包含外源性活化环的梭菌神经毒素

本发明涉及梭菌神经毒素及其活化和使用方法。

梭菌属(genus Clostridia)中的细菌产生高毒力和特定的蛋白质毒素，这种毒素毒害其被运送到的神经元和其他细胞。此类梭菌神经毒素的实例包括破伤风梭菌(C.Tetani，TeNT)和肉毒杆菌(C.botulinum，BoNT)血清型A-G和X产生的神经毒素(参见WO2018/009903 A2)，以及巴拉特梭菌(C.Baratii)和丁酸梭菌(C.Butyricum)产生的神经毒素。

在梭菌神经毒素中，已知有一些毒力最强的毒素。举例来说，取决于血清型，肉毒杆菌神经毒素对小鼠具有0.5至5ng/kg的中位致死剂量(LD

梭菌神经毒素在梭菌属中表达为单链多肽。每种梭菌神经毒素均具有一条催化轻链，该轻链与一条重链(包含N-末端易位结构域和C-末端受体结合结构域)被称为活化环的暴露区域隔开。在蛋白质成熟过程中，活化环的蛋白水解裂解将通过二硫键结合在一起的梭菌神经毒素的轻链和重链分开，从而产生完全活化的双链毒素。在重组毒素生产过程中，必须再现此过程。

外源性蛋白酶，例如胰蛋白酶或Lys-C，用于蛋白水解活化单链梭菌神经毒素。但是，对于某些梭菌神经毒素，与Lys-C或胰蛋白酶一起孵育导致单链多肽的部分或不正确裂解，从而导致产生污染性单链和/或无活性的裂解/降解产物(例如，在BoNT/E的情况下)，需要纯化全长双链多肽。因此，目前不存在用于活化梭菌神经毒素的通用外源性蛋白酶。这在鉴定新的梭菌神经毒素或生产修饰的(例如嵌合或杂合的)神经毒素时，特别成问题，其需要筛选多种蛋白酶以确定正确的活化。

最近鉴定出肉毒杆菌神经毒素血清型X(BoNT/X)(WO2018/009903 A2)。已经发现BoNT/X在活化方面特别成问题，并且用胰蛋白酶或Lys-C的裂解完全降解该多肽。

本发明克服了一个或多个上述问题。

与常规使用的胰蛋白酶和Lys-C相比，蛋白酶肠激酶具有更高的底物特异性。该蛋白酶紧接DDDDK肽序列(SEQ ID No：72)的C-末端进行识别和裂解。值得注意的是，所有梭菌神经毒素活化环均不存在该序列(参见图1)，因此之前将肠激酶排除在用作活化梭菌神经毒素的蛋白酶之外。

本发明人惊奇地发现，肠激酶紧接BoNT/C1活化环中存在的IDGR序列的C-末端进行识别和裂解(参见图1)。有利地，该序列也可以被因子Xa识别和裂解，因子Xa是另一种显示出高底物特异性的蛋白酶(例如，与胰蛋白酶和Lys-C相比)。此外，BoNT/C1活化环还具有赖氨酸和精氨酸残基，允许被赖氨酸或胰蛋白酶裂解。因此，本发明人惊奇地发现，BoNT/C1环构成了梭菌神经毒素的通用活化环，从而提供了使用四种不同蛋白酶的灵活性。

在一方面，本发明提供了一种用于将单链梭菌神经毒素(例如，本文所述的工程化的梭菌神经毒素)蛋白水解加工成相应的双链梭菌神经毒素的方法，所述方法包括：

a.提供单链梭菌神经毒素；和

b.使单链梭菌神经毒素与肠激酶接触；

其中所述单链梭菌神经毒素具有活化环，所述活化环包含多肽序列Cys-(Xaa)

其中肠激酶水解活化环的肽键，从而产生双链梭菌神经毒素(例如,本文所述的工程化的双链梭菌神经毒素)。

在相关方面，本发明提供了一种用于将单链梭菌神经毒素(例如，本文所述的工程化的梭菌神经毒素)蛋白水解加工成相应的双链梭菌神经毒素的方法，所述方法包括：

a.提供单链梭菌神经毒素；和

b.使单链梭菌神经毒素与因子Xa接触；

其中所述单链梭菌神经毒素具有活化环，所述活化环包含多肽序列Cys-(Xaa)

其中因子Xa水解活化环的肽键，从而产生双链梭菌神经毒素(例如,本文所述的工程化的双链梭菌神经毒素)。

单链梭菌神经毒素优选是本发明的工程化的单链梭菌神经毒素，其中活化环是外源性活化环。有利地，本发明人发现用如SEQ ID NO：1所示的外源性活化环(其在自然环境中包含蛋白酶裂解位点)代替内源性梭菌神经毒素活化环克服了与修饰内源性活化环以插入蛋白酶裂解位点(例如，因子Xa裂解位点，例如Ile-Asp-Gly-Arg[SEQ ID NO:18]或Ile-Glu-Gly-Arg[SEQ ID NO:19])相关的问题。特别地，修饰内源性活化环以插入蛋白酶裂解位点可导致构象变化，这反过来可对裂解效率产生负面影响(参见本文的实施例7)。

在一个特别优选的实施方案中，本发明的方法包括使用肠激酶。

一方面，本发明涉及肠激酶用于水解多肽(例如，梭菌神经毒素)的肽键中的用途，所述多肽包含如SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:19(优选地，SEQ ID NO:18)所示的序列。优选地，肠激酶水解紧接所述多肽序列中包含的SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:19(更优选地SEQID NO:18)的C-末端的肽键。在一个实施方案中，多肽包含如SEQ ID NO：1所示的多肽序列，或与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO:3具有至少70％序列同一性的多肽序列。

本发明还提供了一种制备工程化的梭菌神经毒素的方法，所述方法包括：

a.鉴定梭菌神经毒素的内源性活化环，其中所述梭菌神经毒素的特征在于，所述梭菌神经毒素的内源性活化环外的肽键被胰蛋白酶或Lys-C水解；和

b.用外源性活化环代替内源性活化环，从而提供工程化的梭菌神经毒素，其中外源性活化环包含多肽序列Cys-(Xaa)

本发明还提供了一种制备工程化的梭菌神经毒素的方法，所述方法包括：

a.鉴定梭菌神经毒素的内源性活化环，其中所述梭菌神经毒素的特征在于，内源性活化环不能有效地被胰蛋白酶或Lys-C蛋白水解加工；和

b.用外源性活化环代替内源性活化环，从而提供工程化的梭菌神经毒素，其中外源性活化环包含多肽序列Cys-(Xaa)

在一个实施方案中，梭菌神经毒素的特征在于，梭菌神经毒素的内源性活化环外的肽键被胰蛋白酶或Lys-C水解，并且内源性活化环不能有效地被胰蛋白酶或Lys-C蛋白水解加工。

在内源性活化环不能有效地被胰蛋白酶蛋白水解加工的实施方案中(优选地，梭菌神经毒素的内源性活化环外的肽键不能被胰蛋白酶水解)，方法可以进一步包括使工程化的梭菌神经毒素与胰蛋白酶接触，所述胰蛋白酶能够水解工程化的梭菌神经毒素的外源性活化环中的肽键。类似地，在内源性活化环不能有效地被Lys-C蛋白水解加工的实施方案中(优选地，梭菌神经毒素的内源性活化环外的肽键不能被Lys-C水解)，方法可以进一步包括使工程化的梭菌神经毒素与Lys-C接触，所述Lys-C能够水解工程化的梭菌神经毒素的外源性活化环中的肽键。

在一个实施方案中，方法包括筛选适用于本发明的方法中的梭菌神经毒素的步骤。筛选步骤可以包括确定梭菌神经毒素的内源性活化环外的肽键是否被胰蛋白酶或Lys-C水解。替代地或另外，筛选步骤可以包括确定梭菌神经毒素的内源性活化环是否不能够有效地被胰蛋白酶或Lys-C蛋白水解加工。

与梭菌神经毒素(工程化前)相反，在一个实施方案中，本发明的工程化的梭菌神经毒素能有效地被肠激酶或因子Xa蛋白水解加工，和/或工程化的梭菌神经毒素的外源性活化环外的肽键不被肠激酶或因子Xa水解。因此，梭菌神经毒素(工程化前)优选对肠激酶和/或因子Xa的蛋白水解加工具有抗性。

可以通过测定法鉴定梭菌神经毒素适用于本发明方法中的工程化：所述测定法包括在至少4℃下，使1mg梭菌神经毒素在50mM Tris-HCl pH 8.0，50mM NaCl反应缓冲液中与至少0.25μg的≥3350单位/mg的胰蛋白酶或≥200单位/mg的Lys-C接触至少5小时。

在一个实施方案中，所述测定法包括在4℃下，使1mg梭菌神经毒素在50mM Tris-HCl pH 8.0，50mM NaCl反应缓冲液中与0.25μg的≥3350单位/mg的胰蛋白酶(梭菌神经毒素与胰蛋白酶的摩尔比为～1：611)或≥200单位/mg的Lys-C(梭菌神经毒素与Lys-C的摩尔比为～1：734)接触18小时。

在另一个实施方案中，所述测定法包括在20℃下，使1mg梭菌神经毒素在50mMTris-HCl pH 8.0，50mM NaCl反应缓冲液中与0.40μg的≥3350单位/mg的胰蛋白酶(梭菌神经毒素与胰蛋白酶的摩尔比为～1：978)或≥200单位/mg的Lys-C(梭菌神经毒素与Lys-C的摩尔比为～1：1174)接触5小时。

所用的胰蛋白酶优选是可商购的TrypZean(Sigma#T3568)。胰蛋白酶可以具有多肽序列，所述多肽序列与SEQ ID NO：47具有至少70％的序列同一性。在一个实施方案中，胰蛋白酶可具有多肽序列，所述多肽序列与SEQ ID NO：47具有至少80％或90％的序列同一性。优选地，胰蛋白酶可以具有如SEQ ID NO：47所示的多肽序列。一单位的所述胰蛋白酶(Trypzean)定义为在3.2mL的反应体积中，使用0.23mM Na-苄基-L-精氨酸乙酯溶液(BAEE)作为底物，在25℃、在pH 7.6、在253nm下，每分钟产生0.003的吸光度变化的酶量。

优选地，使用的Lys-C是可商购的Lys-C(Sigma#000000011047825001)。Lys-C可具有多肽序列，所述多肽序列与SEQ ID No：48具有至少70％的序列同一性。在一个实施方案中，Lys-C可具有多肽序列，所述多肽序列与SEQ ID No：48具有至少80％或90％的序列同一性。优选地，Lys-C可具有如SEQ ID NO：48所示的多肽序列。一单位所述的Lys-C定义为在25℃，pH 7下每分钟水解1.0μmol Tos-Gly-Pro-Lys-pNA的酶的量。

如果通过SDS-PAGE观察到除梭菌神经毒素的H链和L链以外的一种或多种裂解产物(优选当用考马斯或同等灵敏度的染料染色时)，则确认梭菌神经毒素的内源性活化环外的肽键被胰蛋白酶或Lys-C水解。优选地，如果在进行上述测定法后，通过SDS-PAGE观察到梭菌神经毒素的链和L链以外的至少3、4、5、6、7、8、9或10个裂解产物，则确认梭菌神经毒素内源性活化环外的肽键被胰蛋白酶或Lys-C水解。

另外地或替代地，如果少于70％的内源性活化环被胰蛋白酶或Lys-C蛋白水解加工，产生双链梭菌神经毒素(在进行上述测定法之后通过SDS-PAGE方法评估，优选地用考马斯或同等灵敏度的染料染色时)，则确认内源性活化环不能有效地被胰蛋白酶或Lys-C蛋白水解裂解。优选地，如果少于60％、50％、40％、30％、10％或5％的内源性活化环被胰蛋白酶或Lys-C蛋白水解加工(在进行上述测定法后通过SDS-PAGE方法评估)，则梭菌神经毒素可以表征为内源性活化环不能有效地被胰蛋白酶或Lys-C蛋白水解裂解。更优选地，如果少于30％的内源性活化环被胰蛋白酶或Lys-C蛋白水解加工(在进行上述测定法后通过SDS-PAGE方法评估)，则梭菌神经毒素可以表征为内源性活化环不能有效地被胰蛋白酶或Lys-C蛋白水解裂解。

梭菌神经毒素(工程化前)优选是其中肽键(在活化环内或外)不被、或基本上不被肠激酶或因子Xa水解的毒素。术语“基本上不被水解”是指反应中存在的梭菌神经毒素中少于10％、5％、4％、3％、2％或1％的梭菌神经毒素含有被本发明方法中的肠激酶或因子Xa水解的肽键。

在一个实施方案中，本发明的方法还包括使工程化的梭菌神经毒素与肠激酶或因子Xa(更优选肠激酶)接触，从而产生相应的双链工程化的梭菌神经毒素。

一方面，本发明提供了一种工程化的梭菌神经毒素(例如，可通过本发明的方法获得)，其中，梭菌神经毒素的内源性活化环已被外源性活化环代替，从而提供了工程化的梭菌神经毒素，其中外源性活化环包含多肽序列Cys-(Xaa)

在一个实施方案中，梭菌神经毒素(工程化前)的特征在于：梭菌神经毒素的内源性活化环外的肽键被胰蛋白酶或Lys-C水解。在一个实施方案中，梭菌神经毒素(工程化前)的特征在于：内源性活化环不能有效地被胰蛋白酶或Lys-C蛋白水解加工。在另一个实施方案中，梭菌神经毒素(工程化前)的特征在于：梭菌神经毒素的内源性活化环外的肽键被胰蛋白酶或Lys-C水解；并且内源性活化环不能有效地被胰蛋白酶或Lys-C蛋白水解加工。梭菌神经毒素(工程化前)的这些特征的确认优选地通过前述测定法。

本发明可以包括用本文所述的外源性活化环代替任何梭菌神经毒素的内源性活化环。优选地，所述梭菌神经毒素不是BoNT/C1。梭菌神经毒素可以是肉毒杆菌神经毒素或破伤风神经毒素。优选地，梭菌神经毒素是肉毒杆菌神经毒素(BoNT)，例如BoNT/A、BoNT/B、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G或BoNT/X。

在一个实施方案中，用于本发明的一种梭菌神经毒素是BoNT/X、BoNT/E或BoNT/A1C1杂合体。优选地，梭菌神经毒素是BoNT/X或BoNT/E，两者的特征均在于胰蛋白酶和/或Lys-C水解其内源性活化环外的肽键，和/或特征在于两种梭菌神经毒素均包含不能有效地被胰蛋白酶和/或Lys-C蛋白水解加工的内源性活化环。最优选地，用于本发明的梭菌神经毒素是BoNT/X。

如本文所用，术语“内源性活化环”是指在受试者梭菌神经毒素中存在的活化环，例如，指定血清型的受试者梭菌神经毒素中存在的活化环。例如，BoNT/A1包括BoNT/A1重链和轻链，因此BoNT/A1的内源性活化环是A1活化环。对于梭菌神经毒素嵌合体或杂合体，本领域技术人员可以例如通过确定衍生L链和H

优选地，“内源性活化环”是任何活化环，但不是SEQ ID NO:1。优选地，“内源性活化环”是任何活化环，但不是SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:3。

相比之下，本文所用的“外源性活化环”是指与受试者梭菌神经毒素(例如指定血清型的受试者梭菌神经毒素)中存在的内源性活化环不同的活化环。例如，BoNT/C1活化环与野生型BoNT/A1活化环具有不同的多肽序列，因此BoNT/C1活化环对BoNT/A1是外源性的。对于梭菌神经毒素嵌合体或杂合体，本领域技术人员可以，例如通过确定衍生L链和H

可以通过将受试者梭菌神经毒素的序列与活化环比对，并查看该活化环是否存在于受试者梭菌神经毒素序列中，来确定活化环是否为“外源性活化环”。如果不存在，则可以将活化环鉴定为外源性活化环。

优选地，用本文所述的外源性活化环代替整个内源性活化环。然而，在一些实施方案中，内源性活化环的一部分被代替，例如内源性活化环的至少5、10、15、20、25、30、35或40个氨基酸残基被代替。

可以通过本领域已知的任何方法来实现内源性活化环的代替。例如，可以通过氨基酸修饰来实现代替。在一个实施方案中，可以通过删除内源性活化环的一个或多个氨基酸残基来代替内源性活化环。可以通过用外源性活化环的氨基酸残基取代内源性活化环的一个或多个氨基酸残基来代替内源性活化环。在一些实施方案中，可以删除内源性活化环(或其一部分)，并且优选在由内源性活化环在形式上占据的位置处插入外源性活化环。备选地，可以在本发明的工程化的梭菌神经毒素中保留内源性活化环，并且优选地(例如，通过突变的方式)使其灭活。优选在本发明的工程化的梭菌神经毒素中不存在内源性活化环(或其一部分，更优选整个内源性活化环)。优选地，外源性活化环占据梭菌神经毒素中形式上被内源性活化环占据的位置。

通过取代、插入或删除氨基酸残基修饰蛋白质的方法是本领域已知的，并且可以用于本发明的实践中。举例来说，可以通过修饰编码梭菌神经毒素的DNA序列来引入氨基酸修饰。这可以使用标准的分子克隆技术来实现，例如通过定点诱变，其中编码所需氨基酸的短链DNA(寡核苷酸)用于代替原始编码序列(通过使用聚合酶，或通过用各种酶(例如连接酶和限制性核酸内切酶)插入/删除基因的一部分)。或者，可以化学合成修饰的基因序列。

在一个实施方案中，内源性活化环包含多肽序列，所述多肽序列与SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：31，SEQ IDNO：61，SEQ ID NO：62，SEQ ID NO：63，SEQ ID NO：64，SEQ ID NO：65，SEQ ID NO：66，SEQ IDNO：67，SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：69，SEQ ID NO：70或SEQ ID NO：71具有至少70％(例如，至少80％或90％)的序列同一性。在一实施方案中，内源性活化环包含多肽序列，所述多肽序列与SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：24，SEQ IDNO：25，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：30，SEQ IDNO：31，SEQ ID NO：61，SEQ ID NO：62，SEQ ID NO：63，SEQ ID NO：64，SEQ ID NO：65，SEQ IDNO：66，SEQ ID NO：67，SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：69，SEQ ID NO：70或SEQ ID No：71具有至少95％的序列同一性。优选地，内源性活化环包含如SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21，SEQ IDNO：22，SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：27，SEQ IDNO：28，SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：31，SEQ ID NO：61，SEQ ID NO：62，SEQ IDNO：63，SEQ ID NO：64，SEQ ID NO：65，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：67，SEQ ID NO：68，SEQ IDNO：69，SEQ ID NO：70或SEQ ID No：71所示的多肽序列。

在一个实施方案中，内源性活化环包含多肽序列，所述多肽序列与SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：62，SEQ ID NO：63，SEQ ID NO：64，SEQ ID NO：65，SEQ ID NO：67，SEQ ID NO：68或SEQ ID NO：69具有至少70％(例如，至少80％或90％)的序列同一性。在一实施方案中，内源性活化环包含多肽序列，所述多肽序列与SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：62，SEQ ID NO：63，SEQ ID NO：64，SEQ IDNO：65，SEQ ID NO：67，SEQ ID NO：68或SEQ ID NO：69具有至少95％的序列同一性。优选地，内源性活化环包含如SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：62，SEQ IDNO：63，SEQ ID NO：64，SEQ ID NO：65，SEQ ID NO：67，SEQ ID NO：68或SEQ ID NO：69所示的多肽序列。

在一个实施方案中，内源性活化环包含多肽序列，所述多肽序列与SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：24具有至少70％(例如，至少80％或90％)的序列同一性。在一实施方案中，内源性活化环包含多肽序列，所述多肽序列与SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：24具有至少95％的序列同一性。优选地，内源性活化环包含如SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：24所示的多肽序列。

优选地，内源性活化环包含多肽序列，所述多肽序列与SEQ ID NO：20具有至少70％(例如，至少80％或90％)的序列同一性。在一实施方案中，内源性活化环包含多肽序列，所述多肽序列与SEQ ID NO：20具有至少95％的序列同一性。更优选地，内源性活化环包含如SEQ ID NO：20所示的多肽序列。

优选地，内源性活化环包含多肽序列，所述多肽序列与SEQ ID NO：21具有至少70％(例如，至少80％或90％)的序列同一性。在一实施方案中，内源性活化环包含多肽序列，所述多肽序列与SEQ ID NO：21具有至少95％的序列同一性。更优选地，内源性活化环包含如SEQ ID NO：21所示的多肽序列。

优选地，内源性活化环包含多肽序列，所述多肽序列与SEQ ID NO：24具有至少70％(例如，至少80％或90％)的序列同一性。在一实施方案中，内源性活化环包含多肽序列，所述多肽序列与SEQ ID NO：24具有至少95％的序列同一性。更优选地，内源性活化环包含如SEQ ID NO：24所示的多肽序列。

本发明包括方法和梭菌神经毒素，在所述梭菌神经毒素中内源性活化环已被外源性活化环代替,例如包括如Cys-(Xaa)

在一个实施方案中，“a”为1-12，例如1-10。优选地，“a”为1-7，例如2-4。更优选地，“a”为3。在一个实施方案中，“b”为1-20，例如4-15。优选地，“b”为6-10。更优选地，“b”为8。

不旨在将Xaa或Yaa限定为仅一种类型的氨基酸。因此，在Xaa位置的一个或多个残基可以独立地选自标准氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、赖氨酸、组氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸和苯丙氨酸。在Yaa位置的一个或多个残基可以独立地选自标准氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、赖氨酸、组氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸和苯丙氨酸。优选地，在Yaa位置的氨基酸(更优选紧接SEQ ID NO：1的Arg残基的C-末端)不是脯氨酸。

替代地/另外，在Xaa或Yaa位置上存在的一个或多个残基可以独立地选自非标准氨基酸(不是上述标准组20的一部分的氨基酸)。举例来说，非标准氨基酸可包括4-羟基脯氨酸、6-N-甲基赖氨酸、2-氨基异丁酸、异缬氨酸、α-甲基丝氨酸、反式3-甲基脯氨酸、2，4-甲基脯氨酸、顺式-4-羟基脯氨酸、反式-4-羟基脯氨酸、N-甲基甘氨酸、别苏氨酸、甲基苏氨酸、羟乙基半胱氨酸、羟乙基高半胱氨酸、硝基谷氨酰胺、高谷氨酰胺、哌酸、叔亮氨酸、正缬氨酸、2-氮杂苯丙氨酸、3-氮杂苯丙氨酸、4-氮杂苯丙氨酸、L-鸟氨酸、L-2-氨基-3-胍基丙酸、或赖氨酸、精氨酸和/或鸟氨酸的D-异构体、以及4-氟苯丙氨酸。将非标准氨基酸引入蛋白质的方法是本领域已知的，包括使用大肠杆菌营养缺陷型表达宿主的重组蛋白质合成。

下表列出了标准氨基酸的特性：

以下氨基酸被认为是带电荷的氨基酸：天冬氨酸(负)、谷氨酸(负)、精氨酸(正)和赖氨酸(正)。

SEQ ID NO：1中包含的序列Ile-Asp/Glu-Gly-Arg是指本发明人惊奇地发现的被肠激酶(以及因子Xa)识别的位点。优选地，该序列是Ile-Asp-Gly-Arg,e.g.Cys-(Xaa)

在一个实施方案中，紧接SEQ ID NO：1的Ile的N-末端的Xaa处的氨基酸残基是不带电荷的疏水氨基酸，优选丙氨酸。在一些实施方案中，“a”为至少2，并且Xaa至少包含C-末端不带电荷的极性氨基酸和紧接其N-末端的带电荷的碱性氨基酸。带电荷的碱性氨基酸优选为赖氨酸。因此，在“a”为至少2的实施方案中，Xaa可至少包含Lys-Ala，其中Ala紧接SEQID NO：1的Ile的N-末端。

在一个实施方案中，Xaa包含序列HKA或由其组成。

在一个实施方案中，紧接SEQ ID NO：1的Arg的C-末端的Yaa处的氨基酸残基是不带电荷的极性氨基酸，优选丝氨酸。在一些实施方案中，“b”为至少2，并且Yaa至少包含N-末端的不带电荷的极性氨基酸和紧接其C-末端的不带电荷的疏水氨基酸。不带电荷的疏水氨基酸优选是亮氨酸。因此，在“b”为至少2的实施方案中，Yaa可至少包含Ser-Leu，其中Ser紧接SEQ ID NO：1的Arg的C-末端。

在一个实施方案中，Yaa包含序列SLYNKTLDC或由其组成。

在一些实施方案中，外源性活化环与SEQ ID NO：2具有至少70％的序列同一性。在一个实施方案中，外源性活化环与SEQ ID NO：2具有至少80％、85％或90％的序列同一性。优选地，外源性活化环与SEQ ID NO：2具有至少95％的序列同一性。更优选地，外源性活化环与SEQ ID NO：2具有至少99％的序列同一性。

在一个特别优选的实施方案中，外源性环包含SEQ ID NO：2。更优选地，外源性环由SEQ ID NO：2组成。

外源性环也可以是SEQ ID NO：2的变体，例如SEQ ID NO：3或与其具有至少70％的序列同一性的序列。SEQ ID NO：3是SEQ ID NO：2的变体，其中肠激酶识别位点IDGR已突变为IEGR。在一个实施方案中，外源性活化环与SEQ ID NO：3具有至少80％、85％或90％的序列同一性。优选地，外源性活化环与SEQ ID NO：3具有至少95％的序列同一性。更优选地，外源性活化环与SEQ ID NO：3具有至少99％的序列同一性。

在一个特别优选的实施方案中，外源性环包含SEQ ID NO：3。更优选地，外源性环由SEQ ID NO：3组成。

本发明的梭菌神经毒素(例如工程化的梭菌神经毒素)可以由核苷酸序列编码，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：12具有至少70％的序列同一性。在一个实施方案中，本发明的梭菌神经毒素可以由核苷酸序列编码，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：10或SEQID NO：12具有至少80％或90％的序列同一性。优选地，本发明的梭菌神经毒素可以由核苷酸序列编码，所述核苷酸序列包含SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：12(更优选地，由其组成)。

本发明的梭菌神经毒素(例如工程化的梭菌神经毒素)可包含多肽序列，所述多肽序列与SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：13具有至少70％的序列同一性。在一个实施方案中，本发明的梭菌神经毒素可包含多肽序列，所述多肽序列与SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：13具有至少80％或90％的序列同一性。优选地，本发明的梭菌神经毒素可包含如SEQ ID NO：5，SEQ IDNO：7，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：13所示的多肽序列(更优选由其组成)。

本发明的梭菌神经毒素(例如工程化的梭菌神经毒素)优选是BoNT/X，其中梭菌神经毒素由核苷酸序列编码，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：4具有至少70％的序列同一性。在一个实施方案中，梭菌神经毒素由核苷酸序列编码，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：4具有至少80％或90％的序列同一性。优选地，梭菌神经毒素由核苷酸序列编码，所述核苷酸序列包含SEQ ID NO：4(或由其组成)。本发明的梭菌神经毒素优选是BoNT/X，其中梭菌神经毒素包含多肽序列，所述多肽序列与SEQ ID NO：5具有至少70％的序列同一性。在一个实施方案中，梭菌神经毒素包含多肽序列，所述多肽序列与SEQ ID NO：5具有至少80％或90％的序列同一性。优选地，梭菌神经毒素包含如SEQ ID NO：5所示的多肽序列(或由其组成)。

本发明的梭菌神经毒素(例如工程化的梭菌神经毒素)优选是BoNT/E，其中梭菌神经毒素由核苷酸序列编码，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：10具有至少70％的序列同一性。在一个实施方案中，梭菌神经毒素由核苷酸序列编码，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：10具有至少80％或90％的序列同一性。优选地，梭菌神经毒素由核苷酸序列编码，所述核苷酸序列包含SEQ ID NO：10(或由其组成)。本发明的梭菌神经毒素优选是BoNT/E，其中梭菌神经毒素包含多肽序列，所述多肽序列与SEQ ID NO：11具有至少70％的序列同一性。在一个实施方案中，梭菌神经毒素包含多肽序列，所述多肽序列与SEQ ID NO：11具有至少80％或90％的序列同一性。优选地，梭菌神经毒素包含如SEQ ID NO：11所示的多肽序列(或由其组成)。

在一些实施方案中，本发明的多肽序列(或编码其的核苷酸序列)可以包括纯化标签，例如His标签。本发明还旨在包括其中去除了纯化标签的多肽序列(和编码其的核苷酸序列)。

本发明包括使单链梭菌神经毒素(例如本发明的工程化的梭菌神经毒素)与蛋白酶接触，所述蛋白酶能够水解单链梭菌神经毒素的活化环中的肽键，从而产生双链梭菌神经毒素。蛋白酶可以是内肽酶。蛋白酶可以是肠激酶、因子Xa、Lys-C或胰蛋白酶。优选地，蛋白酶是肠激酶或因子Xa，更优选地是肠激酶。

术语“肠激酶”或“EK”包括本文所述的肠激酶，以及任何具有结构和/或功能相似性(优选地结构和功能相似性)的蛋白酶，其能够水解SEQ ID NO：1的肽键。合适的肠激酶是肠激酶轻链，其可从NEB(#P8070)商购获得。一单位可以定义为在25℃下、在25μl的总反应体积(20mM Tris-HCl,50mM NaCl,2mM CaCl

在一个实施方案中，肠激酶包含多肽序列，所述多肽序列与SEQ ID NO：49具有至少70％的序列同一性。在一些实施方案中，肠激酶包含多肽序列，所述多肽序列与SEQ IDNO：49具有至少80％或90％的序列同一性。优选地，肠激酶包含SEQ ID NO：49(更优选由其组成)。

在一些实施方案中，肠激酶可进一步包含重链，其中重链和轻链通过二硫键连接。这样的肠激酶是可商购的(例如，来自R&D Systems)。

术语“因子Xa”包括本文所述的因子Xa，以及任何具有结构和/或功能相似性(优选地结构和功能相似性)的蛋白酶，其能够水解SEQ ID NO：1的肽键。合适的因子Xa可从NEB(#P8010)商购获得。一单位可以定义为在23℃下、在50μl的反应体积(20mM Tris-HCl,100mMNaCl,2mM CaCl

在一个实施方案中，因子Xa包含具有重链和轻链的多肽序列，所述重链与SEQ IDNO：50具有至少70％的序列同一性，所述轻链与SEQ ID NO：51具有至少70％的序列同一性，其中重链和轻链通过二硫键连接。在一些实施方案中，因子Xa包含具有重链和轻链的多肽序列，所述重链与SEQ ID NO：50具有至少80％或90％的序列同一性，所述轻链与SEQ IDNO：51具有至少80％或90％的序列同一性，其中重链和轻链通过二硫键连接。优选地，因子Xa包含SEQ ID NO：50和SEQ ID NO：51(更优选地由其组成)，其中重链和轻链通过二硫键连接。

接触可以在任何合适的条件下发生，所述条件导致产生多于30％、40％、50％或60％(优选地，多于70％)的单链梭菌神经毒素被蛋白水解加工成相应的双链梭菌神经毒素，没有或基本上没有所述梭菌神经毒素活化环外的肽键水解。“基本上没有水解”可以指在本发明的方法中，少于5％、4％、3％、2％或1％的所接触的梭菌神经毒素包含被蛋白酶水解的在活化环外的肽键。

技术人员可以选择适当的反应时间、温度、缓冲液和蛋白酶与单链梭菌神经毒素的摩尔比以实现上述目的。可以使用常规技术凭经验确定此类条件的最优化，例如在所述接触之后SDS-PAGE(例如，用考马斯或具有相似灵敏度的染料染色)对反应产物进行可视分析，或光谱技术(例如质谱法)。

当通过SDS-PAGE评估时(例如用考马斯或相似灵敏度的染料染色)，本发明的方法优选仅导致梭菌神经毒素L链和H链的产生。

在一个实施方案中，在本发明的方法中通过蛋白酶的蛋白水解加工导致产生少于5个梭菌神经毒素L链或H链的降解产物，更优选少于4、3、2或1个降解产物。优选地，通过本发明的方法产生的L链和H链是全长L链和H链。

因此，在一个特别优选的实施方案中，用于本发明方法的蛋白酶(例如肠激酶或因子Xa)仅水解SEQ ID NO：1的肽键，更优选地，仅水解SEQ ID NO：1的Arg和Yaa之间的肽键。

在一实施方案中，接触发生至少1小时，例如至少2、4、6、8、10、12、14、16、18或20小时。

在一个实施方案中，接触在至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40℃的温度下发生。

在一个实施方案中，接触在1至10℃(优选约4℃)的温度下发生。优选地，接触在1-10℃(更优选约4℃)的温度下发生10-25小时(优选15-20小时)。

在一个实施方案中，接触在15-25℃(优选约20℃)的温度下发生。优选地，接触在15-25℃(更优选约20℃)的温度下发生10-25小时(优选15-20小时)。

在一个实施方案中，接触在20-30℃(优选约25℃)的温度下发生。优选地，接触在20-30℃(更优选约25℃)的温度下发生10-25小时(优选15-20小时)。

本发明方法的接触步骤可以包括每mg梭菌神经毒素使用至少1μg蛋白酶。在一个实施方案中，本发明方法的接触步骤包括每mg梭菌神经毒素使用至少0.1、0.2、0.4、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20μg蛋白酶。优选地，本发明方法的接触步骤包括每mg梭菌神经毒素使用至少2μg(更优选至少4μg)蛋白酶。

在一个实施方案中，本发明方法的接触步骤包括每mg梭菌神经毒素使用≤20μg蛋白酶。在一个实施方案中，本发明方法的接触步骤包括每mg梭菌神经毒素使用≤15μg蛋白酶。优选地，本发明方法的接触步骤包括每mg梭菌神经毒素使用≤10μg蛋白酶。更优选地，本发明方法的接触步骤包括每mg梭菌神经毒素使用≤7μg蛋白酶。

本发明方法的接触步骤可以包括每mg梭菌神经毒素使用0.1-20μg蛋白酶。在一个实施方案中，本发明的方法可包括每mg梭菌神经毒素使用1-10μg蛋白酶，优选地，每mg梭菌神经毒素使用4-7μg蛋白酶。

本发明方法的接触步骤可以包括每mg梭菌神经毒素使用至少10、20、30、40、50、60或70单位的肠激酶。优选地，本发明方法的接触步骤可以包括每mg梭菌神经毒素使用至少60单位的肠激酶(更优选至少70单位)。在一些实施方案中，本发明方法的接触步骤可以包括每mg梭菌神经毒素使用≤150、≤140、≤130、≤120、≤110、≤100、≤90单位的肠激酶。优选地，本发明方法的接触步骤可包括每mg梭菌神经毒素使用≤100单位的肠激酶(更优选≤90单位)。本发明方法的接触步骤可以包括每mg梭菌神经毒素使用50-110单位的肠激酶。在一个实施方案中，本发明的方法可包括每mg梭菌神经毒素使用70-90单位的肠激酶，例如每mg梭菌神经毒素使用约80单位的肠激酶。

本发明方法的接触步骤可包括每mg梭菌神经毒素使用至少0.5、1、2、3、4或5单位的因子Xa。优选地，本发明方法的接触步骤可以包括每mg梭菌神经毒素使用至少3单位的因子Xa(更优选至少4单位)。在一些实施方案中，本发明方法的接触步骤可以包括每mg梭菌神经毒素使用≤15、≤14、≤13、≤12、≤11、≤10、≤9、≤8或≤7单位的因子Xa。优选地，本发明方法的接触步骤可包括每mg梭菌神经毒素使用≤8单位的因子Xa(更优选≤7单位)。本发明方法的接触步骤可以包括每mg梭菌神经毒素使用0.5-15单位的因子Xa。在一个实施方案中，本发明的方法可包括每mg梭菌神经毒素使用1-10单位(优选4-7单位)的因子Xa，例如每mg梭菌神经毒素使用约5或6单位的因子Xa。

本发明方法的接触步骤可以包括每mg梭菌神经毒素使用至少0.02、0.04、0.06或0.08单位的Lys-C。优选地，本发明方法的接触步骤可以包括每mg梭菌神经毒素使用至少0.04单位的Lys-C。在一些实施方案中，本发明方法的接触步骤可以包括每mg梭菌神经毒素使用≤0.5、≤0.4或≤0.2单位的Lys-C。优选地，本发明方法的接触步骤可以包括每mg梭菌神经毒素使用≤0.2单位的Lys-C。本发明方法的接触步骤可以包括每mg梭菌神经毒素使用0.02-0.5单位的Lys-C。优选地，本发明的方法可以包括每mg梭菌神经毒素使用0.04-0.2单位的Lys-C。

本发明方法的接触步骤可以包括每mg梭菌神经毒素使用至少0.1、0.2、0.3或0.4单位的胰蛋白酶。优选地，本发明方法的接触步骤可以包括每mg梭菌神经毒素使用至少0.4单位的胰蛋白酶。在一些实施方案中，本发明方法的接触步骤可以包括每mg梭菌神经毒素使用≤2.5、≤2.3、≤2.1、≤1.9单位的胰蛋白酶。优选地，本发明方法的接触步骤可以包括每mg梭菌神经毒素使用≤1.8单位的胰蛋白酶。本发明方法的接触步骤可以包括每mg梭菌神经毒素使用0.1-2.5单位的胰蛋白酶。优选地，本发明的方法可以包括每mg梭菌神经毒素使用0.3-2单位(更优选0.4-1.8单位)的胰蛋白酶。

在一个实施方案中，梭菌神经毒素(例如，工程化前)可以是BoNT/X。参考BoNT/X序列如SEQ ID NO：33所示。BoNT/X的带组氨酸标签形式如SEQ ID NO：34所示。编码BoNT/X的参考核苷酸序列如SEQ ID NO：32所示。

在一个实施方案中，梭菌神经毒素(例如，工程化前)可以是BoNT/A。参考BoNT/A序列如SEQ ID NO：35所示。

在另一个实施方案中，梭菌神经毒素(例如，工程化前)可以是BoNT/B。参考BoNT/B序列如SEQ ID NO：36所示。

在另一个实施方案中，梭菌神经毒素(例如，工程化前)可以是BoNT/C。参考BoNT/C

在另一个实施方案中，梭菌神经毒素(例如，工程化前)可以是BoNT/D。参考BoNT/D序列如SEQ ID NO：38所示。

在另一个实施方案中，梭菌神经毒素(例如，工程化前)可以是BoNT/E。参考BoNT/E序列如SEQ ID NO：39所示。

在另一个实施方案中，梭菌神经毒素(例如，工程化前)可以是BoNT/F。参考BoNT/F序列如SEQ ID NO：40所示。

在另一个实施方案中，梭菌神经毒素(例如，工程化前)可以是BoNT/G。参考BoNT/G序列如SEQ ID NO：41所示。

在另一个实施方案中，梭菌神经毒素(例如，工程化前)可以是TeNT。参考TeNT序列如SEQ ID NO：42所示。

如上所述，梭菌神经毒素由两条多肽链：重链和轻链形成，重链(H链)的分子量约为100kDa，轻链(L链)的分子量约为50kDa。H链包含C-末端靶向组分(受体结合结构域或H

轻链参考序列的示例包括：

A型肉毒杆菌神经毒素：氨基酸残基1-448

B型肉毒杆菌神经毒素：氨基酸残基1-440

C1型肉毒杆菌神经毒素：氨基酸残基1-441

D型肉毒杆菌神经毒素：氨基酸残基1-445

E型肉毒杆菌神经毒素：氨基酸残基1-422

F型肉毒杆菌神经毒素：氨基酸残基1-439

G型肉毒杆菌神经毒素：氨基酸残基1-441

破伤风神经毒素：氨基酸残基1-457

对于最近鉴定的BoNT/X，据报道L链对应于其氨基酸1-439，其中L链边界可能相差约25个氨基酸(例如1-414或1-464)。

以上鉴定的参考序列应被视为指导，因为根据血清亚型可能会发生细微变化。举例来说，US 2007/0166332(通过引用整体并入本文)引用了略有不同的梭菌序列：

A型肉毒杆菌神经毒素：氨基酸残基M1-K448

B型肉毒杆菌神经毒素：氨基酸残基M1-K441

C1型肉毒杆菌神经毒素：氨基酸残基M1-K449

D型肉毒杆菌神经毒素：氨基酸残基M1-R445

E型肉毒杆菌神经毒素：氨基酸残基M1-R422

F型肉毒杆菌神经毒素：氨基酸残基M1-K439

G型肉毒杆菌神经毒素：氨基酸残基M1-K446

破伤风神经毒素：氨基酸残基M1-A457

易位结构域是能够使蛋白酶易位到靶细胞中的分子，从而在靶细胞的细胞质内发生蛋白酶活性的功能性表达。可以通过许多常规测定法中的任何一种来确认任何分子(例如蛋白质或肽)是否具有本发明必需的易位功能。

例如，Shone C.(1987)描述了使用脂质体的体外测定法，所述脂质体受到测试分子的攻击。通过从脂质体中释放的K

Blaustein R.(1987)提供了另一个示例，其描述了使用平面磷脂双层膜的简单的体外测定法。用测试分子攻击膜，并通过所述膜的跨膜电导的增加来确认必需的易位功能[参见Blaustein(1987)FEBS Letts；第226卷,第1号:第115-120页]。

Methods in Enzymology Vol 220and 221,Membrane Fusion Techniques,PartsA and B,Academic Press 1993提供了能够评估膜融合并因此鉴定适用于本发明的易位结构域的其他方法。

本发明还包括易位结构域变体，只要所述结构域变体仍显示出必需的易位活性。举例来说，变体可与参考易位结构域具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％或至少98％的氨基酸序列同源性。当相对于易位结构域使用时，术语片段是指肽，其具有参考易位结构域的至少20个，优选至少40个，更优选至少80个，最优选至少100个氨基酸残基。在梭菌易位结构域的情况下，该片段优选具有参考易位结构域(例如H

易位结构域优选地能够在低pH条件下在脂质膜中形成离子可渗透的孔。优选地，已经发现仅使用能够在内体膜内形成孔的蛋白质分子的那些部分。

易位结构域可获自微生物蛋白来源，特别是获自细菌或病毒蛋白来源。因此，在一个实施方案中，易位结构域是酶的易位结构域，例如，细菌毒素或病毒蛋白的易位结构域。

众所周知，细菌毒素分子的某些结构域能够形成此类孔。还已知病毒表达的膜融合蛋白的某些易位结构域能够形成此类孔。这样的结构域可以在本发明中使用。

易位结构域可以是梭菌来源的，例如H

合适的(参考)易位结构域的示例包括：

A型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(449-871)

B型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(441-858)

C型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(442-866)

D型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(446-862)

E型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(423-845)

F型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(440-864)

G型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(442-863)

破伤风神经毒素-氨基酸残基(458-879)

以上鉴定的参考序列应被视为指导，因为根据血清亚型可能会发生细微变化。举例来说，US 2007/0166332(通过引用整体并入本文)引用了略有不同的梭菌序列：

A型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(A449-K871)

B型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(A442-S858)

C型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(T450-N866)

D型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(D446-N862)

E型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(K423-K845)

F型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(A440-K864)

G型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(S447-S863)

破伤风神经毒素-氨基酸残基(S458-V879)

在本发明的上下文中，多种具有易位结构域的梭菌神经毒素H

有关肉毒杆菌(Clostridium botulinum)和破伤风梭菌产生毒素的遗传基础的更多详细信息，参见Henderson等人(1997)in The Clostridia:Molecular Biology andPathogenesis,Academic press。

术语H

备选地，易位结构域可以是非梭菌来源的。非梭菌(参考)易位结构域来源的示例包括但不限于白喉毒素的易位结构域[O’Keefe等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)89,6202-6206；Silverman等人,J.Biol.Chem.(1993)269,22524-22532；和London,E.(1992)Biochem.Biophys.Acta.,1112,pp.25-51],A型假单胞菌外毒素的易位结构域[Prior等人Biochemistry(1992)31,3555-3559]，炭疽毒素的易位结构域[Blanke等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1996)93,8437-8442]，各种具有易位功能的融合或疏水性肽[Plank等人J.Biol.Chem.(1994)269,12918-12924；和Wagner等人(1992)PNAS,89,pp.7934-7938]，和两亲性肽[Murata等人(1992)Biochem.,31，第1986-1992页]。易位结构域可以反映天然存在的蛋白质中存在的易位结构域，或者可以包含氨基酸变异，只要变异不破坏易位结构域的易位能力。

适用于本发明的病毒(参考)易位结构域的具体示例包括病毒表达的膜融合蛋白的某些易位结构域。例如，Wagner等人(1992)和Murata等人(1992)描述了源自流感病毒血凝素N-末端区域的许多融合和两亲性肽的易位(即,膜融合和囊泡化)功能。其他已知具有所需易位活性的病毒表达的膜融合蛋白是Semliki森林病毒(SFV)融合肽的易位结构域、水疱性口炎病毒(VSV)糖蛋白G的易位结构域、SER病毒F蛋白的易位结构域和泡沫病毒包膜糖蛋白的易位结构域。病毒编码的Aspike蛋白在本发明的上下文中具有特定的应用，例如，SFV的E1蛋白和VSV的G蛋白的G蛋白。

表(下表)中列出的(参考)易位结构域的使用包括其序列变体的使用。变体可以包含一个或多个保守核酸取代和/或核酸删除或插入，只要该变体具有必需的易位功能。变体还可以包含一个或多个氨基酸取代和/或氨基酸删除或插入，只要该变体具有必需的易位功能。

梭菌神经毒素H

BoNT/A-N872-L1296

BoNT/B-E859-E1291

BoNT/C1-N867-E1291

BoNT/D-S863-E1276

BoNT/E-R846-K1252

BoNT/F-K865-E1274

BoNT/G-N864-E1297

TeNT-I880-D1315

对于最近鉴定的BoNT/X，据报道H

本文所述的梭菌神经毒素可进一步包含易位促进结构域。所述结构域促进将非细胞毒性蛋白酶递送至靶细胞的细胞质中，并且描述在例如，WO 08/008803和WO 08/008805中，其各自通过引用并入本文。

举例来说，合适的易位促进结构域包括包膜病毒融合(fusogenic)肽结构域，例如，合适的融合肽结构域包括流感病毒融合肽结构域(例如23个氨基酸的甲型流感病毒融合肽结构域)、α病毒融合肽结构域(例如26个氨基酸的Semliki森林病毒融合肽结构域)、水疱病毒融合肽结构域(例如21个氨基酸的水疱性口炎病毒融合肽结构域)、呼吸道病毒融合肽结构域(例如25个氨基酸的仙台病毒融合肽结构域)、麻疹病毒融合肽结构域(例如25个氨基酸的犬瘟热病毒融合肽结构域)、avulavirus病毒融合肽结构域(例如25个氨基酸的新城病毒融合肽结构域)、henipavirus病毒融合肽结构域(例如25个氨基酸的亨德拉病毒融合肽结构域)、间质性肺炎病毒(metapneumovirus)融合肽结构域(例如25个氨基酸的人间质性肺炎病毒融合肽结构域)或spumavirus病毒融合肽结构域，如猿猴泡沫病毒融合肽结构域；或其片段或变体。

作为进一步的示例，易位促进结构域可包含梭菌神经毒素H

A型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(872-1110)

B型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(859-1097)

C型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(867-1111)

D型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(863-1098)

E型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(846-1085)

F型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(865-1105)

G型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(864-1105)

破伤风神经毒素-氨基酸残基(880-1127)

上述序列位置可能会根据血清型/亚型略有差别，合适的(参考)梭菌神经毒素H

A型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(874-1110)

B型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(861-1097)

C型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(869-1111)

D型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(865-1098)

E型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(848-1085)

F型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(867-1105)

G型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(866-1105)

破伤风神经毒素-氨基酸残基(882-1127)

任何上述促进结构域可与任何适用于本发明的前述易位结构域肽组合。因此，举例来说，非梭菌促进结构域可以与非梭菌易位结构域肽或与梭菌易位结构域肽组合。或者，可将梭菌神经毒素H

A型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(449-1110)

B型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(442-1097)

C型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(450-1111)

D型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(446-1098)

E型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(423-1085)

F型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(440-1105)

G型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(447-1105)

破伤风神经毒素-氨基酸残基(458-1127)

在一些实施方案中，本发明的梭菌神经毒素可缺少梭菌神经毒素的功能性H

天然梭菌神经毒素的H

因此，在一个实施方案中，本发明的梭菌神经毒素H

A型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(Y1111-L1296)

B型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(Y1098-E1291)

C型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(Y1112-E1291)

D型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(Y1099-E1276)

E型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(Y1086-K1252)

F型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(Y1106-E1274)

G型肉毒杆菌神经毒素-氨基酸残基(Y1106-E1297)

破伤风神经毒素-氨基酸残基(Y1128-D1315)。

以上鉴定的参考序列应被视为指导，因为根据血清亚型可能会发生细微变化。

本发明适用于多种不同的梭菌神经毒素。因此，在本发明的上下文中，术语“梭菌神经毒素”包括由以下梭菌产生的毒素：肉毒杆菌(肉毒杆菌神经毒素血清型A、B、C1、D、E、F、G、H和X)，破伤风梭菌(破伤风神经毒素)，丁酸梭菌(肉毒杆菌神经毒素血清型E)和巴拉特梭菌(肉毒杆菌神经毒素血清型F)，以及修饰的梭菌神经毒素或衍生自上述物质的衍生物。术语“梭菌神经毒素”还包括血清型H的肉毒杆菌神经毒素。优选地，梭菌神经毒素不是BoNT/C1。

肉毒杆菌神经毒素(BoNT)是由肉毒杆菌产生的一种大蛋白复合物形式，由BoNT本身与许多辅助蛋白复合组成。目前有九种不同类别的肉毒杆菌神经毒素，即：肉毒杆菌神经毒素血清型A、B、C1、D、E、F、G、H和X，其均具有相似的结构和作用方式。可以基于通过特异性中和抗血清的失活来区分不同的BoNT血清型，其中通过血清型的这种分类与氨基酸水平的序列同一性百分比相关。根据氨基酸序列同一性百分比，将给定血清型的BoNT蛋白进一步分为不同的亚型。

BoNT在胃肠道中吸收，进入大循环后，与胆碱能神经末梢的突触前膜结合并阻止其神经递质乙酰胆碱的释放。BoNT/B、BoNT/D、BoNT/F和BoNT/G裂解小突触泡蛋白/囊泡相关膜蛋白(VAMP)；BoNT/C1、BoNT/A和BoNT/E裂解25kDa的突触体相关蛋白(SNAP-25)；BoNT/C1裂解突触融合蛋白。发现BoNT/X可以裂解SNAP-25、VAMP1、VAMP2、VAMP3、VAMP4、VAMP5、Ykt6和突触融合蛋白1。

破伤风梭菌产生单一血清型的破伤风毒素。丁酸梭菌产生BoNT/E，而巴拉特梭菌产生BoNT/F。

术语“梭菌神经毒素”也意图包括修饰的梭菌神经毒素及其衍生物，包括但不限于以下所述的那些。修饰的梭菌神经毒素或衍生物可包含一个或多个氨基酸，所述氨基酸与梭菌神经毒素的天然(未修饰)形式相比已被修饰，或者所述修饰的梭菌神经毒素或衍生物可包含一个或多个插入的在天然(未修饰)形式中不存在的氨基酸。举例来说，相对于天然(未修饰的)梭菌神经毒素序列，修饰的梭菌神经毒素可以在一个或多个结构域中具有修饰的氨基酸序列。这样的修饰可以修饰毒素的功能方面，例如生物活性或持久性。因此，在一个实施方案中，本发明的工程化的梭菌神经毒素是工程化的修饰的梭菌神经毒素，或工程化的修饰的梭菌神经毒素衍生物，或工程化的梭菌神经毒素衍生物。

修饰的梭菌神经毒素可以在重链的氨基酸序列中具有一个或多个修饰(如修饰的H

修饰的梭菌神经毒素可在轻链的氨基酸序列中具有一个或多个修饰，例如在底物结合或催化结构域中的修饰，其可改变或修改修饰的L链的SNARE蛋白特异性。此类修饰的梭菌神经毒素的示例描述于WO 2010/120766和US 2011/0318385中，二者均在此通过引用整体并入本文。

修饰的梭菌神经毒素可包含一个或多个修饰，其增加或降低修饰的梭菌神经毒素的生物活性和/或生物持久性。例如，修饰的梭菌神经毒素可包含基于亮氨酸或酪氨酸的基序，其中所述基序增加或降低修饰的梭菌神经毒素的生物活性和/或生物持久性。合适的基于亮氨酸的基序包括xDxxxLL(SEQ ID NO:74)、xExxxLL(SEQ ID NO:75)、xExxxIL(SEQ IDNO:76)和xExxxLM(SEQ ID NO:77)(其中x是任何氨基酸)。合适的基于酪氨酸的基序包括Y-x-x-Hy(SEQ ID NO:78)(其中Hy是疏水性氨基酸)。包含基于亮氨酸和酪氨酸的基序的修饰的梭菌神经毒素的示例在WO 2002/08268中描述，其通过引用整体并入本文。

术语“梭菌神经毒素”旨在包括杂合和嵌合的梭菌神经毒素。杂合梭菌神经毒素包含来自一种梭菌神经毒素或其亚型的轻链的至少一部分，以及来自另一种梭菌神经毒素或梭菌神经毒素亚型的重链的至少一部分。在一个实施方案中，杂合梭菌神经毒素可包含来自一种梭菌神经毒素亚型的整个轻链和来自另一种梭菌神经毒素亚型的重链。在另一个实施方案中，嵌合的梭菌神经毒素可以包含一种梭菌神经毒素亚型的重链的一部分(例如结合结构域)，其中重链的另一部分来自另一种梭菌神经毒素亚型。类似地或可替代地，治疗元件可包含来自不同梭菌神经毒素的轻链部分。此类杂合或嵌合的梭菌神经毒素可用作，例如，向对给定梭菌神经毒素亚型具有免疫抗性的患者、向对给定梭菌神经毒素重链结合结构域可能具有低于平均受体浓度的患者、或向可能具有膜或囊泡毒素底物(例如SNAP-25，VAMP和突触融合蛋白)的蛋白酶抗性变体的患者递送此类梭菌神经毒素的治疗益处的手段。杂合和嵌合的梭菌神经毒素描述于US 8,071,110，其公开内容在此整体引用作为参考。因此，在一个实施方案中，本发明的工程化的梭菌神经毒素是工程化的杂合梭菌神经毒素或工程化的嵌合梭菌神经毒素。

在特别优选的实施方案中，梭菌神经毒素是BoNT/X，其包含来自非BoNT/X梭菌神经毒素的至少一个结构域(例如，BoNT/X杂合体或嵌合体)。

例如，在一个实施方案中，本发明的梭菌神经毒素(包括外源性活化环)可以包括：

i.BoNT/X L链和非BoNT/X H

ii.BoNT/X H

iii.BoNT/X H

iv.BoNT/X L链和H

v.BoNT/X L链和H

vi.BoNT/X H

在一个实施方案中，本发明的工程化的梭菌神经毒素包含BoNT/XL链和H

在一个实施方案中，本发明的工程化的梭菌神经毒素包含BoNT/X L链和H

在一个实施方案中，本发明的工程化的梭菌神经毒素包含BoNT/X L链和H

在一个实施方案中，梭菌神经毒素是BoNT/A，其包含至少一个来自非BoNT/A梭菌神经毒素的结构域。

例如，在一个实施方案中，本发明的梭菌神经毒素(包含外源性活化环)可以包括：

i.BoNT/A L链和非BoNT/A H

ii.BoNT/A H

iii.BoNT/A H

iv.BoNT/A L链和H

v.BoNT/A L链和H

vi.BoNT/A H

在一个实施方案中，本发明的工程化的梭菌神经毒素包含BoNT/A L链和H

在一个实施方案中，本发明的工程化的梭菌神经毒素包含BoNT/A L链和H

例如，在一个实施方案中，本发明的梭菌神经毒素(包含外源性活化环)可以包括：

i.BoNT/B L链和非BoNT/B H

ii.BoNT/B H

iii.BoNT/B H

iv.BoNT/B L链和H

v.BoNT/B L链和H

vi.BoNT/B H

例如，在一个实施方案中，本发明的梭菌神经毒素(包含外源性活化环)可以包括：

i.BoNT/D L链和非BoNT/XD H

ii.BoNT/D H

iii.BoNT/D H

iv.BoNT/D L链和H

v.BoNT/D L链和H

vi.BoNT/D H

例如，在一个实施方案中，本发明的梭菌神经毒素(包含外源性活化环)可以包括：

i.BoNT/E L链和非BoNT/E H

ii.BoNT/E H

iii.BoNT/E H

iv.BoNT/E L链和H

v.BoNT/E L链和H

vi.BoNT/E H

例如，在一个实施方案中，本发明的梭菌神经毒素(包含外源性活化环)可以包括：

i.BoNT/F L链和非BoNT/F H

ii.BoNT/F H

iii.BoNT/F H

iv.BoNT/F L链和H

v.BoNT/F L链和H

vi.BoNT/F H

例如，在一个实施方案中，本发明的梭菌神经毒素(包含外源性活化环)可以包括：

i.BoNT/G L链和非BoNT/G H

ii.BoNT/G H

iii.BoNT/G H

iv.BoNT/G L链和H

v.BoNT/G L链和H

vi.BoNT/G H

例如，在一个实施方案中，本发明的梭菌神经毒素(包含外源性活化环)可以包括：

i.TeNT L链和非TeNT H

ii.TeNT H

iii.TeNT H

iv.TeNT L链和H

v.TeNT L链和H

vi.TeNT H

术语“梭菌神经毒素”也可以包含由非梭菌微生物表达的新发现的肉毒杆菌神经毒素蛋白家族成员，例如肠球菌编码的毒素，其与BoNT/X具有最接近的序列同一性，称为BoNT/Wo的Weissella oryzae编码的毒素(NCBI参考序列：WP_027699549.1)，其在W89-W90处裂解VAMP2，粪肠球菌编码的毒素(GenBank：OTO22244.1)，其裂解VAMP2和SNAP25，以及Chryseobacterium pipero编码的毒素(NCBI Ref.Seq：WP_034687872.1)。

术语“梭菌神经毒素”旨在包括重新靶向的梭菌神经毒素。在重新靶向的梭菌神经毒素中，梭菌神经毒素被修饰以包括称为靶向部分(TM)的外源性配体。选择TM以提供对所需靶细胞的结合特异性，并且作为重新靶向过程的一部分，可以去除梭菌神经毒素的天然结合部分(例如，H

在一个实施方案中，本发明的工程化的梭菌神经毒素可包含本文所述的工程化的LH

在一个实施方案中，工程化的梭菌神经毒素可以包含本文所述的工程化的LH

参考工程化的LH

在一个实施方案中，TM可包含炭疽毒素保护性抗原(PA)或其片段。PA的参考序列如EQ ID NO：52所示。在一些实施方案中，PA包含与SEQ ID NO：52具有至少70％序列同一性的多肽序列，或其片段。在一些实施方案中，PA包含与SEQ ID NO：52具有至少80％或90％的序列同一性的多肽序列，或其片段。在其他实施方案中，PA包含如SEQ ID NO：52所示的多肽序列或其片段(或由其组成)。

因此，在一个实施方案中，本发明的工程化的梭菌神经毒素可包含：梭菌神经毒素非细胞毒性蛋白酶结构域、梭菌神经毒素易位结构域(例如，梭菌神经毒素的LH

因此，在一个实施方案中，工程化的梭菌神经毒素包含PA或其片段和LH

Lys-C不适合与包含LH

因此，在一些实施方案中，工程化的梭菌神经毒素包含PA(或其片段)和：

i.SEQ ID NO：35的氨基酸残基1-871；

ii.SEQ ID NO：36的氨基酸残基1-858；

iii.SEQ ID NO：38的氨基酸残基1-862；

iv.SEQ ID NO：39的氨基酸残基1-845；

v.SEQ ID NO：40的氨基酸残基1-864；

vi.SEQ ID NO：41的氨基酸残基1-863；

vii.SEQ ID NO：42的氨基酸残基1-879；

viii.SEQ ID NO：33的氨基酸残基1-924；

其中内源性梭菌神经毒素活化环已被外源性活化环代替，所述外源性活化环包含多肽序列Cys-(Xaa)

在一个实施方案中，工程化的梭菌神经毒素具有多肽序列，所述多肽序列与以下多肽具有至少70％的序列同一性，所述多肽包含：

a.SEQ ID NO：52；和

b.SEQ ID NO：53，SEQ ID NO:54，SEQ ID NO:55，SEQ ID NO:56，SEQ ID NO:57，SEQ ID NO:58，SEQ ID NO:59或SEQ ID NO:60。

在一个实施方案中，工程化的梭菌神经毒素具有多肽序列，所述多肽序列与以下多肽具有至少80％或90％的序列同一性，所述多肽包含：

a.SEQ ID NO:52；和

b.SEQ ID NO:53,SEQ ID NO:54，SEQ ID NO:55,SEQ ID NO:56,SEQ ID NO:57,SEQ ID NO:58,SEQ ID NO:59或SEQ ID NO:60。

优选地，工程化的梭菌神经毒素具有多肽序列，所述多肽序列包含：

a.SEQ ID NO:52；和

b.SEQ ID NO:53,SEQ ID NO:54，SEQ ID NO:55,SEQ ID NO:56,SEQ ID NO:57,SEQ ID NO:58,SEQ ID NO:59或SEQ ID NO:60。

在一个实施方案中，工程化的梭菌神经毒素具有多肽序列，所述多肽序列与以下多肽具有至少70％的序列同一性，所述多肽包含：

a.SEQ ID NO：52的片段；和

b.SEQ ID NO:53,SEQ ID NO:54,SEQ ID NO:55,SEQ ID NO:56,SEQ ID NO:57,SEQ ID NO:58,SEQ ID NO:59或SEQ ID NO:60。

在一个实施方案中，工程化的梭菌神经毒素具有多肽序列，所述多肽序列与以下多肽具有至少80％或90％的序列同一性，所述多肽包含：

a.SEQ ID NO：52的片段；和

b.SEQ ID NO:53,SEQ ID NO:54,SEQ ID NO:55,SEQ ID NO:56,SEQ ID NO:57,SEQ ID NO:58,SEQ ID NO:59或SEQ ID NO:60。

优选地，工程化的梭菌神经毒素具有多肽序列，所述多肽序列包含：

a.SEQ ID NO：52的片段；和

b.SEQ ID NO:53,SEQ ID NO:54,SEQ ID NO:55,SEQ ID NO:56,SEQ ID NO:57,SEQ ID NO:58,SEQ ID NO:59或SEQ ID NO:60。

在一个实施方案中，PA片段可以是PAd1，其位于SEQ ID NO：52的残基1-258。在一个实施方案中，PA片段可以是PAd2，其位于SEQ ID NO：52的残基259-487。在一个实施方案中，PA片段可以是PAd3，其位于SEQ ID NO：52的残基488-594。在一个实施方案中，PA片段可以是PAd4，其位于SEQ ID NO：52的残基595-735。在其他实施方案中，PA片段可以包含PAd1、PAd2、PAd3或PAd4的任何组合。

全长83kDa PA(PA83)可以通过弗林蛋白酶或其他弗林蛋白酶样蛋白酶进行蛋白水解加工，从而去除N-末端片段(PA20)。63kDa加工形式，称为PA63，是PA的可低聚形式。

在一个实施方案中，PA片段可包含PA63、PAd3-d4、PAd2-d4和PAd4中的一种或多种(或由其组成)。

在一个实施方案中，PA片段可以是PA的C-末端受体结合结构域或PA的片段(或变体)，其保留了与ANTXR2或伤害感受器神经元结合蛋白的结合活性。

本发明还包括具有非天然蛋白酶裂解位点的梭菌神经毒素。在此类梭菌神经毒素中，天然蛋白酶裂解位点(如上所述，也称为活化位点)被非梭菌神经毒素的天然蛋白酶裂解位点(即外源性裂解位点)修饰或代替。这样的位点需要用于裂解的外源性蛋白酶，该蛋白酶能够更好地控制裂解事件的时间和位置。可用于梭菌神经毒素的非天然蛋白酶裂解位点包括：

TEV(烟草蚀纹病毒) (ENLYFQ↓G)(SEQ ID NO：79)

凝血酶 (LVPR↓GS)(SEQ ID NO：80)

PreScission (LEVLFQ↓GP)(SEQ ID NO:81)。

另外的蛋白酶裂解位点包括被非细胞毒性蛋白酶，例如被梭菌神经毒素的轻链裂解的识别序列。这些裂解位点包括被非细胞毒性蛋白酶，例如梭菌神经毒素的轻链裂解的SNARE(例如SNAP-25，突触融合蛋白，VAMP)蛋白识别序列。在US 7,132,259，EP 1206554-B2和US 2007/0166332中描述了包含非天然蛋白酶裂解位点的梭菌神经毒素，其全部通过引用整体并入本文。术语蛋白酶裂解位点还包括内含肽，其是自裂解序列。例如，通过改变存在的还原剂的浓度，可控制自剪切反应。

本发明还涵盖包含“破坏性裂解位点”的梭菌神经毒素。在所述梭菌神经毒素中，将非天然蛋白酶裂解位点并入梭菌神经毒素中，选择并入的位置使得在所述位点处的裂解将降低梭菌神经毒素的活性或使其失活。如果在施用后梭菌神经毒素迁移至非靶标位置，则破坏性蛋白酶裂解位点可能易于被局部蛋白酶裂解。合适的非天然蛋白酶裂解位点包括上述那些。包含破坏性裂解位点的梭菌神经毒素描述于WO 2010/094905和WO 2002/044199中，这两个文献均通过引用整体并入本文。

本发明的工程化的梭菌神经毒素，特别是其轻链组分可以被聚乙二醇化-这可以帮助增加稳定性，例如轻链组分的作用持续时间。当轻链包含BoNT/A、B或C1蛋白酶时，聚乙二醇化是特别优选的。聚乙二醇化优选包括将PEG添加至轻链组分的N-末端。举例来说，轻链的N-末端可以延伸一个或多个可以相同或不同的氨基酸(例如半胱氨酸)残基。一个或多个所述氨基酸残基可以具有其自身连接的PEG分子(例如，共价连接的)。在WO2007/104567中描述了该技术的示例，该申请的全部内容通过引用并入本文。

本发明的工程化的梭菌神经毒素可以不含在天然存在的梭菌神经毒素复合物中存在的复合蛋白。

可以使用重组核酸技术生产本发明的工程化的梭菌神经毒素。因此，在一个实施方案中，工程化的梭菌神经毒素(如上所述)是重组工程化的梭菌神经毒素。

在另一方面，本发明提供了包含核酸序列的核酸(例如，DNA)，所述核酸序列编码如上所述的工程化的梭菌神经毒素。在一个实施方案中，将核酸序列制备为包含启动子和终止子的DNA载体的一部分。

在一个优选的实施方案中，载体具有选自以下的启动子：

在另一个优选的实施方案中，载体具有选自以下的启动子：

可以使用本领域已知的任何合适方法来制备本发明的核酸分子。因此，可以使用化学合成技术来制备核酸分子。或者，可以使用分子生物学技术来制备本发明的核酸分子。

本发明的DNA构建体优选在计算机上设计，然后通过常规DNA合成技术合成。

根据将使用的最终宿主细胞(例如大肠杆菌)表达系统，任选地针对密码子偏好修饰上述核酸序列信息。

一方面，本发明提供了编码本发明的工程化的梭菌神经毒素的核苷酸序列。所述核苷酸序列包含与SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:12具有至少70％序列同一性的序列。在一个实施方案中，核苷酸序列包含与SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:12具有至少80％或90％序列同一性的序列。优选地，所述核苷酸序列包含SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:8,SEQ IDNO:10或SEQ ID NO:12(更优选由其组成)。

本发明的核苷酸序列编码包含SEQ ID NO：1的多肽。

术语“核苷酸序列”和“核酸”在本文中同义使用。优选地，核苷酸序列是DNA序列。

本发明提供了一种产生具有轻链和重链的单链(工程化的)梭菌神经毒素蛋白的方法，所述方法包括在合适的宿主细胞中表达本文所述的核酸、裂解所述宿主细胞以提供包含单链(工程化的)梭菌神经毒素蛋白的宿主细胞匀浆、和分离单链(工程化的)梭菌神经毒素蛋白。一方面，本发明提供了一种将本发明的(工程化的)梭菌神经毒素蛋白水解加工成相应的双链梭菌神经毒素的方法，所述方法包括使(工程化的)梭菌神经毒素与蛋白酶(优选内肽酶，例如肠激酶或因子Xa)接触，从而产生双链梭菌神经毒素(例如，其中轻链和重链通过二硫键连接在一起)。

因此，本发明提供了通过本发明的方法可获得的双链梭菌神经毒素。

如本文所使用的术语“可获得的”还涵盖术语“获得的”。在一个实施方案中，术语“可获得的”是指获得的。

本发明的梭菌神经毒素适合在药物或化妆品中使用。在使用中，梭菌神经毒素优选为双链形式。

本发明的(工程化的)梭菌神经毒素可用于预防或治疗某些医学或美容疾病和病症。因此，在另一方面，本发明提供了如上所述的(工程化的)梭菌神经毒素，其用于医学中。

在相关方面，本发明提供了如上所述的(工程化的)梭菌神经毒素，其用于预防或治疗选自以下的疾病或病症：与不想要的免疫分泌相关的病症、斜视、眼睑痉挛、斜眼、肌张力障碍(例如痉挛性肌张力障碍、口下颌肌张力障碍、局灶性肌张力障碍、迟发性肌张力障碍、喉肌张力障碍、肢体肌张力障碍、颈肌张力障碍)、斜颈(例如痉挛性斜颈)、受益于细胞/肌肉失能(通过SNARE下调或失活)的美容治疗(美容)应用、眼球运动的神经肌肉疾患或病症(例如，共同性斜视、垂直斜视、外侧直肌麻痹、眼球震颤、甲状腺机能障碍性肌病)、书写痉挛、睑痉挛、磨牙症、威尔逊氏病、震颤、抽动、部分性肌阵挛、痉挛、由于慢性多发性硬化症的强直状态、强直状态导致的膀胱控制异常、animus、背部痉挛、肌肉痉挛(charleyhorse)、紧张性头痛、提肌盆腔综合征、脊柱裂、迟发性运动障碍、帕金森氏病、口吃、半面肌痉挛、眼睑疾患、脑瘫、局灶性强直状态、痉挛性结肠炎、神经源性膀胱功能障碍、肛门痉挛、肢体强制、抽动、震颤、磨牙症、肛裂、弛缓不能、吞咽困难、流泪、多汗、流涎过多、胃肠道分泌过多、肌肉疼痛(例如，肌肉痉挛引起的疼痛)、头痛(例如，紧张性头痛)、额头皱纹、皮肤皱纹、癌症、子宫疾患、泌尿生殖器疾患、泌尿生殖神经系统疾患、慢性神经源性炎症和平滑肌疾患。

当本发明的(工程化的)梭菌神经毒素包含BoNT/X序列(或其部分)时，由于其裂解VAMP4、VAMP5和/或Ykt6的能力，所述梭菌神经毒素可能能够靶向除神经元以外的其他类型的分泌细胞。在一些实施方案中，靶向的分泌细胞是分泌免疫细胞。如本文所用，“分泌免疫细胞”是指分泌细胞因子、趋化因子或抗体的免疫细胞。此类分泌免疫细胞可以是固有免疫细胞，包括但不限于天然杀伤细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞和树突细胞。分泌抗体的分泌免疫细胞(例如白细胞)也可以被本发明的梭菌神经毒素靶向。抗体分泌细胞的非限制性示例包括但不限于血浆B细胞、浆细胞(plasmocytes)、浆细胞(plasmacytes)和效应B细胞。在一些实施方案中，梭菌神经毒素可调节免疫应答。因此，本文进一步考虑了本发明的梭菌神经毒素在治疗与不想要的分泌，优选与不想要的免疫分泌相关的病症中的治疗用途。与不想要的免疫分泌相关的病症包括但不限于：炎症、牛皮癣、过敏、噬血细胞淋巴组织细胞增生和酒精性胰腺疾病。

一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含本发明的(工程化的)梭菌神经毒素或双链梭菌神经毒素以及药学上可接受的载体、赋形剂、佐剂、推进剂和/或盐。

本发明的(工程化的)梭菌神经毒素可以配制用于口服、肠胃外、持续输注、吸入或局部应用。适合注射的组合物可以是溶液、悬浮液或乳液或干粉的形式，所述干粉在使用前溶解或悬浮在合适的载剂中。

在(工程化的)梭菌神经毒素被局部递送的情况下，(工程化的)梭菌神经毒素可以配制成乳膏(例如用于局部应用)或用于皮下注射。

局部递送装置可包括气溶胶或其他喷雾剂(例如雾化器)。在这方面，(工程化的)梭菌神经毒素的气溶胶制剂能够递送至肺和/或其他鼻和/或支气管或气道通道。

本发明的(工程化的)梭菌神经毒素可以通过鞘内或硬膜外注射，在涉及受影响器官的神经分布的脊柱节段的水平，在脊柱内施用于患者。

优选的施用途径是通过腹腔镜和/或局部注射，特别是肌内注射施用。

本发明的(工程化的)梭菌神经毒素的施用剂量范围是产生期望的治疗效果的剂量范围。应当理解，所需的剂量范围取决于(工程化的)梭菌神经毒素或组合物的确切性质、施用途径、制剂性质、患者的年龄、患者病症的性质、程度或严重性、禁忌症(如果有)和主治医师的判断。可以使用优化的标准经验程序调整这些剂量水平的变化。

合适的日剂量(每千克患者体重)在0.0001-1ng/kg的范围内，优选0.0001-0.5ng/kg，更优选0.002-0.5ng/kg，特别优选0.004-0.5ng/kg。单位剂量可以从少于1皮克到30ng不等，但通常在每剂0.01ng到1ng的范围内，可以每天施用，或优选以更低的频率施用，例如每周或每月六次施用。

一种特别优选的给药方案是基于0.05ng(工程化的)梭菌神经毒素作为1X剂量。在这方面，优选剂量范围是1X–100X(即0.05-5ng)。

通常利用(工程化的)梭菌神经毒素和无热原的无菌载剂制备液体剂型。根据使用的载剂和浓度，(工程化的)梭菌神经毒素可以溶解或悬浮在载剂中。在制备溶液时，可以将(工程化的)梭菌神经毒素溶解在载剂体中，如有必要，可通过添加氯化钠使溶液等渗，并使用无菌技术通过无菌过滤器过滤灭菌，然后填充到合适的无菌小瓶或安瓿瓶中并密封。或者，如果溶液的稳定性足够，则可以通过高压灭菌对密封容器中的溶液进行灭菌。有利地，可以将添加剂溶解在载剂中，所述添加剂例如为缓冲剂、增溶剂、稳定剂、防腐剂或杀菌剂、助悬剂或乳化剂和/或局部麻醉剂。

通过使用无菌技术在无菌区域将预先灭菌的成分填充到无菌容器中，可以制备干粉，以在使用前溶解或悬浮在合适的载剂中。可替代地，可以使用无菌技术在无菌区域中将成分溶解到合适的容器中。然后将产品冷冻干燥，并将容器无菌密封。

以基本上相同的方式制备适合于肌内、皮下或皮内注射的肠胃外混悬剂，不同之处在于将无菌组分悬浮在无菌载剂体中，而不是溶解，并且不能通过过滤来实现灭菌。可以以无菌状态分离组分，或者可选地，可以在分离后例如通过γ辐射将其灭菌。

有利地，在一种或多种组合物中包括助悬剂，例如聚乙烯吡咯烷酮，以促进组分的均匀分布。

根据本发明的施用可以利用多种递送技术，包括微粒包封、病毒递送系统或高压喷雾撞击。

与本发明的各种方法有关的实施方案旨在等同地应用于其他方法、梭菌神经毒素，例如工程化的梭菌神经毒素(无论是单链还是双链形式)、用途或药物组合物，反之亦然。

多种序列比对方法中的任何都可以用于确定同一性百分比，包括但不限于全局方法、局部方法和混合方法，例如区段方法。确定同一性百分比的方案是本领域技术人员范围内的常规程序。全局方法从分子的开始到结束比对序列，并通过累加各个残基对的分数和通过施加空位罚分来确定最佳比对。非限制性方法包括，例如CLUSTAL W，参见例如JulieD.Thompson等人,CLUSTAL W:Improving the Sensitivity of Progressive MultipleSequence Alignment Through Sequence Weighting,Position-Specific Gap Penaltiesand Weight Matrix Choice,22(22)Nucleic Acids Research 4673-4680(1994)；和迭代改进，参见例如，Osamu Gotoh,Significant Improvement in Accuracy of MultipleProtein Sequence Alignments by Iterative Refinement as Assessed by Referenceto Structural Alignments,264(4)J.MoI.Biol.823-838(1996)。局部方法通过鉴定所有输入序列共有的一个或多个保守基序来比对序列。非限制性方法包括，例如火柴盒(Match-box)，参见例如Eric Depiereux and Ernest Feytmans,Match-Box:A Fundamentally NewAlgorithm for the Simultaneous Alignment of Several Protein Sequences,8(5)CABIOS501-509(1992)；Gibbs采样，参见例如C.E.Lawrence等人,Detecting SubtleSequence Signals:A Gibbs Sampling Strategy for Multiple Alignment,262(5131)Science 208-214(1993)；Align-M，参见，例如，Ivo Van WaIIe等人，Align-M-A NewAlgorithm for Multiple Alignment of Highly Divergent Sequences,20(9)Bioinformatics:1428-1435(2004)。

因此，通过常规方法确定序列同一性百分比。参见，例如，Altschul等人,Bull.Math.Bio.48:603-16,1986and Henikoff and Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915-19,1992。简而言之，如下所示，使用空位开放罚分10，空位延伸罚分1，以及Henikoff和Henikoff的“blosum 62”评分矩阵(同上)对两个氨基酸序列进行比对，以优化比对得分(氨基酸由标准的单字母代码表示)。

两个或更多个核酸或氨基酸序列之间的“序列同一性百分比”是该序列共有的相同位置数目的函数。因此，同一性％可以计算为相同核苷酸/氨基酸的数目除以核苷酸/氨基酸的总数，再乘以100。％序列同一性的计算也可以考虑需要引入以优化两个或更多个序列比对的空位的数目，以及每个空位的长度。可以使用本领域技术人员熟悉的特定数学算法(例如BLAST)进行序列比较和确定两个或多个序列之间的同一性百分比。

然后，百分比同一性计算为：

基本上同源的多肽的特征在于具有一个或多个氨基酸取代、删除或添加。这些变化优选是不重要的，即，保守的氨基酸取代(见下文)和不显著影响多肽折叠或活性的其他取代；小的删除，通常删除1至约30个氨基酸；和小的氨基或羧基末端延伸，例如氨基末端甲硫氨酸残基，最多约20-25个残基的小接头肽或亲和标签。

保守氨基酸取代

碱性：精氨酸

赖氨酸

组氨酸

酸性：谷氨酸

天冬氨酸

极性：谷氨酰胺

天冬酰胺

疏水性：亮氨酸

异亮氨酸

缬氨酸

芳香族：苯丙氨酸

色氨酸

酪氨酸

小的：甘氨酸

丙氨酸

丝氨酸

苏氨酸

甲硫氨酸

除20个标准氨基酸外，非标准氨基酸(例如4-羟基脯氨酸、6-N-甲基赖氨酸、2-氨基异丁酸、异缬氨酸和α-甲基丝氨酸)可以取代本发明多肽的氨基酸残基。有限数量的非保守氨基酸、不是由遗传密码子编码的氨基酸和非天然氨基酸可以取代多肽氨基酸残基。本发明的多肽还可以包含非天然存在的氨基酸残基。

非天然存在的氨基酸包括但不限于，反式-3-甲基脯氨酸、2,4-甲基-脯氨酸、顺式-4-羟基脯氨酸、反式-4-羟基脯氨酸、N-甲基甘氨酸、别苏氨酸、甲基苏氨酸、羟乙基半胱氨酸、羟乙基高半胱氨酸、硝基谷氨酰胺、高谷氨酰胺、哌啶酸、叔亮氨酸、正缬氨酸、2-氮杂苯丙氨酸、3-氮杂苯丙氨酸、4-氮杂苯丙氨酸和4-氟苯丙氨酸。用于将非天然存在的氨基酸残基并入蛋白质中的几种方法是本领域已知的。例如，可以使用体外系统，其中使用化学氨酰化的抑制子tRNA抑制无义突变。合成氨基酸和氨酰化tRNA的方法是本领域已知的。包含无义突变的质粒的转录和翻译是在无细胞系统中进行的，该系统包含大肠杆菌S30提取物以及可商购的酶和其他试剂。蛋白质通过色谱法纯化。参见，例如，Robertson等人,J.Am.Chem.Soc.113:2722,1991；Ellman等人,Methods Enzymol.202:301,1991；Chung等人,Science 259:806-9,1993；和Chung等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:10145-9,1993)。在第二种方法中，通过显微注射突变的mRNA和化学氨酰化的抑制子tRNA在非洲爪蟾卵母细胞中进行翻译(Turcatti等人,J.Biol.Chem.271:19991-8,1996)。在第三种方法中，在不存在待替代的天然氨基酸(例如，苯丙氨酸)和存在期望的非天然存在的氨基酸(例如，2-氮杂苯丙氨酸、3-氮杂苯丙氨酸、4-氮杂苯丙氨酸或4-氟苯丙氨酸)的情况下培养大肠杆菌细胞。将非天然存在的氨基酸并入多肽，代替其天然对应物。参见，Koide等人,Biochem.33:7470-6,1994。可通过体外化学修饰将天然存在的氨基酸残基转化为非天然存在的物质。化学修饰可以与定点诱变组合使用，以进一步扩大取代范围(Wynn andRichards,Protein Sci.2:395-403,1993)。

有限数量的非保守氨基酸、不是由遗传密码子编码的氨基酸、非天然存在的氨基酸和非天然氨基酸可以取代本发明多肽的氨基酸残基。

可以根据本领域已知的程序来鉴定本发明多肽中的必需氨基酸，例如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham and Wells,Science 244:1081-5,1989)。也可以通过结构的物理分析来确定生物相互作用的位点，如通过核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记等技术，结合假定的接触位点氨基酸突变来确定。参见，例如，de Vos等人,Science 255:306-12,1992；Smith等人,J.Mol.Biol.224:899-904,1992；Wlodaver等人,FEBS Lett.309:59-64,1992。还可以从与本发明多肽的相关组分(例如易位或蛋白酶组分)的同源性分析中推断出必需氨基酸的鉴定。

可以使用诱变和筛选的已知方法进行多种氨基酸取代，并进行测试，例如Reidhaar-Olson and Sauer(Science 241:53-7,1988)或Bowie and Sauer(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:2152-6,1989)中公开的那些方法。简而言之，这些作者公开了同时使多肽中的两个或更多个位置随机化，选择功能性多肽，然后对诱变的多肽进行测序以确定每个位置上允许取代的光谱的方法。可以使用的其他方法包括噬菌体展示(例如，Lowman等人,Biochem.30:10832-7,1991；Ladner等人,美国专利号5,223,409；Huse,WIPO公开WO 92/06204)和区域定向诱变(Derbyshire等人,Gene 46:145,1986；Ner等人,DNA 7:127,1988)。

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。Singleton等人,DICTIONARY OF MICROBIOLOGY ANDMOLECULAR BIOLOGY,第20版,John Wiley and Sons,New York(1994),和Hale&Marham,THEHARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY,Harper Perennial,NY(1991)，为熟练的技术人员提供了本公开中使用的许多术语的通用词典。

本公开内容不受本文公开的示例性方法和材料的限制，并且与本文描述的那些方法或材料类似或等同的任何方法和材料都可以用于本公开内容的实施方案的实践或测试。数字范围包括定义范围的数字。除非另有说明，否则任何核酸序列都以5'至3'的方向从左至右书写；氨基酸序列分别以氨基至羧基的方向从左至右书写。

本文提供的标题不是对本公开的各个方面或实施方案的限制。

在本文中，使用氨基酸名称、三字母缩写或单字母缩写来指代氨基酸。如本文所用，术语“蛋白质”包括蛋白质、多肽和肽。如本文所用，术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白质”同义。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“肽”同义。在一些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“酶”同义。术语“蛋白质”和“多肽”在本文可互换使用。在本公开和权利要求中，可以使用氨基酸残基的常规单字母和三字母密码子。根据IUPACIUB生化命名联合委员会(JCBN)定义氨基酸的3个字母密码子。还应理解，由于遗传密码子的简并性，多肽可以被一个以上的核苷酸序列编码。

术语的其他定义可能在整个说明书中出现。在更详细地描述示例性实施方案之前，应当理解，本公开不限于所描述的特定实施方案，并因此可以变化。还应理解，本文中使用的术语仅出于描述具体实施方案的目的，而不旨在进行限制，因为本公开的范围仅由所附权利要求书限定。

在提供值的范围的情况下，应理解的是，除非上下文另外明确指出，否则在该范围的上限和下限之间、每个居中值至下限单位的十分之一，具体包括在本公开内。在指定范围内的任何指定值或居中值与该指定范围内的任何其他指定值或居中值之间的每个较小范围都包括在本公开中。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在该范围内或排除在该范围内，并且每个范围也包括在本公开内，其中包括在较小范围内的上下限之一、均不包括、或包括二者，以所述范围内的任何明确排除的限为准。在所述范围包括一个或两个限的情况下，排除那些包括的限中任一个或两个的范围也包括在本公开中。

必须注意的是，如本文和所附权利要求书中所使用的，单数形式的“一个”，“一种”和“该”包括复数指示物，除非上下文另外明确指出。因此，例如，提及“梭菌神经毒素”包括多种这样的候选试剂，并且提及“梭菌神经毒素”包括提及一种或多种梭菌神经毒素及本领域技术人员已知的其等同物，等等。

本文所讨论的出版物仅在本申请的提交日期之前提供其公开内容。本文中的任何内容均不应解释为承认此类出版物构成了所附权利要求的现有技术。

附图说明

现在将参考以下附图和实施例仅以举例的方式描述本发明的实施方案。

图1显示了所有BoNT血清型和破伤风毒素活化环的蛋白质序列的比较，其中具有两个侧翼半胱氨酸，形成连接毒素分子轻链和重链的二硫键。BoNT/C1和BoNT/CD中的因子Xa裂解位点(IDGR)用下划线标出。

图2显示了测试的所有四种蛋白酶：胰蛋白酶(TrypZean)、Lys-C、因子Xa(FXa)和肠激酶(EK)，与C-蛋白酶未经处理的对照相比，这四种蛋白酶具有裂解BoNT/C1活化环并产生双链分子的能力。(A,B)如在非还原(A)和还原条件(B)下通过SDS-PAGE检测所示，用因子Xa(FXa)、肠激酶(EK)和胰蛋白酶(1-16小时的时程)处理BoNT/C1(0)(SEQ ID NO:15)。类似地，通过Lys-C的蛋白水解消化产生BoNT/C1的双链分子(C)。胰蛋白酶和Lys-C均在BoNT/C1重链内显示脱靶裂解。1-基准(5ul)；2-对照样品(-LysC)–DTT；3-对照样品(-LysC)+DTT；4-活化–DTT；5-活化+DTT。

图3(A)显示了Lys-C对BoNT/X的裂解。在非还原和还原(+DTT)条件下测试样品。1-基准(5ul)；2-无蛋白酶对照；3-LysC 0.125μg/ml；4-LysC 0.25μg/ml；5-LysC 0.5μg/ml；6-LysC 1μg/ml；7-LysC 2μg/ml；8-LysC 4μg/ml；9-无蛋白酶对照+DTT；10-LysC 0.125μg/ml+DTT；11-LysC 0.25μg/ml+DTT；12-LysC 0.5μg/ml+DTT；13-LysC 1μg/ml+DTT；14-LysC2μg/ml+DTT；15-LysC 4μg/ml+DTT；和16-基准(5ul)。(B)显示了胰蛋白酶(TrypZean)、因子Xa和肠激酶对BoNT/X的裂解。在非还原和还原(+DTT)条件下测试样品。1-基准(5ul)；2-无蛋白酶对照；3-TrypZean 0.125μg/ml；4-TrypZean 0.25μg/ml；5-无蛋白酶对照；6-TrypZean 1μg/ml；7-TrypZean 2μg/ml；8-TrypZean 4μg/ml；9-因子Xa 5μg/ml；10-肠激酶0.01μg/ml；11-无蛋白酶对照+DTT；12-TrypZean 0.125μg/ml+DTT；13-TrypZean 0.25μg/ml+DTT；14-无蛋白酶对照+DTT；15-TrypZean 1μg/ml+DTT；16-TrypZean 2μg/ml+DTT；17-TrypZean 4μg/ml+DTT；18-因子Xa 5μg/ml；19-肠激酶0.01μg/ml；和20-基准(5ul)。

图4通过非还原(-DTT)和还原(+DTT)条件之间的比较，显示了用指定的蛋白酶处理的工程化的BoNT/X(SEQ ID NO：5)和成功的BoNT双链形成的证据。泳道4-7显示了加工中的样品。泳道8-11显示了最后的修正步骤后的最终样品。1-捕获HisHP上样；2-对照-DTT–蛋白酶；3-对照+DTT–蛋白酶；4-活化的-DTT+EK；5-活化的+DTT+EK；6-活化的-DTT+FXa；7-活化的+DTT+FXa；8-最终的-DTT EK活化的；9-最终+DTT EK活化的；10-最终-DTT Fxa活化的；11-最终+DTT FXa活化的

图5(A)显示了在37℃下使用来自产酶溶杆菌(Lysobacter enzymogenes)(“Lys-C”)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)(“rLys-C”)的10μg/ml胞内蛋白酶Lys-C测试BoNT/E 2h。在非还原和还原(+TCEP)条件下测试样品。(B)显示在20℃下用指定量的胰蛋白酶处理BoNT/E 7小时。(C)在-20℃储存的样品。(T)在20℃下无蛋白酶的对照。在还原(+DTT)条件下测试样品。

图6通过非还原(-DTT)和还原(+DTT)条件之间的比较，显示了用指定的蛋白酶处理的工程化的BoNT/E(SEQ ID NO:11)和成功的BoNT双链形成的证据。1-基准(5ul)；2-对照样品(–EK)–DTT；3-对照样品(–EK)+DTT；4-活化的(+EK)–DTT；5-活化的(+EK)+DTT；6-基准(5ul)；7-对照样品(–FXa)–DTT；8-对照样品(–FXa)+DTT；9-活化的(+FXa)–DTT；10-活化的(+FXa)+DTT。

图7(A)通过非还原(-DTT)和还原(+DTT)条件之间的比较，显示了用因子Xa蛋白酶处理的工程化的BoNT/A1C1(SEQ ID NO:13)和成功的BoNT双链形成的证据。1-基准标记；2-对照(-FXa–DTT)；3-对照(-FXa+DTT)；4-活化的(+FXa-DTT)；5-活化的(+FXa+DTT)。(B)显示了用FXa或EK裂解BoNT/A1 2小时后与阳性对照(二链BoNT/A1)的对比。

图8显示了BoNT/A1C1和BoNT/C1剂量依赖性抑制谷氨酸从原代大鼠神经元中的释放。

图9显示了非还原的被肠激酶活化的工程化BoNT/E(SEQ ID NO：11)的完整质量分析，指示质量为143853Da。

图10显示了还原的被肠激酶活化的工程化BoNT/E(SEQ ID No：11)的不完整质量分析，指示质量为47518Da和96338Da。

图11显示了非还原的被因子Xa活化的工程化BoNT/E(SEQ ID NO：11)的完整质量分析，指示质量为143850Da。

图12显示了还原的被因子Xa活化的工程化BoNT/E(SEQ ID No：11)的完整质量分析，指示质量为47518Da和96335Da。

图13显示了包含插入到活化环中的EK裂解位点，并用EK处理的LH

图14显示了用FXa活化工程化的BoNT/XA(SEQ ID NO：7)。

图15显示了用FXa活化工程化的BoNT/XB(SEQ ID NO：9)。

在任何以下SEQ ID NO中指示初始Met氨基酸残基或相应的初始密码子时，所述残基/密码子是任选的。

Cys-(Xaa)

CHKAIDGRSLYNKTLDC

CHKAIEGRSLYNKTLDC

IDGR

IEGR

CKSVRAPGIC

CLRLTKNSRDDSTC

CKNIVSVKGIRKSIC

实施例

·5ml HiTrap Butyl HP(GE#:28411005)

·5ml HiTrap Q HP(GE#:17-1154-01)

·5ml HiTrap苯基HP色谱柱(GE#17-5195-01)

·CHT II型色谱柱(Biorad#7324756)

·TrypZean(Sigma#T3568)

·Lys-C(Sigma#000000011047825001)

·肠激酶，轻链(NEB#P8070)

·因子Xa(NEB#P8010)

·ACQUITY UPLC蛋白BEH C4色谱柱(Waters#186004495)

大肠杆菌BL21(DE3)或NiCo(DE3)(NEB)用于蛋白质表达。一般而言，将细菌在37℃下培养直至诱导，温度降至16℃，并用1mM IPTG过夜诱导蛋白表达。

通过超声处理，在裂解缓冲液(50mM Tris-HCl pH＝8)中破坏细菌沉淀，并通过离心澄清。将硫酸铵浓度调节至1.3M，并使用丁基HP树脂(GE)捕获靶蛋白。将含有靶蛋白的级分脱盐，然后上样至Q HP树脂(GE)。纯化的蛋白质在4℃下用6μg/1mg的BoNT因子Xa(NEB)过夜活化，然后使用苯基HP树脂(GE)进行修正。

通过超声处理，在裂解缓冲液(100mM磷酸钠pH＝7.8；100mM NaCl)中破坏细菌沉淀，并通过离心澄清。将硫酸铵浓度调节至1.25M，并使用丁基HP树脂(GE)捕获靶蛋白。将含有靶蛋白的级分脱盐，然后上样至Q HP树脂(GE)。纯化的蛋白质在4℃下用5μg/1mg BoNT因子Xa(NEB)或80U/ml肠激酶(NEB)过夜活化，然后使用CHT II型树脂(Biorad)进行修正。

通过超声处理，在裂解缓冲液(50mM Tris-HCl pH＝8，500mM NaCl)中破坏细菌沉淀，并通过离心澄清。使用HisTrap HP色谱柱(GE)捕获靶蛋白。将含有靶蛋白的级分脱盐，然后上样至Q HP树脂(GE)。纯化的蛋白质在4℃下用5μg/1mg BoNT因子Xa(NEB)或80U/1mgBoNT肠激酶(NEB)过夜活化，然后使用1ml HisTrap色谱柱(GE)进行修正。

在分析之前，将样品缓冲液交换至50mM碳酸氢铵中。样品为完整蛋白，或通过与10mM DTT在37℃孵育30分钟还原。使用Waters Acquity H-Class UPLC系统与Waters XevoG2-XS QToF质谱仪组合对样品进行测试。

·流动相A，0.1％甲酸的水溶液

·流动相B，0.1％甲酸的乙腈溶液

·色谱柱：ACQUITY UPLC蛋白BEH C4(Waters)

失活的BoNT/C1(0)(SEQ ID NO：15)与一组蛋白酶孵育：胰蛋白酶、Lys-C、肠激酶和因子Xa。所有蛋白酶均显示在活化环内裂解。在4℃和25℃下用肠激酶(EK)或因子Xa(FXa)过夜消化BoNT/C1(0)(SEQ ID NO：15)。此外，BoNT/C1(0)在20℃下被胰蛋白酶消化16小时的时程(图2A，B)。与蛋白酶未处理的对照相比，所有三种蛋白酶均可裂解BoNT/C1活化环并产生双链分子。但是，在胰蛋白酶和Lys-C消化后，还可以看到其他裂解产物。

部分纯化的野生型BoNT/X-10HT(SEQ ID NO：34)在4℃下与递增量的胰蛋白酶(TrypZean)和Lys-C，以及因子Xa(FXa)和肠激酶(EK)过夜孵育。

图3显示野生型BoNT/X被Lys-C(图3A)和胰蛋白酶(图3B，泳道12-13和15-17)完全降解。值得注意的是，FXa和EK不能将蛋白质裂解成双链形式(分别为图3B的泳道18和19)。

为了改善BoNT/X的活化，将BoNT/X活化环用BoNT/C1活化环(SEQ ID No：2)代替，产生工程化的BoNT蛋白SEQ ID NO：5。使用几个色谱步骤纯化工程化的BoNT，并用肠激酶(EK)或因子Xa(FXa)处理，以验证存在可产生双链分子的BoNT/C环。出人意料的是，图4显示EK和FXa特异地将工程化的BoNT/X裂解为双链形式。

用Lys-C和胰蛋白酶(TryZean)裂解野生型BoNT/E。图5A显示Lys-C不正确地裂解/降解BoNT/E。用胰蛋白酶处理导致BoNT/E截短，这意味着需要额外的纯化步骤以从截短产物中分离全长蛋白(图5B)。

为了改善BoNT/E的活化，将BoNT/E活化环用BoNT/C1活化环(SEQ ID No：2)代替，产生工程化的BoNT蛋白SEQ ID NO：11。使用几个色谱步骤纯化工程化的BoNT，并用肠激酶(EK)或因子Xa(FXa)处理，以验证存在可产生双链分子的BoNT/C环。出人意料的是，图6显示EK和FXa特异地将工程化的BoNT/E裂解为双链形式。

将BoNT/C环引入BoNT/A1C1嵌合体(带有C1 H

用实施例4的含有BoNT/C1活化环的BoNT/A1C1(SEQ ID No:13)和纯化的重组BoNT/C1(SEQ ID NO:17)处理大鼠原代皮质神经元24h。孵育后，测量从氯化钾刺激的细胞中释放的SNARE依赖性谷氨酸(图8)。这些数据证实了修饰的包括BoNT/C1活化环的梭菌神经毒素的活性。

用肠激酶或因子Xa蛋白酶活化含有BoNT/C1环的纯化的BoNT/E(SEQ ID NO：11)，并与10mM DTT孵育以还原二硫键并分离轻链和重链。在还原和非还原的工程化BoNT/E(SEQID No：11)样品上进行完整蛋白质量的液相色谱-质谱分析，以绘制两种蛋白酶的裂解位点。两种蛋白酶均裂解BoNT/E，产生相同大小的轻链和重链，表明肠激酶和因子Xa在相同位点裂解(表1)。

表1在C环内的IDGR↓SL位点裂解后，工程化的BoNT/E(SEQ ID NO：11)的预测质量和测量质量的比较。重链质量表明肠激酶和因子Xa均在预测位点裂解。

BoNT/C1活化环是唯一的包含天然存在的裂解位点的BoNT活化环，所述裂解位点对蛋白酶FXa(以及令人惊讶地，EK)具有位点特异性(参见图1)。所有其他环均被非特异性蛋白酶(例如胰蛋白酶或Lys-C)裂解。Lys-C和胰蛋白酶的裂解通常导致不希望的蛋白质截断，因为裂解位点由蛋白酶的可及性确定，而不是由特定的识别序列确定。

来自不同血清型的天然活化环进化，以允许蛋白酶的可及性，并通过梭菌将毒素加工成双链形式。不希望受理论的束缚，据信突变这些环以产生蛋白酶识别位点可导致构象变化，这可对裂解效率产生负面影响。

为了检验该假设，将具有BoNT/A1轻链和易位结构域(LH

制备了包含BoNT/X的轻链和易位结构域、BoNT/A1的结合结构域以及BoNT/C1活化环的BoNT/XA嵌合体(SEQ ID NO：7)。图14显示，经FXa活化后，产生了工程化的BoNT/XA嵌合体的双链形式。

制备了包含BoNT/X的轻链和易位结构域、BoNT/B的结合结构域以及BoNT/C1活化环的BoNT/XB嵌合体(SEQ ID NO：9)。图15显示，经FXa活化后，产生了工程化的BoNT/XB嵌合体的双链形式。

以上说明书中提及的所有出版物均通过引用并入本文。在不脱离本发明的范围和主旨的情况下，本发明所描述的方法和系统的各种修改和变化对本领域技术人员将是显而易见的。尽管已经结合特定的优选实施方案描述了本发明，但是应当理解，所要求保护的发明不应不适当地限于这样的特定实施方案。实际上，对于生物化学和生物技术或相关领域的技术人员而言，对描述的用于执行本发明的方式进行各种修改，使其落入以下权利要求的范围内，是显而易见的。