用于原位捕获水生微生物组的装置

技术领域

本公开涉及一种用于原位采集和/或浓缩浮游生物微生物组的便携式装置，其构造为浸入水中。本文公开的装置是一种紧凑且低成本的自主生物采样器，具有产生用于后续基因组分析的DNA样品的能力。

背景技术

在包括海洋和淡水生态系统在内的水生环境中的生命以微生物的多样性和丰富性为主导。包括浮游植物和浮游动物、细菌、古细菌、单细胞真核生物、原生动物和真菌在内的整个海洋微生物群落估计占水生生物总量的超过90％。这些微生物对于生活在海洋和其它水生生态系统中的高等生物的生存至关重要，这些高等生物高度依赖复杂的海洋微生物群落的活动。微生物可以通过自然地控制营养物质的通量以及降解和回收人为的有机和无机污染物来改善水质。此外，通常由环境变化引起的浮游生物微生物群落的失衡可能会损害水质和所有相关用途。因此，有很大的兴趣和需要在相关时空尺度上研究浮游微生物群落，以使用当前可用的高度敏感的基因组学方法表征其多样性和功能动力学。

水浮游生物的常规采样方法意味着在预定深度处采集确定量的水，例如在海洋中，常规使用Niskin瓶以单独的方式或使用船上起重机以莲座丛构造的方式来完成。这些采样方法需要在船上或家庭实验室中花费时间和精力来采集和过滤水。此程序还增加了成本，这主要是由于船舶的租赁和运营所致，并且由于直至过滤步骤的存储时间而导致样品劣化。另外，由于需要从采样器中提取水并将其保存在船舶上和/或实验室中直到过滤，因此存在水的物理化学条件发生变化的风险，该变化可能导致某些微生物真核生物的裂解，也增加了潜在污染的风险。

迄今为止，很少开发生物采样器系统。在少数可用的生物采样器系统中，开发了用于水过滤和不同生物类别尺寸的采样保存的原型(Trembanis et al.2012)。然而，这种系统部署成本昂贵，需要采集生物生命的先验知识，需要高维护成本，并且尺寸限制了其集成在小型自主驾驶无人车(AUV)中。先前已经开发了通过AUV采集水的系统(Bird etal.2007)，但是它仅限于少量水，并且没有浓缩水微浮游生物样品的能力，从而限制了将这些样品用于某些高度敏感的分析基因组学方法。还开发了一些生物采样器，用于使用自动采样和分子技术来对特定遗传靶标进行原位和实时检测，以枚举特定物种和功能组的丰度(例如McQuillan and Robidart,2017；Scholin et al.2009；Preston et al 2011)。这些系统对于某些应用非常强大，但成本极高并且限于识别特定的蛋白质、毒素和/或生物。

公开这些事实以说明本公开解决的技术问题。

发明内容

本公开涉及开发一种低成本的原位自动生物采样器装置，其允许采集和浓缩(特别是通过过滤)水浮游生物样品以研究浮游生物微生物组，并且可以容易地连接至AUV。使用现在公开的装置采集的样品适用于高度敏感的分析基因组方法(基因组、宏基因组学和转录组学)来研究浮游生物微生物组，而不是特定物种或功能组。通过与基于MicroB3 OSD手册(ten Hoopen et al.2016)中描述的标准采样和实验室过滤协议的常规手动样品采集进行比较，并且通过对由两种过滤程序采集的样品进行大规模测序分析来分析原核(16SrDNA)和真核(18S rDNA)群落的重现性、eDNA回收率和多样性，验证了该装置的过滤效率和性能。

另外，现在公开的装置是一种紧凑且低成本的自主生物采样器，具有产生用于后续基因组分析的DNA样品的能力。本公开进一步证明，在丰富和稀有成员水平上，就原核和微生物真核生物群落的DNA回收和微生物组多样性而言，现在公开的装置与标准手动协议之间具有相似的性能。

现在公开的装置是一种小型且紧凑的系统，非常便于运输。而且，现在公开的装置非常简单，易于使用，并将用户友好的应用程序集成到程序采样定义中。现在公开的装置是对增强浮游生物微生物采样感兴趣的研究人员的一种新资源；经专门设计不仅用于海洋研究，而且用于沿海、河口、河流、湖泊或水产养殖环境。现在公开的装置的主要优点是可以原位过滤大量水，提高DNA产量，因此可以检测稀有群落。现在公开的装置可以成功地用于提高水生微生物组监测的时空分辨率。其将代表对固定和移动(例如AUV)水生观测系统的重要补充，以解决未充分研究的偏远水生生态系统中的生物知识缺口。

本公开涉及一种用于原位采集和/或浓缩浮游生物微生物组的便携式装置，其配置用于浸入水中，包括：

用于含浮游生物微生物组的水的入口；

用于耗尽浮游生物微生物组的水的出口；

入口和出口之间的多个阀；

用于将水从入口泵送到出口以使水通过滤筒的泵；

用于测量流量和压力的传感器组；

滤筒，包括用于原位过滤含浮游生物微生物组的水的多个过滤器；

具有微控制器的电子控制系统，用于控制多个阀的打开和关闭以及水泵送速度，以使该装置原位采集和/或浓缩浮游生物微生物组。

本公开还涉及一种用于原位采集和/或浓缩浮游生物微生物组的便携式装置，其配置用于浸入水中，包括：

用于含浮游生物微生物组的水的入口；

用于耗尽浮游生物微生物组的水的出口；

置于入口和出口之间的多个阀；

用于测量流量和压力的传感器组；

用于将水从入口泵送至出口以使水通过滤筒的泵，

其中滤筒包括用于原位过滤含浮游生物微生物组的水的多个过滤器；

微控制器，用于控制多个阀的打开和关闭以及水泵送速度，以使该装置原位采集和/或浓缩浮游生物微生物组；

储库，含有用于保存核酸的保存溶液。

在一个实施方式中，包括多个过滤器的滤筒可以是包括至少16个孔径为0.22μm的过滤器的滤筒，但过滤器的孔径可以根据采样目标而变化。

在一个实施方式中，便携式装置可以包括至少2个滤筒，优选至少4个滤筒，更优选至少8个滤筒。

在一个实施方式中，便携式装置可以进一步包括储库，该储库含有用于DNA和/或RNA的保存溶液，其中所述保存溶液用于注射到滤筒中，并由此长时间保持微生物组的DNA和/或RNA完整。

在一个实施方式中，传感器组可以包括压力传感器，用于控制滤筒的压力，从而达到1-1.3巴的压力。

在一个实施方式中，传感器组可以包括流量传感器，用于检测和/或控制通过滤筒的水流量。

在一个实施方式中，现在公开的便携式装置用于通过过滤原位浓缩浮游生物微生物组DNA。

在一个实施方式中，所述便携式装置可以在深达150m的深度运行。

在一个实施方式中，现在公开的便携式装置可以包括用于冲洗和清洁该装置的过滤器管线，因此避免例如对装置的污染。

在一个实施方式中，多个阀可以是多个电磁阀。

在一个实施方式中，便携式装置可以进一步包括电子速度控制器模块，用于控制泵，优选用于控制所述泵的马达(发动机，motor)。

在一个实施方式中，便携式装置可以进一步包括用于检测入口流量和出口流量的流量传感器。

在一个实施方式中，便携式装置可以进一步包括用于水流分配的阀歧管，优选歧管1:6。

在一个实施方式中，便携式装置可以进一步包括模拟压力计，用于检测所述装置的压力。

本公开还适用于包括本文所述的便携式装置的遥控潜水器(remote operatedvehicle)、水下自主载具(autonomous underwater vehicle)、滑翔机、断面仪(profiler)、潜水艇、小型潜水艇、载人潜水器(human operated vehicle)、系泊设备、浮标、浮子或近海站。

附图说明

为了更容易地理解本公开，本文所附的附图代表了本公开的优选实施方式，其不旨在限制本公开的保护范围。

图1.电子、微液压和过滤器组件。在装置开发中使用的系统组件，诸如泵、微控制器、电磁阀、流量传感器、歧管、压力表、过滤器和滤筒。

图2.系统控制架构。

图3.系统液压图。具有电磁阀的水和RNA/DNA储存试剂回路，电磁阀控制正在使用的回路以及泵和传感器的相对位置。

图4.嵌入式微控制器软件结构。表示微控制器以及与之连接的传感器或执行器中正在运行的五个任务。它们之间的信息通过消息队列和全局事件位的组传递。

图5.嵌入式控制软件状态机。在任务状态机中的微控制器固件中实现的状态机。标志“开始(START)”、“完成(COMPLETE)”和“中止(ABORT)”设置有来自处理传感器信号的任务的信息。

图6.高级别控制和配置。用户界面基于网页，在该网页上配置任务，然后将其保存在本地数据库(SSD磁盘)上。然后，任务通过RS-232协议传递给嵌入式电子设备。

图7.过滤程序设计。在OSD程序中以及在不同广口玻璃瓶中的装置中同时开始过滤不同的重复样品。

图8.现场自主生物采样器原型组件(左)和CAD模型(右)。所有组件均安装在真空圆柱体内。

图9.装置原型。水入口/出口(A)；外部连接器接口(B)；在现场打开(C)；集成在多传感器系统中。

图10.滤筒盒。滤筒盒打开(A)和关闭(B)的设计；和Sterivex滤筒图像(C)。

图11.生物采样器配置和监控网页的示例。配置网页的两个屏幕截图。上)水过滤任务的一部分配置示例。下)易于阅读下一要执行的任务的摘要。

图12.实验室OSD过滤装置。(a)隔膜真空泵。(b)废水采集瓶。(c)PowerVac

图13.在操作分类单位(OTU)水平上16S rDNA(A)和18S rDNA(B)的树状图。基于获得的下三角相似矩阵的Bray-Curtis相似性并使用Simprof检验来验证生成的群集之间的显著差异(黑线和实线)，通过层次分析生成的树状图。使用海洋采样日过滤标准程序(OSD)或现在公开的装置回收样品(n＝3)。对于现在公开的装置，选择了两个过滤压力(1和1.3巴)。

图14.在操作分类单位(OTU)水平上稀有(<1％)16S rDNA(A)和18S rDNA(B)的树状图。基于获得的下三角相似矩阵的Bray-Curtis相似性并使用Simprof检验来验证生成的群集之间的显著差异(黑线和实线)，通过层次分析生成。使用海洋采样日过滤标准程序(OSD)或该装置回收样品(n＝3)。对于该装置，选择了两个过滤压力(1和1.3巴)。

具体实施方式

本主题中公开的便携式装置的目的之一是使用于原核和真核微生物组分析的水采样采集和过滤过程自动化，该过程常规上使用手动程序来执行，如在海洋学和其它水生生态系统活动诸如海洋采样日(OSD)中(ten Hoopen et al.2016)。这旨在减少水生环境中生物学研究的物流和运营成本，并利用当前技术来提高数据采集的质量及其效率。

在一个实施方式中，该装置包括电子和微型液压组件组以及用于原位水采样和过滤的回路，包括多个组件，即：自吸水泵(TCS MG2000)、ARM Cortex M4微控制器(STM32F411RE)、通用100A电子速度控制器(ESC)模块、流量传感器(Bio-Tech BT PCH-M-POM-LC 6)、歧管1:6(NRESEARCH HP225T052)、模拟压力计(AVS-ROEMER E301)、用于所有湿式回路的半刚性管、用于所有管的推入式连接、过滤器组及它们的筒(图1)。该装置配置为使用与标准实验室程序(ten Hoopen et al.2016)中使用的过滤器相同类型的过滤器，孔径为0.22μm。

在一个实施方式中，该装置集成了全电子控制，可以对过程进行精确的控制和监视。此外，有关执行的采样参数和时间戳(时间标记，timestamp)的所有信息都可以容易与使用其它传感器采集的数据整合。嵌入式计算机控制也相关，以便将装置集成到AUV等自主系统上。

在一个实施方式中，装置的架构是本文公开的架构。

在一个实施方式中，控制和编程是在两级层次架构中实现的(图2)。低级微控制器负责微液压回路的控制和相关的传感。这种装置提供了可以从更高级控制计算机进行编程/定义的功能组。

在一个实施方式中，水过滤控制系统基于运行实时操作系统(FreeRTOS)的STM32F411RE ARM Cortex M4微控制器。微控制器通过低功耗计算机系统的RS232通信线接收高级别任务定义。该计算机系统基于运行Linux的Odroid XU4，并具有数据库组，其中含有要执行的任务的信息以及当前过滤过程的状态和先前过滤的日志。该计算机在水面时可通过GPS调整时钟，并使用压力传感器估算装置的深度。微控制器控制阀的打开和关闭以及水泵送速度。

在一个实施方式中，可以从外部提供电源(例如，通过不受管制的电缆DC电源或通过实验室工作台电源)，也可以提供内部电池组。在该装置中构建了用于其组件的所有所需稳压线路(regulated voltage line)。

在一个实施方式中，液压回路如图3所示(仅例示了一个6-过滤器歧管)。使用以电子速度控制器(ESC)经由脉宽调制信号(PWM)控制的泵，通过液压回路从环境将水泵送到一个或多个(重复)无菌压力驱动过滤器。这些过滤器由布置在歧管中的阀组选择，该歧管分支为六个元件。可以使用多个歧管以选择所需数量的可用样品过滤器。水过滤后，泵可以从船载储库将保存DNA/RNA溶液注入过滤器中。压力和流量传感器允许同时控制进入过滤器的压力和液体流量(在两个阶段中)。使用空的过滤器管线(直通)来冲洗和清洁液压回路。

在一个实施方式中，嵌入式固件基于FreeRTOS(图4)、ARM Cortex M3的实时操作系统(RTOS)并通过初始化连接到微控制器的所有外围设备启动。外围设备包括具有PWM输出的泵、使用输入/输出(I/O)的阀、和具有模拟输出并通过主板连接到微控制器12位内部ADC和RS232通信的压力传感器(图4)。

在一个实施方式中，实时操作系统中运行着5个任务(或线程)(通信、状态机、水/RNAlater体积、泵控制和压力)。因为一切都包括在单独的任务中，因此该实施能够开发简化装置以及集成新功能。

在一个实施方式中，任务通信负责读取主计算机(SBC)通过RS232发送的命令。解析后，这些命令将使用RTOS信号和/或消息队列传递到相应任务中。这些命令主要是“开始(START)”或“停止(STOP)”过滤过程以及配置参数。状态机任务实施在图5中描述的状态机。该任务阻断直至START命令到达并且在其执行过程中，通过消息队列从其它任务接收传感器数据，用于更改其当前状态。来自任务水/保存溶液体积的数据计算过滤后的水体积以及过滤后注入Sterivex过滤器中的保存溶液量。实施状态机的任务的输出被发送到另一个任务，即泵控制，其仅负责控制泵。该泵控制任务从任务压力接收输入，该任务压力读取压力传感器并处理其信号，以获得由泵施加到无菌压力驱动过滤器的压力。

在一个实施方式中，外部环境压力传感器可以估算深度，并且可从水过滤系统电子设备获得，其值是通过I2C上的低功耗计算机获得的。GPS直接连接到单板计算机(SBC)，该计算机使用Chrony服务同步时钟(图6)。SBC允许灵活开发和将来可能需要的其它传感器集成(例如保存大量数据或具有特殊的通信协议)。当前，SBC使用Wi-Fi天线提供基于PHP和SQLite3的Web界面，该界面允许用户将参数输入到过滤操作中，并监视生物采样器(当其在表面时)的当前状态。可以通过使用具有Wi-Fi和网络浏览器的任何设备(例如智能手机、台式机、笔记本电脑或平板电脑)来配置任务，从而可以简单且快速地设置过滤操作(图6)。

在一个实施方式中，用户可以通过预先设置控制过滤过程的输入参数组来配置过滤任务。这些参数包括：(i)要过滤的水的体积；(ii)最大泵送压力；(iii)应开始过滤的水柱深度；(iv)要通过过滤同时采集的样品数；(v)一天中开始过滤任务的时间。通过输入滤筒中可用的无菌压力驱动过滤器的数量、采样的初始时间、样品采集之间的延迟以及应进行多少次重复来配置任务。这是通过具有因特网浏览器的设备进行的，该设备通过Wi-Fi连接到SBC。SBC具有带配置网页的HTML服务器(Apache)(图11)，并将用户提供的每个配置以及传感器数据保存在SQLite3数据库中。

在一个实施方式中，然后，通过为此目的编写的服务来封装该配置，该服务在操作系统中运行，为用户提供简单的界面并返回要执行的操作的反馈循环。然后将操作设置通过RS232协议传递给微控制器。

在一个实施方式中，如下进行过滤体积与时间性能关系的测试。通过在三个不同的恒定工作压力(0.8、1.3和1.8巴)下监控2L水的过滤来评估装置在过滤体积和过滤时间方面的性能。测量每100ml过滤水的过滤时间直到获得2升的总过滤体积。

在一个实施方式中，如下进行微生物组分析的验证。通过在实验室中使用该装置并使用常规OSD协议(ten Hoopen et al.2016)进行并行过滤来执行原型验证。此后，在海洋微生物多样性方面比较结果。2016年11月，在离岸约25km处采集了表层海水样品，将其存储在两个20L广口玻璃瓶中，并运送到实验室。

在一个实施方式中，如下进行过滤程序。OSD过滤设备(图12)由连接至废水采集瓶的隔膜真空泵(KNF N145 AN.18)组成，该废水采集瓶从连接至0.22μm无菌压力驱动过滤器的50mL无菌注射器接收过滤后的水。真空泵的极限真空度为100毫巴(绝对)，产生约1巴的压差。

在一个实施方式中，该装置的过滤程序采用蠕动自吸水泵(MG2000)和0.22μm无菌压力驱动滤筒。

在一个实施方式中，在每个无菌压力驱动过滤器中过滤总计约3升沿海海水。实验室标准方法与该装置的对比进行一式三份(A、B、C)并且在类似的过滤压力下进行(≈1.0巴)。还对装置测试了附加的过滤压力(1.3巴)(图7)。将无菌压力驱动过滤器单元存储在-80℃下直至需进行DNA提取。按照OSD指南进行DNA提取(ten Hoopen et al.2016)。

在一个实施方式中，为了避免由于过滤时间流逝和/或海水在不同广口玻璃瓶中存储造成的差异而导致两个过滤程序之间的潜在差异，在两个程序中同时开始重复过滤(图7)。此外，在刚要进行每次过滤之前手动摇动广口玻璃瓶以确保样品的均质性。

在一个实施方式中，如下进行微生物组分析。使用DNA分离试剂盒按照制造商的说明从每个无菌压力驱动过滤器中提取DNA。通过荧光测定法测量DNA的浓度和品质。将提取后获得的环境DNA分别用于靶向原核生物和真核生物的16S rDNA和18S rDNA元条形码分析(metabarcode analysis)。使用通用引物对515YF/Y906R-jed扩增16S rDNA基因的高变V4-V5区(≈412bp)。对于真核生物，使用TAReuk454FWD1/TAReukREV3_修饰引物组扩增18SrDNA基因的V4区(≈434bp)。进行配对末端测序。

在一个实施方式中，如下进行数据分析。进行了通过OSD手动程序和该装置检测的微生物群落结构的比较评估，聚焦于整个原核和真核生物群落和‘稀有生物圈’(即，低丰度分类群池，阈值1％)。使用PRIMER软件(版本6.1.11)，使用OTU相对百分比值来计算原核和真核生物的β多样性。

在一个实施方式中，装置的机械集成和功能可以如下。该装置包括液压组件(图1A和图3)诸如水泵、微控制器、ESC模块、流量传感器、歧管1:6、模拟压力计、用于所有湿式回路的半刚性管、用于所有管的推入式连接和过滤器组及其滤筒、嵌入式控制器电子器件、主低功率计算机和LiPo电池组(图8)。

在一个实施方式中，电源基于4节22.2V和16000mA的锂离子聚合物电池组，其重量轻且密度高。这些电池分别连接到两个隔离的宽输入和低噪声输出DC/DC转换器，分别具有5V和24V输出。从这一点来看，每个子系统都会接收必要的电压输入。对于需要其它电压(例如3.3V)的电子系统，电压由低压差稳压器提供在印刷电路板中。电池是可选的，因为装置可以与可提供必要电源的其它系统(例如遥控潜水器或水下自主载具)集成。

在一个实施方式中，所有组件均容纳在直径为150mm且长度为500mm的铝制压力外壳中，允许在深度达150m下操作(图9)。对于液压回路，允许使用柔性塑料管和快速连接器的组，从而易于维护和抗腐蚀。现在公开的独立式装置(图9A、B和C)具有外部水下连接器(图9B)，可与其它系统(例如多传感器系统)集成(图9D)。将现在公开的装置集成在不同的水观测系统(例如AUV或固定平台)中将大大提高生物监测能力，从而允许使用高度敏感的基因组方法来检测整个或特定的微生物群落的多样性和功能。

在一个实施方式中，液压回路、柔性塑料管和快速连接器的组件是透明的，可以放置在UV光下进行灭菌，并消除来自外源微生物的最终DNA。在过滤程序之前，可以轻松地在装置中设置这些液压回路组件。

在一个实施方式中，现在公开的装置操作如下：首先，使用微型泵(TCS MG2000)将预期位置的原位水泵送通过液压回路，然后冲洗整个装置，以清理管道和阀中的最终残留物。然后，开始过滤过程，通过置于滤筒中的一个(通过歧管系统控制)或多个(重复)过滤器，特别是孔径为0.22μm的过滤器，优选无菌压力驱动过滤器，原位过滤水。优选地，该装置具有至少16个孔径为0.22μm的过滤器(Sterivex过滤器)。如果需要用于宏基因组学和元转录组学分析，则同时使用多个过滤器进行过滤可以为所采集的数据增加冗余度和统计学显著性。这使研究人员可以在采样的确切时间将水柱中存在的微生物组的种类和活性与生物学功能相关联。

在一个实施方式中，根据预定义的参数通过嵌入式控制系统来控制过滤过程。可以使用要过滤的水体积、过滤过程的持续时间或检测过滤器堵塞来结束过程。一旦过滤结束，将DNA/RNA保存溶液泵入过滤器中以保存样品，以供后取出。根据采样和研究要求，可以通过在原型中添加多组歧管和滤筒来扩展装置。

在一个实施方式中，现在公开的装置集成了滤筒盒，该滤筒盒特别地由可以耦连在一起的部件组制成(图10A和B)，并且专门设计为容易地将无菌压力驱动过滤器与滤筒一起存储。因此，可以方便地将滤筒从装置中取出，并在过滤任务结束时进行分类，直到提取DNA。该盒内装有过滤器组，特别是滤筒内的16个过滤器(图10)，其可以根据用户的选择将其单独或联合卸下。

在一个实施方式中，这些滤筒盒由高密度聚乙烯(HDPE)1000制成以在极端温度下保持滤筒的性能。这也允许在冷冻条件下方便地存储样品，这是保存样品直至进行宏基因组学和元转录组学分析的另一种合适方法。这样允许长运输时间(例如在典型的海洋学运动中发生的运输时间)。一旦进入实验室，可以将单个无菌压力驱动过滤器卸下，以进行DNA/RNA提取和测序。

在一个实施方式中，能够在原位进行eDNA采样和分子生物学传感的自动化采样装置是解决不同水生环境中高时空水监测的有前途的方法(McQuillan and Robidart etal.2017)。该装置能够进行原位水过滤，并能够采集和保存微生物材料，每次部署最多可容纳16个样品过滤器，并且并在一定条件下，与后续的宏基因组学和元转录组学研究相容。此外，由于该装置在过滤过程后立即固定样品，因此可避免DNA/RNA污染和与采集的水样品管理有关的偏差。而且，现在公开的装置克服了常规Niskin瓶采集和船上过滤的一些限制，如瓶存储和运输到家庭实验室进行过滤，从而降低运营成本。

在一个实施方式中，过滤流动性能可以如下。考虑到相同体积的水(2L)，对装置过滤性能的初步评估表明，提高泵的速度(从0.8到1.3和到1.8巴)得到更高的平均过滤流量，并显著缩短过滤时间(表1)。

表1.过滤时间和平均流量。进行水过滤，总过滤体积为2升，并使用装置在0.8、1.0和1.3巴的压力下以100mL的部分进行测量(平均值±标准偏差，n＝3)。

此外，考虑到每个测试的过滤压力，随着过滤水体积或过滤时间的增加，记录了平均流量显著下降(ANOVA,P<0.05)(表1)。与手动程序(35.8±0.3min)相比，当通过自主装置过滤等体积的水(2L)时，过滤时间大大减少(24±1min)(表1)。

在一个实施方式中，使用标准OSD手动程序和该装置，在相同的压力(1巴)下过滤3升水后从无菌压力驱动过滤器回收的DNA的结果表明，这两种方法的性能类似(P≥0.05)(表2)。由于相对于手动OSD程序具有更高的平均流量，因此该装置具有过滤时间更短的优势(表2)。

表2.过滤时间、体积、平均流量和回收的DNA。表2示出了使用该装置以海洋采样日(OSD)标准程序进行的测试结果(平均值±标准偏差，n＝3)。选择了两个过滤压力。对于每个参数，不同的上标字母指示三种过滤程序之间的显著差异(ANOVA，P<0.05)。

对比使用现在公开的装置测试的两种压力，未观察到统计学显著差异(P>0.05)，但是在较高的测试压力下，观察到在回收的DNA方面变化(标准偏差)的增加(表2)。

在一个实施方式中，序列和回收的OTU的性能如下。如上所述，分析了从不同过滤测试中获得的DNA样品，以探索原核生物(16S rDNA)和单细胞真核生物群落(18S rDNA)，从而突出由于手动和自主过滤程序(OSD和现在公开的装置)导致的群落结构的潜在不同结果。此外，还对由现在公开的装置在1巴和1.3巴下过滤的样品进行了更深层次的比较。

在一个实施方式中，通过Mothur pipeline v.1.38.1进行的分类程序产生了462956(16S)和227045(18S)个独特序列的总策划数据集。对原核生物和真核生物以97％的相似性将读段聚类，产生了385029和149725个OTU(表3)。

表3. 16S和18S数据集概述。数据集是由OSD标准方法和该装置在1巴过滤压力下以及使用该装置在两个不同过滤压力(1和1.3巴)下生成的。在每个参数下，不同的上标字母指示三种过滤程序之间的显著差异(ANOVA，P<0.05)。

在一个实施方式中，通过比较几种多样性指数来评估过滤程序对微生物组多样性的再现性，所述多样性指数包括观察到的OTU数量、Chao1、Shannon、Berger Parker优势、Simpson’s均匀度以及Good覆盖率(表4)。不论测试的过滤程序如何，计算得出的多样性指数的总体趋势未显示出统计学显著差异(P>0.05)(表4)。

表4. 16S和18S rDNA的多样性指数。表4示出了使用海洋采样日过滤标准程序和所述装置回收的DNA量的结果(平均值±标准偏差，n＝3)。使用了两种过滤压力(1和1.3巴)。对于每个多样性指数，不同的上标字母指示三种过滤程序之间的显著差异(ANOVA，P<0.05)。

在一个实施方式中，在高群落分类法级别下的性能如下。使用OSD或该装置过滤程序回收的样品中主要古细菌和细菌门类的出现表明，在分析的不同门类内OTU的相对百分比相似(ANOVA，P≥0.05)(表5)。

表5.在门类级别上16S OTU(细菌和古细菌)分类组成的相对百分比(>1％)。表5示出了使用海洋采样日(OSD)标准程序和现在公开的装置进行的测试中检测到的细菌和古细菌的相对百分比(平均值±标准偏差，n＝3)。对于现在公开的装置，选择了两种过滤压力(1和1.3巴)。对于每个门类，不同的上标字母指示三种过滤程序之间的显著差异(ANOVA,P<0.05)。

真核生物(18S rDNA)优势分类群的分析还显示，OSD与现在公开的装置过滤程序之间的OTU模式的相对百分比在统计学上相似(ANOVA，P≥0.05)(表6)。

表6.在门类级别上18S OTU分类组成的相对百分比。表6示出了在使用海洋采样日(OSD)标准程序和使用该装置进行的测试中检测的在门类级别上18S OTU分类组成的相对百分比(平均值±标准偏差，n＝3)。选择了两种过滤压力(1和1.3巴)。对于每个门类，不同的上标字母指示三种过滤程序之间的显著差异(ANOVA，P<0.05)。

结果表明，现在公开的装置中施加的两种不同的过滤压力不会影响在较高等级下原核和真核生物的分类组成(表5和6)。

在一个实施方式中，群落较低分类级别下的性能如下。使用Bray Curtis相似度进行了下三角相似矩阵确定了不同过滤程序的潜在影响(OSD和现在公开的装置)。在OTU级别的原核(16S rDNA)群落结构(图13A)显示重复(A、B和C)之间存在差异，表明水过滤经过的时间和/或来自不同广口玻璃瓶的水比过滤本身的类型(OSD对比装置)引起了更大的分化(Simprof，P<0.05)。

在一个实施方式中，不论所使用的过滤程序如何，较低分类级别的分析结果未显示出所选细菌和古细菌属具有统计学显著性差异(ANOVA，P≥0.05)(表7)。

表7.在较低的分类级别上从16S rDNA OTU分类组成检索到的丰富分类群(>1％)的分布。表7示出了在使用海洋采样日(OSD)标准程序和使用该装置进行的测试中检测到的在低分类级别上16S rDNA OTU分类组成的相对百分比(平均值±标准偏差，n＝3)。选择了两种过滤压力(1和1.3巴)。对于每个属的相对百分比，未在三种过滤程序之间观察到统计学显著性差异(ANOVA，P≥0.05)。

在涉及真核生物的最低分类学级别的实施方式中，结果表明，两种过滤方法的样品均包括大(微型/中浮游生物)和小(超微型浮游生物/纳米浮游生物)原生生物(表8)。确实，当在较低的分类学级别上探索原生生物群落时，在最丰富的分类群(相对丰度高于1％)中，确定了属于微/中浮游生物的大细胞尺寸组：硅藻纲(Bacillariophycae)、纤毛亚门(Ciliophora)和沟鞭藻纲(Dinophyceae)诸如原甲藻(Prorocentrum sp.)(1％的丰度)。同样，已记录了相同1％丰度的较小光合作用群体，例如微型真核生物，MAST-8C_X_sp。我们的数据表明，对于原核和真核生物群落，所有属始终存在，而与所使用的过滤系统和施加的压力无关。

表8.在较低的分类级别上从18S rDNA OTU分类组成检索到的丰富分类群(>1％)的分布。表8示出了在使用海洋采样日(OSD)标准程序和使用该自主生物采样器(现在公开的装置)进行的测试中检测到的在低分类级别上18S rDNA OTU分类组成的相对百分比(平均值±标准偏差，n＝3)。选择了两种过滤压力(1和1.3巴)。对于每个属的相对百分比，未在三种过滤程序之间观察到统计学显著性差异(ANOVA，P≥0.05)。

结果表明，在低分类学组成级别上，不同的过滤程序(现在公开的装置和标准OSD)未在原核和真核群落中引起统计学显著性差异(不显著)。

在一个实施方式中，已经越来越认识到原核和真核稀有物种(相对丰度<1％)是至关重要的，因为它们在生物地球化学循环中可具有超比例的作用，并且可能是微生物组功能(例如在对有机污染物的响应中)的隐藏驱动力。在97％下聚类的稀有OTU概览(表9)未显示出统计学显著差异(ANOVA，P≥0.05)，而与使用的不同过滤系统(OSD和装置)无关。

表9. 16S和18S rDNA中稀有(<1％)OTU(97％)的数量。表9示出了由不同程序(海洋采样日(OSD)和原位自主过滤原型(现在公开的装置)以及不同的过滤压力(1和1.3巴)获得的DNA的量。每种处理重复(A、B和C)以及总样品的信息。对于每个组，直接从DNA-至-数据(例如Illumina MiSeq)测序平台获得原始读段对，通过mothur分析管线进行清洗后的序列计数。不同的上标字母显示了过滤程序之间的显著差异(ANOVA，P<0.05)。

在一个实施方式中，通过比较多个多样性指数，包括观察到的OUT数、Chao1、Shannon、Berger Parker优势、Simpson’s均匀度以及Good覆盖率，评估了过滤程序对稀有(<1％)微生物组多样性的再现性和影响(表10)。不论过滤程序如何，多样性指数趋势显示无显著差异(ANOVA，P≥0.05)。

表10.稀有(<1％)16S和18S rDNA的多样性指数。表10示出了使用海洋采样日(OSD)标准程序和使用自主DNA采样器(现在公开的装置)进行的测试中检测到的DNA(平均值±标准偏差，n＝3)。选择了两种过滤压力(1和1.3巴)。对于每个多样性指数，不同的上标字母指示三种过滤程序之间的显著差异(ANOVA，P<0.05)。

在一个实施方式中，在OUT级别(较低分类级别)上，下三角相似矩阵显示，稀有(<1％)原核生物(16S rDNA)群落(图14A)和真核生物(18S rDNA)群落(图14B)未显示出重大差异，与使用的不同过滤系统(OSD和装置)无关。因此，该装置能够低相对丰富(<1％)微浮游生物组中的偏移。

不应以任何方式将本公开视为限于所描述的实施方式，并且本领域普通技术人员可以预见对其修改的许多可能性。

此外，在给出范围的情况下，包括端点。此外，应当理解的是，除非另有说明或从上下文和/或本领域普通技术人员的理解是显而易见的，否则作为范围表达的值可以假定为在本公开不同实施方式中所述范围内的任何具体值，直至该范围下限单位的十分之一，除非上下文另有明确规定。还应理解的是，除非另有说明或从上下文和/或本领域普通技术人员的理解是显而易见的，表达为范围的值可以假定所述给定范围内的任何子范围，其中所述子范围端点表达的精确程度与该范围下限单位的十分之一相同。

上述实施方式是可组合的。所附权利要求进一步阐述了本公开的特定实施方式。

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