一种抗Her2抗体的制备方法

技术领域

本发明实施例涉及生物工程技术领域，具体涉及一种抗Her2抗体的制备方法。

背景技术

人类表皮生长因子受体2（缩写Her2）属于人表皮生长因子受体家族，是由ERBB2基因编码的蛋白。Her2在正常细胞中表达水平极低，过量表达导致细胞增殖、分化、发育等功能紊乱，与肿瘤发生有密切关系。有20%左右乳腺癌会发生Her2基因扩增或过表达，成为乳腺癌治疗的主要靶点。目前已上市的Her2治疗性抗体曲妥株单抗（又称赫赛汀），1998年Genentech通过FDA批准上市销售，成为乳腺癌治疗的一线用药。

在抗Her2抗体的制备纯化过程中，需有效去除聚集体、片段、外源DNA、宿主蛋白等。抗体的注射剂量较大，严格控制工艺相关杂质、产品相关杂质，是抗体制备纯化的主要技术难点。在低pH孵育后pH回调，一般在5.0～7.0，正处于宿主蛋白的等电点附近，导致料液浑浊甚至沉淀，对后续离子交换和工艺放大都有不利影响，导致目的蛋白损失。

发明内容

本发明所解决的技术问题为针对抗Her2抗体纯化方法的问题，提供了一种her2的纯化方法，将阴离子交换层析与proteinA亲和层析串联，将传统工艺步骤由三步减为两步。以解决现有技术中操作步骤多，收率低，proteinA载量低，收率损失严重，工艺时间较长的问题。提高了生产效率，十分适合规模化放大生产。

实施本发明病毒灭活及过滤等步骤，可以采用CN201110452837、US6719971中公布的方法来进行。

该方法的主要步骤在于：将经过深层过滤的细胞表达上清，顺序通过阴离子交换层析柱与proteinA亲和层析层析柱串联层析系统，利用内毒素、宿主蛋白与阴离子高吸附作用达到去除内毒素、宿主蛋白的目的。

之后采用低pH的缓冲液对亲和层析柱单独进行洗脱，收集洗脱后的目的蛋白。

本发明的具体处理步骤如下：

含抗Her2抗体的细胞发酵液，经过深层过滤，滤膜为pall SC050PDH4滤膜，得到细胞上清。缓冲液为pH6.0~7.5，浓度10mmol/L~100 mmol/L磷酸盐缓冲液平衡；

上清液顺次通过阴离子交换层析柱与proteinA亲和层析柱串联层析系统，使内毒素和宿主蛋白结合到阴离子交换层析柱上，至上样完毕。

采用低pH缓冲液单独对proteinA亲和层析柱进行洗脱，收集目的蛋白液；

洗脱后的目的蛋白经阳离子交换层析，获得高纯度的蛋白样品。

所述阴离子交换层析柱与proteinA亲和层析柱串联层析层析条件为：180~300cm/h，柱高：15~20cm，平衡缓冲液为：pH6.5~7.5，浓度10mmol/L~100 mmol/L磷酸盐缓冲液平衡。pH3.0~3.6， 10mmol/L~100 mmol/L柠檬酸或甘氨酸洗脱；

阴离子交换层析为：、聚甲基丙烯酸脂类，配基为伯铵基或高流速琼脂糖凝胶类，配基为N-苄基-N-甲基乙醇胺或阴离子复合膜。

阳离子交换层析条件为：200~400cm/h，柱高：15~20cm，平衡缓冲液为：pH5.0~5.5，浓度10mmol/L~100 mmol/L磷酸盐或柠檬酸缓冲液，洗脱液：pH6.0~6.5，浓度10mmol/L~100mmol/L磷酸盐或醋酸盐缓冲液，加氯化钠100~300 mmol/L。

采用这种技术，将两步层析进行串联，简化层析步骤，缩短工艺周期和工艺成本，提高了工艺的可操作性。

抗Her2抗体等电点在8.5～9.0左右，传统将阴离子交换放在亲和层析之后，大量外源DNA和宿主蛋白导致ProteinA层析载量较低，低pH孵育后料液浑浊度高，一般通过深层过滤进行处理。

内毒素等电点在3.5左右，宿主蛋白等电点在5.0～6.0，均明显低于目的蛋白，通过阴离子交换层析采用流穿的方式，使宿主蛋白、内毒素有效结合，抗Her2抗体流穿，减少了proteinA亲和介质的损伤，延长使用寿命。

本发明实施例的纯化方法充分利用目的蛋白与杂质的表面电荷、分子量大小等差异，先通过一个阴离子交换层析串联proteinA亲和层析，有效去除宿主蛋白、外源DNA，增加工艺的可控性；再通过进一步阳离子交换层析进一步提纯。本工艺不仅有效去除产品、工艺相关杂质，简化了工艺步骤，缩短工艺周期，易于控制，便于操作，重复性较好。工艺稳定、可控，适合规模工业生产。

附图说明

图1为本发明实施例1提供的抗Her 2抗体纯化的SEC-HPLC色谱图；

图2为本发明实施例2提供的抗Her 2抗体纯化的SEC-HPLC色谱图；

图3为本发明实施例3提供的抗Her 2抗体纯化的SEC-HPLC色谱图；

图4为本发明实施例4提供的抗Her 2抗体纯化的SEC-HPLC色谱图。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

1. 采用pH6.5 10 mmol/L的磷酸盐缓冲液平衡琼脂糖凝胶类，配基为N-苄基-N-甲基乙醇胺层析柱(capto adhere)-proteinA（不限制类型）串联层析，将深层过滤液上样完毕，用pH6.5，10 mmol/L的磷酸盐缓冲液再平衡阴离子-亲和层析柱，然后用pH3.0 10mmol/L柠檬酸钠缓冲液对亲和层析柱进行洗脱，而后病毒灭活。

2. 用pH5.0 100 mmol/L柠檬酸缓冲液平衡阳离子交换层析柱（Fractogel® EMDSO3-(S)）,将亲和层析收集液上样，至上样完毕，再用pH5.0 100 mmol/L柠檬酸钠缓冲液冲洗至基线。然后用含有0.1 mol/L氯化钠的pH6.5 10mmol/L磷酸盐缓冲液进行洗脱，收集目的蛋白；

取样进行SEC-HPLC检测，纯度达99%以上，层析工艺收率70%以上。如图1所示，SEC-HPLC检测结果 99.939%。

实施例2

1. 采用pH6.5，100mmol/L的磷酸盐缓冲液平衡聚甲基丙烯酸脂类，配基为伯铵基（-NH2）层析柱-proteinA（不限制类型）串联层析，将深层过滤液上样，至上样完毕，用pH6.5，100mmol/L的磷酸盐缓冲液平衡阴离子-亲和层析柱，冲洗至基线。然后用pH3.6100mmol/L甘氨酸缓冲液对亲和层析柱进行洗脱，而后病毒灭活。

2. 用pH5.5 10 mmol/L磷酸盐缓冲液平衡阳离子交换层析柱（GigaCapS-650S），将亲和层析收集液上样，至上样完毕，再用pH5.5 10 mmol/L磷酸盐缓冲液至基线。然后用含有0.3mol/L氯化钠的pH6.0 10 mmol/L磷酸盐缓冲液进行洗脱，收集目的蛋白；

取样进行SEC-HPLC检测，纯度达99%以上，工艺收率70%以上。如图2所示，SEC-HPLC检测结果 99.221%。

实施例3

1. 采用pH7.0，10mmol/L的磷酸盐缓冲液平衡琼脂糖凝胶类，配基为N-苄基-N-甲基乙醇胺层析柱(capto adhere) -proteinA（不限制类型）串联层析，将深层过滤液上样，至完毕，用pH7.0，10 mmol/L的磷酸盐缓冲液平衡阴离子-亲和层析柱，然后用pH3.2 20mmol/L柠檬酸钠缓冲液对亲和层析柱进行洗脱，而后病毒灭活。

2. 用pH5.0 50 mmol/L磷酸盐缓冲液平衡阳离子交换层析柱（Fractogel® EMDSO3-(S)）,将亲和层析收集液上样，至上样完毕，再用pH5.0 50 mmol/L柠檬酸钠缓冲液冲洗至基线。然后用含有0.2 mol/L氯化钠的pH6.2 50 mmol/L磷酸盐缓冲液进行洗脱，收集目的蛋白；

取样进行SEC-HPLC检测，纯度达99%以上，工艺收率70%以上。如图3所示，SEC-HPLC检测结果 99.216%。

实施例4

1. 采用pH7.5，20 mmol/L的磷酸盐缓冲液平衡聚甲基丙烯酸脂类，配基为伯铵基（-NH2）层析柱-proteinA（不限制类型）串联层析，将深层过滤液上样，至完毕，用pH7.5，20mmol/L的磷酸盐缓冲液平衡阴离子-亲和层析串联层析柱，然后用pH3.4 50 mmol/L柠檬酸缓冲液对亲和层析柱进行洗脱，而后病毒灭活。

2. 用pH5.0 20 mmol/L柠檬酸缓冲液平衡阳离子交换层析柱（GigaCap S-650S）,将亲和层析收集液上样，至上样完毕，再用pH5.0 20 mmol/L柠檬酸缓冲液冲洗至基线。然后用含有0.2 mol/L氯化钠的pH6.2 50 mmol/L醋酸钠缓冲液进行洗脱，收集目的蛋白；

取样进行SEC-HPLC检测，纯度达99%以上，工艺总收率70%以上。如图4所示，SEC-HPLC检测结果 99.743%。

比较例

现有技术与本发明实施例3样品HCP、HCD去除效果、proteinA载量对比：

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。