一种基于光致可重复使用固定化材料的酶固定化复合物及其制备方法
文献发布时间:2023-06-19 11:47:31
技术领域
本发明涉及纳米复合材料技术领域,具体涉及一种基于光致可重复使用固定化材料的酶固定化复合物及其制备方法。
背景技术
酶作为一种高效、专一的生物催化剂,能够降低反应过程的能耗,绿色环保,在污水处理领域受到越来越多的关注。但是,游离酶稳定性较低、易失活、成本昂贵、不能重复利用,限制了酶催化法的实际应用。为了解决这一问题,科研人员开发出一系列酶固定化材料,如碳纳米管、介孔硅、磁性纳米颗粒及聚合材料等,将酶固定化在固定化材料后形成酶固定化复合物,酶固定化复合物能够显著提高酶的稳定性和活性,从而进一步提高水中污染物的降解速率。
酶固定化复合物在连续处理污染物时,由于酶与反应底物的相互作用以及反应环境中其他因素的影响,酶活性会逐渐降低,从而影响了反应的速率及生产效率。而传统的酶固定化技术无法实现酶的脱附,使得酶固定化材料无法重复使用,造成了资源浪费。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于光致可重复使用固定化材料的酶固定化复合物及其制备方法,该方法制备得到的酶固定化复合物不仅能提高酶催化剂的效率和稳定性,还能够实现光致酶催化剂的负载-脱附,以便于回收无机-有机磁性纳米复合固定化材料,实现酶固定化材料的重复使用。
为了实现上述目的,本发明提供了一种基于光致可重复使用固定化材料的酶固定化复合物及其制备方法,包括以下步骤:
(1)将β-环糊精、四氟对苯二腈、碳酸盐加入混合溶剂中得到混合溶液Ⅰ,然后将纳米四氧化三铁加入混合溶液Ⅰ中,于80~100℃反应24~48h,外加磁场将纳米四氧化铁磁性分离后,用浓盐酸冲洗至无气泡产生得到无机-有机磁性纳米复合固定化材料;
所述β-环糊精、四氟对苯二腈和碳酸盐之间的质量比为1∶(0.5~1)∶(1~2);混合溶剂为四氢呋喃和N,N-二甲基甲酰胺之间按体积比为(7~9)∶1配制而成,所述纳米四氧化三铁与β-环糊精的质量比为1∶(6~10);
(2)将偶氮苯-4-苯甲酸、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)和N-羟基琥珀酰亚胺加入到有机溶剂中配制成0.25g/ml的有机溶液,于室温下搅拌2~5h,反应结束后加入5mg/mL含有酶催化剂的PBS溶液,于4~10℃下搅拌10~30min得到混合溶液Ⅱ;将无机-有机磁性纳米复合固定化材料加入混合溶液Ⅱ中,恒温10~25℃摇床培养2~4h,外加磁场磁性分离后得到酶固定化复合物;
所述有机溶液与PBS溶液的体积比为1:(200~500),所述偶氮苯-4-苯甲酸、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)、N-羟基琥珀酰亚胺之间的质量比为1∶(0.5~1)∶(0.1~1),所述酶催化剂和无机-有机磁性纳米复合固定化材料的质量比为1∶(2~5)。
优选的,步骤(1)中β-环糊精、四氟对苯二腈和碳酸盐之间的质量比为1∶0.5∶1.5;所述纳米四氧化三铁与β-环糊精的质量比为1∶8。
优选的,步骤(1)中于80℃反应48h。
优选的,步骤(1)中碳酸盐为碳酸钾或碳酸钠。
优选的,步骤(2)中所述偶氮苯-4-苯甲酸、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)、N-羟基琥珀酰亚胺之间的质量比为1∶0.6∶0.4。
优选的,步骤(2)中酶催化剂和无机-有机磁性纳米复合固定化材料的质量比为1∶2。
优选的,步骤(2)中有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺或二甲亚砜;酶催化剂为酪氨酸酶或漆酶。
上述基于光致可重复使用固定化材料的酶固定化复合物的制备方法所制备得到的酶固定化复合物。
本发明成功制备含有环糊精的磁性纳米复合固定化材料,并通过偶氮苯化合物简单修饰酶催化剂,在不同波长光照下,实现酶催化剂与固定化材料之间的负载-脱附。环糊精和偶氮类化合物组成的超分子体系,利用不同波长光源刺激下偶氮结构顺反式结构的互变,实现光致可逆“包结-脱包结”过程。在正常可见光下,偶氮苯以反式结构存在,可被环糊精识别并包结得到酶固定化复合物;当酶催化剂活性降至一定程度时,在紫外光下,偶氮苯以顺式结构存在,环糊精不能包结,酶催化剂脱附,实现磁性纳米复合固定化材料的重复使用。
本发明制备的酶固定化复合物在处理污水中有机污染物时,污水处理过程中,固定化催化剂完成催化反应后,可以通过外加磁场将其从体系中分离出来。当酶催化活性显著降低时,外加光源刺激,即可实现酶催化剂的脱附。回收的磁性纳米复合固定化材料可以重新用于酶的固定负载,实现酶固定化材料的重复使用。
与现有技术相比,本发明具有以下优点:
本发明大大提高了酶催化剂的效率和稳定性,并通过光致可逆“包结-脱包结”过程,实现了酶固定化材料的重复使用。
附图说明
图1是实施例一制备的无机-有机磁性纳米复合固定化材料的扫描电子显微镜图;
图2是实施例一中酶固定化复合物的荧光照片;
图3是实施例一中酶固定化复合物用于降解苯酚的效果图;
图4是实施例一中制备的无机-有机磁性纳米复合固定化材料重复使用的效果图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例一
一种基于光致可重复使用固定化材料的酶固定化复合物及其制备方法,包括以下步骤:
(1)将β-环糊精、四氟对苯二腈、碳酸钾加入混合溶剂中得到混合溶液Ⅰ,然后将纳米四氧化三铁加入混合溶液Ⅰ中,于80℃反应48h,外加磁场将纳米四氧化铁磁性分离后,用浓盐酸冲洗至无气泡产生得到无机-有机磁性纳米复合固定化材料;
所述β-环糊精、四氟对苯二腈和碳酸钾之间的质量比为1∶0.5∶1.5;混合溶剂为四氢呋喃和N,N-二甲基甲酰胺之间按体积比为9∶1配制而成,所述纳米四氧化三铁与β-环糊精的质量比为1∶8;
(2)将偶氮苯-4-苯甲酸、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)和N-羟基琥珀酰亚胺加入到N,N-二甲基甲酰胺中配制成0.25g/ml的有机溶液,于室温下搅拌2h,反应结束后加入5mg/mL含有酪氨酸酶的PBS溶液,于4℃下搅拌20min得到混合溶液Ⅱ;将无机-有机磁性纳米复合固定化材料加入混合溶液Ⅱ中,恒温10℃摇床培养4h,外加磁场磁性分离后得到酶固定化复合物;
所述有机溶液与PBS溶液的体积比为1:200,所述偶氮苯-4-苯甲酸、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)、N-羟基琥珀酰亚胺之间的质量比为1∶0.6∶0.4,所述酪氨酸酶和无机-有机磁性纳米复合固定化材料的质量比为1∶2。
图1为本实施例制备的无机-有机磁性纳米复合固定化材料的扫描电子显微镜图,从图中可以看出,含有β-环糊精的多孔聚合物包裹在磁性四氧化三铁纳米粒子表面,由此说明步骤(1)已成功合成出了复合固定化材料。
图2为本实施例制备的酶固定化复合物的荧光照片,从图中可以明显看出,通过荧光染色的酶已经成功负载于无机-有机磁性纳米复合固定化材料中。
以苯酚作为污染物,0.1mg/mL、0.3mg/mL、0.5mg/mL的酶固定化复合物降解0.5mM苯酚的反应体系培养在25℃,100rpm的恒温振荡培养箱中,每隔一段时间取出50uL的样品,磁铁分离5min,收集上清液利用高效液相色谱对苯酚进行定量分析。
图3本实施例制备的酶固定化复合物降解苯酚的效果图,从图中可以看出,酶固定化复合物可以高效的去除水中污染物苯酚,在6h内可将浓度为0.1mg/ml,0.3mg/ml以及0.5mg/ml的苯酚溶液完全降解,充分说明酶催化剂保持较高的活性。
图4为本实施例制备的酶固定化复合物光致可逆负载-脱附降解苯酚实验效果图,从图中可以看出,负载酶催化剂之后对苯酚保持较高的降解效率,光照之后,酶催化剂从固定化材料上脱附,失去催化能力;将无机-有机磁性纳米复合固定化材料重新负载酶催化剂之后恢复催化能力。由此证明,光照可实现酶催化剂的可逆负载-脱附,使无机-有机磁性纳米复合固定化材料可以重复得到使用。
实施例二
一种基于光致可重复使用固定化材料的酶固定化复合物及其制备方法,包括以下步骤:
(1)将β-环糊精、四氟对苯二腈、碳酸钠加入混合溶剂中得到混合溶液Ⅰ,然后将纳米四氧化三铁加入混合溶液Ⅰ中,于90℃反应36h,外加磁场将纳米四氧化铁磁性分离后,用浓盐酸冲洗至无气泡产生得到无机-有机磁性纳米复合固定化材料;
所述β-环糊精、四氟对苯二腈和碳酸钠之间的质量比为1∶1∶1;混合溶剂为四氢呋喃和N,N-二甲基甲酰胺之间按体积比为8∶1配制而成,所述纳米四氧化三铁与β-环糊精的质量比为1∶10;
(2)将偶氮苯-4-苯甲酸、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)和N-羟基琥珀酰亚胺加入到N,N-二甲基甲酰胺中配制成0.25g/ml的有机溶液,于室温下搅拌3h,反应结束后加入5mg/mL含有漆酶的PBS溶液,于7℃下搅拌30min得到混合溶液Ⅱ;将无机-有机磁性纳米复合固定化材料加入混合溶液Ⅱ中,恒温20℃摇床培养3h,外加磁场磁性分离后得到酶固定化复合物;
所述有机溶液与PBS溶液的体积比为1:350,所述偶氮苯-4-苯甲酸、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)、N-羟基琥珀酰亚胺之间的质量比为1∶0.5∶0.1,所述漆酶和无机-有机磁性纳米复合固定化材料的质量比为1∶3。
实施例三
一种基于光致可重复使用固定化材料的酶固定化复合物及其制备方法,包括以下步骤:
(1)将β-环糊精、四氟对苯二腈、碳酸钾加入混合溶剂中得到混合溶液Ⅰ,然后将纳米四氧化三铁加入混合溶液Ⅰ中,于100℃反应24h,外加磁场将纳米四氧化铁磁性分离后,用浓盐酸冲洗至无气泡产生得到无机-有机磁性纳米复合固定化材料;
所述β-环糊精、四氟对苯二腈和碳酸钾之间的质量比为1∶0.8∶2;混合溶剂为四氢呋喃和N,N-二甲基甲酰胺之间按体积比为7∶1配制而成,所述纳米四氧化三铁与β-环糊精的质量比为1∶6;
(2)将偶氮苯-4-苯甲酸、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)和N-羟基琥珀酰亚胺加入到二甲亚砜中配制成0.25g/ml的有机溶液,于室温下搅拌5h,反应结束后加入5mg/mL含有酪氨酸酶的PBS溶液,于10℃下搅拌10min得到混合溶液Ⅱ;将无机-有机磁性纳米复合固定化材料加入混合溶液Ⅱ中,恒温25℃摇床培养2h,外加磁场磁性分离后得到酶固定化复合物;
所述有机溶液与PBS溶液的体积比为1:500,所述偶氮苯-4-苯甲酸、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)、N-羟基琥珀酰亚胺之间的质量比为1∶1∶1,所述酪氨酸酶和无机-有机磁性纳米复合固定化材料的质量比为1∶5。
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