏氨酸；

SEQ ID NO:2中序列第87位的精氨酸；

SEQ ID NO:2中序列第88位的丝氨酸。

4.编号排列1至3中任一项所述的抗原结合构建体，其中，抗原结合构建体特异性地结合至CD4。

5.编号排列4所述的抗原结合构建体，其中，抗原结合构建体消耗CD4 T细胞。

6.编号排列1至3中任一项所述的抗原结合构建体，还包含可检测标记。

7.编号排列1至3中任一项所述的抗原结合构建体，还包含可变的重链结构域(VH)，其中，VH包含SEQ ID NO:2中的氨基酸序列。

8.编号排列1至3中任一项所述的抗原结合构建体，还包含可变的轻链结构域(VL)，其中，VL包含SEQ ID NO:4中的氨基酸序列。

9.编号排列1至3中任一项所述的抗原结合构建体，还包含：

SEQ ID NO:2的可变重链结构域(VH)；以及

SEQ ID NO:4的可变轻链结构域(VL)。

10.编号排列1至3中任一项所述的抗原结合构建体，其中，抗原结合构建体是全长抗体。

11.编号排列1至3中任一项所述的抗原结合构建体，其中，抗原结合构建体是微抗体。

12.编号排列11所述的抗原结合构建体，还包含SEQ ID NO:5、6、7或8的氨基酸序列。

13.一种编码编号排列11所述的微抗体的核酸序列，其中，核酸序列包含SEQ IDNO:9或10的核酸序列。

14.编号排列1至3中任一项所述的抗原结合构建体，其中，抗原结合构建体是人源化cys-双价抗体。

15.编号排列14所述的人源化cys-双价抗体，包含SEQ ID NO:11、12、13、14、15、16、17或18的氨基酸序列。

16.编号排列1所述的抗原结合构建体，其中，抗原结合构建体包含多肽，多肽包含含有连接至可变轻链结构域(VL)的可变重链结构域(VH)的单链可变片段(scFv)。

17.编号排列14所述的人源化cys-双价抗体，其中，从N端至C端是VH、VL。

18.编号排列15所述的人源化cys-双价抗体，其中，从N端至C端是VL、VH。

19.编号排列1至3中任一项所述的抗原结合构建体，还包含含有SEQ ID NO:34、35、36或37的氨基酸序列的铰链区。

20.编号排列1至3中任一项所述的抗原结合构建体，还包含以下各项中的至少一个：

SEQ ID NO:2中序列第1位的谷氨酰胺；

SEQ ID NO:2中序列第5位的缬氨酸；

SEQ ID NO:2中序列第9位的丙氨酸；

SEQ ID NO:2中序列第11位的缬氨酸；

SEQ ID NO:2中序列第13位的赖氨酸；

SEQ ID NO:2中序列第44位的精氨酸；

SEQ ID NO:2中序列第46位的谷氨酸；

SEQ ID NO:2中序列第65位的谷氨酰胺；

SEQ ID NO:2中序列第66位的甘氨酸；

SEQ ID NO:2中序列第67位的精氨酸；

SEQ ID NO:2中序列第68位的缬氨酸；

SEQ ID NO:2中序列第69位的苏氨酸；

SEQ ID NO:2中序列第87位的精氨酸；

SEQ ID NO:2中序列第88位的丝氨酸；

SEQ ID NO:4中序列第1位的谷氨酸；

SEQ ID NO:4中序列第13位的亮氨酸；

SEQ ID NO:4中序列第18位的精氨酸；

SEQ ID NO:4中序列第20位的苏氨酸；

SEQ ID NO:4中序列第21位的亮氨酸；

SEQ ID NO:4中序列第22位的丝氨酸；

SEQ ID NO:4中序列第41位的谷氨酰胺；

SEQ ID NO:4中序列第42位的丙氨酸；

SEQ ID NO:4中序列第57位的异亮氨酸；

SEQ ID NO:4中序列第59位的天冬氨酸；

SEQ ID NO:4中序列第70位的苯丙氨酸；

SEQ ID NO:4中序列第71位的苏氨酸；

SEQ ID NO:4中序列第77位的亮氨酸；

SEQ ID NO:4中序列第79位的脯氨酸；

SEQ ID NO:4中序列第84位的缬氨酸；

SEQ ID NO:4中序列第99位的甘氨酸。

21.编号排列1至3中任一项所述的抗原结合构建体，还包含以下各项中的至少一个：

SEQ ID NO:2中序列第1位的谷氨酰胺；

SEQ ID NO:2中序列第5位的缬氨酸；

SEQ ID NO:2中序列第9位的丙氨酸；

SEQ ID NO:2中序列第11位的缬氨酸；

SEQ ID NO:2中序列第13位的赖氨酸；

SEQ ID NO:2中序列第44位的精氨酸；

SEQ ID NO:2中序列第46位的谷氨酸；

SEQ ID NO:2中序列第65位的谷氨酰胺；

SEQ ID NO:2中序列第66位的甘氨酸；

SEQ ID NO:2中序列第67位的精氨酸；

SEQ ID NO:2中序列第68位的缬氨酸；

SEQ ID NO:2中序列第69位的苏氨酸；

SEQ ID NO:2中序列第87位的精氨酸；

SEQ ID NO:2中序列第88位的丝氨酸；

SEQ ID NO:4中序列第1位的谷氨酸；

SEQ ID NO:4中序列第13位的亮氨酸；

SEQ ID NO:4中序列第18位的精氨酸；

SEQ ID NO:4中序列第20位的苏氨酸；

SEQ ID NO:4中序列第21位的亮氨酸；

SEQ ID NO:4中序列第22位的丝氨酸；

SEQ ID NO:4中序列第41位的谷氨酰胺；

SEQ ID NO:4中序列第42位的丙氨酸；

SEQ ID NO:4中序列第57位的异亮氨酸；

SEQ ID NO:4中序列第59位的天冬氨酸；

SEQ ID NO:4中序列第70位的苯丙氨酸；

SEQ ID NO:4中序列第71位的苏氨酸；

SEQ ID NO:4中序列第77位的亮氨酸；

SEQ ID NO:4中序列第79位的脯氨酸；

SEQ ID NO:4中序列第84位的缬氨酸；

SEQ ID NO:4中序列第99位的甘氨酸。

22.编号排列1至3中任一项所述的抗原结合构建体，还包含所有以下各项：

SEQ ID NO:2中序列第1位的谷氨酰胺；

SEQ ID NO:2中序列第5位的缬氨酸；

SEQ ID NO:2中序列第9位的丙氨酸；

SEQ ID NO:2中序列第11位的缬氨酸；

SEQ ID NO:2中序列第13位的赖氨酸；

SEQ ID NO:2中序列第44位的精氨酸；

SEQ ID NO:2中序列第46位的谷氨酸；

SEQ ID NO:2中序列第65位的谷氨酰胺；

SEQ ID NO:2中序列第66位的甘氨酸；

SEQ ID NO:2中序列第67位的精氨酸；

SEQ ID NO:2中序列第68位的缬氨酸；

SEQ ID NO:2中序列第69位的苏氨酸；

SEQ ID NO:2中序列第87位的精氨酸；

SEQ ID NO:2中序列第88位的丝氨酸；

SEQ ID NO:4中序列第1位的谷氨酸；

SEQ ID NO:4中序列第13位的亮氨酸；

SEQ ID NO:4中序列第18位的精氨酸；

SEQ ID NO:4中序列第20位的苏氨酸；

SEQ ID NO:4中序列第21位的亮氨酸；

SEQ ID NO:4中序列第22位的丝氨酸；

SEQ ID NO:4中序列第41位的谷氨酰胺；

SEQ ID NO:4中序列第42位的丙氨酸；

SEQ ID NO:4中序列第57位的异亮氨酸；

SEQ ID NO:4中序列第59位的天冬氨酸；

SEQ ID NO:4中序列第70位的苯丙氨酸；

SEQ ID NO:4中序列第71位的苏氨酸；

SEQ ID NO:4中序列第77位的亮氨酸；

SEQ ID NO:4中序列第79位的脯氨酸；

SEQ ID NO:4中序列第84位的缬氨酸；

SEQ ID NO:4中序列第99位的甘氨酸。

23.一种微抗体或cys-双价抗体，包括：

SEQ ID NO:2中的HCDR1的HCDR1；

SEQ ID NO:2中的HCDR2的HCDR2；

SEQ ID NO:2中的HCDR3的HCDR3；

SEQ ID NO:4中的LCDR1的LCDR1；

SEQ ID NO:4中的LCDR2的LCDR2；

SEQ ID NO:4中的LCDR3的LCDR3；以及以下各项中的至少一个：

SEQ ID NO:2中序列第1位的谷氨酰胺；

SEQ ID NO:2中序列第2位的缬氨酸；

SEQ ID NO:2中序列第4位的亮氨酸；

SEQ ID NO:2中序列第24位的丙氨酸；

SEQ ID NO:2中序列第25位的丝氨酸；

SEQ ID NO:2中序列第34位的甲硫氨酸；

SEQ ID NO:2中序列第35位的组氨酸；

SEQ ID NO:2中序列第46位的谷氨酸；

SEQ ID NO:2中序列第47位的色氨酸；

SEQ ID NO:2中序列第48位的异亮氨酸；

SEQ ID NO:2中序列第49位的甘氨酸；

SEQ ID NO:2中序列第50位的丙氨酸；

SEQ ID NO:2中序列第51位的亮氨酸；

SEQ ID NO:2中序列第61位的天冬酰胺；

SEQ ID NO:2中序列第64位的苯丙氨酸；

SEQ ID NO:2中序列第70位的异亮氨酸；

SEQ ID NO:2中序列第72位的精氨酸；

SEQ ID NO:2中序列第79位的丙氨酸；

SEQ ID NO:2中序列第97位的苏氨酸；

SEQ ID NO:2中序列第98位的精氨酸；

SEQ ID NO:4中序列第1位的谷氨酸；

SEQ ID NO:4中序列第2位的异亮氨酸；

SEQ ID NO:4中序列第4位的亮氨酸；

SEQ ID NO:4中序列第6位的谷氨酰胺；

SEQ ID NO:4中序列第34位的色氨酸；

SEQ ID NO:4中序列第35位的酪氨酸；

SEQ ID NO:4中序列第45位的亮氨酸；

SEQ ID NO:4中序列第46位的亮氨酸；

SEQ ID NO:4中序列第47位的异亮氨酸；

SEQ ID NO:4中序列第67位的甘氨酸；

SEQ ID NO:4中序列第70位的苯丙氨酸；

SEQ ID NO:4中序列第97位的苯丙氨酸。

24.一种抗原结合构建体，包含：

SEQ ID NO:2中的HCDR1的HCDR1；

SEQ ID NO:2中的HCDR2的HCDR2；

SEQ ID NO:2中的HCDR3的HCDR3；

SEQ ID NO:4中的LCDR1的LCDR1；

SEQ ID NO:4中的LCDR2的LCDR2；

SEQ ID NO:4中的LCDR3的LCDR3；以及以下各项中的至少一个：

SEQ ID NO:2中序列第1位的谷氨酰胺；

SEQ ID NO:2中序列第20位的缬氨酸；

SEQ ID NO:2中序列第38位的精氨酸；

SEQ ID NO:2中序列第40位的丙氨酸；

SEQ ID NO:2中序列第44位的精氨酸；

SEQ ID NO:2中序列第60位的酪氨酸；

SEQ ID NO:2中序列第68位的缬氨酸；

SEQ ID NO:2中序列第70位的异亮氨酸；

SEQ ID NO:2中序列第72位的精氨酸；

SEQ ID NO:2中序列第74位的苏氨酸；

SEQ ID NO:4中序列第1位的谷氨酸；

SEQ ID NO:4中序列第11位的亮氨酸；

SEQ ID NO:4中序列第13位的亮氨酸；

SEQ ID NO:4中序列第19位的丙氨酸；

SEQ ID NO:4中序列第21位的亮氨酸；

SEQ ID NO:4中序列第57位的异亮氨酸；

SEQ ID NO:4中序列第70位的苯丙氨酸；

SEQ ID NO:4中序列第77位的亮氨酸；

SEQ ID NO:4中序列第79位的脯氨酸；

SEQ ID NO:4中序列第84位的缬氨酸；

SEQ ID NO:4中序列第99位的甘氨酸。

25.一种抗原结合构建体，包含：

SEQ ID NO:2中的HCDR1的HCDR1；

SEQ ID NO:2中的HCDR2的HCDR2；

SEQ ID NO:2中的HCDR3的HCDR3；

SEQ ID NO:4中的LCDR1的LCDR1；

SEQ ID NO:4中的LCDR2的LCDR2；

SEQ ID NO:4中的LCDR3的LCDR3；以及以下各项中的至少一个：

a)包含以下各项中的至少一个的VH：E1Q、Q5V、T9A、V10E、L11V、A12K、R13K、Q19K、M20V、K38R、R40A、Q46E、T59、N61、K65Q、D66G、K67R、A68V、K69T、L70I、A72R、V73D、T87R、N88S、S91T、T115L或L116V；

b)包含以下各项中的至少一个的VL：Q1E、I10T、M11L、A13L、K18R、V19A、A20T、M21L、T22S、S41Q、S42A、V57I、V59D、I62S、S69D、Y70F、S71T、M77L、A79P、A82、T84V、A99G或L106I；

c)a)的VH和b)的VL；

d)a)、b)和c)中的任一项，其中，VH与SEQ ID NO:2的同一性为至少80％；

e)a)、b)和c)中的任一项，其中，VL与SEQ ID NO:4的同一性为至少80％；

f)a)、b)和c)中的任一项，其中，VH与SEQ ID NO:2的同一性为至少80％；以及a)、b)和c)中的任一项，其中，VL与SEQ ID NO:4的同一性为至少80％；

g)具有T59、N61或两者的VH，其中，VH是人源化VH；

h)具有A82的VL，其中，VL是人源化VL；

i)根据g)的VH和根据h)的VL；

j)具有Q46E的VH；

k)具有Q46E的VH，其中，

i)VH与SEQ ID NO:2的同一性为至少80％

ii)VL与SEQ ID NO:4的同一性为至少80％

iiii)VH与SEQ ID NO:2的同一性为至少80％，并且VL与SEQ ID NO:4的同一性为至少80％；

l)具有T115L、L116V中的至少一个的VH；

m)具有S41Q、A99G或L106I中的至少一个的VL；

n)具有T115L、L116V中的至少一个的VH和具有S41Q、A99G或L106I中的至少一个的VL；或者

o)l)、m)或n)，其中，

i)VH与SEQ ID NO:2的同一性为至少80％

ii)VL与SEQ ID NO:4的同一性为至少80％

iiii)VH与SEQ ID NO:2的同一性为至少80％，并且VL与SEQ ID NO:4的同一性为至少80％。

26.编号排列1至12或19至25中任一项所述的抗原结合构建体，其中，抗原结合构建体是微抗体。

27.编号排列1至12或19至26中任一项所述的抗原结合构建体，其中，VH与SEQ IDNO:2的同一性为至少90％，VL与SEQ ID NO:4的同一性为至少90％，或VH和VL分别与SEQ IDNO:2和SEQ ID NO:4的同一性为至少90％。

28.编号排列1至12或19至27中任一项所述的抗原结合构建体，其中，VH与SEQ IDNO:2的同一性为至少95％，VL与SEQ ID NO:4的同一性为至少95％，或VH和VL分别与SEQ IDNO:2和SEQ ID NO:4的同一性为至少95％。

29.编号排列1至12或19至28中任一项所述的抗原结合构建体，其中，VH与SEQ IDNO:2的同一性为至少99％，VL与SEQ ID NO:4的同一性为至少99％，或VH和VL分别与SEQ IDNO:2和SEQ ID NO:4的同一性为至少99％。

30.编号排列1至12或19至29中任一项所述的抗原结合构建体，其中，VH与SEQ IDNO:2相同，VL与SEQ ID NO:4相同，或VH和VL分别与SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4相同。

31.编号排列1至12或19至30中任一项所述的抗原结合构建体，其中，抗原结合构建体结合至CD4。

32.编号排列31所述的抗原结合构建体，其中，CD4是人CD4。

33.编号排列1至12或19至32中任一项所述的抗原结合构建体，还包含含有SEQ IDNO:34、35、36或37的氨基酸序列的铰链区。

34.编号排列1至12或19至33中任一项所述的抗原结合构建体，其中，对于a)至f)，存在以下各项中的至少两个：对于VH，E1Q、Q5V、T9A、V10E、L11V、A12K、R13K、Q19K、M20V、K38R、R40A、Q46E、T59、N61、K65Q、D66G、K67R、A68V、K69T、L70I、A72R、V73D、T87R、N88S、S91T、T115L或L116V，和/或对于VL，Q1E、I10T、M11L、A13L、K18R、V19A、A20T、M21L、T22S、S41Q、S42A、V57I、V59D、I62S、S69D、Y70F、S71T、M77L、A79P、A82、T84V、A99G或L106I中的至少两种。

35.编号排列1至12或19至34中任一项所述的抗原结合构建体，其中，抗原结合构建体是微抗体，并且其中，微抗体与可检测标记共价连接。

36.编号排列35所述的抗原结合构建体，其中，可检测标记是

37.编号排列1至12或19至36中任一项所述的抗原结合构建体，其中，抗原结合构建体包含具有T59、N61或两者的VH，其中，VH是人源化VH。

38.编号排列1至12或19至37中任一项所述的抗原结合构建体，其中，抗原结合构建体包含具有A82的VL，其中，VL是人源化VL。

39.编号排列1至12或19至38中任一项所述的抗原结合构建体，其中，抗原结合构建体包含具有T59、N61或两者的VH，其中，VH是人源化VH；并且其中，抗原结合构建体包含具有A82的VL，其中，VL是人源化VL。

40.编号排列1至12或19至39中任一项所述的抗原结合构建体，其中，抗原结合构建体包含SEQ ID NO:5。

41.一种结合至人CD4的人源化微抗体，其中，人源化微抗体包括：

SEQ ID NO:2中的HCDR1的HCDR1；

SEQ ID NO:2中的HCDR2的HCDR2；

SEQ ID NO:2中的HCDR3的HCDR3；

SEQ ID NO:4中的LCDR1的LCDR1；

SEQ ID NO:4中的LCDR2的LCDR2；

SEQ ID NO:4中的LCDR3的LCDR3；以及以下各项中的至少一个：

a)具有T59、N61或两者的VH，其中，VH是人源化VH，其中，VH与SEQ ID NO:2的同一性为至少80％，并且VL与SEQ ID NO:4的同一性为至少80％；

b)VL-VH取向(氨基至羧基)的VH和VL；

c)具有A99G的VL；

d)具有T59、N61或两者的VH，

e)具有A99G的VL和ii)具有T59、N61或两者的VH，

f)具有T59、N61或两者的VH，其中，VH是人源化VH，其中，VH与SEQ ID NO:2的同一性为至少80％，并且VL与SEQ ID NO:4的同一性为至少80％，并且其中，VL包含A99G。或者

g)包含T59、N61或两者的VH，其中，VH是如根据SEQ ID NO:2的编号方式编号的人源化VH，以及如根据SEQ ID NO:4的编号方式编号的包含A99G的VL。

42.编号排列41所述的人源化微抗体，其中，人源化微抗体包含具有T59、N61或两者的VH，其中，VH是人源化VH，其中，VH与SEQ ID NO:2的同一性为至少80％。

43.编号排列41或编号排列42所述的人源化微抗体，其中，人源化微抗体包含与SEQ ID NO:4的同一性为至少80％的VL，并且其中，VL包含A99G。

44.编号排列41至43中任一项所述的人源化微抗体，其中，人源化微抗体包含具有T59、N61或两者的VH，其中，VH是人源化VH，其中，VH与SEQ ID NO:2的同一性为至少80％；并且其中，人源化微抗体包含与SEQ ID NO:4的同一性为至少80％的VL，并且其中，VL包含A99G。

45.编号排列41至44中任一项所述的人源化微抗体，其中，人源化微抗体包含含有T59、N61或两者的VH，其中，VH是如根据SEQ ID NO:2的编号方式编号的人源化VH。

46.编号排列41至45中任一项所述的人源化微抗体，其中，人源化微抗体包含含有如根据SEQ ID NO:4的编号方式编号的A99G的VL。

47.编号排列41至46中任一项所述的人源化微抗体，其中，人源化微抗体包含含有T59、N61或两者的VH，其中，VH是如根据SEQ ID NO:2的编号方式编号的人源化VH。并且其中，人源化微抗体包含含有如根据SEQ ID NO:4的编号方式编号的A99G的VL。

48.编号排列41至47中任一项所述的人源化微抗体，其中，人源化微抗体包含SEQID NO:5。

49.一种治疗受试者的方法，所述方法包括：

提供患有CD4相关病症的受试者；以及

施用受试者有效量的编号排列41至48中任一项所述的人源化微抗体或编号排列1至12、14至22、24至40中任一项所述的抗原结合构建体或编号排列23所述的微抗体或cys-双价抗体，以便减少CD4相关病症的至少一个症状。

50.编号排列49所述的方法，其中，人源化微抗体、抗原结合构建体、微抗体或cys-双价抗体连接至治疗剂。

51.编号排列41至48中任一项的人源化微抗体或编号排列1至12、14至22、24至40中任一项所述的抗原结合构建体或编号排列23的微抗体或cys-双价抗体在制备用于治疗CD4相关病症的药物的应用。

52.编号排列41至48中任一项所述的人源化微抗体或编号排列1至12、14至22、24至40中任一项所述的抗原结合构建体或编号排列23所述的微抗体或cys-双价抗体用作药物。

53.编号排列41至48所述的人源化微抗体或编号排列1至12、14至22、24至40中任一项所述的抗原结合构建体或编号排列23所述的微抗体或cys-双价抗体，用于在以下各项中的至少一个中使用：检测、诊断、手术、分期、治疗、监测治疗、疾病进展监测和治疗监测。

54.编号排列41至48所述的人源化微抗体或编号排列1至12、14至22、24至40中任一项所述的抗原结合构建体或编号排列23所述的微抗体或cys-双价抗体，用于在以下各项中的至少一个中使用：CD4相关病症的检测、诊断、手术、分期、治疗、监测治疗、疾病进展监测和治疗监测。

在细胞计数实验中测试抗体(结合原代T细胞)。图1说明了未缀合的抗人CD4微抗体与HPB-ALL细胞(物种：人(智人(Homo sapiens)))的流式细胞术结合结果；细胞类型：T细胞白血病；DSMZ编号：ACC 483。(A)示出了通过流式细胞术测试的不同嵌合体和人源化构建体的结合。(B)说明了阳性对照：商业抗人CD4抗体。(C)显示与商业阳性对照相比嵌合体和人源化微抗体的EC50值。

图2示出了去铁胺缀合的人源化的抗人CD4微抗体与HPB-ALL细胞的流式细胞术结合，与未缀合的微抗体相比。与去铁胺的结合不影响与HPC-ALL的结合。针对结果测试的构建体如下：图4中的IAB41-1，SEQ ID 5；图5中的IAB41-2，SEQ ID 6；以及图7中的IAB41-3，SEQ ID 8。构建体41-1是图4。

人源化CD4 cys-双价抗体经由cys-双价抗体上的C端半胱氨酸与相关螯合剂缀合并且随后用In111的同位素(或在替代方案中，Zr89或Cu64)放射性标记。可替代地，在将相关螯合剂附接至赖氨酸残基之后对cys-双价抗体进行放射性标记或用碘直接进行放射性标记。可替代地，经由与[18F]-氟苯甲醛的还原氨化，或经由与[18F]-N-琥珀酰亚胺基氟苯甲酸酯的反应，用F18放射性标记cys-双价抗体。

将cys-双价抗体静脉内输注或注射到人类受试者中。在输注后，cys-双价抗体循环并且扩散通过受试者。在孵育的同一天内，通过PET扫描或外部闪烁系统检测cys-双价抗体的定位。

cys-双价抗体的定位用于确定携带CD4的细胞在受试者中的定位。除了其他目的之外，器官或瘤中存在或不存在携带CD4的细胞的积累，可以用于分类或选择用于临床试验的人类受试者，推荐或确定人类受试者用于治疗性治疗的资格，预测对人类受试者的治疗的响应，和/或分析或检测在人类受试者中响应于治疗性治疗的携带CD4的细胞群体的迁移和/或分布模式的变化。

CD4微抗体经由微抗体上的赖氨酸残基与相关螯合剂缀合并且随后用In111的同位素(或在替代方案中，Zr89或Cu64)放射性标记，或用含碘的化合物(如，Bolten-Huntrer)直接标记赖氨酸残基。可替代地，微抗体可以通过经由酪氨酸残基用碘直接放射性标记来放射性标记。可替代地，通过用[18F]-氟苯甲醛的还原氨化，或通过与[18F]-N-琥珀酰亚胺基氟苯甲酸酯反应，用F18放射性标记微抗体。

将微抗体静脉内输注到人类受试者中。微抗体在输注后循环并扩散通过受试者。在孵育的同一天，通过PET扫描或外部闪烁系统检测微抗体的定位。

使用微抗体的定位来确定携带CD4的细胞在受试者中的定位。除了其他目的之外，器官或瘤中存在或不存在携带CD4的细胞的积累，可以用于分类或选择用于临床试验的人类受试者，推荐或确定人类受试者用于治疗性治疗的资格，预测对人类受试者的治疗的响应，和/或分析或检测在人类受试者中响应于治疗性治疗的携带CD4的细胞群体的迁移和/或分布模式的变化。

通过在哺乳动物细胞中瞬时表达产生IAB41微抗体。将DNA序列克隆到适于哺乳动物表达的质粒中，并根据制造商提供的方案转染到Expi293细胞中。在37℃下，在具有排气盖的无菌聚碳酸酯锥形瓶中，将细胞培养物在搅拌下孵育4天。在培养期间监测细胞活性和浓度。在转染后的第四天，通过在600rpm下离心分离含有微抗体的条件培养基，随后通过无菌0.22μm过滤器瓶进行无菌过滤。

通过用包含与琼脂糖珠缀合的骆驼源性单结构域抗体片段的色谱树脂的亲和层析法从条件培养基中纯化微抗体使条件培养基通过亲和基质，同时监测280nm处的吸光度。在此加载步骤之后，用磷酸盐缓冲盐水洗涤该柱直到在280nm处的吸光度达到基线值。然后用pH 3.5的缓冲液从亲和树脂洗脱微抗体。立即用浓缩的Tris缓冲液将洗脱级分的pH校正至pH 7.2，并且通过在280nm下测量吸光度来计算抗体浓度。通过分析型尺寸排阻色谱法和十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳测试微抗体的纯度。通过在Sephacryl 200柱上使用磷酸盐缓冲盐水作为流动相的制备型尺寸排阻色谱法进一步精制微抗体。将对应于单体微抗体的级分合并，并且通过在280nm下测量吸光度来确认浓度。

微抗体与去铁胺(Df)的缀合通过将微抗体与Df以1:7的比例于35℃在pH 8.5缓冲的溶液中温育2小时来进行。在缀合反应结束时，通过UV光谱法测量浓度和螯合剂与微抗体比率，并且通过分析性尺寸排阻色谱法评估缀合产物的纯度。通过在中性pH下将缀合物与

在本申请中，单数的使用可以包括复数，除非另有明确说明，或者除非本领域技术人员根据本公开将理解，单数是唯一的功能性实施方式。因此，例如，“一个”可以意指多于一个，并且“一个实施方式”可以意指该描述适用于多个实施方式。

本文引用的所有参考文献，包括专利、专利申请、论文、教科书等，以及其中引用的参考文献，在它们尚未存在的程度上，通过引用以其全部内容结合于此。在所结合的文献和类似材料中的一个或多个与本申请不同或矛盾的情况下；包括但不限于限定的术语、术语使用、描述的技术等，本申请进行控制。

前面的描述和实施例详细描述了某些实施方式。然而，应当理解，无论前述内容在文本中如何详细出现，本发明都可以以许多方式实践，并且本发明应当根据所附权利要求及其任何等同物来解释。

序列表

<110> 伊麦吉纳博公司（ImaginAb, Inc.）

亚历山德罗·马肖尼（Mascioni, Alessandro）

托弗·奥拉夫森（Olafsen , Tove）

道列特·萨特帕耶夫（Satpayev, Daulet）

<120> CD4的抗原结合构建体

<130> IGNAB.048WO

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705 710 715 720

Gly Cys Cys Gly Thr Gly Thr Ala Thr Thr Ala Cys Thr Gly Cys Cys

725 730 735

Ala Gly Cys Ala Ala Thr Gly Gly Ala Gly Cys Gly Ala Thr Thr Ala

740 745 750

Thr Cys Cys Thr Cys Thr Gly Ala Cys Cys Thr Thr Thr Gly Gly Cys

755 760 765

Gly Gly Ala Gly Gly Cys Ala Cys Cys Ala Ala Gly Cys Thr Cys Gly

770 775 780

Ala Gly Ala Thr Cys Ala Ala Gly Gly Ala Gly Cys Cys Cys Ala Ala

785 790 795 800

Ala Thr Cys Cys Thr Cys Cys Gly Ala Thr Ala Ala Ala Ala Cys Cys

805 810 815

Cys Ala Cys Ala Cys Cys Thr Gly Cys Cys Cys Thr Cys Cys Thr Thr

820 825 830

Gly Thr Cys Cys Thr Cys Cys Thr Thr Gly Thr Gly Gly Cys Gly Gly

835 840 845

Cys Gly Gly Cys Thr Cys Cys Ala Gly Cys Gly Gly Ala Gly Gly Cys

850 855 860

Gly Gly Cys Thr Cys Cys Gly Gly Cys Gly Gly Ala Cys Ala Gly Cys

865 870 875 880

Cys Cys Ala Gly Ala Gly Ala Gly Cys Cys Thr Cys Ala Gly Gly Thr

885 890 895

Cys Thr Ala Cys Ala Cys Cys Cys Thr Gly Cys Cys Cys Cys Cys Thr

900 905 910

Ala Gly Cys Ala Gly Gly Gly Ala Ala Gly Ala Gly Ala Thr Gly Ala

915 920 925

Cys Cys Ala Ala Gly Ala Ala Cys Cys Ala Gly Gly Thr Gly Ala Gly

930 935 940

Cys Cys Thr Gly Ala Cys Cys Thr Gly Thr Cys Thr Gly Gly Thr Gly

945 950 955 960

Ala Ala Gly Gly Gly Cys Thr Thr Cys Thr Ala Cys Cys Cys Cys Thr

965 970 975

Cys Cys Gly Ala Thr Ala Thr Thr Gly Cys Cys Gly Thr Cys Gly Ala

980 985 990

Gly Thr Gly Gly Gly Ala Gly Thr Cys Cys Ala Ala Cys Gly Gly Cys

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Cys Ala Gly Cys Cys Cys Gly Ala Ala Ala Ala Cys Ala Ala Cys

1010 1015 1020

Thr Ala Cys Ala Ala Ala Ala Cys Ala Ala Cys Cys Cys Cys Cys

1025 1030 1035

Cys Cys Cys Gly Thr Gly Cys Thr Cys Gly Ala Cys Thr Cys Cys

1040 1045 1050

Gly Ala Cys Gly Gly Thr Thr Cys Thr Thr Thr Thr Thr Thr Cys

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Cys Thr Cys Thr Ala Cys Thr Cys Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly

1070 1075 1080

Ala Cys Cys Gly Thr Cys Gly Ala Cys Ala Ala Gly Thr Cys Cys

1085 1090 1095

Ala Gly Gly Thr Gly Gly Cys Ala Gly Cys Ala Gly Gly Gly Cys

1100 1105 1110

Ala Ala Cys Gly Thr Gly Thr Thr Cys Ala Gly Cys Thr Gly Cys

1115 1120 1125

Ala Gly Cys Gly Thr Gly Ala Thr Gly Cys Ala Cys Gly Ala Gly

1130 1135 1140

Gly Cys Cys Cys Thr Cys Cys Ala Cys Ala Ala Cys Cys Ala Cys

1145 1150 1155

Thr Ala Cys Ala Cys Cys Cys Ala Gly Ala Ala Ala Thr Cys Cys

1160 1165 1170

Cys Thr Cys Thr Cys Cys Cys Thr Gly Ala Gly Cys Cys Cys Cys

1175 1180 1185

Gly Gly Cys Thr Gly Ala

1190

<210> 11

<211> 234

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Cys-双价抗体

<400> 11

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1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Arg Ser Ser Val Ser Tyr Leu

20 25 30

Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr

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50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Asp Tyr Pro Leu Thr

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100 105 110

Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser

115 120 125

Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Ala Asn Tyr Trp

130 135 140

Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile Gly

145 150 155 160

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165 170 175

Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met

180 185 190

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195 200 205

Arg Met Gly Thr Thr Leu Glu Ala Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

210 215 220

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Cys

225 230

<210> 12

<211> 237

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Cys-双价抗体

<400> 12

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Arg Ser Ser Val Ser Tyr Leu

20 25 30

Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr

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Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Asp Tyr Pro Leu Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ser Gly Gly Gly Gly Gln

100 105 110

Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser

115 120 125

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130 135 140

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165 170 175

Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met

180 185 190

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195 200 205

Arg Met Gly Thr Thr Leu Glu Ala Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

210 215 220

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Cys Pro Pro Cys

225 230 235

<210> 13

<211> 240

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Cys-双价抗体

<400> 13

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Arg Ser Ser Val Ser Tyr Leu

20 25 30

Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Asp Tyr Pro Leu Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ser Gly Gly Gly Gly Gln

100 105 110

Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser

115 120 125

Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Ala Asn Tyr Trp

130 135 140

Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile Gly

145 150 155 160

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165 170 175

Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met

180 185 190

Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr

195 200 205

Arg Met Gly Thr Thr Leu Glu Ala Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

210 215 220

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Cys Pro Pro Cys Pro Pro Cys

225 230 235 240

<210> 14

<211> 243

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Cys-双价抗体

<400> 14

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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Arg Ser Ser Val Ser Tyr Leu

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Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser

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165 170 175

Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met

180 185 190

Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr

195 200 205

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210 215 220

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Cys Pro Pro Cys Pro Pro Cys

225 230 235 240

Pro Pro Cys

<210> 15

<211> 234

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Cys-双价抗体

<400> 15

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Ala Asn Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile

35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ser Gly Gly Gly Gly Glu Ile Val

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Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala

130 135 140

Thr Leu Ser Cys Ser Ala Arg Ser Ser Val Ser Tyr Leu Tyr Trp Tyr

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Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Thr Ser

165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

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210 215 220

Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Cys

225 230

<210> 16

<211> 237

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Cys-双价抗体

<400> 16

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Ala Asn Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile

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Gly Ala Leu Tyr Pro Gly Asn Val Asp Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

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Thr Arg Met Gly Thr Thr Leu Glu Ala Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ser Gly Gly Gly Gly Glu Ile Val

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Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala

130 135 140

Thr Leu Ser Cys Ser Ala Arg Ser Ser Val Ser Tyr Leu Tyr Trp Tyr

145 150 155 160

Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Thr Ser

165 170 175

Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

180 185 190

Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Ala Ala

195 200 205

Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Asp Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly

210 215 220

Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Cys Pro Pro Cys

225 230 235

<210> 17

<211> 240

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Cys-双价抗体

<400> 17

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Ala Asn Tyr

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Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile

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65 70 75 80

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100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ser Gly Gly Gly Gly Glu Ile Val

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130 135 140

Thr Leu Ser Cys Ser Ala Arg Ser Ser Val Ser Tyr Leu Tyr Trp Tyr

145 150 155 160

Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Thr Ser

165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Asp Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly

210 215 220

Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Cys Pro Pro Cys Pro Pro Cys

225 230 235 240

<210> 18

<211> 243

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Cys-双价抗体

<400> 18

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Ala Asn Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Leu Tyr Pro Gly Asn Val Asp Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

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65 70 75 80

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Thr Leu Ser Cys Ser Ala Arg Ser Ser Val Ser Tyr Leu Tyr Trp Tyr

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Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Thr Ser

165 170 175

Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

180 185 190

Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Ala Ala

195 200 205

Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Asp Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly

210 215 220

Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Cys Pro Pro Cys Pro Pro Cys

225 230 235 240

Pro Pro Cys

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000

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<400> 20

000

<210> 21

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000

<210> 22

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 信号肽

<400> 22

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Gly Ser Thr Gly

20

<210> 23

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 信号肽

<400> 23

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly

20

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<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 信号肽

<400> 24

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly

20

<210> 25

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 信号肽

<400> 25

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

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Gly Ser Thr Gly

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 信号肽

<400> 26

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

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Gly Ser Thr Gly

20

<210> 27

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 信号肽

<400> 27

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly

20

<210> 28

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 信号肽

<400> 28

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Gly Ser Thr Gly

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 信号肽

<400> 29

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly

20

<210> 30

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 信号肽

<400> 30

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly

20

<210> 31

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 信号肽

<400> 31

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly

20

<210> 32

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 信号肽

<400> 32

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly

20

<210> 33

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 信号肽

<400> 33

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly

20

<210> 34

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 铰链

<400> 34

Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Pro

1 5 10 15

Cys Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly

20 25

<210> 35

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 铰链

<400> 35

Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Pro

1 5 10 15

Cys Pro Pro Cys Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly

20 25 30

<210> 36

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 铰链

<400> 36

Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Pro

1 5 10 15

Cys Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly

20 25

<210> 37

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 铰链

<400> 37

Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Pro

1 5 10 15

Cys Pro Pro Cys Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly

20 25 30

<210> 38

<211> 62

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MAX16H5

<400> 38

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Gln Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Ala Asn Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Gln Trp Ile

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Gly Ala Leu Tyr Pro Gly Asn Val Asp Thr Thr Tyr Asn Gln

50 55 60

<210> 39

<211> 62

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 39

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Ala Gly Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ser Gln

50 55 60

<210> 40

<211> 62

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> IAB41

<400> 40

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Ala Asn Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Leu Tyr Pro Gly Asn Val Asp Thr Thr Tyr Asn Gln

50 55 60

<210> 41

<211> 60

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MAX16H5

<400> 41

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Ala Met Thr Cys Ser Ala Arg Ser Ser Val Ser Tyr Leu

20 25 30

Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg

50 55 60

<210> 42

<211> 43

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 42

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Leu Ala

20 25 30

Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ile Pro Asp Arg

35 40

<210> 43

<211> 60

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> IAB41

<400> 43

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Arg Ser Ser Val Ser Tyr Leu

20 25 30

Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Asp Arg

50 55 60

<210> 44

<211> 433

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 44

Lys Lys Val Val Leu Gly Lys Lys Gly Asp Thr Val Glu Leu Thr Cys

1 5 10 15

Thr Ala Ser Gln Lys Lys Ser Ile Gln Phe His Trp Lys Asn Ser Asn

20 25 30

Gln Ile Lys Ile Leu Gly Asn Gln Gly Ser Phe Leu Thr Lys Gly Pro

35 40 45

Ser Lys Leu Asn Asp Arg Ala Asp Ser Arg Arg Ser Leu Trp Asp Gln

50 55 60

Gly Asn Phe Pro Leu Ile Ile Lys Asn Leu Lys Ile Glu Asp Ser Asp

65 70 75 80

Thr Tyr Ile Cys Glu Val Glu Asp Gln Lys Glu Glu Val Gln Leu Leu

85 90 95

Val Phe Gly Leu Thr Ala Asn Ser Asp Thr His Leu Leu Gln Gly Gln

100 105 110

Ser Leu Thr Leu Thr Leu Glu Ser Pro Pro Gly Ser Ser Pro Ser Val

115 120 125

Gln Cys Arg Ser Pro Arg Gly Lys Asn Ile Gln Gly Gly Lys Thr Leu

130 135 140

Ser Val Ser Gln Leu Glu Leu Gln Asp Ser Gly Thr Trp Thr Cys Thr

145 150 155 160

Val Leu Gln Asn Gln Lys Lys Val Glu Phe Lys Ile Asp Ile Val Val

165 170 175

Leu Ala Phe Gln Lys Ala Ser Ser Ile Val Tyr Lys Lys Glu Gly Glu

180 185 190

Gln Val Glu Phe Ser Phe Pro Leu Ala Phe Thr Val Glu Lys Leu Thr

195 200 205

Gly Ser Gly Glu Leu Trp Trp Gln Ala Glu Arg Ala Ser Ser Ser Lys

210 215 220

Ser Trp Ile Thr Phe Asp Leu Lys Asn Lys Glu Val Ser Val Lys Arg

225 230 235 240

Val Thr Gln Asp Pro Lys Leu Gln Met Gly Lys Lys Leu Pro Leu His

245 250 255

Leu Thr Leu Pro Gln Ala Leu Pro Gln Tyr Ala Gly Ser Gly Asn Leu

260 265 270

Thr Leu Ala Leu Glu Ala Lys Thr Gly Lys Leu His Gln Glu Val Asn

275 280 285

Leu Val Val Met Arg Ala Thr Gln Leu Gln Lys Asn Leu Thr Cys Glu

290 295 300

Val Trp Gly Pro Thr Ser Pro Lys Leu Met Leu Ser Leu Lys Leu Glu

305 310 315 320

Asn Lys Glu Ala Lys Val Ser Lys Arg Glu Lys Ala Val Trp Val Leu

325 330 335

Asn Pro Glu Ala Gly Met Trp Gln Cys Leu Leu Ser Asp Ser Gly Gln

340 345 350

Val Leu Leu Glu Ser Asn Ile Lys Val Leu Pro Thr Trp Ser Thr Pro

355 360 365

Val Gln Pro Met Ala Leu Ile Val Leu Gly Gly Val Ala Gly Leu Leu

370 375 380

Leu Phe Ile Gly Leu Gly Ile Phe Phe Cys Val Arg Cys Arg His Arg

385 390 395 400

Arg Arg Gln Ala Glu Arg Met Ser Gln Ile Lys Arg Leu Leu Ser Glu

405 410 415

Lys Lys Thr Cys Gln Cys Pro His Arg Phe Gln Lys Thr Cys Ser Pro

420 425 430

Ile