包含对称的被修饰的反向末端重复序列的被修饰的封闭端DNA(CEDNA)

本申请要求2018年11月9日提交的第62/757,872号美国临时申请以及2018年11月9日提交的第62/757,892号美国临时申请的优先权，所述临时申请中的每一个的内容特此以全文引用的方式并入本文中。

技术领域

本发明涉及基因疗法领域，包括将封闭式DNA调控开关递送到目标细胞、组织、器官或生物体。

本申请的序列表已经通过EFS-Web以ASCII格式的序列表电子提交，文件名为“05320Sequence_Listing.txt”，创建日期为2019年11月8日并且大小为204KB(209,626字节)。本申请含有序列表，所述序列表已以电子方式提交并且特此以全文引用的方式并入。

背景技术

基因疗法旨在改善患有因基因表达谱畸变引起的基因突变或获得性疾病的患者的临床结局。基因疗法包括治疗或预防因可能导致病症、疾病、恶性病等的缺陷基因或异常调节或表达，例如表达不足或过表达所引起的医学病状。举例来说，可以通过向患者递送矫正性遗传物质，使得所述遗传物质在患者体内发生治疗性表达来治疗、预防或改善由缺陷基因引起的疾病或病症。基因疗法的基础是提供具有活性基因产物(有时称为转基因)的转录盒，所述活性基因产物例如可以产生正功能获得性作用、负功能损失性作用或其它结局，如溶瘤作用。基因疗法也可以用于治疗由其它因素引起的疾病或恶性病。人类单基因病症可以通过将正常基因递送给目标细胞并表达来治疗。矫正基因在患者目标细胞中的递送和表达可以通过多种方法进行，包括使用工程化病毒和病毒基因递送载体。在许多可用的病毒来源载体(例如重组逆转录病毒、重组慢病毒、重组腺病毒等)当中，重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus；rAAV)作为基因疗法中的多用途载体越来越受到欢迎。然而，随着技术改进，并且实现高效的基因转移和表达，在时间和空间水平上调节此类表达的能力变得越来越重要。

腺相关病毒(AAV)属于细小病毒科，并且更具体地说，组成依赖病毒属。AAV基因组由线性单链DNA分子构成，所述分子含有大致4.7千碱基(kb)并且由编码非结构性Rep(复制)和结构性Cap(衣壳)蛋白的两个主要开放阅读框(open reading frame；ORF)组成。在cap基因内鉴定出第二个ORF，其编码装配激活蛋白(assembly-activating protein；AAP)。侧接AAV编码区的DNA是两个顺式作用的反向末端重复(ITR)序列，长度大致为145个核苷酸，具有间断的回文序列，所述回文序列可以折叠成能量稳定的发夹结构，起到DNA复制引物的功能。通常，野生型序列相同但相对于彼此反转。除了它们在DNA复制中的作用外，ITR序列还展示参与病毒DNA整合到细胞基因组中、从宿主基因组或质粒中拯救，以及将病毒核酸衣壳化为成熟的病毒粒子(Muzyczka,(1992)《微生物学与免疫学的当前课题(Curr.Top.Micro.Immunol.)》158:97-129)。

源自AAV的载体(即重组AAV(rAVV)或AAV载体)对于递送遗传物质具有吸引力，因为(i)它们能够感染(转导)多种多样的非分裂和分裂细胞类型，包括肌细胞和神经元；(ii)它们缺乏病毒结构基因，从而减弱了宿主细胞对病毒感染的应答，例如干扰素介导的应答；(iii)野生型病毒被认为在人类中是非致病性的；(iv)与能够整合到宿主细胞基因组中的野生型AAV相比，复制缺陷型AAV载体缺乏rep基因，并且通常作为附加体存留，从而限制了插入诱变或基因毒性的风险；以及(v)与其它载体系统相比，AAV载体通常被认为是更小的免疫原，并且因此不会触发明显的免疫应答(参见ii)，因而获得了载体DNA的持久性以及治疗性转基因的潜在长期表达。AAV载体还可以高滴度地产生和配制，并通过动脉内、静脉内或腹膜内注射来递送，从而在啮齿动物(Goyenvalle等人,2004；Fougerousse等人,2007；Koppanati等人,2010；Wang等人,2009)和犬中允许通过单次注射对重要肌肉区域进行载体分布和基因转移。在一项治疗脊椎型肌营养不良症1型的临床研究中，以靶向大脑为目的全身性递送AAV载体，产生明显的临床改善。

然而，使用AAV粒子作为基因递送载体存在几个主要缺陷。与rAAV相关的一个主要缺点是其病毒包装容量有限，为约4.5kb的异源DNA(Dong等人,1996；Athanasopoulos等人,2004；Lai等人,2010)。结果，AAV载体的用途被限制在少于150,000Da蛋白质编码容量上。第二个缺点是，由于人群中野生型AAV感染盛行，所以必须筛查rAAV基因疗法候选者中从患者消除所述载体的中和抗体的存在。第三个缺点与衣壳免疫原性有关，所述免疫原性阻止了对未从初始治疗中排除的患者进行再施用。患者的免疫系统可以对有效充当“强化”注射的所述载体作出应答，以刺激免疫系统产生高滴度的抗AAV抗体，从而杜绝了进一步治疗。最近的一些报告指出在高剂量情况下对免疫原性的顾虑。另一个值得注意的缺点是，鉴于在异源基因表达之前必须将单链AAV DNA转化为双链DNA，所以AAV介导的基因表达的启动相对较慢。尽管已经尝试通过构建双链DNA载体来规避这个问题，但这个策略进一步限制了可以整合到AAV载体中的转基因表达盒的大小(McCarty,2008；Varenika等人,2009；Foust等人,2009)。

另外，通过引入一种或多种含有AAV基因组、rep基因和cap基因的质粒，产生具有衣壳的常规AAV病毒粒子(Grimm等人,1998)。在以反式引入这些辅助质粒后，就从宿主基因组“拯救”(即释放并随后扩增)了AAV基因组，并进一步衣壳化(病毒衣壳)以产生生物活性AAV载体。然而，发现此类衣壳化AAV病毒载体转导某些细胞和组织类型的效率低。衣壳还诱导免疫应答。

因此，腺相关病毒(AAV)载体在基因疗法中的使用受到限制是由于某些患者中的现有免疫性；对尚未免疫的患者的单次施用(因患者的免疫应答之故)；由于相关AAV衣壳的病毒包装容量极低(约4.5kb)而使得适用于在AAV载体中递送的转基因遗传物质的范围有限；以及AAV介导的缓慢基因表达。因患者之间的变异性无法通过在同基因小鼠模型或其它模型物种中的剂量反应来预测，从而进一步阻碍了rAAV临床基因疗法的应用。

重组无衣壳AAV载体可以作为分离的线性核酸分子获得，所述线性核酸分子包含侧接有两个野生型AAV反向末端重复序列(ITR)的可表达的转基因和启动子区，所述反向末端重复序列包括Rep结合位点和末端解链位点(terminal resolution site)。这些重组AAV载体缺乏AAV衣壳蛋白编码序列，并且可以是一端或两端通过两个野生型ITR回文序列共价连接的单链、双链或双螺旋体(例如WO2012/123430、美国专利9,598,703)。其避免了AAV介导的基因疗法的许多问题，因为转基因容量高得多，转基因表达起始快速，并且其缺乏通常引起那些载体的免疫性和快速清除的基于AAV的载体的属性。然而，转基因的恒定表达可能并非在所有情况下都是合乎需要的。

仍存在对具有改良的产生和/或表达特性的可控制重组DNA载体的至关重要的未满足的需求。

发明内容

本公开大体上提供具有共价封闭端的非病毒无衣壳DNA载体(在本文中称为“封闭式DNA载体”或“ceDNA载体”)。本文所描述的ceDNA载体为无衣壳的线性双螺旋DNA分子，其由具有共价封闭端的互补DNA(线性、连续和非衣壳化结构)的连续链形成，其包含相同但彼此反向互补的5'反向末端重复(ITR)序列和3'ITR序列，即所述序列为对称或大体上对称的。根据一些实施例，ceDNA载体包含至少一个可操作地安置于两个侧接反向末端重复序列(ITR)之间的异源核苷酸序列，其中所述异源核苷酸序列的全部或一部分处于至少一个调控开关的控制下。在其它实施例中，本文所描述的技术涉及含有两个经修饰的AAV反向末端重复序列(ITR)的ceDNA载体，其中经修饰的ITR相对于彼此对称并且侧接可表达的转基因。本文公开的ceDNA载体可以在真核细胞中产生，因此在昆虫细胞中没有原核DNA修饰和细菌内毒素污染。

在一个方面，非病毒无衣壳DNA载体优选地为线性双螺旋分子，并且可从载体多核苷酸获得，所述载体多核苷酸编码可操作地安置于两个对称的经修饰的反向末端重复序列(例如，mod-ITR)(例如，AAV ITR)之间的异源核酸。也就是说，两个ITR具有相同序列，但彼此为反向互补序列(反向)。在替代实施例中，经修饰的ITR对如本文所定义是大体上对称的，即，经修饰的ITR对可以具有不同的序列，但具有相应或相同的对称三维形状。举例来说，一个经修饰的ITR可以来自一个血清型，而另一个经修饰的ITR来自不同的血清型，但其在相同区域具有相同的突变(例如核苷酸插入、缺失或取代)。换句话说，仅出于说明目的，5'mod-ITR可以来自AAV2并在C区中具有一个缺失，而3'mod-ITR可以来自AAV5并在C'区中具有相应的缺失，并且倘若5'mod-ITR和3'mod-ITR具有相同或对称的三维空间组构，那么其作为经修饰的ITR对涵盖用于本文中。

在一些实施例中，相对于来自相同AAV血清型的野生型ITR序列，经修饰的ITR对包含缺失、插入或取代中的至少一种或任何组合。对称ITR中的添加、缺失或取代是相同的，但彼此反向互补。举例来说，在5'ITR的C区中插入3个核苷酸将反映为在3'ITR的C'区中相应部分中插入3个反向互补核苷酸。仅出于说明目的，如果在5'ITR中添加AACG，那么在3'ITR中相应位点处添加CGTT。举例来说，如果5'ITR有义链是ATCGATCG，并且在G与A之间添加了AACG，那么产生序列ATCGAACGATCG。相应的3'ITR有义链是CGATCGAT(ATCGATCG的反向互补序列)，并且在T与C之间添加CGTT(即AACG的反向互补序列)，那么产生序列CGATCGTTCGAT(ATCGAACGATCG的反向互补序列)，即5'ITR修饰的镜像。在一些实施例中，经修饰的ITR包含末端解链位点和复制蛋白结合位点(RPS)(有时称为复制性蛋白结合位点)，例如Rep结合位点。在一些实施例中，经修饰的ITR不包含末端解链位点和/或复制蛋白结合位点(RPS)，例如Rep结合位点。

在一些实施例中，ceDNA载体包含：(1)表达盒，其包含顺式调控元件、启动子和至少一种转基因；或(2)启动子，其可操作地连接到至少一种转基因；以及(3)侧接所述表达盒的两个自互补对称序列，例如对称的经修饰的ITR，其中ceDNA载体不与衣壳蛋白相关。

在一个实施例中，ceDNA载体包含其它组分来调控转基因的表达，例如顺式调控元件和/或调控开关，其在本文中标题为用于控制和调控转基因的表达的“调控开关”的章节中更充分地描述，如调控开关，例如能够控制包含ceDNA载体的细胞的细胞死亡的杀灭开关。顺式调控元件包括(但不限于)：启动子、核糖开关、隔离子、mir可调控元件、转录后调控元件、组织和细胞类型特异性启动子以及增强子。在一些实施例中，ITR可以充当转基因的启动子。

在一些实施例中，两个自互补序列可以是来自任何已知的细小病毒，例如如AAV的依赖病毒(例如，AAV1-AAV12)的经修饰的ITR序列。可以使用任何AAV血清型，包括(但不限于)经修饰的AAV2 ITR序列，其除了允许发夹二级结构形成的可变回文序列外，还保留了Rep结合位点(RBS)，如5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'(SEQ ID NO:531)和末端解链位点(trs)。在一些实施例中，经修饰的ITR是合成ITR序列，其除了允许发夹二级结构形成的可变回文序列之外，还保留了功能性Rep结合位点(RBS)，如5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'(SEQ ID NO:531)和末端解链位点(TRS)。在一些实例中，ITR序列从野生型ITR(如AAV1、2、3、4、5、6、7、8、9和10、11以及12)的相应序列中保留了RBS、trs的序列以及Rep结合元件的结构和位置，形成ITR发夹二级结构中之一个的末端环部分。

用于包含对称经修饰的ITR的ceDNA载体中的示例性经修饰的ITR序列展示于本文表4中，其展示ITR对(经修饰的5'ITR和对称经修饰的3'ITR)。用于ceDNA载体中的示例性经修饰的ITR序列是选自经修饰的以下ITR对中的任何一个：SEQ ID NO:484(ITR-33左)与SEQID NO:469(ITR-18，右)；SEQ ID NO:485(ITR-34左)与SEQ ID NO:95(ITR-51，右)；SEQ IDNO:486(ITR-35左)与SEQ ID NO:470(ITR-19，右)；SEQ ID NO:487(ITR-36左)与SEQ IDNO:471(ITR-20，右)；SEQ ID NO:488(ITR-37左)与SEQ ID NO:472(ITR-21，右)；SEQ IDNO:489(ITR-38左)与SEQ ID NO:473(ITR-22右)；SEQ ID NO:490(ITR-39左)与SEQ ID NO:474(ITR-23，右)；SEQ ID NO:491(ITR-40左)与SEQ ID NO:475(ITR-24，右)；SEQ ID NO:492(ITR-41左)与SEQ ID NO:476(ITR-25右)；SEQ ID NO:493(ITR-42左)与SEQ ID NO:477(ITR-26右)；SEQ ID NO:494(ITR-43左)与SEQ ID NO:478(ITR-27右)；SEQ ID NO:495(ITR-44左)与SEQ ID NO:479(ITR-28右)；SEQ ID NO:496(ITR-45左)与SEQ ID NO:480(ITR-29，右)；SEQ ID NO:497(ITR-46左)与SEQ ID NO:481(ITR-30，右)；SEQ ID NO:498(ITR-47，左)与SEQ ID NO:482(ITR-31，右)；SEQ ID NO:499(ITR-48，左)与SEQ ID NO:483(ITR-32右)。

在一些实施例中，用于ceDNA载体中的示例性经修饰的ITR序列包含选自以下序列对的部分ITR序列：SEQ ID NO:101与SEQ ID NO:102；SEQ ID NO:103与SEQ ID NO:96；SEQID NO:105与SEQ ID NO:106；SEQ ID NO:545与SEQ ID NO:116；SEQ ID NO:111与SEQ IDNO:112；SEQ ID NO:117与SEQ ID NO:118；SEQ ID NO:119与SEQ ID NO:120；SEQ ID NO:121与SEQ ID NO:122；SEQ ID NO:107与SEQ ID NO:108；SEQ ID NO:123与SEQ ID NO:124；SEQ ID NO:125与SEQ ID NO:126；SEQ ID NO:127与SEQ ID NO:128；SEQ ID NO:129与SEQID NO:130；SEQ ID NO:131与SEQ ID NO:132；SEQ ID NO:133与SEQ ID NO:134；SEQ IDNO:547与SEQ ID NO:546，也展示于图6B-21B中。

在一些实施例中，ceDNA载体可以包含具有对应于2018年9月7日提交的PCT/US18/49996的表2、3、4、5、6、7、8、9或10A-10B中展示的ITR序列或ITR部分序列中的修饰中的任何一个的每个ITR中的修饰的ITR，其中如本文所定义侧接ITR序列是其对称的(例如，反向互补序列)或大体上对称的，即，具有对称3D空间组构。

作为示例性实例，本公开提供了一种封闭式DNA载体，其包含可操作地连接到转基因的启动子，具有或不具有调控开关，其中所述ceDNA不含衣壳蛋白并且：(a)由编码对称ITR的ceDNA质粒(例如，参见图1A-B)产生，其中每个经修饰的ITR在其发夹二级构型中均具有相同数目的分子内双螺旋碱基对(与这些参考序列相比，优选在这种构型中不包括任何AAA或TTT末端环的缺失)；以及(b)使用实例1中在天然凝胶和变性条件下通过琼脂糖凝胶电泳鉴定ceDNA的分析，被鉴定为ceDNA。

在一个实施例中，侧接经修饰的ITR大体上彼此对称。在这个实施例中，修饰是相同的，即添加、取代或缺失是相同的，但ITR不是相同的反向互补序列。在此类实施例中，经修饰的ITR对大体上对称，因为其具有对称的三维空间组构，但不具有相同的反向互补核苷酸序列。换句话说，在一些实施例中，来自mod-ITR对的ITR可以具有不同的反向互补核苷酸序列，但仍具有相同的对称三维空间组构，即两个ITR都具有产生相同的整体3D形状的突变。举例来说，mod-ITR对中的一个ITR(例如5'ITR)可以来自一种血清型，而另一个ITR(例如3'ITR)可以来自不同的血清型，但是，两种都可以具有相同的对应突变(例如，如果5'ITR在C区中具有缺失，那么来自不同血清型的同源修饰的3'ITR在C'区的对应位置处也具有缺失)，以使得经修饰的ITR对具有相同的对称三维空间组构。在此类实施例中，经修饰的ITR对中的每个ITR可以来自不同血清型(例如AAV1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12)，如AAV2与AAV6的组合，其中一个ITR中的修饰在来自不同血清型的同源ITR的对应位置得到反映。在一个实施例中，大体上对称的经修饰的ITR对是指一对经修饰的ITR(mod-ITR)，只要ITR之间的核苷酸序列的差异不影响特性或整体形状并且其在3D空间中具有大体上相同的形状即可。举例来说，如通过所属领域中熟知的标准方法，如默认设置下的BLAST(基本局部比对搜索工具)或BLASTN测定，mod-ITR与典型的mod-ITR具有至少95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性，并且还具有对称的三维空间组构，以使其3D结构在几何空间中的形状相同。大体上对称的mod-ITR对在3D空间中具有相同的A、C-C'和B-B'环，例如，如果大体上对称的mod-ITR对中的经修饰的ITR缺失C-C'臂，那么同源mod-ITR对应缺失C-C'环，并且还具有在其同源mod-ITR的几何空间中呈相同形状的剩余A和B-B'环的类似3D结构。

在一些实施例中，ITR的结构元件可以是参与ITR与较大Rep蛋白(例如Rep 78或Rep 68)的功能性相互作用的任何结构元件。在某些实施例中，结构元件为ITR与较大Rep蛋白的相互作用提供选择性，即，至少部分确定哪种Rep蛋白与ITR功能性相互作用。在其它实施例中，当Rep蛋白与ITR结合时，结构元件与较大Rep蛋白物理上相互作用。每个结构元件可以是例如ITR的二级结构、ITR的核苷酸序列、两个或更多个元件之间的间隔，或上述任一个的组合。在一个实施例中，结构元件选自以下组成的组：A和A'臂、B和B'臂、C和C'臂、D臂、Rep结合位点(RBE)和RBE'(即互补RBE序列)以及末端解链位点(trs)。

更确切地说，ITR可以在结构上进行修饰。举例来说，可以与ITR的野生型序列相比较来修饰结构元件的核苷酸序列。在一个实施例中，可以去除ITR的结构元件(例如A臂、A'臂、B臂、B'臂、C臂、C'臂、D臂、RBE、RBE'和trs)并用来自不同细小病毒的野生型结构元件替代。举例来说，替代结构可以来自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、蛇细小病毒(例如巨蟒细小病毒)、牛细小病毒、山羊细小病毒、禽类细小病毒、犬细小病毒、马细小病毒、虾细小病毒、猪细小病毒或昆虫AAV。举例来说，ITR可以是AAV2 ITR，并且A或A'臂或RBE可以用来自AAV5的结构元件替代。在另一个实例中，ITR可以是AAV5 ITR，并且C或C'臂、RBE和trs可以用来自AAV2的结构元件替代。在另一个实例中，AAV ITR可以是B和B'臂被AAV2 ITR B和B'臂替代的AAV5 ITR。

仅举例来说，表3指示在经修饰的ITR的区域中的至少一个核苷酸的示例性修饰(例如缺失、插入和/或取代)，其中X指示在所述部分中相对于对应野生型ITR的至少一个核酸的修饰(例如缺失、插入和/或取代)。在一些实施例中，在C和/或C'和/或B和/或B'的任何区域中的至少一个核苷酸的任何修饰(例如缺失、插入和/或取代)在至少一个末端环中保留三个连续的T核苷酸(即，TTT)。举例来说，如果修饰引起以下中任一种：单臂ITR(例如，单个C-C'臂或单个B-B'臂)或经修饰的C-B'臂或C'-B臂、或具有至少一个截断臂(例如截断的C-C'臂和/或截断的B-B'臂)的两臂ITR，那么至少所述单臂、或两臂ITR(其中一个臂可以是截断的)的至少一个臂在至少一个末端环中保留三个连续的T核苷酸(即TTT)。在一些实施例中，截断的C-C'臂和/或截断的B-B'臂在末端环中具有三个连续的T核苷酸(即TTT)。

本文所描述的技术进一步涉及可以递送和编码目标细胞中的一种或多种转基因的ceDNA载体，例如其中ceDNA载体包含多顺反子序列，或其中转基因和其天然基因组背景(例如转基因、内含子和内源性未翻译区)一起并入ceDNA载体中。转基因可以是蛋白质编码转录物、非编码转录物或这两种。ceDNA载体可以包含多个编码序列，和非典型翻译起始位点或超过一个启动子以表达蛋白质编码转录物、非编码转录物或这两种。转基因可以包含编码超过一种蛋白质的序列，或可以是非编码转录物的序列。表达盒可以包含例如超过4000个核苷酸、5000个核苷酸、10,000个核苷酸或20,000个核苷酸、或30,000个核苷酸、或40,000个核苷酸、或50,000个核苷酸，或在约4000-10,000个核苷酸或10,000-50,000个核苷酸之间的任何范围，或超过50,000个核苷酸。ceDNA载体不具有衣壳化AAV载体的大小限制，因此能够递送大尺寸的表达盒来提供有效的转基因表达。在一些实施例中，ceDNA载体缺乏原核生物特异性甲基化。

表达盒还可以包含内部核糖体进入位点(IRES)和/或2A元件。顺式调控元件包括(但不限于)：启动子、核糖开关、隔离子、mir可调控元件、转录后调控元件、组织和细胞类型特异性启动子以及增强子。在一些实施例中，ITR可以充当转基因的启动子。在一些实施例中，ceDNA载体包含调节转基因表达的其它组分。举例来说，其它调控组分可以是如本文公开的调控开关，包括(但不限于)在必要时可杀灭ceDNA感染的细胞的杀灭开关，以及其它诱导型和/或抑制型元件。

本文所描述的技术进一步提供使用ceDNA载体递送并且有效和选择性地表达一种或多种转基因的新颖方法。ceDNA载体能够被吸收到宿主细胞中，以及在缺乏AAV衣壳下被转运到细胞核中。另外，本文所描述的ceDNA载体没有衣壳，因此避免了可能对含衣壳的载体作出应答而产生的免疫应答。

本发明的方面涉及产生本文所描述的ceDNA载体的方法。其它实施例涉及通过本文提供的方法产生的ceDNA载体。在一个实施例中，无衣壳的非病毒DNA载体(ceDNA载体)是从质粒(在本文中称作“ceDNA-质粒”)获得，所述质粒包含含按这个次序的多核苷酸表达构建体模板：第一5'反向末端重复序列(例如，AAV ITR)；表达盒；以及3'ITR(例如，AAV ITR)，其中5'和3'ITR为相对于野生型ITR的经修饰的ITR，并且其中修饰相对于彼此是相同的，即，ITR相对于彼此是对称的(即，结构镜像)。

本文公开的ceDNA载体可通过普通技术人员在阅读本公开之后将会知道的许多手段获得。举例来说，用于产生本公开的ceDNA载体的多核苷酸表达构建体模板可以是ceDNA-质粒(例如，参见表7或图1B或6B)、ceDNA-杆粒和/或ceDNA-杆状病毒。在一个实施例中，ceDNA-质粒包含可操作地安置于ITR之间的限制性克隆位点(例如SEQ ID NO:7)，其中可以插入包含例如可操作地连接到转基因例如报道基因和/或治疗基因)的启动子的表达盒。在一些实施例中，ceDNA载体由多核苷酸模板(例如ceDNA-质粒、ceDNA-杆粒、ceDNA-杆状病毒)产生，所述多核苷酸模板含有侧接表达盒的经修饰的对称5'和3'ITR，其中与野生型AAV2或AAV3 ITR序列相比，所述修饰为缺失、插入和/或取代中的任何一个或多个。

在容许宿主细胞中，在例如Rep存在下，具有至少一个经修饰的ITR复制的多核苷酸模板以产生ceDNA载体。ceDNA载体产生经历两个步骤：首先，通过Rep蛋白从模板骨架(例如ceDNA-质粒、ceDNA-杆粒、ceDNA-杆状病毒基因组等)切除(“拯救”)模板，并且其次，切下的ceDNA载体进行Rep介导的复制。各种AAV血清型的Rep蛋白和Rep结合位点是所属领域的普通技术人员熟知的。普通技术人员理解基于至少一种功能性ITR从血清型中选择结合并复制核酸序列的Rep蛋白。举例来说，如果复制胜任型经修饰的ITR来自AAV血清型2，那么对应的Rep将来自与所述血清型一起工作的AAV血清型，如AAV2 ITR与AAV2或AAV4 Rep一起，而非AAV5 Rep，其不行。复制后，共价封闭式ceDNA载体继续在容许细胞中累积，并且ceDNA载体在Rep蛋白存在下在标准复制条件下优选随时间足够稳定，例如，累积达至少1pg/细胞、优选至少2pg/细胞、优选至少3pg/细胞、更优选至少4pg/细胞、甚至更优选至少5pg/细胞的量。

因此，本公开的一个方面涉及一种方法，其包含以下步骤：a)在Rep蛋白存在下，在有效并且持续足以诱导宿主细胞内ceDNA载体产生的时间的条件下培育携带多核苷酸表达构建体模板(例如ceDNA-质粒、ceDNA-杆粒和/或ceDNA-杆状病毒)的宿主细胞(例如昆虫细胞)群体，所述模板不含病毒衣壳编码序列，并且其中所述宿主细胞并不包含病毒衣壳编码序列；以及b)从宿主细胞中收获并分离ceDNA载体。Rep蛋白的存在诱导具有经修饰的ITR的载体多核苷酸复制，从而在宿主细胞中产生ceDNA载体。然而，没有表达病毒粒子(例如AAV病毒粒子)。因此，没有病毒粒子所施加的大小限制。

可以通过用在ceDNA载体上具有单个识别位点的限制酶消化从宿主细胞分离的DNA，并在变性和非变性凝胶上分析消化的DNA物质，以与线性和非连续DNA相比较确认线性和连续DNA的特征带的存在，从而确认从宿主细胞分离的ceDNA载体的存在。

根据一个方面，本公开提供一种具有共价封闭端的非病毒无衣壳DNA载体(ceDNA载体)，其中ceDNA载体包含至少一个可操作地安置于两个侧接对称反向末端重复序列(对称ITR)之间的异源核苷酸序列，其中所述对称ITR不是野生型ITR，并且每个侧接ITR具有相同的对称修饰。根据一个实施例，对称ITR序列是合成的。根据一些实施例，ITR选自表4中列出的那些中的任一个。根据一些实施例，对称ITR中的每一个由选自A、A'、B、B'、C、C'、D和D'的ITR区中的至少一个中的缺失、插入和/或取代来修饰。根据一些实施例，所述缺失、插入和/或取代使得通常由A、A'、B、B'、C或C'区所形成的茎-环结构的全部或一部分发生缺失。根据一些实施例，对称ITR由引起通常由B和B'区所形成的茎-环结构的全部或一部分的缺失发生缺失、插入和/或取代来修饰。根据一些实施例，对称ITR由引起通常由C和C'区所形成的茎-环结构的全部或一部分的缺失发生缺失、插入和/或取代来修饰。根据一些实施例，对称ITR由引起通常由B和B'区所形成的茎-环结构的一部分和/或通常由C和C'区所形成的茎-环结构的一部分的缺失发生缺失、插入和/或取代来修饰。根据一些实施例，对称ITR在通常包含由B和B'区所形成的第一茎-环结构以及由C和C'区所形成的第二茎-环结构的区域中包含单个茎-环结构。根据一些实施例，对称ITR在通常包含由B和B'区所形成的第一茎-环结构以及由C和C'区所形成的第二茎-环结构的区域中包含单个茎和两个环。根据一些实施例，对称ITR在通常包含由B和B'区所形成的第一茎-环结构以及由C和C'区所形成的第二茎-环结构的区域中包含单个茎和单个环。根据一些实施例，对称ITR为包含选自以下的核苷酸序列的经修饰的AAV2ITR：本文中的图7A-22B或表4中的ITR，以及与表4中所列或图7A-22B中所示的所述ITR具有至少95％序列一致性的ITR。根据一些实施例，异源核苷酸序列的全部或一部分处于至少一个调控开关的控制下。

根据另一方面，本公开提供一种具有共价封闭端的非病毒无衣壳DNA载体(ceDNA载体)，其中ceDNA载体包含至少一个可操作地安置于两个侧接野生型反向末端重复序列(WT-ITR)之间的异源核苷酸序列，其中所述异源核苷酸序列的全部或一部分处于至少一个调控开关的控制下。根据一些实施例，WT-ITR序列为对称WT-ITR序列或大体上对称的WT-ITR序列。根据一些实施例，WT-ITR序列选自表1中所示的WT-ITR的组合中的任一个。根据一些实施例，侧接WT-ITR与表1或表2中所列的ITR具有至少95％序列一致性，并且所有取代为不影响WT-ITR的结构的保守性核酸取代。根据一些实施例，至少一个调控开关选自表5或在本文中的标题为“调控开关”的章节中所列的调控开关中的任一个或组合。根据一些实施例，ceDNA载体在用在ceDNA载体上具有单个识别位点的限制酶消化并由天然和变性凝胶电泳二者分析时显示相比于线性和非连续DNA对照的线性和连续DNA的特征带。根据一些实施例，ITR序列基于来自选自以下的病毒的序列：细小病毒、依赖病毒和腺相关病毒(AAV)。根据一些实施例，ITR基于来自腺相关病毒(AAV)的序列。根据一些实施例，ITR基于来自选自以下的AAV血清型的序列：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和AAV12。根据一些实施例，载体处于纳米载剂中。根据一些实施例，纳米载剂包含脂质纳米粒子(LNP)。

根据方面的一些实施例和本文中的实施例，ceDNA载体是从包含以下步骤的方法获得：(a)在至少一种Rep蛋白存在下培育携带ceDNA表达构建体的昆虫细胞群体，其中所述ceDNA表达构建体在有效并且持续足以诱导所述昆虫细胞内ceDNA载体产生的时间的条件下编码ceDNA载体；以及(b)从昆虫细胞分离ceDNA载体。根据一些实施例，ceDNA表达构建体是选自ceDNA质粒、ceDNA杆粒和ceDNA杆状病毒。根据一些实施例，昆虫细胞表达至少一种Rep蛋白。根据一些实施例，至少一种Rep蛋白来自选自以下的病毒：细小病毒、依赖病毒和腺相关病毒(AAV)。根据一些实施例，至少一种Rep蛋白是来自选自以下的AAV血清型：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和AAV12。

根据一些实施例，本公开提供编码本文中的方面和实施例中的任一个的ceDNA载体的ceDNA表达构建体。根据一些实施例，构建体为ceDNA质粒、ceDNA杆粒或ceDNA杆状病毒。

根据一些实施例，本公开提供一种宿主细胞，其包含其中方面或实施例种的任一个中的ceDNA表达构建体。根据一些实施例，宿主细胞表达至少一种Rep蛋白。根据一些实施例，至少一种Rep蛋白来自选自以下的病毒：细小病毒、依赖病毒和腺相关病毒(AAV)。根据一些实施例，至少一种Rep蛋白是来自选自以下的AAV血清型：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和AAV12。根据一些实施例，宿主细胞为昆虫细胞。根据一些实施例，昆虫细胞为Sf9细胞。

根据一些实施例，本公开提供一种产生ceDNA载体的方法，其包含(a)在有效且持续足以诱导ceDNA载体产生的时间的条件下培育本文中的方面和实施例中的任一个中的宿主细胞；以及(b)从宿主细胞分离ceDNA。

根据一些实施例，本公开提供一种治疗、预防、改善、监测或诊断个体的疾病或病症的方法，所述方法包含：向有需要的个体施用包含本文中的方面和实施例中的任一个中的ceDNA载体的组合物，其中至少一个异源核苷酸序列经选择以治疗、预防、改善、诊断或监测所述疾病或病症。根据一些实施例，至少一个异源核苷酸序列在转录或翻译时矫正个体中的异常量的内源性蛋白。根据一些实施例，至少一个异源核苷酸序列在转录或翻译时矫正个体中的内源性蛋白或路径的异常功能或活性。根据一些实施例，至少一个异源核苷酸序列编码或包含选自以下组成的组的核苷酸分子：RNAi、siRNA、miRNA、lncRNA和反义寡核苷酸或多核苷酸。根据一些实施例，至少一个异源核苷酸序列编码蛋白质。根据一些实施例，蛋白质为标记蛋白(例如报道蛋白)。根据一些实施例，至少一个异源核苷酸序列编码与所述疾病或病症相关的内源性蛋白或路径的激动剂或拮抗剂。根据一些实施例，至少一个异源核苷酸序列编码抗体。根据一些实施例，所述疾病或病症选自以下组成的组：代谢疾病或病症、CNS疾病或病症、眼部疾病或病症、血液疾病或病症、肝病或病症、免疫疾病或病症、感染性疾病、肌肉疾病或病症、癌症以及基于基因产物的异常水平和/或功能的疾病或病症。根据一些实施例，所述代谢疾病或病症选自以下组成的组：糖尿病、溶酶体贮积症、粘多糖症、尿素循环疾病或病症以及糖原贮积病或病症。根据一些实施例，所述溶酶体贮积症选自以下组成的组：高雪氏病(Gaucher's disease)、庞贝病(Pompe disease)、异染性脑白质营养不良(metachromatic leukodystrophy)(MLD)、苯丙酮尿症(phenylketonuria)(PKU)和法布里病(Fabry disease)。根据一些实施例，所述尿素循环疾病或病症为鸟氨酸氨甲酰基转移酶(OTC)缺乏症。根据一些实施例，所述粘多糖症选自以下组成的组：斯莱综合征(Sly syndrome)、赫尔勒综合征(Hurler Syndrome)、沙伊综合征(Scheie Syndrome)、赫尔勒-沙伊综合征(Hurler-Scheie Syndrome)、亨特氏综合征(Hunter's Syndrome)、圣菲利波综合征(Sanfilippo Syndrome)、莫基奥综合征(Morquio Syndrome)和马-拉二氏综合征(Maroteaux-Lamy Syndrome)。根据一些实施例，所述CNS疾病或病症选自以下组成的组：阿尔茨海默氏病(Alzheimer's disease)、帕金森氏病(Parkinson's disease)、亨廷顿氏病(Huntington's disease)、卡纳万病(Canavan disease)、雷氏病(Leigh's disease)、雷夫叙姆病(Refsum disease)、妥瑞综合征(Tourette syndrome)、原发性侧索硬化(primarylateral sclerosis)、肌萎缩性侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis)、进行性肌萎缩、皮克氏病(Pick's disease)、肌营养不良症、多发性硬化、重症肌无力、宾斯旺格氏病(Binswanger's disease)、脊髓或头部损伤引起的创伤、泰-萨二氏病(Tay Sachsdisease)、莱施-尼汉病(Lesch-Nyan disease)、癫痫症(epilepsy)、脑梗塞(cerebralinfarct)、精神病症、精神分裂症(schizophrenia)、药物依赖、神经症(neuroses)、精神病、痴呆症、妄想症(paranoia)、注意缺陷障碍(attention deficit disorder)、睡眠障碍(sleep disorder)、疼痛障碍、进食障碍或体重失调，以及CNS的癌症和肿瘤。根据一些实施例，所述眼部疾病或病症选自以下组成的组：涉及视网膜、后束和/或视神经的眼科病症。根据一些实施例，涉及视网膜、后束和/或视神经的眼科病症选自以下组成的组：糖尿病性视网膜病变(diabetic retinopathy)、包括年龄相关性黄斑变性的黄斑变性、地图样萎缩和血管性或“湿性”黄斑变性、青光眼、葡萄膜炎、视网膜色素变性(retinitis pigmentosa)、斯塔加特病(Stargardt)、雷伯氏先天性黑蒙(Leber Congenital Amaurosis；LCA)、尤塞氏综合征(Usher syndrome)、弹力纤维性假黄瘤(pseudoxanthoma elasticum)(PXE)、X连锁视网膜色素变性(x-linked retinitis pigmentosa；XLRP)、X连锁视网膜劈裂症(x-linkedretinoschisis)(XLRS)、无脉络膜症(Choroideremia)、雷伯氏遗传性视神经病变(Leberhereditary optic neuropathy；LHON)、全色盲(Archomatopsia)、视锥-视杆细胞营养不良(cone-rod dystrophy)、富克斯角膜内皮营养不良(Fuchs endothelial cornealdystrophy)、糖尿病性黄斑水肿以及眼癌和肿瘤。根据一些实施例，所述血液疾病或病症选自以下组成的组：A型血友病、B型血友病、地中海贫血(thalassemia)、贫血和血癌。根据一些实施例，所述肝病或病症选自以下组成的组：进行性家族性肝内胆汁淤积症(progressive familial intrahepatic cholestasis；PFIC)和肝癌以及肿瘤。根据一些实施例，疾病或病症为囊性纤维化。根据一些实施例，ceDNA载体与药学上可接受的载剂组合施用。

根据一些实施例，本公开提供一种向个体递送治疗蛋白的方法，所述方法包含向个体施用包含本文中的方面和实施例中的任一个中的ceDNA载体的组合物，其中至少一个异源核苷酸序列编码治疗蛋白。根据一些实施例，治疗蛋白为治疗性抗体。根据一些实施例，治疗蛋白选自以下组成的组：酶、红细胞生成素、血管抑制素、内皮抑制素、超氧化物歧化酶、珠蛋白、瘦素、过氧化氢酶、酪氨酸羟化酶、细胞因子、囊性纤维化跨膜传导调控因子(CFTR)、肽生长因子和激素。

根据一些实施例，本公开提供一种试剂盒，其包含本文中的方面和实施例中的任一个中的ceDNA载体和包装于具有药品说明书的容器中的纳米载剂。

根据一些方面，本公开提供一种用于产生ceDNA载体的试剂盒，所述试剂盒包含表达构建体，所述表达构建体包含至少一个用于插入至少一个异源核苷酸序列的限制位点或调控开关或这二者，所述至少一个限制位点可操作地安置于(i)对称反向末端重复序列(对称ITR)之间，其中所述对称ITR不是野生型ITR或(ii)两个野生型反向末端重复序列(WT-ITR)之间。根据一些实施例，试剂盒适用于产生本文中的方面和实施例中的任一个中的ceDNA载体。根据一些实施例，所述试剂盒还包含不含病毒衣壳编码序列的昆虫细胞群体，所述病毒衣壳编码序列在Rep蛋白存在下可以诱导ceDNA载体的产生。根据一些实施例，所述试剂盒还包含载体，所述载体包含编码至少一种Rep蛋白的多核苷酸序列，其中所述载体适用于在昆虫细胞中表达所述至少一种Rep蛋白。

下文进一步详细描述本公开的这些和其它方面。

附图说明

图1A说明ceDNA载体的示例性结构。在这个实施例中，示例性ceDNA载体包含含有CAG启动子、WPRE和BGHpA的表达盒。将编码转基因(例如，荧光素酶)的开放阅读框(ORF)插入介于CAG启动子与WPRE之间的克隆位点(R3/R4)中。表达盒侧接两个对称的反向末端重复序列(ITR)，也就是说，侧接表达盒的5'经修饰的ITR和3'经修饰的ITR相对于彼此对称。

图1B说明具有含有增强子/启动子的表达盒、用于插入转基因的开放阅读框架(ORF)、转录后元件(WPRE)和聚A信号的ceDNA载体(或存在于示例性ceDNA质粒中的对应序列)的示例性结构。开放阅读框(ORF)允许转基因插入介于CAG启动子与WPRE之间的克隆位点中。表达盒侧接两个对称的反向末端重复序列(ITR)，也就是说，表达盒的上游(5'端)上的经修饰的ITR和表达盒的下游(3'端)上的经修饰的ITR，其中5'ITR和3'ITR都是经修饰的ITR，但具有相同修饰(即，其是彼此的结构镜像，即，相对于彼此对称)。

图2A说明ceDNA载体的示例性结构。在这个实施例中，示例性ceDNA载体包含含有CAG启动子、WPRE和BGHpA的表达盒。将编码转基因(例如，荧光素酶)的开放阅读框(ORF)插入介于CAG启动子与WPRE之间的克隆位点(R3/R4)中。表达盒侧接两个野生型反向末端重复序列(WT-ITR)，也就是说，5'WT-ITR和3'WT-ITR侧接表达盒。

图2B说明具有含有增强子/启动子的表达盒、用于插入转基因的开放阅读框架(ORF)、转录后元件(WPRE)和聚A信号的ceDNA载体(或存在于示例性ceDNA质粒中的对应序列)的示例性结构。开放阅读框(ORF)允许转基因插入介于CAG启动子与WPRE之间的克隆位点中。表达盒侧接两个WT反向末端重复序列(WT-ITR)，也就是说，表达盒的上游(5'端)上的WT-ITR和表达盒的下游(3'端)上的WT-ITR，，其中5'WT-ITR和3'WT-ITR可以来自相同血清型，或来自不同的血清型。

图3A提供AAV2(SEQ ID NO:538)的野生型左ITR的T形茎-环结构，并鉴定了A-A'臂、B-B'臂、C-C'臂、两个Rep结合位点(RBE和RBE')，并且还展示了末端解链位点(trs)。RBE含有一连串4个双螺旋四聚体，其被认为与Rep 78或Rep 68相互作用。另外，RBE'也被认为与在所述构建体中的野生型ITR或突变的ITR上装配的Rep复合物相互作用。D和D'区含有转录因子结合位点和其它保守结构。图3B展示了野生型左ITR(SEQ ID NO:539)中提议的Rep催化的切口和接合活性，所述野生型左ITR包括AAV2的野生型左ITR的T形茎-环结构，并鉴定了A-A'臂、B-B'臂、C-C'臂、两个Rep结合位点(RBE和RBE')，并且还展示了末端解链位点(trs)，以及包含几个转录因子结合位点和其它保守结构的D和D'区。

图4A提供了野生型左AAV2 ITR(SEQ ID NO:540)的A-A'臂的含RBE部分以及C-C'臂和B-B'臂的一级结构(多核苷酸序列)(左)和二级结构(右)。图4B展示了左ITR的示例性突变的ITR(也称为经修饰的ITR)序列。展示的是示例性突变的左ITR(ITR-1，左)(SEQ IDNO:113)的A-A'臂的RBE部分、C臂和B-B'臂的一级结构(左)和所预测的二级结构(右)。图4C展示了野生型右AAV2 ITR(SEQ ID NO:541)的A-A'环的含RBE部分以及B-B'和C-C'臂的一级结构(左)和二级结构(右)。图4D展示了野生型右AAV2 ITR(SEQ ID NO:541)的A-A'环的含RBE部分以及B-B'和C-C'臂的一级结构(左)和二级结构(右)。图4E展示了示例性右修饰ITR。展示的是示例性突变的右ITR(ITR-1，右)(SEQ ID NO:114)的A-A'臂的含RBE部分、B-B'臂和C臂的一级结构(左)和所预测的二级结构(右)。可以使用左ITR和右ITR(例如，AAV2ITR或其它病毒血清型或合成ITR)的任何组合，前提是左ITR是对称的或与右ITR成反向互补。图3A-3D多核苷酸序列中的每一个是指在用于产生如本文所描述的ceDNA的质粒或杆粒/杆状病毒基因组中所用的序列。图4A-4E的每一个中还包括从质粒或杆粒/杆状病毒基因组中的ceDNA载体构型推断出的对应ceDNA二级结构以及所预测的吉布斯自由能(Gibbsfree energy)值。

图5A为说明制备杆状病毒感染的昆虫细胞(baculovirus infected insectcell；BIIC)的上游过程的示意图，所述细胞适用于在图5B的示意图中所描述的过程中产生ceDNA。图5B是ceDNA产生的示例性方法的示意图，并且图5C说明证实ceDNA载体产生的一种生化方法和过程。图5D和图5E是描述用于鉴定从在图4B的ceDNA产生过程期间获得的细胞团块收获的DNA中ceDNA的存在的过程的示意图。图5E展示具有非连续结构的DNA。ceDNA可以通过在ceDNA载体上具有单个识别位点的限制性核酸内切酶切割，并在中性和变性两种条件下产生两个大小不同(1kb和2kb)的DNA片段。图5E还展示了具有线性和连续结构的ceDNA。所述ceDNA载体可以被限制性核酸内切酶切割，并产生两个DNA片段，所述片段在中性条件下以1kb和2kb迁移，但在变性条件下，链保持连接并产生以2kb和4kb迁移的单链。图5D展示未切割或用限制性核酸内切酶消化并且然后在天然凝胶或变性凝胶上进行电泳的示例性ceDNA的示意性预期带。最左边的示意图是天然凝胶，并展示多个带，表明以其双螺旋体和未切割形式的ceDNA以至少单体和二聚体状态存在，可看到呈迁移较快的较小单体和迁移较慢的二聚体，二聚体的大小是单体的两倍。左起第二个示意图展示，当用限制性核酸内切酶切割ceDNA时，原始带消失并出现了迁移较快(例如较小)的带，与裂解后剩余的预期片段大小相对应。在变性条件下，原始双螺旋DNA是单链的，并且因为互补链是共价连接的，所以作为两倍于天然凝胶上观察到的大小的物种进行迁移。因此，在右起第二个示意图中，经过消化的ceDNA展示出与在天然凝胶上观察到的相似的带分布，但所述带作为其天然凝胶对应物大小的两倍的片段进行迁移。最右边的示意图展示，在变性条件下未切割的ceDNA作为单链开环进行迁移，并且因此观察到的带是在不开环的天然条件下观察到的带大小的两倍。在这个图中，“kb”用于指示核苷酸分子的相对大小，取决于背景，其基于核苷酸链长(例如，对于在变性条件下观察到的单链分子)或碱基对数目(例如，对于在天然条件下观察到的双链分子)。

图6A是包含Rep蛋白Rep52和Rep78的核酸序列的pFBDLSR质粒中的示例性Rep-杆粒。所述示例性Rep-杆粒包含：IE1启动子片段(SEQ ID NO:66)；Rep78核苷酸序列，包括Kozak序列(SEQ ID NO:67)、Rep52的多角体启动子序列(SEQ ID NO:68)和Rep58核苷酸序列，从Kozak序列gccgccacc)(SEQ ID NO:69)开始。图6B为示例性ceDNA-质粒的示意图，其具有经修饰的左ITR(L-修饰的ITR)、CAG启动子、荧光素酶转基因、WPRE和聚腺苷酸化序列以及经修饰的右ITR(R-修饰的ITR)，其中L-修饰的ITR和R-修饰的ITR相对于彼此对称。图6C为示例性ceDNA-质粒的示意图，其具有WT-左ITR(L-WT-ITR)、CAG启动子、荧光素酶转基因、WPRE和聚腺苷酸化序列以及WT-右ITR(R-WT ITR)。

图7A展示示例性经修饰的左ITR(“ITR-33(左)”SEQ ID NO:101)的A-A'臂的含RBE部分以及C-C'和B-B'部分的所预测的最低能量结构，并且图7B展示同源对称右ITR(ITR-18，右)，其展示示例性经修饰的右ITR(“ITR-18(右)”SEQ ID NO:102)的A-A'臂的含RBE部分以及C-C'和B-B'部分的所预测的最低能量结构。预测ITR-33(左)和ITR-18(右)二者以形成具有单个臂的结构(即，单个C-C'臂)。

图8A展示示例性经修饰的左ITR(“ITR-34(左)”SEQ ID NO:103)的A-A'臂的含RBE部分以及C-C'和B-B'部分的所预测的最低能量结构，并且图8B展示同源对称右ITR(ITR-51，右)，其展示示例性经修饰的右ITR(“ITR-51(右)”SEQ ID NO:96)的A-A'臂的含RBE部分以及C-C'和B-B'部分的所预测的最低能量结构。预测ITR-34(左)和ITR-51(右)二者以形成具有单个臂的结构(即，单个B-B'臂)。

图9A展示示例性经修饰的左ITR(“ITR-35(左)”SEQ ID NO:105)的A-A'臂的含RBE部分以及C-C'和B-B'部分的所预测的最低能量结构，并且图9B展示同源对称右ITR(ITR-19，右)，其展示示例性经修饰的右ITR(“ITR-35(右)”SEQ ID NO:105)的A-A'臂的含RBE部分以及C-C'和B-B'部分的所预测的最低能量结构。预测ITR-35(左)和ITR-19(右)二者以形成具有单个臂的结构(即，单个C-C'臂)。

图10A展示示例性经修饰的左ITR(“ITR-36(左)”SEQ ID NO:454)的A-A'臂的含RBE部分以及C-C'和B-B'部分的所预测的最低能量结构，并且图10B展示同源对称右ITR(“ITR-20(右)”)，其展示示例性经修饰的右ITR(“ITR-20(右)”SEQ ID NO:116)的A-A'臂的含RBE部分以及C-C'和B-B'部分的所预测的最低能量结构。预测ITR-36(左)和ITR-20(右)二者以形成具有两个臂的结构，两个臂中的一个被截断(例如，C-C'臂被截断)。

图11A展示示例性经修饰的左ITR(“ITR-37(左)”SEQ ID NO:111)的A-A'臂的含RBE部分以及C-C'和B-B'部分的所预测的最低能量结构，并且图11B展示同源对称右ITR(“ITR-21(右)”)，其展示示例性经修饰的右ITR(“ITR-21(右)”SEQ ID NO:112)的A-A'臂的含RBE部分以及C-C'和B-B'部分的所预测的最低能量结构。预测ITR-37(左)和ITR-21(右)二者以形成具有单个茎(例如，的结构在通常包含由B和B'区所形成的第一茎-环结构以及由C和C'区所形成的第二茎-环结构的区域中包含单个茎-环结构)。

图12A展示示例性经修饰的左ITR(“ITR-38(左)”SEQ ID NO:117)的A-A'臂的含RBE部分以及C-C'和B-B'部分的所预测的最低能量结构，并且图12B展示同源对称右ITR(“ITR-22(右)”)，其展示示例性经修饰的右ITR(“ITR-22(右)”SEQ ID NO:118)的A-A'臂的含RBE部分以及C-C'和B-B'部分的所预测的最低能量结构。预测ITR-38(左)和ITR-22(右)二者以形成具有两个臂的结构，两个臂中的一个被截断(例如，B-B'臂被截断)。

图13A展示示例性经修饰的左ITR(“ITR-39(左)”SEQ ID NO:119)的A-A'臂的含RBE部分以及C-C'和B-B'部分的所预测的最低能量结构，并且图13B展示同源对称右ITR(“ITR-23(右)”)，其展示示例性经修饰的右ITR(“ITR-23(右)”SEQ ID NO:120)的A-A'臂的含RBE部分以及C-C'和B-B'部分的所预测的最低能量结构。预测ITR-39(左)和ITR-23(右)二者以形成具有两个臂的结构，两个臂中的一个被截断(例如，B-B'臂被截断)。

图14A展示示例性经修饰的左ITR(“ITR-40(左)”SEQ ID NO:121)的A-A'臂的含RBE部分以及C-C'和B-B'部分的所预测的最低能量结构，并且图14B展示同源对称右ITR(“ITR-24(右)”)，其展示示例性经修饰的右ITR(“ITR-24(右)”SEQ ID NO:122)的A-A'臂的含RBE部分以及C-C'和B-B'部分的所预测的最低能量结构。预测ITR-40(左)和ITR-24(右)二者以形成具有两个臂的结构，两个臂中的一个被截断(例如，B-B'臂被截断)。

图15A展示示例性经修饰的左ITR(“ITR-41(左)”SEQ ID NO:107)的A-A'臂的含RBE部分以及C-C'和B-B'部分的所预测的最低能量结构，并且图15B展示同源对称右ITR(“ITR-25(右)”)，其展示示例性经修饰的右ITR(“ITR-25(右)”SEQ ID NO:108)的A-A'臂的含RBE部分以及C-C'和B-B'部分的所预测的最低能量结构。预测ITR-41(左)和ITR-25(右)二者以形成具有两个臂的结构，两个臂中的一个被截断(例如，B-B'臂被截断)。

图16A展示示例性经修饰的左ITR(“ITR-42(左)”SEQ ID NO:123)的A-A'臂的含RBE部分以及C-C'和B-B'部分的所预测的最低能量结构，并且图16B展示同源对称右ITR(“ITR-26(右)”)，其展示示例性经修饰的右ITR(“ITR-26(右)”SEQ ID NO:124)的A-A'臂的含RBE部分以及C-C'和B-B'部分的所预测的最低能量结构。预测ITR-42(左)和ITR-26(右)二者以形成具有两个臂的结构，两个臂中的一个为细长的(例如，C-C'臂被截断)。

图17A展示示例性经修饰的左ITR(“ITR-43(左)”SEQ ID NO:125)的A-A'臂的含RBE部分以及C-C'和B-B'部分的所预测的最低能量结构，并且图17B展示同源对称右ITR(“ITR-27(右)”)，其展示示例性经修饰的右ITR(“ITR-27(右)”SEQ ID NO:126)的A-A'臂的含RBE部分以及C-C'和B-B'部分的所预测的最低能量结构。预测ITR-43(左)和ITR-27(右)二者以形成具有两个臂的结构，两个臂中的一个为细长的(例如，C-C'臂被截断)。

图18A展示示例性经修饰的左ITR(“ITR-44(左)”SEQ ID NO:127)的A-A'臂的含RBE部分以及C-C'和B-B'部分的所预测的最低能量结构，并且图18B展示同源对称右ITR(“ITR-28(右)”)，其展示示例性经修饰的右ITR(“ITR-28(右)”SEQ ID NO:128)的A-A'臂的含RBE部分以及C-C'和B-B'部分的所预测的最低能量结构。预测ITR-44(左)和ITR-28(右)二者以形成具有两个臂的结构，两个臂中的一个被截断(例如，C-C'臂被截断)。

图19A展示示例性经修饰的左ITR(“ITR-45(左)”SEQ ID NO:129)的A-A'臂的含RBE部分以及C-C'和B-B'部分的所预测的最低能量结构，并且图19B展示同源对称右ITR(“ITR-29(右)”)，其展示示例性经修饰的右ITR(“ITR-29(右)”SEQ ID NO:130)的A-A'臂的含RBE部分以及C-C'和B-B'部分的所预测的最低能量结构。预测ITR-45(左)和ITR-29(右)二者以形成具有两个臂的结构，两个臂中的一个被截断(例如，C-C'臂被截断)。

图20A展示示例性经修饰的左ITR(“ITR-46(左)”SEQ ID NO:131)的A-A'臂的含RBE部分以及C-C'和B-B'部分的所预测的最低能量结构，并且图20B展示同源对称右ITR(“ITR-30(右)”)，其展示示例性经修饰的右ITR(“ITR-30(右)”SEQ ID NO:132)的A-A'臂的含RBE部分以及C-C'和B-B'部分的所预测的最低能量结构。预测ITR-46(左)和ITR-30(右)二者以形成具有两个臂的结构，两个臂中的一个被截断(例如，C-C'臂被截断)。

图21A展示示例性经修饰的左ITR(“ITR-47(左)”SEQ ID NO:133)的A-A'臂的含RBE部分以及C-C'和B-B'部分的所预测的最低能量结构，并且图21B展示同源对称右ITR(“ITR-31(右)”)，其展示示例性经修饰的右ITR(“ITR-31(右)”SEQ ID NO:134)的A-A'臂的含RBE部分以及C-C'和B-B'部分的所预测的最低能量结构。预测ITR-47(左)和ITR-31(右)二者以形成具有两个臂的结构，两个臂中的一个被截断(例如，C-C'臂被截断)。

图22A展示示例性经修饰的左ITR(“ITR-48(左)”SEQ ID NO:547)的A-A'臂的含RBE部分以及C-C'和B-B'部分的所预测的最低能量结构，并且图22B展示同源对称右ITR(“ITR-32(右)”)，其展示示例性经修饰的右ITR(“ITR-32(右)”SEQ ID NO:546)的A-A'臂的含RBE部分以及C-C'和B-B'部分的所预测的最低能量结构。预测ITR-48(左)和ITR-32(右)二者以形成具有两个臂的结构，两个臂中的一个被截断(例如，C-C'臂被截断)。

图23展示用来自表4的具有对称突变型ITR变体的16ceDNA转染的Sf9 GlycoBac昆虫细胞的荧光素酶活性(对于全部构建体也参见表7)。ceDNA载体具有侧接有选自表4的对称突变型ITR的荧光素酶基因。“模拟”条件为仅转染试剂，不具有供体DNA。

图24A和图24B展示用实例4中所描述的WT/WT ITR构建体转染的Sf9 GlycoBac昆虫细胞的GFP活性。ceDNA载体具有侧接有WT ITR的GFP基因。图24A使用荧光显微镜在用WT/WT ITR GFP ceDNA载体转染并且随后用Rep病毒感染的Sf9细胞的40×放大率下提供图像。图24B在图像“A”中所描绘的相同细胞的40×放大率下提供亮场图像。图24C提供40×下的用WT/WT ITR转染但未用Rep病毒感染的对照细胞的亮场图像。这些细胞无法产生任何荧光信号。

图25展示具有野生型ITR的假定ceDNA的天然琼脂糖凝胶(1％琼脂糖)。色带1展示1kb Plus DNA梯并且色带2展示使用含有野生型ITR盒的质粒产生的ceDNA，二者都从相同凝胶获得。预期GFP ceDNA单体物种约4kb并且预期二聚体约8kb。

图26展示含有野生型ITR的ceDNA的变性凝胶。色带1展示1kb Plus DNA梯，色带2展示尚未用核酸内切酶切割的野生型ceDNA，并且色带3展示相同野生型ceDNA但用限制性核酸内切酶ClaI切割。所有样品来自相同的凝胶。

图27展示构建体-388(突变型)和构建体-393(野生型AAV2)的对称ITR的潜在二级结构。

图28展示经LNP+polyC(对照)处理的CD-1小鼠的体重变化；LNP+Sf9产生的左侧具有WT AAV2 ITR和右侧具有截断的ITR的不对称ceDNA；LNP+合成ceDNA左、右两侧对称地具有WT AAV2 ITR；LNP+合成ceDNA具有不对称ITR，左侧具有WT AAV2ITR并且右侧具有截断的ITR；Sf9产生的ceDNA左、右两侧对称地具有突变型ITR(构建体-388)；以及在构建体(构建体-393；Sf9产生的)的左侧和右侧两侧上对称地含有野生型AAV2 ITR的ceDNA。

图29A和29B描绘在经以下处理的CD-1小鼠中的第14天荧光素酶体内表达的图像：(1)LNP+polyC(对照；左上)；(2)LNP+ceDNA，其在由Sf9产生的构建体(构建体-388)的左侧和右侧两侧上对称地具有突变型ITR(右上)；以及含有由Sf9产生的对称野生型AAV2 ITR的ceDNA(构建体-393；底部中间图)。

具体实施方式

特别在罕见疾病中，治疗剂开发中的最大障碍中的一个是大量的个别病状。地球上约有3.5亿人患有罕见病症，根据美国国立卫生研究院(National Institutes ofHealth)的定义为诊断患有疾病或病状的人数不到200,000人。约这些罕见病症中的80％是基因起源的，并且约95％的这些罕见病症未经过由FDA批准的治疗。

本文所描述的ceDNA载体的优点中在于提供一种可以快速适应多种疾病，并且尤其适应罕见单基因疾病的方法，所述方法可以针对基因病症或疾病中的多种有意义地改变当前治疗状态。此外，本文所描述的ceDNA载体包含调控开关，因此允许在递送之后可控制的基因表达。

I.定义

除非本文另有定义，否则结合本申请使用的科学和技术术语应具有本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的含义。应理解，本发明不限于本文所描述的特定方法、方案和试剂等，并且因此可以变化。本文中所用的术语仅是出于描述特定实施例的目的，而无意于限制本发明的范围，本发明的范围仅仅由权利要求书限定。免疫学和分子生物学中常用术语的定义可以在下列文献中找到：《默克诊疗手册(The Merck Manual of Diagnosisand Therapy)》第19版，默克夏普公司(Merck Sharp&Dohme Corp.)出版，2011(ISBN978-0-911910-19-3)；Robert S.Porter等人(编辑)，《病毒学领域(Fields Virology)》第6版，利平科特威廉姆斯和维尔金斯出版社(Lippincott Williams&Wilkins)出版，美国宾夕法尼亚州费城(Philadelphia,PA,USA)(2013)；Knipe,D.M.和Howley,P.M.(编辑),《分子细胞生物学与分子医学百科全书(The Encyclopedia of Molecular Cell Biology andMolecular Medicine)》，布莱克威尔科学有限公司(Blackwell Science Ltd.)出版,1999-2012(ISBN 9783527600908)；以及Robert A.Meyers(编辑)，《分子生物学与生物技术：综合案头参考(Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive DeskReference)》，由德国化学学会出版公司(VCH Publishers,Inc.)出版，1995(ISBN 1-56081-569-8)；Werner Luttmann的《免疫学(Immunology)》，由爱思唯尔(Elsevier)出版，2006；《詹韦氏免疫生物学(Janeway's Immunobiology)》，Kenneth Murphy,Allan Mowat,Casey Weaver(编辑)，泰勒&弗朗西斯有限公司(Taylor&Francis Limited)，2014(ISBN0815345305、9780815345305)；《勒温基因XI(Lewin's Genes XI)》，由琼斯&巴特利特出版社(Jones&Bartlett Publishers)出版，2014(ISBN-1449659055)；Michael Richard Green和Joseph Sambrook，《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A LaboratoryManual)》，第4版，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，美国纽约州冷泉港(Cold Spring Harbor,N.Y.,USA)(2012)(ISBN 1936113414)；Davis等人，《分子生物学的基本方法(Basic Methods in Molecular Biology)》，爱思唯尔科学出版有限公司，美国纽约(2012)(ISBN 044460149X)；《酶学实验室方法：DNA(Laboratory Methodsin Enzymology:DNA)》,Jon Lorsch(编辑)爱思唯尔,2013(ISBN 0124199542)；《分子生物学现代方法(Current Protocols in Molecular Biology；CPMB)》，Frederick M.Ausubel(编辑)，约翰·威利父子出版公司(John Wiley and Sons)，2014(ISBN047150338X、9780471503385),《蛋白质科学现代方法(Current Protocols in Protein Science；CPPS)》，John E.Coligan(编辑)，约翰·威利父子出版公司，2005；以及《免疫学现代方法(Current Protocols in Immunology，CPI)》(John E.Coligan,ADA M Kruisbeek,David HMargulies,Ethan M Shevach,Warren Strobe(编辑)约翰·威利父子出版公司，2003(ISBN0471142735、9780471142737)，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。

如本文所用，术语“施用(administration/administering)”和其变化形式是指将组合物或药剂(例如，核酸，尤其ceDNA)引入个体中并且包括同时和依序引入一种或多种组合物或药剂。“施用”可以指例如治疗、药物动力学、诊断、研究、安慰剂以及实验方法。“施用”还涵盖体外和离体治疗。将组合物或药剂引入个体中是通过任何适合的途径，包括经口、经肺、经鼻、肠胃外(静脉内、肌肉内、腹膜内或皮下)、经直肠、淋巴内、瘤内或局部。施用包含自我施用和由另一个人施用。可以通过任何适合的途径进行施用。适合的施用途径使得组合物或药剂执行其预期功能。举例来说，如果所适合的途径是静脉内，那么通过将组合物或药剂引入个体的静脉来施用组合物。

如本文所用，术语“抗体”以最广泛的含义使用并且涵盖各种抗体结构，包括(但不限于)：单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要其展现出所希望的抗原结合活性即可。“抗体片段”是指并非完整抗体的分子，所述分子包含完整抗体的结合所述完整抗体所结合的抗原的部分。在一个实施例中，抗体或抗体片段包含免疫球蛋白链或抗体片段以及至少一个免疫球蛋白可变域序列。抗体或其片段的实例包括(但不限于)：Fv、scFv、Fab片段、Fab'、F(ab')

如本文所用，术语抗体分子的“抗原结合域”是指抗体分子(例如免疫球蛋白(Ig)分子)的参与抗原结合的部分。在实施例中，抗原结合位点是由重链(H)和轻链(L)的可变(V)区的氨基酸残基形成。重链和轻链可变区内的三个高趋异性片段(称为高变区)安置于较保守的侧接片段(称为“构架区”(FR))之间。FR是在免疫球蛋白的高变区之间和邻近处天然发现的氨基酸序列。在实施例中，在抗体分子中，轻链的三个高变区和重链的三个高变区在三维空间中相对于彼此安置以形成抗原结合表面，所述抗原结合表面与所结合抗原的三维表面互补。重链和轻链中的每一个的三个高变区称为“互补决定区”或“CDR”。构架区和CDR已定义并且描述于例如Kabat,E.A.等人(1991)《免疫学所关注的蛋白质的序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)》第五版，美国健康和人服务部(U.S.Department of Health and Human Services)，NIH出版号91-3242，以及Chothia,C.等人(1987)《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》196:901-917中。每条可变链(例如，可变重链和可变轻链)通常由三个CDR和四个FR构成，其从氨基末端到羧基末端，按照以下氨基酸次序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。

如本文所用，短语“抗治疗性核酸免疫应答”、“抗转移载体免疫应答”、“针对治疗性核酸的免疫应答”、“针对转移载体的免疫应答”等意指针对其来源的治疗性核酸、病毒或非病毒的任何非所要免疫应答。在一些实施例中，非所要免疫应答为针对病毒转移载体自身的抗原特异性免疫应答。在一些实施例中，免疫应答对可以是双链DNA、单链RNA或双链RNA的转移载体具有特异性。在其它实施例中，免疫应答对转移载体的序列具有特异性。在其它实施例中，免疫应答对转移载体的CpG含量具有特异性。

本文所用，“载剂”包括任何和所有的溶剂、分散介质、媒剂、包衣、稀释剂、抗细菌和抗真菌剂、等张和吸收延迟剂、缓冲液、载剂溶液、悬浮液、胶体等。此类介质和药剂用于药学上活性物质的用途是所属领域熟知的。补充性活性成分也可以并入组合物中。短语“药学上可接受的”是指当施用宿主时不会产生毒性、过敏性或类似的不良反应的分子实体和组合物。

如本文所用，术语“ceDNA”意指用于非病毒基因转移、合成或其它形式的无衣壳封闭式线性双链(ds)双螺旋DNA。ceDNA的详细描述描述于2017年3月3日提交的PCT/US2017/020828的国际申请中，所述申请的全部内容以引用的方式明确地并入本文中。使用基于细胞的方法产生包含各种反向末端重复(ITR)序列和构型的ceDNA的某些方法描述于2018年9月7日提交的国际申请PCT/US18/49996和2018年12月6日提交的PCT/US2018/064242的实例1中，所述申请中的每一个以全文引用的方式并入本文中。用于产生包含各种ITR序列和构型的合成ceDNA载体的某些方法描述于例如2019年1月18日提交的国际申请PCT/US2019/14122中，所述国际申请的全部内容以引用的方式并入本文中。如本文所用，术语“ceDNA载体”和“ceDNA”可互换地使用。根据一些实施例，ceDNA为封闭式线性双螺旋(CELiD)CELiDDNA。根据一些实施例，ceDNA为基于DNA的小环。根据一些实施例，ceDNA为简约的免疫学定义的基因表达(MIDGE)-载体。根据一些实施例，ceDNA为辅助DNA。根据一些实施例，ceDNA为哑铃形线性双螺旋封闭式DNA，其包含表达盒的5'和3'端中的ITR的两个发夹结构。根据一些实施例，ceDNA为doggybone

如本文所用，术语“ceDNA-杆粒”是指一种包含作为分子间双螺旋体的ceDNA基因组的感染性杆状病毒基因组，其能够作为质粒在大肠杆菌中增殖，并且因此可以作为杆状病毒的穿梭载体操作。

如本文所用，术语“ceDNA-杆状病毒”是指一种在杆状病毒基因组内包含作为分子间双螺旋体的ceDNA基因组的杆状病毒。

如本文所用，术语“ceDNA-杆状病毒感染的昆虫细胞”和“ceDNA-BIIC”可互换使用，并且是指被ceDNA-杆状病毒感染的无脊椎动物宿主细胞(包括(但不限于)昆虫细胞(例如Sf9细胞))。

如本文所用，术语“ceDNA基因组”是指还并入了至少一个反向末端重复区的表达盒。ceDNA基因组还可以包含一个或多个间隔区。在一些实施例中，ceDNA基因组作为DNA的分子间双螺旋多核苷酸并入质粒或病毒基因组中。

如本文所用，术语“ceDNA-质粒”是指一种包含作为分子间双螺旋体的ceDNA基因组的质粒。

本文所用，术语“封闭式DNA载体”、“ceDNA载体”和“ceDNA”可互换使用，并且是指具有至少一个共价封闭端(即分子内双螺旋体)的非病毒无衣壳DNA载体。在一些实施例中，ceDNA包含两个共价封闭端。

如本文所用，术语“ceDNA间隔区”是指分隔ceDNA载体或ceDNA基因组中的功能元件的中间序列。在一些实施例中，ceDNA间隔区将两个功能元件保持在对于最佳功能性来说所期望的距离上。在一些实施例中，ceDNA间隔区提供或增加了ceDNA基因组在例如质粒或杆状病毒内的遗传稳定性。在一些实施例中，ceDNA间隔区通过提供克隆位点等的便利位置，促进ceDNA基因组的就绪基因操作。举例来说，在某些方面，含有若干限制性核酸内切酶位点的寡核苷酸“多酶切点接头”或设计成不具有已知蛋白质(例如，转录因子)结合位点的非开放阅读框架序列可以安置于ceDNA基因组中以分离顺式作用因子，例如将6聚体、12聚体、18聚体、24聚体、48聚体、86聚体、176聚体等插入末端解链位点与上游转录调控元件之间。类似地，可以在聚腺苷酸化信号序列和3'-末端解链位点之间并入间隔子。

如本文所用，短语活性剂或治疗剂(如治疗性核酸)的“有效量”或“治疗有效量”是足以产生所需作用(例如，相比于在不存在治疗性核酸的情况下检测到的表达水平抑制目标序列的表达)的量。用于测量目标基因或目标序列的表达的适合的分析包括例如使用所属领域的技术人员已知的技术检查蛋白质或RNA水平，所述技术如斑点印迹、北方印迹法、原位杂合、ELISA、免疫沉淀、酶功能以及所属领域的技术人员已知的表型分析。

如本文所用，术语“外源”意指存在于除其原生来源以外的细胞中的物质。当在本文中使用时，术语“外源”可以指已经通过涉及人手的过程被引入如细胞或生物体的生物系统中的核酸(例如编码多肽的核酸)或多肽，通常在所述细胞或生物体中未发现所述核酸或多肽，并且希望将核酸或多肽引入此类细胞或生物体中。可替代地，“外源”可以指已经通过涉及人手的过程被引入如细胞或生物体的生物系统中的核酸或多肽，在所述细胞或生物体中发现核酸或多肽的量相对较低，并且希望增加细胞或生物体中核酸或多肽的量，例如以产生异位表达或水平。与此相反，如本文所用，术语“内源”是指对生物系统或细胞天然的物质。

如本文所用，术语“效应子蛋白”是指一种提供可检测读数的多肽，例如作为报道多肽，或更适当地，作为杀灭细胞的多肽，例如毒素，或致使细胞易用所选药剂或因缺乏所选药剂而被杀灭的药剂。效应子蛋白包括直接靶向或损害宿主细胞的DNA和/或RNA的任何蛋白质或肽。举例来说，效应子蛋白可以包括(但不限于)：靶向宿主细胞DNA序列(无论是基因组的还是在染色体外元件上的)的限制性核酸内切酶、降解细胞存活所必需的多肽目标的蛋白酶；DNA旋转酶抑制剂；以及核糖核酸酶型毒素。在一些实施例中，由如本文所描述的合成生物回路控制的效应子蛋白表达可以作为一个因子参与另一个合成生物回路，从而扩大了生物回路系统应答性的范围和复杂度。

如本文所用，术语“表达盒”和“转录盒”可互换使用，并且是指一段线性核酸，其包括与一个或多个启动子或足以引导转基因转录的其它调控序列可操作地连接的转基因，但不包含衣壳编码序列、其它载体序列或反向末端重复区。表达盒可以另外包含一个或多个顺式作用序列(例如启动子、增强子或阻遏子)、一个或多个内含子和一个或多个转录后调控元件。

如本文所用，术语“侧接”是指一个核酸序列相对于另一核酸序列的相对位置。通常，在序列ABC中，B侧接A和C。对于A×B×C排列，情况也是如此。因此，侧接序列在所侧接的序列之前或之后，但不必与所侧接的序列相邻或紧邻。在一个实施例中，术语侧接是指在线性单链合成AAV载体的每个末端处的末端重复序列。

如本文所用，术语“全长抗体”是指免疫球蛋白(Ig)分子(例如，IgG抗体)，例如天然存在的免疫球蛋白(Ig)分子，并且由正常的免疫球蛋白基因片段重组过程形成。

如本文所用，术语“功能抗体片段”是指结合到与由完整(例如全长)抗体识别的抗原相同的抗原的片段。术语“抗体片段”或“功能片段”还包括由可变区组成的分离的片段，如由重链和轻链的可变区组成的“Fv”片段；或重组单链多肽分子，其中轻链与重链可变区通过肽连接子(“scFv蛋白”)连接。在一些实施例中，抗体片段不包括无抗原结合活性的抗体部分，如Fc片段或单一氨基酸残基。

如本文所用，术语“间隙”和“切口”可互换地使用，并且意指本公开的合成DNA载体的中断部分，其在另外双链ceDNA中产生单链DNA部分的延伸。在双螺旋DNA的一个链中，间隙的长度可以是1个碱基对到100个碱基对。由本文所描述的方法以及由所述方法产生的合成载体设计和产生的典型间隙的长度可以是例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60bp。本公开中的示例性间隙的长度可以是1bp到10bp、1bp到20bp、1bp到30bp。

如本文所用，术语“基因”广义上用以指与给定RNA或蛋白质的体外或体内表达相关的核酸的任何区段。因此，基因包括编码所表达的RNA的区域(其通常包括多肽编码序列)和通常其表达所需的调控序列。基因可以从多种来源获得，包括从所关注的来源克隆或从已知或预测的序列信息合成，并且可以包括设计成具有所需参数的序列。

如本文所用，短语“基因疾病”或“基因病症”是指部分或完全、直接或间接地由基因组中的一种或多种异常引起的疾病，包括并且尤其是从出生起出现的病状。异常可以是基因中的突变、插入或缺失。异常可能影响基因的编码序列或其调控序列。

如本文所用，术语“异源”意指分别在天然核酸或蛋白质中未发现的核苷酸或多肽序列。

如本文所用，术语“异源核苷酸序列”和“转基因”可互换使用，并且是指并入如本文公开的ceDNA载体中并可以由其递送和表达的所关注的核酸(除编码衣壳多肽的核酸外)。异源核酸序列可以与天然存在的核酸序列(或其变体)连接(例如通过基因工程)以产生编码嵌合多肽的嵌合核苷酸序列。异源核酸序列可以连接到变异多肽(例如通过基因工程)以产生编码融合变异多肽的核苷酸序列。所关注的转基因包括(但不限于)编码多肽的核酸，所述多肽优选为治疗性(例如医学、诊断或兽医学用途)或免疫原性多肽(例如用于疫苗)。在一些实施例中，所关注的核酸包括转录成治疗性RNA的核酸。为了在本公开的ceDNA载体中使用而包括的转基因包括(但不限于)表达或编码以下中的一种或多种的转基因：多肽、肽、核酶、适体、肽核酸、siRNA、RNAi、miRNA、lncRNA、反义寡核苷酸或多核苷酸、抗体、抗原结合片段或其任何组合。

如本文所用，术语“同源性”或“同源”意指在比对序列并在需要时为实现最大的序列一致性百分比而引入间隙后，同源臂中与目标染色体上对应序列中的核苷酸残基相同的核苷酸残基的百分比。出于确定核苷酸序列同源性百分比的比对可以用所属技术领域中内的各种方式来实现，例如使用公开可用的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ClustalW2或Megalign(DNASTAR)软件。所属领域的技术人员可以确定用于比对序列的合适的参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。在一些实施例中，当例如修复模板的同源臂的核酸序列(例如DNA序列)与宿主细胞的对应天然或未编辑的核酸序列(例如基因组序列)至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更多同一时，所述序列视为“同源”。

如本文所用，术语“宿主细胞”是指易于被本公开的核酸治疗剂转化、转染、转导等的任何细胞类型。作为非限制性实例，宿主细胞可以是分离的原代细胞、多能干细胞、CD34+细胞、诱导的多能干细胞或许多永生化细胞系(例如，HepG2细胞)中的任一种。可替代地，宿主细胞可以是组织、器官或生物体中的原位或体内细胞。此外，宿主细胞可以是例如哺乳动物个体(例如，需要基因疗法的人类患者)的目标细胞。

如本文所用，“免疫球蛋白可变域序列”是指可以形成免疫球蛋白可变域结构的氨基酸序列。举例来说，所述序列可以包括天然存在的可变域的氨基酸序列的全部或一部分。举例来说，所述序列可以或可以不包括一个、两个或更多个N端或C端氨基酸，或可以包括与蛋白质结构形成相容的其它变化。

如本文所描述，“诱导型启动子”是特征在于当存在诱导物或诱导剂或受其影响或被其接触时，引发或增强转录活性的启动子。如本文所定义的“诱导物”或“诱导剂”可以是内源性的，或是以能够从诱导型启动子诱导转录活性的方式施用的通常外源性的化合物或蛋白质。在一些实施例中，诱导物或诱导剂，即化学物质、化合物或蛋白质，本身可以是核酸序列转录或表达的结果(即，诱导物可以是由另一组分或模块表达的诱导蛋白)，转录或表达本身可以在诱导型启动子的控制下。在一些实施例中，诱导型启动子是在不存在某些药剂，如阻遏子的情况下被诱导的。诱导型启动子的实例包括(但不限于)：四环素、金属硫蛋白、蜕皮激素、哺乳动物病毒(例如，腺病毒晚期启动子；以及小鼠乳腺肿瘤病毒长末端重复序列(MMTV-LTR))和其它类固醇应答启动子、雷帕霉应答启动子等。

如本文所用，“输入剂应答域”是转录因子的一个域，其以致使连接的DNA结合融合域对条件或输入剂的存在作出应答的方式与所述条件或输入剂结合或以其它方式作出应答。在一个实施例中，条件或输入剂的存在导致输入剂应答结构域或其融合的蛋白质发生构象变化，从而改变转录因子的转录调制活性。

术语“体内”是指在生物体，如多细胞动物中或内部进行的分析或过程。在本文所描述的一些方面，当使用如细菌的单细胞生物体时，可以说方法或用途是在“体内”发生的。术语“离体”是指使用具有完整膜的活细胞进行的方法和用途，所述活细胞在多细胞动物或植物体之外，例如外植体、培养细胞，包括原代细胞和细胞系、转化的细胞系，以及提取的组织或细胞，包括血细胞，等等。

术语“体外”是指不需要存在具有完整膜的细胞的分析和方法，如细胞提取物，并且可以指在非细胞系统，如不包含细胞或细胞系统的介质，如细胞提取物中引入可编程的合成生物回路。

如本文所用，术语“局部递送”意指将如干扰RNA(例如，siRNA)的活性剂直接递送到生物体内的目标位点。举例来说，药剂可以通过直接注射到疾病部位(如肿瘤或其它目标部位，如发炎部位或目标器官，如肝脏、心脏、胰腺、肾脏等)中来局部递送。

如本文所用，短语“经修饰的ITR”或“mod-ITR”或“突变型ITR”在本文中可互换使用，并且是指与来自相同血清型的WT-ITR相比在至少一个或多个核苷酸中具有突变的ITR。所述突变可以引起ITR中的A、C、C'、B、B'区中的一个或多个发生变化，并且可以使得三维空间组构(即，其几何空间中的3D结构)相较于相同血清型的WT-ITR的3D空间组构发生变化。

如本文所用，术语“neDNA”或“带切口的ceDNA”意指在开放阅读框架(例如，待表达的启动子和转基因)上游的茎区或间隔区5'中具有1-100个碱基对的切口或间隙的封闭式DNA。

如本文所用，术语“核酸”意指含有呈单链或双链形式的至少两种核苷酸(即，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)并且包括DNA、RNA和其杂合物的聚合物。DNA可以呈例如反义分子、质粒DNA、DNA-DNA双螺旋体、预缩合DNA、PCR产物、载体(P1、PAC、BAC、YAC、人工染色体)、表达盒、嵌合序列、染色体DNA或这些组的衍生物和组合的形式。DNA可以呈小环、质粒、杆粒、小基因、辅助DNA(线性共价闭合DNA载体)、封闭式线性双螺旋DNA(CELiD或ceDNA)、doggybone

如本文所用，“核苷酸”含有糖脱氧核苷(DNA)或核糖(RNA)、碱基和磷酸酯基。核苷酸通过磷酸酯基连接在一起。

如本文所用，短语“核酸治疗性”、“治疗性核酸”和“TNA”可互换地使用，并且是指使用核酸作为治疗疾病或病症的治疗剂的活性组分的治疗的任何模态。如本文所用，这些短语是指基于RNA的治疗剂和基于DNA的治疗剂。基于RNA的治疗剂的非限制性实例包括mRNA、反义RNA和寡核苷酸、核酶、适体、干扰RNA(RNAi)、切丁酶-底物dsRNA、小发夹RNA(shRNA)、不对称干扰RNA(aiRNA)、微RNA(miRNA)。基于DNA的治疗剂的非限制性实例包括小环DNA、小基因、病毒DNA(例如，慢病毒或AAV基因组)或非病毒合成DNA载体、封闭式线性双螺旋DNA(ceDNA/CELiD)、质粒、杆粒、doggybone

如本文所用，术语“启动子”是指通过驱动核酸序列的转录来调节另一核酸序列表达的任何核酸序列，其可以是编码蛋白质或RNA的异源目标基因。启动子可以是组成型的、诱导型的、阻遏型的、组织特异性的或其任何组合。启动子是核酸序列的控制区域，在所述核酸序列的其余部分的引发和转录速率是受控的。启动子还可以含有可以结合调控蛋白和分子的基因元件，如RNA聚合酶和其它转录因子。在本文所描述的方面的一些实施例中，启动子可以驱动转录因子的表达，所述转录因子调控启动子本身的表达，或可以驱动本文所描述的合成生物学回路中的另一模块化组分中使用的另一启动子的表达。在启动子序列内将发现转录起始位点，以及负责RNA聚合酶结合的蛋白质结合域。真核启动子将经常但并非总是含有“TATA”框和“CAT”框。各种启动子，包括诱导型启动子，可以用于驱动本文公开的ceDNA载体中转基因的表达。

如本文所用，术语“增强子”是指顺式作用调控序列(例如50-1,500个碱基对)，其结合一种或多种蛋白质(例如，活化剂蛋白质或转录因子)以增强核酸序列的转录活化。增强子可以位于其调节的基因起始位点上游或基因起始位点下游最多1,000,000个碱基对处。增强子可以位于内含子区域内，或无关基因的外显子区中。

启动子可以称为驱动其调节的核酸序列的表达或驱动其转录。如本文所用，“可操作地连接”意指一种并置，其中如此描述的组分处于允许其以预期方式起作用的关系中。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，那么所述启动子可操作地连接到所述编码序列。短语“可操作地连接”、“操作性定位”、“操作性连接”，“在控制下”和“在转录控制下”指示启动子相对于其调节的核酸序列处于正确的功能位置和/或取向，以控制所述序列的转录引发和/或表达。如本文所用，“反向启动子”是指核酸序列处于相反的取向，使得编码链现在成为非编码链的启动子，并且反之亦然。反向启动子序列可以在各种实施例中用于调控开关的状态。另外，在各种实施例中，启动子可以与增强子结合使用。

启动子可以是与基因或序列天然结合的启动子，如可以通过分离位于编码区段上游的5'非编码序列和/或给定基因或序列的外显子所获得。此类启动子可以称为“内源性的”。类似地，在一些实施例中，增强子可以是与核酸序列天然相关的增强子，位于所述序列的下游或上游。

在一些实施例中，编码核酸区段定位在“重组启动子”或“异源启动子”的控制下，所述启动子均指在其天然环境中通常不与其可操作地连接的编码核酸序列关联的启动子。重组或异源增强子是指在其天然环境中通常不与给定核酸序列关联的增强子。此类启动子或增强子可以包括其它基因的启动子或增强子；从任何其它原核、病毒或真核细胞分离的启动子或增强子；以及非“天然存在”的合成启动子或增强子，即包含不同转录调节区的不同元件和/或通过所属领域已知的基因工程方法来改变表达的突变。除了通过合成产生启动子和增强子的核酸序列以外，还可以结合本文公开的合成生物回路和模块，使用重组克隆和/或核酸扩增技术，包括PCR，来产生启动子序列(参见例如美国专利第4,683,202号、美国专利第5,928,906号，各自以引用的方式并入本文中)。此外，预期也可以采用指导序列在如线粒体、叶绿体等非核细胞器内的转录和/或表达的控制序列。

如本文所用，术语“Rep结合位点”、“Rep结合元件”、“RBE”和“RBS”可互换使用并且是指Rep蛋白(例如AAV Rep 78或AAV Rep 68)的结合位点，其在Rep蛋白结合后允许Rep蛋白在并入了所述RBS的序列上发挥其位点特异性核酸内切酶活性。RBS序列和其反向互补序列一起形成单个RBS。RBS序列在所属领域中是已知的，并且包括例如5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3′(SEQ ID NO:531)，AAV2中所鉴定的RBS序列。在本发明的实施例中可以使用任何已知的RBS序列，包括其它已知的AAV RBS序列和其它天然已知的或合成的RBS序列。不受理论束缚，认为Rep蛋白的核酸酶域结合到双螺旋核苷酸序列GCTC，并且因此，两种已知的AAV Rep蛋白直接结合到双螺旋寡核苷酸5'-(GCGC)(GCTC)(GCTC)(GCTC)-3'(SEQID NO:531)并在其上稳定组装。另外，可溶聚集性构象异构体(即，数目未定的相互缔合的Rep蛋白)解离并结合到含有Rep结合位点的寡核苷酸。每个Rep蛋白都与每个链上的含氮碱基和磷酸二酯骨架相互作用。与含氮碱基的相互作用提供序列特异性，而与磷酸二酯骨架的相互作用是非或较少序列特异性的，并稳定了蛋白质-DNA复合物。

如本文所用，术语“报道子”意指可以用于提供可检测读数的蛋白质。报道子通常产生可测量的信号，如荧光、颜色或发光。报道蛋白编码序列编码在细胞或生物体中的存在易于观察到的蛋白质。举例来说，荧光蛋白当被特定波长的光激发时会导致细胞发荧光，荧光素酶引起细胞催化产生光的反应，以及如β-半乳糖苷酶的酶将底物转化为有色产物。适用于实验或诊断目的的示例性报道多肽包括(但不限于)：β-内酰胺酶、β-半乳糖苷酶(LacZ)、碱性磷酸酶(AP)、胸苷激酶(TK)、绿色荧光蛋白(GFP)和其它荧光蛋白、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、荧光素酶和其它在所属领域中熟知的报道多肽。

如本文所用，“阻遏蛋白”或“诱导蛋白”是与调控序列元件结合并分别阻遏或活化与调控序列元件可操作连接的序列的转录的蛋白质。如本文所描述的优选阻遏和诱导蛋白对至少一种输入剂或环境输入物的存在或不存在敏感。如本文所描述的优选蛋白质是模块的形式，包含例如可分离的DNA结合和输入剂结合或应答元件或域。

如本文所用，术语“序列一致性”意指两个核苷酸序列之间的相关性。出于本公开的目的，使用如在EMBOSS软件包的Needle程序(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件,Rice等人,2000,同上)，优选版本3.0.0或更高版本中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,同上)确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列一致性程度。使用的可选参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5和EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)替换矩阵。标记为“最长一致性”的Needle的输出(使用-nobrief选项获得)用作一致性百分比，并按以下计算：(相同的脱氧核糖核苷酸乘以100)/(比对长度-比对空位总数)。比对的长度优选为至少10个核苷酸、优选为至少25个核苷酸、更优选为至少50个核苷酸并且最优选为至少100个核苷酸。

如本文所用，术语“有义”和“反义”意指多核苷酸上结构元件的取向。元件的有义和反义型式彼此反向互补。

如本文所用，术语“间隔区”意指分离载体或基因组中的功能元件的中间序列。在一些实施例中，AAV间隔区将两个功能元件保持在对于最佳功能性来说所期望的距离上。在一些实施例中，间隔区提供或增加了载体或基因组的基因稳定性。在一些实施例中，间隔区通过提供克隆位点的适宜位置和设计数目的碱基对的间隙而促进基因组的就绪基因操作。举例来说，在某些方面，含有若干限制性核酸内切酶位点的寡核苷酸“多酶切点接头”或“聚克隆位点”，或设计成不具有已知蛋白质(例如转录因子)结合位点的非开放阅读框序列可以位于载体或基因组中以分离顺式作用因子，例如插入6聚体、12聚体、18聚体、24聚体、48聚体、86聚体、176聚体等。

本文所用，术语“个体”是指向其提供用根据本发明的ceDNA载体的治疗，包括预防性治疗的人类或动物。通常，动物是脊椎动物，如(但不限于)：灵长类动物、啮齿动物、家养动物或野生动物。灵长类动物包括(但不限于)：黑猩猩、食蟹猴、蜘蛛猴和猕猴，例如恒河猴。啮齿动物包括小鼠、大鼠、土拨鼠、雪貂、兔和仓鼠。家养和野生动物包括(但不限于)：牛、马、猪、鹿、野牛、水牛、猫科物种(例如家猫)、犬科物种(例如狗、狐狸、狼)、禽类物种(例如鸡、鸸鹋、鸵鸟)，以及鱼，例如鳟鱼、鲶鱼和鲑鱼。在本文所描述方面的某些实施例中，个体是哺乳动物，例如灵长类动物或人类。个体可以是雄性或雌性。另外，个体可以是婴儿或儿童。在一些实施例中，个体可以是新生儿或未出生个体，例如，个体还在子宫内。优选地，个体是哺乳动物。哺乳动物可以是人类、非人类灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或牛，但不限于这些实例。人类以外的哺乳动物可以有利地用作代表疾病和病症的动物模型的个体。另外，本文所描述的方法和组合物可以用于家养动物和/或宠物。人类个体可以具有任何年龄、性别、种族或族群，例如，高加索人(白人)、亚洲人、非洲人、黑人、非裔美洲人、非裔欧洲人、西班牙人、中东人等。在一些实施例中，个体可以是临床环境中的患者或其它个体。在一些实施例中，个体已进行治疗。

如本文所用，术语“大体上对称的经修饰的ITR”或“大体上对称的mod-ITR对”是指单个ceDNA基因组或ceDNA载体中的一对经修饰的ITR，其在其全长上均具有反向互补序列。举例来说，经修饰的ITR即使具有一些偏离反向互补序列的核苷酸序列，只要变化并不影响特性和整体形状，也可以认为是大体上对称的。作为一个非限制性实例，序列与典型序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性(如使用默认设置下的BLAST测量)，并且还与其同源经修饰的ITR具有对称的三维空间组构，使得其3D结构在几何空间中具有相同的形状。换句话说，大体上对称的经修饰的ITR对具有在3D空间中组织的相同的A、C-C'和B-B'环。在一些实施例中，来自mod-ITR对的ITR可以具有不同的反向互补核苷酸序列，但仍具有相同的对称三维空间组构，即两个ITR都具有产生相同的整体3D形状的突变。举例来说，mod-ITR对中的一个ITR(例如5'ITR)可以来自一种血清型，而另一个ITR(例如3'ITR)可以来自不同的血清型，但是，两种都可以具有相同的对应突变(例如，如果5'ITR在C区中具有缺失，那么来自不同血清型的同源修饰的3'ITR在C'区的对应位置处也具有缺失)，以使得经修饰的ITR对具有相同的对称三维空间组构。在此类实施例中，经修饰的ITR对中的每个ITR可以来自不同血清型(例如AAV1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12)，如AAV2与AAV6的组合，其中一个ITR中的修饰在来自不同血清型的同源ITR的对应位置得到反映。在一个实施例中，大体上对称的经修饰的ITR对是指一对经修饰的ITR(mod-ITR)，只要ITR之间的核苷酸序列的差异不影响特性或整体形状并且其在3D空间中具有大体上相同的形状即可。作为非限制性实例，如通过所属领域中熟知的标准方法，如默认设置下的BLAST(基本局部比对搜索工具)或BLASTN测定，mod-ITR与典型的mod-ITR具有至少95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性，并且还具有对称的三维空间组构，以使其3D结构在几何空间中的形状相同。大体上对称的mod-ITR对在3D空间中具有相同的A、C-C'和B-B'环，例如，如果大体上对称的mod-ITR对中的经修饰的ITR缺失C-C'臂，那么同源mod-ITR对应缺失C-C'环，并且还具有在其同源mod-ITR的几何空间中呈相同形状的剩余A和B-B'环的类似3D结构。

如本文所用，术语“大体上对称的WT-ITR”或“大体上对称的WT-ITR对”是指单个ceDNA基因组或ceDNA载体中的一对WT-ITR，其在其全长上均具有反向互补序列。举例来说，ITR即使具有一个或多个偏离典型的天然存在的序列的核苷酸，只要变化并不影响所述序列的特性和整体三维结构，所述ITR也可以被认为是野生型序列。在一些方面，偏离的核苷酸代表保守的序列变化。作为一个非限制性实例，序列与典型序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性(如使用默认设置下的BLAST测量)，并且还与另一WT-ITR具有对称的三维空间组构，使得其3D结构在几何空间中具有相同的形状。大体上对称的WT-ITR在3D空间中具有相同的A、C-C'和B-B'环。通过确定具有与合适的Rep蛋白配对的可操作的Rep结合位点(RBE或RBE')和末端解链位点(trs)，可以在功能上确认大体上对称的WT-ITR为WT。可以任选地测试其它功能，包括在容许条件下的转基因表达。

如本文所用，术语“遏制”、“减少”、“干扰”、“抑制”和/或“降低”(以及类似术语)通常是指直接或间接地降低相对于自然条件、预期条件或平均条件，或相对控制条件的浓度、水平、功能、活动或行为的行为。

如本文所用，术语“对称ITR”是指单个ceDNA基因组或ceDNA载体内的一对ITR，其相对于野生型依赖病毒ITR序列发生突变或修饰并且在其全长上反向互补。这两个ITR都不是野生型ITR AAV2序列(即，它们是经修饰的ITR，也称为突变型ITR)，并且由于核苷酸的添加、缺失、取代、截断或点突变，而在序列上与野生型ITR不同。本文中为方便起见，将位于ceDNA载体中表达盒的5'(上游)的ITR称为“5'ITR”或“左ITR”，并将位于ceDNA载体中表达盒的3'(下游)的ITR称为“3'ITR”或“右ITR”。

如本文所用，术语“合成AAV载体”和“AAV载体的合成产生”意指在完全无细胞环境中的AAV载体和其合成产生方法。

如本文所用，术语“末端重复”或“TR”包括任何包含至少一个最低需要的复制起点和包含回文发夹结构的区域的病毒末端重复或合成序列。Rep结合序列(“RBS”)(也称为RBE(Rep结合元件))和末端解链位点(“TRS”)共同构成“最低需要的复制起点”，并且因此TR包含至少一个RBS和至少一个TRS。在给定的一段多核苷酸序列内彼此是反向互补序列的TR通常各自被称为“反向末端重复序列”或“ITR”。在病毒背景下，ITR介导复制、病毒包装、整合和原病毒拯救。正如在本发明中意外发现的，不同于野生型依赖病毒ITR的ITR仍然可以执行野生型ITR的传统功能，因此术语ITR在本文中用于指ceDNA基因组或ceDNA载体中能够介导ceDNA载体复制的TR。所属领域的普通技术人员将理解，在复杂的ceDNA载体构型中，可以存在超过两个ITR或对称的ITR对。ITR可以是AAV ITR或非AAV ITR，或可以来源于AAV ITR或非AAV ITR。举例来说，ITR可以来源于细小病毒科，其涵盖细小病毒和依赖病毒(例如犬细小病毒、牛细小病毒、小鼠细小病毒、猪细小病毒、人类细小病毒B-19)，或可以将充当SV40复制起点的SV40发夹用作ITR，其可以通过截断、取代、缺失、插入和/或添加而被进一步修饰。细小病毒科病毒由两个亚科组成：感染脊椎动物的细小病毒亚科和感染无脊椎动物的浓核病毒亚科。通常，这些ITR为约145个核苷酸并且本质上相对于另一个反向。依赖细小病毒包括腺相关病毒(AAV)的病毒家族，其能够在脊椎动物宿主中复制，所述宿主包括(但不限于)：人类、灵长类动物、牛、犬、马和羊物种。

如本文所用，术语“末端解链位点”和“TRS”在可互换地使用，并且是指一个区域，在所述区域处Rep与5'胸苷形成酪氨酸-磷酸二酯键，产生3'OH，其充当通过细胞DNA聚合酶，例如DNA polδ或DNA polε进行DNA延伸的底物。可替代地，Rep-胸苷复合物可以参与配位接合反应。在一些实施例中，TRS最低限度地涵盖非碱基配对的胸苷。在一些实施例中，TRS的切口效率可以至少部分地由其在同一分子内距RBS的距离来控制。当受体底物是互补ITR时，所产生的产物是分子内双螺旋体。TRS序列在所属领域中是已知的，并且包括例如5'-GGTTGA-3'(SEQ ID NO:45)，即AAV2中所鉴定的六核苷酸序列。本发明的实施例中可以使用任何已知的TRS序列，包括其它已知的AAV TRS序列和其它天然已知或合成的TRS序列，如AGTT(SEQ ID NO:46)、GGTTGG(SEQ ID NO:47)、AGTTGG(SEQ ID NO:48)、AGTTGA(SEQ IDNO:49)和其它基序，如RRTTRR(SEQ ID NO:50)。

如本文所用，术语“转录调控因子”意指活化或遏制所关注基因转录的转录活化因子和阻遏子。启动子为引发特定基因转录的核酸区域。转录活化因子通常结合于转录启动子附近并且募集RNA聚合酶以直接引发转录。阻遏子与转录启动子结合，并在空间上阻碍RNA聚合酶引发转录。其它转录调控因子可以取决于其结合位置以及细胞和环境条件来充当活化因子或阻遏子。转录调控因子类别的非限制性实例包括(但不限于)：同源域蛋白、锌指蛋白、翼状螺旋(叉头)蛋白和亮氨酸拉链蛋白。

如本文所用，术语“治疗(treat/treating/treatment)”包括减轻、大体上抑制、减缓或逆转病状的进展，大体上改善病状的临床症状或大体上预防病状的临床症状的出现、获得有益或所需的临床结果。治疗进一步指代实现以下中的一个或多个：(a)降低病症的严重程度；(b)限制所治疗的一种或多种病症的症状特征的发展；(c)限制所治疗的一种或多种病症的症状特征的恶化；(d)限制先前患有病症的患者中的一种或多种病症的复发；以及(e)限制先前对于一种或多种病症无症状的患者中的症状的复发。

有益或所需的临床结果，如药理学和/或生理学作用，包括(但不限于)：预防可能易患有疾病、病症或病状但尚未经历或展现疾病的症状的个体出现所述疾病、病症或病状(防治性治疗)；缓解所述疾病、病症或病状的症状；减轻所述疾病、病症或病状的程度；稳定所述疾病、病症或病状(即，不恶化)；预防所述疾病、病症或病状的扩散；延迟或减缓所述疾病、病症或病状进展；改善或缓和所述疾病、病症或病状；和其组合，以及与如果不接受治疗所预期的存活期相比，延长存活期。

如本文所用，术语活性剂(例如，如本文所描述的ceDNA脂质粒子)的“治疗量”、“治疗有效量”、“有效量”或“药学上有效量”可互换地使用以指代足以提供治疗的预期益处的量。然而，剂量水平是基于多种因素，包括损伤类型、年龄、体重、性别、患者的医学病状、病状的严重程度、施用途径和所采用的特定活性剂。因此，剂量方案可以在很大范围内变化，但可以由医生使用标准方法常规地确定。另外，术语“治疗量”、“治疗有效量”和“药学上有效量”包括所描述的本发明的组合物的防治或预防量。在所描述的本发明的防治性或预防性应用中，以足以消除或降低疾病、病症或病状的风险、减轻严重程度或延迟发病的量向易患有疾病、病症或病状或以其它方式处于疾病、病症或病状风险下的患者施用药物组合物或药剂，所述疾病、病症或病状包括疾病、病症或病状的生物化学、组织学和/或行为症状，其并发症和在疾病、病症或病状的发展期间呈现的中间病理学表型。通常优选使用最大剂量，即，根据一些医学判断的最高安全剂量。术语“剂量(dose/dosage)”在本文中可互换地使用。

如本文所用，术语“治疗效果”是指治疗的结果，其结果被判定为合乎需要并且有益的。治疗效果可以直接或间接地包括疾病表现的遏制、减少或消除。治疗效果还可以直接或间接地包括疾病表现的进展的遏制减少或消除。

对于本文所描述的任何治疗剂，治疗有效量可以初始地根据初步的体外研究和/或动物模型来确定。治疗有效剂量也可以根据人数据来确定。可以基于相对生物利用度和施用的化合物的效力调节施用剂量。基于上述方法和其它熟知的方法调整剂量以实现最大功效在普通技术人员的能力内。下文总结了用于测定治疗有效性的一般原理，其可以在《古德曼和吉尔曼的治疗学的药理学基础(Goodman and Gilman's The PharmacologicalBasis of Therapeutics)》,第10版,麦格劳-希尔专业出版公司(McGraw-Hill)(纽约)(2001)的第1章中找到，所述文献以引用的方式并入本文中。

药代动力学原理为修改剂量方案以获得期望程度的治疗功效并且具有最小的不可接受的副作用提供了基础。在可以测量药物的血浆浓度并且与治疗窗口有关的情况下，可以获得针对剂量修改的另外的指导。

如本文所用，术语“载体”或“表现载体”意指复制子，如质粒、杆粒、噬菌体、病毒、病毒粒子或粘粒，可以附接另一个DNA区段，即“插入物”“转基因”或“表达盒”，以便实现所附接区段(“表达盒”)在细胞中的表达或复制。载体可以是设计用于递送到宿主细胞或用于在不同宿主细胞之间转移的核酸构建体。如本文所用，载体可以以最终形式起源于病毒或非病毒。然而，出于本公开的目的，“载体”通常是指合成AAV载体或带切口的DNA载体。因此，术语“载体”涵盖与适当的控制元件缔合时能够复制并且可以将基因序列转移到细胞的任何基因元件。在一些实施例中，载体可以是重组载体或表达载体。

如本文所用，短语“重组载体”意指包括能够在体内表达的异源核酸序列或“转基因”的载体。应理解，在一些实施例中，本文所描述的载体可以与其它适合的组合物和疗法组合。在一些实施例中，载体是游离型的。适合的游离型载体的使用提供了一种以高拷贝数的染色体外DNA维持个体中的所关注核苷酸，从而消除染色体整合的潜在影响的方式。

如本文所用，“野生型ITR”或“WT-ITR”是指AAV或其它依赖病毒中天然存在的ITR序列的序列，其保留例如Rep结合活性和Rep切口能力。由于遗传密码的简并性或漂移，来自任何AAV血清型的WT-ITR的核苷酸序列可能与典型天然存在的序列略有不同，并且因此，本文涵盖使用的WT-ITR序列包括由于在产生过程中发生的天然存在的变化(例如复制误差)而产生的WT-ITR序列。

如本文所用，术语“包含(comprising/comprises)”在提及组合物、方法以及对所述方法或组合物来说必不可少的一种或所种其相应组分时使用，但对于包括未指明的要素，无论是否必要，仍然是开放的。

如本文所用，术语“基本上由……组成”是指给定实施例所需要的那些要素。所述术语允许存在不实质影响所述实施例的一个或多个基本和新颖或功能性特征的要素。

术语“由……组成”是指如本文所描述的组合物、方法和其相应组分，其排除在所述实施例的描述中未叙述的任何要素。

如本说明书和所附权利要求书所用，除非上下文另有明确规定，否则单数形式“一种/一个(a/an)”和“所述”包括多个提及物。因此，举例来说，提到“方法”包括本文所描述的和/或在阅读本公开等之后对于所属领域技术人员而言将变得显而易见的类型的一个或多个方法和/或步骤。类似地，除非上下文另有明确规定，否则单词“或”旨在包括“和”。尽管与本文所描述的方法和材料相似或等效的那些方法和材料可以用于实施或测试本公开，但在下文描述适合的方法和材料。缩写“例如(e.g.)”源自于拉丁文exempli gratia，并且在本文中用以指示非限制性实例。因此，缩写“例如(e.g.)”与术语“例如(for example)”同义的。

如本文所用，术语“如”、“例如”等意图指代示例性实施例，而不限制本公开的范围。

除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。尽管与本文所描述的任何方法和材料相似或等效的那些方法和材料可以用于实施以测试本发明，但在本文描述优选的材料和方法。

除了在操作例中或在另外指示的情况下，本文所使用的表示成分或反应条件的量的所有数字都应理解为在所有情况下均由术语“约”修饰。术语“约”在结合百分比使用时，可以意指±1％。以下实例进一步详细解释本发明，但本发明的范围不应限于此。

应理解，本发明不限于本文所描述的特定方法、方案和试剂等，并且因此可以变化。本文中所用的术语仅是出于描述特定实施例的目的，而无意于限制本发明的范围，本发明的范围仅仅由权利要求书限定。

II.封闭式DNA(ceDNA)载体

本文提供了具有共价封闭端的新颖非病毒无衣壳的ceDNA分子(ceDNA)。如本文所公开的ceDNA载体不存在由病毒衣壳内的有限空间所强加的包装局限。与囊封的AAV基因组相反，ceDNA载体是活真核生物产生的，其代表着原核生物产生的质粒DNA载体的替代方案。这允许插入控制元件，例如如本文所公开的调控开关、较大转基因、多个转基因等，并且必要时并入转基因的天然基因调控元件。

ceDNA载体有许多与基于质粒的表达载体不同的结构特点。ceDNA载体可以具有以下特点中的一个或多个：缺乏原始(即没有插入)的细菌DNA；缺乏原核复制起点；是自给的，即其不需要除两个ITR以外的任何序列，包括Rep结合位点和末端解链位点(RBS和TRS)以及ITR之间的外源序列；存在形成发夹的ITR序列；具有真核来源(即其在真核细胞中产生)；以及不存在细菌型DNA甲基化或实际上被哺乳动物宿主认为异常的任何其它甲基化。一般来说，本发明载体优选不含有任何原核DNA，但作为非限制性实例，预期可以将一些原核DNA作为外源序列插入启动子或增强子区中。区分ceDNA载体与质粒表达载体的另一个重要特点是，ceDNA载体是具有封闭端的单链线性DNA，而质粒始终是双链DNA。

使用如本文所描述的ceDNA载体存在优于基于质粒的表达载体的若干优点。此类优点包括(但不限于)：1)质粒含有细菌DNA序列并且经历原核特异性甲基化，例如6-甲基腺苷和5-甲基胞嘧啶甲基化，而无衣壳AAV载体序列具有真核起源并且未经历原核特异性甲基化；因此，相较于质粒，无衣壳AAV载体不大可能诱导发炎和免疫应答；2)质粒在产生过程期间需要存在抗性基因，而ceDNA载体则不需要；3)环状质粒在引入细胞后并不递送到细胞核并且需要过量装载以规避细胞核酸酶的降解作用，而载体含有病毒顺式元件，即经修饰的ITR，其赋予核酸酶抗性并且可以设计成靶向并递送到细胞核。假设对于ITR功能必不可少的最小定义元件是Rep结合位点(RBS；对于AAV2为5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'(SEQ ID NO:531))和末端解链位点(TRS；对于AAV2为5'-AGTTGG-3'(SEQ ID NO:48))加上允许发夹化成的可变回文序列。相比之下，用本文公开的无衣壳AAV载体进行的转导可以有效地靶向难以使用各种递送试剂用常规AAV病毒粒子转导的细胞和组织类型。

如通过限制酶消化分析和电泳分析所确定，ceDNA载体优选地具有线性和连续结构而非非连续结构(图5D)。相信线性和连续结构在受到细胞核酸内切酶攻击时更稳定，并且不太可能重组并引起诱变。因此，线性和连续结构的ceDNA载体是优选的实施例。连续、线性、单链的分子内双螺旋ceDNA载体可以具有共价结合的末端，而不具有编码AAV衣壳蛋白的序列。这些ceDNA载体在结构上不同于质粒(包括本文所描述的ceDNA质粒)，所述质粒是细菌来源的环状双螺旋核酸分子。质粒的互补链在变性后可以分离，从而产生两个核酸分子，而与此相反，ceDNA载体虽具有互补链，却是单个DNA分子，并且因此即使变性，也仍保持是单个分子。在一些实施例中，与质粒不同，如本文所描述的ceDNA载体可以在没有原核类型的DNA碱基甲基化情况下产生。因此，在结构方面(特别是线性相对于环状)以及还考虑用于产生和纯化这些不同物体(参见下文)的方法方面，并且还考虑其DNA甲基化方面，即ceDNA-质粒属于原核类型而ceDNA载体属于真核类型，ceDNA载体和ceDNA质粒是不同的。

本文提供了具有共价封闭端的非病毒无衣壳的ceDNA分子(ceDNA)。这些非病毒无衣壳的ceDNA分子可以在容许宿主细胞中由含有安置于两个对称反向末端重复(ITR)序列之间的异源基因(转基因)的表达构建体(例如，ceDNA-质粒、ceDNA-杆粒、ceDNA-杆状病毒或整合细胞系)产生，其中所述ITR不使野生型ITR并且相对于彼此对称。也就是说，ITR经修饰并且3'ITR的序列为5'ITR的序列的反向互补序列，并且反之亦然。在一些实施例中，与对应的野生型ITR序列(例如AAV ITR)相比，ITR通过缺失、插入和/或取代来修饰。在一些实施例中，经修饰的ITR包含功能性末端解链位点(trs)和Rep结合位点。ceDNA载体优选为双螺旋体，例如相对于分子的至少一部分是自互补的，如表达盒(例如，ceDNA不是类似于质粒的双链环状分子)。ceDNA载体具有共价封闭端，并且因此抵抗核酸外切酶消化(例如，核酸外切酶I或核酸外切酶III)，例如在37℃下维持超过一小时。

在一个方面，ceDNA载体在5'到3'方向上包含：第一腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)、所关注的核苷酸序列(例如如本文所描述的表达盒)和第二AAV ITR。在一个实施例中，第一ITR(5'ITR)和第二ITR(3'ITR)相对于彼此不对称，也就是说，其彼此具有不同的3D空间构型。作为示例性实施例，第一ITR可以是野生型ITR，并且第二ITR可以是经突变或修饰的ITR，或反过来，其中第一ITR可以是经突变或修饰的ITR，并且第二ITR可以是野生型ITR。在一个实施例中，第一ITR和第二ITR都经突变或修饰但为不同的序列，或具有不同的修饰，或不是相同的经突变或修饰的ITR并且具有不同的3D空间构型。换句话说，具有不对称ITR的ceDNA载体具有一个ITR相对于WT-ITR的任何变化都不会反映在另一个ITR中的ITR；或可替代地，其中不对称ITR具有经突变或修饰的不对称ITR对，可以具有相对于彼此不同的序列和不同的三维形状。

根据一些实施例，ceDNA载体在5'到3'方向上包含：第一腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)、所关注的核苷酸序列(例如如本文所描述的表达盒)和第二AAV ITR，其中第一ITR和第二ITR相对于彼此对称，也就是说，其为相同的序列但彼此反向互补。也就是说，ceDNA载体可以包含ITR序列，其具有对称的三维空间组构，使得其结构在几何空间中为相同形状，或在3D空间中具有相同的A、C-C'和B-B'环。在此类实施例中，对称的ITR对或大体上对称的ITR对可以为不是野生型ITR的经突变或修饰的ITR。作为示例性实施例，第一ITR可以是野生型ITR，并且第二ITR可以是经突变或修饰的ITR，或反过来，其中第一ITR可以是经突变或修饰的ITR，并且第二ITR可以是野生型ITR。在一个实施例中，第一ITR和第二ITR都经修饰但为不同的序列，或具有不同的修饰，或不是相同的经修饰的ITR并且具有不同的3D空间构型。作为另一个示例性实施例，第一ITR(或5'ITR)可以为经修饰的ITR，例如SEQ ID NO:484(即，ITR-33，左)，并且第二ITR(或3'ITR)可以为经突变或修饰的ITR，例如SEQ ID NO:469(即，ITR-18，右)。换句话说，具有不对称ITR的ceDNA载体包含如下ITR：其中一个ITR相对于WT-ITR的任何变化均未反映于另一个ITR中；或可替代地，其中不对称ITR具有经修饰的不对称ITR对，可以具有相对于彼此不同的序列和不同的三维形状。经突变或修饰的ITR对可以具有相同的相对于野生型ITR具有一个或多个修饰的序列，并且彼此反向互补(反向)。在一个实施例中，经修饰的ITR对如本文所定义是大体上对称的，也就是说，经修饰的ITR对可以具有不同的序列，但具有对应或相同的对称三维形状。在一些实施例中，对称的ITR或大体上对称的ITR是如本文所描述的野生型(WT-ITR)。也就是说，两个ITR都具有野生型序列，但不一定必须是来自同一AAV血清型的WT-ITR。在一个实施例中，一个WT-ITR可以来自一种AAV血清型，而另一个WT-ITR可以来自不同的AAV血清型。在此类实施例中，WT-ITR对如本文所定义是大体上对称的，也就是说，其可以具有一个或多个保守核苷酸修饰，同时仍保持对称的三维空间组构。

根据一些实施例，ceDNA载体在5'到3'方向上包含：第一野生型腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)、所关注的核苷酸序列(例如如本文所描述的表达盒)和第二AAVITR，其中第一WT-ITR和第二WT-ITR来自同一AAV血清型或来自不同的AAV血清型。作为示例性实施例，第一WT-ITR(或5'WT-ITR)可以是AAV2，并且第二WT-ITR(或3'WT-ITR)可以是AAV6。下文在标题为“ITR”的章节中和在本文的表1中讨论了ceDNA载体中并用于产生ceDNA-质粒的示例性WT-ITR。

本文所提供的野生型ITR序列表示用于生产ceDNA载体的表达构建体中所包括的DNA序列(例如，ceDNA-质粒、ceDNA杆粒、ceDNA-杆状病毒)。

在一些实施例中，本文所描述的ceDNA载体包含具有转基因的表达盒，所述转基因可以是例如调控序列、编码核酸的序列(例如miR或反义序列)或编码多肽的序列(例如转基因)。在一个实施例中，转基因可以可操作地连接到允许或控制转基因的表达的一个或多个调控序列。在一个实施例中，多核苷酸包含第一WT-ITR序列和第二WT-ITR序列，其中所关注的核苷酸序列侧接第一和第二WT-ITR序列。

示例性ITR在以下中讨论：标题为“ITR”的章节和本文的表2和表5，或2018年9月7日提交的PCT/US18/49996的表2、3、4、5、6、7、8、9或10A-10B，其中侧接ITR序列与其对称(例如，反向互补)或大体上与其对称。

本文所提供的ITR序列表示用于生产ceDNA载体的表达构建体中所包括的DNA序列(例如，ceDNA-质粒、ce-DNA杆粒、ceDNA-杆状病毒)。因此，实际上含于由ceDNA-质粒或其它表达构建体产生的ceDNA载体中的ITR序列可以或可以不与本文所提供的ITR序列相同，这是由于在产生过程期间发生的天然存在的(包括保守和非保守修饰)变化(例如复制误差)。

在一些实施例中，本文所述的包含具有作为治疗性核酸序列的转基因的表达盒ceDNA载体可以可操作地连接到允许或控制转基因的表达的一或多个调控序列。在一个实施例中，多核苷酸包含第一ITR序列和第二ITR序列，其中所关注的核苷酸序列侧接第一和第二ITR序列，并且第一和第二ITR序列相对于彼此不对称，或相对于彼此对称。

在一个实施例中，表达盒位于两个ITR之间，所述ITR按以下次序包含以下中的一个或多个：可操作地连接到转基因的启动子、转录后调控元件以及聚腺苷酸化和终止信号。在一个实施例中，启动子是可调控的-可诱导的或可抑制的。启动子可以是促进转基因转录的任何序列。在一个实施例中，启动子是CAG启动子(例如SEQ ID NO:03)或其变体。转录后调控元件是调节转基因表达的序列，作为非限制性实例，是产生增强作为治疗性核酸序列的转基因的表达的三级结构的任何序列。

在一个实施例中，转录后调控元件包含WPRE(例如SEQ ID NO:8)。在一个实施例中，聚腺苷酸化和终止信号包含BGH聚A(例如SEQ ID NO:9)。可以另外使用所属领域已知的任何顺式调控元件或其组合，例如SV40晚期聚A信号上游增强子序列(USE)或其它转录后处理元件，包括(但不限于)单纯疱疹病毒的胸苷激酶基因，或乙型肝炎病毒(HBV)。在一个实施例中，表达盒在5'到3'方向上的长度大于已知在AAV病毒粒子中被衣壳化的最大长度。在一个实施例中，长度大于4.6kb、或大于5kb、或大于6kb、或大于7kb。本文中举例说明了各种表达盒。

表达盒可以包含超过4000个核苷酸、5000个核苷酸、10,000个核苷酸或20,000个核苷酸、或30,000个核苷酸、或40,000个核苷酸、或50,000个核苷酸，或在约4000-10,000个核苷酸或10,000-50,000个核苷酸之间的任何范围，或超过50,000个核苷酸。在一些实施例中，表达盒可以包含长度在500到50,000个核苷酸范围内的转基因(例如治疗性核酸序列)。在一些实施例中，表达盒可以包含长度在500到75,000个核苷酸范围内的转基因(例如治疗性核酸序列)。在一些实施例中，表达盒可以包含长度在500到10,000个核苷酸范围内的转基因(例如治疗性核酸序列)。在一些实施例中，表达盒可以包含长度在1000到10,000个核苷酸范围内的转基因(例如治疗性核酸序列)。在一些实施例中，表达盒可以包含长度在500到5,000个核苷酸范围内的转基因(例如治疗性核酸序列)。ceDNA载体不具有衣壳化AAV载体的大小限制，因此能够递送大尺寸的表达盒来提供有效的转基因表达。在一些实施例中，ceDNA载体缺乏原核生物特异性甲基化。

根据一些实施例，表达盒还可以包含内部核糖体进入位点(IRES)和/或2A元件。顺式调控元件包括(但不限于)：启动子、核糖开关、隔离子、mir可调控元件、转录后调控元件、组织和细胞类型特异性启动子以及增强子。在一些实施例中，ITR可以充当转基因的启动子。在一些实施例中，ceDNA载体包含其它组分来调控转基因的表达，例如调控开关，其在本文中标题为用于控制和调控转基因的表达的“调控开关”的章节中描述，并且如果需要，可以包括作为杀灭开关的调控开关，从而能够使包含ceDNA载体的细胞实现可控的细胞死亡。

图1A-1B展示了非限制性的示例性ceDNA载体或ceDNA质粒的相应序列的示意图。ceDNA载体无衣壳，并且可以从按以下次序编码的质粒获得：第一ITR、可表达的转基因盒和第二ITR，其中第一和/或第二ITR序列相对于相应的野生型AAV2 ITR序列突变，并且突变是相同的(即，经修饰的ITR是对称的)。可表达的转基因盒优选依次包括以下中的一个或多个：增强子/启动子、ORF报道子(转基因)、转录后调控元件(例如WPRE)以及聚腺苷酸化和终止信号(例如BGH聚A)。

图2A-2B展示了非限制性的示例性ceDNA载体或ceDNA质粒的相应序列的示意图。ceDNA载体无衣壳，并且可以从按以下次序编码的质粒获得：第一WT-ITR、可表达的转基因盒和第二WT-ITR。在一些实施例中，第一和第二ITR序列为野生型AAV2 ITR序列。在一些实施例中，第一和第二ITR序列是选自表1中所示的WT-ITR的组合中的任一个。可表达的转基因盒优选依次包括以下中的一个或多个：增强子/启动子或调控开关、ORF报道子(转基因)、转录后调控元件(例如WPRE)以及聚腺苷酸化和终止信号(例如BGH聚A)。

图2018年9月7日提交的并且以全文引用的方式并入本文中的国际申请第PCT/US2018/050042号的1A-1C展示非限制性示例性ceDNA载体或ceDNA质粒的相应序列的示意图。ceDNA载体无衣壳，并且可以从按以下次序编码的质粒获得：第一ITR、可表达的转基因盒和第二ITR，其中第一和/或第二ITR序列中的至少一个相对于相应的野生型AAV2 ITR序列突变。可表达的转基因盒优选依次包括以下中的一个或多个：增强子/启动子、ORF报道子(转基因)、转录后调控元件(例如WPRE)以及聚腺苷酸化和终止信号(例如BGH聚A)。

治疗性核酸

表达盒可以包含任何所关注的转基因。所关注的转基因包括(但不限于)：编码多肽的核酸，或优选地治疗性(例如用于医学、诊断或兽医学用途)或免疫原性(例如用于疫苗)多肽的非编码核酸(例如RNAi、miR等)。在某些实施例中，表达盒中的转基因编码一种或多种多肽、肽、核酶、肽核酸、siRNA、RNAi、反义寡核苷酸、反义多核苷酸、抗体、抗原结合片段或其任何组合。

本公开的说明性治疗性核酸可以包括(但不限于)：小基因、质粒、小环、小干扰RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)、反义寡核苷酸(Msg)、核酶、封闭式双链DNA(例如，ceDNA、CELiD、线性共价封闭DNA(“辅助”)、doggybone

本发明还预期可以通过称作RNA干扰(RNAi)的过程下调特定蛋白质的细胞内水平的siRNA或miRNA为核酸治疗剂。在将siRNA或miRNA引入宿主细胞的胞质中之后，这些双链RNA构建体可以结合到称为RISC的蛋白质。siRNA或miRNA的有义链通过RISC复合物去除。RISC复合物当与互补mRNA组合时，裂解mRNA并且释放切割的链。RNAi是通过诱导mRNA的特异性破坏而导致相应蛋白质的下调。

抑制mRNA翻译到蛋白质中的反义寡核苷酸(ASO)和核酶可以是核酸治疗剂。对于反义构建体，这些单链脱氧核酸与目标蛋白mRNA的序列具有互补序列，并且沃森(Watson)能够通过克里克碱基配对(Crick base pairing)结合到mRNA。这一结合阻止目标mRNA的翻译，和/或触发mRNA转录物的RNaseH降解。因此，反义寡核苷酸具有增加的作用特异性(即，特定疾病相关蛋白的下调)。

在本文所提供的任何方法中，治疗性核酸可以是治疗性RNA。所述治疗性RNA可以是mRNA翻译的抑制剂、RNA干扰的药剂(RNAi)、催化活性RNA分子(核酶)、转移RNA(tRNA)或结合mRNA转录物(ASO)的RNA、蛋白质或其它分子配体(适体)。在本文所提供的方法中的任一种中，RNAi的药剂可以是双链RNA、单链RNA、微RNA、短干扰RNA、短发夹RNA或三链形成寡核苷酸。

在一些实施例中，转基因为治疗基因或标记蛋白。在一些实施例中，转基因为激动剂或拮抗剂。在一些实施例中，拮抗剂为模拟物或抗体、或抗体片段、或其抗原结合片段，例如中和抗体或抗体片段等。在一些实施例中，转基因编码如本文定义的抗体，包括全长抗体或抗体片段。在一些实施例中，抗体是如本文所定义的抗原结合域或免疫球蛋白可变域序列。

具体地说，转基因可以编码一种或多种治疗剂，包括(但不限于)例如用于治疗、防治和/或改善疾病、功能障碍、损伤和/或病症的一种或多种症状的一种或多种蛋白质、一种或多种多肽、一种或多种肽、一种或多种酶、抗体、抗原结合片段以及其变体和/或活性片段。示例性转基因描述于本文中的标题为“治疗方法”的章节中。

III.反向末端重复序列(ITR)

如本文所描述，根据一个实施例，ceDNA载体为无衣壳的线性双螺旋DNA分子，其由具有共价封闭末端的互补DNA(线性、连续和非衣壳化结构)的连续链形成，其包含不同的或相对于彼此不对称的5'反向末端重复(ITR)序列和3'ITR序列。根据一些实施例，ITR序列为野生型ITR序列。根据一些实施例，ITR序列不是野生型ITR序列。根据一些实施例，ITR序列为经修饰的ITR序列。

根据一些实施例，ceDNA载体含有位于两个侧接野生型反向末端重复(WT-ITR)序列之间的异源基因，所述侧接野生型反向末端重复序列彼此反向互补(反向)，或可替代地，相对于彼此大体上对称，即WT-ITR对具有对称的三维空间组构。在一些实施例中，野生型ITR序列(例如，AAV WT-ITR)包含功能性Rep结合位点(RBS；例如对于AAV2为5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'，SEQ ID NO:531)和功能性末端解链位点(TRS；例如5'-AGTT-3'，SEQID NO:46)。

根据一些实施例，ceDNA载体含有位于两个侧接修饰的反向末端重复序列(mod-ITR)之间的异源基因，所述侧接修饰的反向末端重复序列彼此的反向互补(反向)，或如本文所定义的大体上对称(即，具有对应的修饰)，并且不是野生型ITR。这些反向互补ITR被称作对称ITR。ITR通过缺失、插入和/或取代从现有天然存在的细小病毒野生型ITR(例如AAVITR)进行修饰；并且可以包含功能性Rep结合位点(RBS；例如对于AAV2为5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'，SEQ ID NO:531)和功能性末端解链位点(TRS；例如5'-AGTT-3'，SEQID NO:46)。

在一些实施例中，ITR序列可以来自细小病毒科的病毒，细小病毒科包括两个亚科：感染脊椎动物的细小病毒亚科，和感染昆虫的浓核病毒亚科。细小病毒亚科(称为细小病毒)包括依赖病毒属，其成员在大多数情况下需要与如腺病毒或疱疹病毒的辅助病毒共同感染才能进行产生性感染。依赖病毒属包括通常感染人类(例如血清型2、3A、3B、5和6)或灵长类动物(例如血清型1和4)的腺相关病毒(AAV)，以及感染其它温血动物的相关病毒(例如牛、犬、马和羊的腺相关病毒)。细小病毒和细小病毒科的其它成员大体描述于KennethI.Berns,《病毒学领域(FIELDS VIROLOGY)》(第3版，1996)中第69章“细小病毒科：病毒和其复制(Parvoviridae:The Viruses and Their Replication)”。所属领域的普通技术人员应了解，来自任何已知细小病毒的ITR可以用于如本文所描述的组合物和方法中。根据一些实施例，ITR来自依赖病毒，如AAV(例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV 5、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV 11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAV-DJ和AAV-DJ8基因组)。例如NCBI:NC002077；NC 001401；NC001729；NC001829；NC006152；NC 006260；NC 006261)、嵌合ITR或来自任何合成AAV的ITR。在一些实施例中，AAV可以感染温血动物，例如禽类(AAAV)、牛(BAAV)、犬、马和绵羊腺相关病毒。在一些实施例中，ITR来自B19细小病毒(基因库登录号:NC 000883)、来自小鼠的细小病毒(MVM)(基因库登录号NC 001510)；鹅细小病毒(基因库k登录号NC001701)；蛇细小病毒1(基因库登录号NC 006148)。

根据一些实施例，所选择的血清型可以基于血清型的组织嗜性。AAV2具有广泛的组织嗜性，AAV1优先靶向神经元和骨骼肌，而AAV5优先靶向神经元、视网膜色素上皮和感光体。AAV6优先靶向骨骼肌和肺。AAV8优先靶向肝脏、骨骼肌、心脏和胰腺组织。AAV9优先靶向肝脏、骨骼和肺组织。根据一些实施例，血清型为AAV2。

普通技术人员应了解ITR序列具有双链霍利迪连结体(Holliday junction)的共同结构，所述结构通常为T形或Y形发夹结构(参见例如图3A和图4A)，其中每个ITR由嵌入较大回文臂(A-A')中的两个回文臂或环(B-B'和C-C')和单链D序列形成，(其中这些回文序列的次序限定ITR的翻转或翻动取向)，并且因此基于本文所提供的示例性AAV2 ITR序列，一个人可以对来自任何AAV血清型的经修饰的ITR序列进行工程改造以用于ceDNA载体或ceDNA-质粒中。参见例如来自不同AAV血清型(AAV1-AAV6)的ITR的结构分析和序列比较，并描述于Grimm等人,《病毒学杂志(J.Virology)》,2006；80(1)；426-439；Yan等人,《病毒学杂志》,2005；364-379；Duan等人,《病毒学(Virology)》1999；261；8-14中。

因此，尽管AAV2 ITR用作本文所公开的ceDNA载体中的示例性ITR(例如野生型(WT)或经修饰的ITR)，但本文所公开的ceDNA载体可以用或基于任何已知AAV血清型的ITR制备，包括例如AAV血清型1(AAV1)、AAV血清型2(AAV2)、AAV血清型4(AAV4)、AAV血清型5(AAV5)、AAV血清型6(AAV6)、AAV血清型7(AAV7)、AAV血清型8(AAV8)、AAV血清型9(AAV9)、AAV血清型10(AAV10)、AAV血清型11(AAV11)或AAV血清型12(AAV12)。技术人员可以通过已知手段确定其它血清型的相应序列。本发明还提供包含来自不同AAV血清型的组合的ITR的ceDNA载体群体和多种ceDNA载体，即一个ITR(例如，野生型(WT)或经修饰的ITR)可以来自一种AAV血清型，并且另一个ITR(例如野生型(WT)或经修饰的ITR)可以来自不同的血清型。不希望受理论的束缚，在一个实施例中，一个ITR(例如，野生型(WT)或经修饰的ITR)可以来自或基于AAV2 ITR序列，而ceDNA载体的另一个ITR(例如，野生型(WT)或经修饰的ITR)可以来自或基于以下中的任一种或多种ITR序列：AAV血清型1(AAV1)、AAV血清型4(AAV4)、AAV血清型5(AAV5)、AAV血清型6(AAV6)、AAV血清型7(AAV7)、AAV血清型8(AAV8)、AAV血清型9(AAV9)、AAV血清型10(AAV10)、AAV血清型11(AAV11)或AAV血清型12(AAV12)。

WT-ITR中的特定更改和突变描述于本文中，使得ceDNA可以并入大体上对称的WT-ITR，也就是说，其具有对称的三维空间组构，使得其结构在几何空间中为相同的形状。这可以在将G-C对修改为例如C-G对或反过来时发生，或将A-T对修改为T-A对或反过来时发生。因此，使用包含ATCGATCG序列的5'WT-ITR和包含CGATCGAT(即，ATCGATCG的反向互补序列)的3'WT-ITR的上述示例性实例，如果例如5'WT ITR具有ATCGAACG序列，那么这些WT-ITR将仍大体上对称，其中T被修改为A，并且大体上对称的3'WT-ITR具有GCATCGAT序列，不具有A被修改为T。在一些实施例中，此类WT-ITR对为大体上对称的，因为其具有对称的三维空间组构。

本文详细地描述了ITR中的特定更改和突变，但在ITR背景下，“更改”或“突变”或“经修饰”指示核苷酸已相对于野生型或天然存在的ITR序列插入、删除和/或取代，其中侧接转基因或异源核酸的两个ITR具有与本文所定义的相同的修饰或大体上对称，即具有相同的三维空间组构，使得其结构在几何空间上形状相同。更改或突变的ITR可以是经工程改造的ITR。如本文所用，“经工程改造”是指通过人手进行操纵的方面。举例来说，当多肽的至少一个方面，例如其序列，通过人手进行操纵而不同于其自然存在的方面时，则认为所述多肽是“经工程改造”的。

在一些实施例中，ITR(例如野生型(WT)或经修饰的ITR)可以是合成的。在一个实施例中，合成ITR是基于来自超过一种AAV血清型的ITR序列。在另一个实施例中，合成ITR不包括基于AAV的序列。在又另一个实施例中，合成ITR尽管仅具有一些或不具有源自AAV的序列，但仍保留了上文所描述的ITR结构。在一些方面，合成ITR可以优先与野生型Rep或特定血清型的Rep相互作用，或在一些情况下，将不由野生型Rep识别并且仅由突变的Rep识别。在一些实施例中，ITR为保留功能性Rep结合位点(RBS)的合成ITR序列，所述功能性Rep结合位点如除允许发夹二级结构化成的可变回文序列以外的5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'和末端解链位点(TRS)。在一些实例中，经修饰的ITR序列从野生型AAV2 ITR的相应序列中保留RBS、trs的序列以及Rep结合元件的结构和位置，形成ITR发夹二级结构中的一个的末端环部分。用于ceDNA载体的示例性ITR序列公开于表2-9、10A和10B中，SEQ ID NO:2、52、101-449和545-547以及部分ITR序列展示于2018年9月7日提交的PCT申请第PCT/US 18/49996号的图26A-26B中。在一些实施例中，ceDNA载体可以包含ITR，其具有对应于2018年9月7日提交的PCT申请第PCT/US 18/49996号的表2、3、4、5、6、7、8、9、10A和10B中的一个或多个中所示的ITR序列或ITR部分序列中的修饰中的任一个的ITR中的修饰。

在一个实施例中，侧接ITR(例如野生型(WT)或经修饰的ITR)彼此大体上对称。在ITR为经修饰的ITR的情况下，修饰是相同的-添加、取代或缺失是相同的，但ITR不是相同的反向互补序列。举例来说，ITR(例如野生型(WT)或经修饰的ITR)可以来自不同的血清型(例如AAV1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12)，如AAV2与AAV6的组合，并在相应位置进行修饰。

在一个实施例中，当一个ITR相对于另一个ITR反向时，大体上对称的ITR为至少80％一致、至少90％一致、至少95％一致、至少96％一致、至少97％一致、至少98％一致或至少99％一致以及其间的所有点。同源性可以通过所属领域熟知的标准方法来确定，如默认设置下的BLAST(基本局部比对搜索工具)、BLASTN。当A、B和C环的总体几何形状类似时，认为ITR大体上对称。在一些实施例中，WT-ITR对由于其具有对称的三维空间组构，例如具有A、C-C'、B-B'和D臂的相同3D组构，因此是大体上对称的。在一个实施例中，大体上对称的WT-ITR对相对于彼此呈反向，并且彼此至少95％一致、至少96％…97％…98％…99％....99.5％以及其间的所有点，并且一个WT-ITR保留了5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'(SEQ IDNO:531)的Rep结合位点(RBS)和末端解链位点(trs)。在一些实施例中，大体上对称的WT-ITR对相对于彼此呈反向，并且彼此至少95％一致、至少96％…97％…98％…99％…99.5％和其间的所有点，并且一个WT-ITR保留5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'(SEQ ID NO:531)的Rep结合位点(RBS)和末端解链位点(trs)，此外保留允许发夹二级结构形成的可变回文序列。

在一个实施例中，大体上对称的经修饰的ITR对是指一对经修饰的ITR(mod-ITR)，只要ITR之间的核苷酸序列的差异不影响特性或整体形状并且其在3D空间中具有大体上相同的形状即可。举例来说，如通过所属领域中熟知的标准方法，如默认设置下的BLAST(基本局部比对搜索工具)或BLASTN测定，mod-ITR与典型的mod-ITR具有至少95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性，并且还具有对称的三维空间组构，以使其3D结构在几何空间中的形状相同。大体上对称的mod-ITR对在3D空间中具有相同的A、C-C'和B-B'环，例如，如果大体上对称的mod-ITR对中的经修饰的ITR缺失C-C'臂，那么同源mod-ITR对应缺失C-C'环，并且还具有在其同源mod-ITR的几何空间中呈相同形状的剩余A和B-B'环的类似3D结构。仅举例来说，大体上对称的ITR可以具有对称的立体化学，使得其结构在几何空间中是相同的形状。这可以例如在将G-C对修改为例如C-G对或反过来时发生，或将A-T对修改为T-A对或反过来时发生。因此，使用经修饰的5'ITR(如ATCGAACGATCG)和经修饰的3'ITR(如CGATCGTTCGAT(即，ATCGAACGATCG的反向互补序列))的上述示例性实例，如果例如5'ITR具有ATCGAACCATCG序列，其中添加中的G被修改为C，并且大体上对称的3'ITR具有CGATCGTTCGAT序列，不具有添加中的T被对应修改为A，那么这些经修饰的ITR仍为对称的。在一些实施例中，因为经修饰的ITR对具有对称的立体化学，所以此类经修饰的ITR对为大体上对称。

在一些实施例中，来自mod-ITR对的ITR可以具有不同的反向互补核苷酸序列，但仍具有相同的对称三维空间组构，即两个ITR都具有产生相同的总体3D形状的突变。举例来说，mod-ITR对中的一个ITR(例如5'ITR)可以来自一种血清型，而另一个ITR(例如3'ITR)可以来自不同的血清型，但是，两种都可以具有相同的对应突变(例如，如果5'ITR在C区中具有缺失，那么来自不同血清型的同源修饰的3'ITR在C'区的对应位置处也具有缺失)，以使得经修饰的ITR对具有相同的对称三维空间组构。大体上对称的mod-ITR对在3D空间中具有相同的A、C-C'和B-B'环。借助于非限制性实例，例如，如果大体上对称的mod-ITR对中的经修饰的ITR缺失C-C'臂，那么同源mod-ITR具有C-C'环的对应缺失并且还具有在其同源mod-ITR的几何空间中呈相同形状的剩余A和B-B'环的类似3D结构。在另一个实例中，如果5'mod-ITR在B区中具有一个或多个核酸的缺失，那么同源经修饰的3'-ITR在B'臂中的对应核苷酸位置处具有缺失。

所属领域的技术人员熟知，如果5'mod-ITR在A区具有修饰，那么同源3'ITR在A'区中的对应位置处具有修饰；如果5'mod-ITR在C区具有修饰，那么同源3'ITR在C'区中的对应位置处具有修饰，或反过来，如果5'mod-ITR在C'区具有修饰，那么同源3'ITR在C区中的对应位置处具有修饰；如果5'mod-ITR在B区具有修饰，那么同源3'ITR在B'区中的对应位置处具有修饰，或反过来，如果5'mod-ITR在B'区具有修饰，那么同源3'ITR在B区中的对应位置处具有修饰；以及如果5'mod-ITR在A'区具有修饰，那么同源3'mod-ITR在A区中的对应位置处具有修饰，使得mod-ITR为如本文所定义的对称的或大体上对称的，以使得经修饰的ITR对具有相同的对称三维空间组构。

在对称经修饰的ITR大体上对称的一些实施例中，侧接对称经修饰的ITR的核苷酸序列相对于其它ITR的差异在于变化为一个核酸被保守核酸取代。在对称经修饰的ITR大体上对称的一些实施例中，侧接对称经修饰的ITR的核苷酸序列相对于其它ITR的差异在于变化为一个或两个或三个核酸被其互补核酸取代，其中所述变化可以在整个ITR中依序或交替、分散或不依序。在对称经修饰的ITR对如本文所定义大体上对称的一些实施例中，ITR可以具有以下中的任一个的取代：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核酸被其相对于侧接大体上对称的经修饰的ITR的互补核酸取代，其条件是两个大体上对称的经修饰的ITR之间的核苷酸序列差异并不影响特性或整体形状并且其在3D空间中具有大体上相同的形状。

任何细小病毒ITR可以用作ITR(例如野生型(WT)或经修饰的ITR)或用作修饰的基础ITR。优选地，细小病毒是依赖病毒。更优选是AAV。所选择的血清型可以是基于血清型的组织嗜性。AAV2具有广泛的组织嗜性，AAV1优先靶向神经元和骨骼肌，而AAV5优先靶向神经元、视网膜色素上皮和感光体。AAV6优先靶向骨骼肌和肺。AAV8优先靶向肝脏、骨骼肌、心脏和胰腺组织。AAV9优先靶向肝脏、骨骼和肺组织。在一个实施例中，经修饰的ITR是基于AAV2ITR。

根据一些实施例，载体多核苷酸包含选自表1中所示的组的一对WT-ITR。表1展示来自相同血清型或不同血清型或不同细小病毒的WT-ITR的示例性组合。所示的次序并不指示ITR位置，例如，“AAV1，AAV2”表明ceDNA可以在5'位置包含WT-AAV1 ITR，而在3'位置包含WT-AAV2 ITR，反之亦然，5'位置包含WT-AAV2 ITR和3'位置包含WT-AAV1ITR。缩写：AAV血清型1(AAV1)，AAV血清型2(AAV2)，AAV血清型3(AAV3)，AAV血清型4(AAV4)，AAV血清型5(AAV5)，AAV血清型6(AAV6)，AAV血清型7(AAV7)，AAV血清型8(AAV8)，AAV血清型9(AAV9)，AAV血清型10(AAV10)，AAV血清型11(AAV11)或AAV血清型12(AAV12)；AAVrh8、AAVrh10、AAV-DJ和AAV-DJ8基因组(例如NCBI:NC 002077；NC 001401；NC001729；NC001829；NC006152；NC006260；NC 006261)，来自温血动物的ITR(禽AAV(AAAV)，牛AAV(BAAV)，犬、马和绵羊AAV)，来自B19细小病毒的ITR(基因库登录号:NC 000883)，来自小鼠的细小病毒(MVM)(基因库登录号NC 001510)；鹅：鹅细小病毒(基因库登录号NC001701)；蛇：蛇细小病毒1(基因库登录号NC 006148)。

表1：WT-ITR的示例性组合

根据一些实施例，具有共价封闭端的载体多核苷酸或非病毒无衣壳DNA载体包含选自表2中所示的WT-ITR的一对WT-ITR。仅举例来说，表2展示来自不同AAV血清型的示例性WT-ITR的序列。

表2：来自不同AAV血清型的示例性WT-ITR

在本发明的某些实施例中，ceDNA载体不具有由选自表2中的序列的任一个的核苷酸序列组成的WT-ITR。根据一些实施例，ceDNA载体不具有由选自以下中的任一个的核苷酸序列组成的WT-ITR：SEQ ID NO:558-567、SEQ ID NO:51或SEQ ID NO:1。

在本发明的替代实施例中，如果ceDNA载体具有包含选自以下中的任一个的核苷酸序列的WT-ITR：SEQ ID NO:558-567、SEQ ID NO:51或SEQ ID NO:1，那么侧接ITR也是WT，并且cDNA包含调控开关，例如如本文所公开的。在一些实施例中，ceDNA载体包含如本文公开的调控开关和所选择的WT-ITR，所述WT-ITR具有选自以下组成的组中的任一个的核苷酸序列：SEQ ID NO:558-567、SEQ ID NO:51或SEQ ID NO:1。

本文所描述的ceDNA载体可以包括保留了可操作的RBE、trs和RBE'部分的WT-ITR结构。出于示例性目的使用野生型ITR，图3A和图3B展示了关于ceDNA载体的野生型ITR结构部分内的trs位点操作的一种可能机制。在一些实施例中，ceDNA载体含有一个或多个功能性WT-ITR多核苷酸序列，所述序列包含Rep结合位点(RBS；对于AAV2为5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'(SEQ ID NO:531))和末端解链位点(TRS；5'-AGTT(SEQ ID NO:46))。在一些实施例中，至少一个WT-ITR是功能性的。在替代实施例中，在ceDNA载体包含彼此大体上对称的两个WT-ITR的情况下，至少一个WT-ITR是功能性的，并且至少一个WT-ITR是非功能性的。在替代实施例中，在ceDNA载体包含彼此对称的两个经修饰的ITR的情况下，至少一个经修饰的ITR是功能性的并且至少一个经修饰的ITR是非功能性的。这些DNA可以包含调控开关，例如如本文所公开并且在下文中的章节V中进一步详细描述。

在一些实施例中，ceDNA载体不具有选自如本文所提供的SEQ ID NO:500-529组成或基本由其组成的任何序列的经修饰的ITR。在一些实施例中，ceDNA载体不具有选自从SEQID NO:500-529选择的任何序列的ITR。

根据一些实施例，ceDNA载体包含选自以下组成的组的一对ITR：SEQ ID NO:484(ITR-33左)与SEQ ID NO:469(ITR-18，右)；SEQ ID NO:485(ITR-34左)与SEQ ID NO:95(ITR-51，右)；SEQ ID NO:486(ITR-35左)与SEQ ID NO:470(ITR-19，右)；SEQ ID NO:487(ITR-36左)与SEQ ID NO:471(ITR-20，右)；SEQ ID NO:488(ITR-37左)与SEQ ID NO:472(ITR-21，右)；SEQ ID NO:489(ITR-38左)与SEQ ID NO:473(ITR-22右)；SEQ ID NO:490(ITR-39左)与SEQ ID NO:474(ITR-23，右)；SEQ ID NO:491(ITR-40左)与SEQ ID NO:475(ITR-24，右)；SEQ ID NO:492(ITR-41左)与SEQ ID NO:476(ITR-25右)；SEQ ID NO:493(ITR-42左)与SEQ ID NO:477(ITR-26右)；SEQ ID NO:494(ITR-43左)与SEQ ID NO:478(ITR-27右)；SEQ ID NO:495(ITR-44左)与SEQ ID NO:479(ITR-28右)；SEQ ID NO:496(ITR-45左)与SEQ ID NO:480(ITR-29，右)；SEQ ID NO:497(ITR-46左)与SEQ ID NO:481(ITR-30，右)；SEQ ID NO:498(ITR-47，左)与SEQ ID NO:482(ITR-31，右)；SEQ ID NO:499(ITR-48，左)与SEQ ID NO:483(ITR-32右)。

在这些方面中的每一个的一个实施例中，具有共价封闭端的ceDNA载体或非病毒无衣壳DNA载体包含选自包含图6B-21B中所示的部分ITR序列的ITR或选自以下的组合的一对对称的ITR：SEQ ID NO:101与SEQ ID NO:102；SEQ ID NO:103与SEQ ID NO:96；SEQ IDNO:105与SEQ ID NO:106；SEQ ID NO:545与SEQ ID NO:116；SEQ ID NO:111与SEQ ID NO:112；SEQ ID NO:117与SEQ ID NO:118；SEQ ID NO:119与SEQ ID NO:120；SEQ ID NO:121与SEQ ID NO:122；SEQ ID NO:107与SEQ ID NO:108；SEQ ID NO:123与SEQ ID NO:124；SEQID NO:125与SEQ ID NO:126；SEQ ID NO:127与SEQ ID NO:128；SEQ ID NO:129与SEQ IDNO:130；SEQ ID NO:131与SEQ ID NO:132；SEQ ID NO:133与SEQ ID NO:134；SEQ ID NO:547与SEQ ID NO:546。

在一些实施例中，ceDNA载体可以包含ITR，其具有与表5中所示的ITR序列或ITR部分序列，或图7A到22B中或2018年9月7日提交的PCT/US18/49996的表2、3、4、5、6、7、8、9或10A-10B中所示的序列中的修饰的任一个对应的ITR中的修饰，其中侧接ITR序列为其对称的(例如，反向互补)或大体上对称的。

在一些实施例中，ceDNA可以形成分子内双螺旋体二级结构。仅举例来说，在野生型ITR(参见例如图2A、2B、4C)和或经修饰的ITR结构(参见例如图7A到22B)的背景下，示例第一ITR和对称的第二ITR的二级结构。基于用于产生ceDNA载体的质粒的ITR序列推测或预测二级结构。经修饰的对称ITR对的示例性二级结构展示于图7A-22B中，其中茎-环结构的一部分缺失。包含单个茎和两个环的经修饰的ITR的示例性二级结构展示于图10A-10B、12A-12B、13A-13B、13A-22B中。具有单个茎和单个环的经修饰的ITR的示例性二级结构展示于图7A-7B(例如，单个C-C'环)和图8A-8B(例如，单个B-B'环)中。具有单个茎代替两个环的经修饰的ITR的示例性二级结构展示于图11A-11B中。在一些实施例中，可以使用基于预测如通过折叠自由能变化所定量的结构的稳定性的最靠近的邻近规则的热力学方法来推测如本文所示的二级结构。举例来说，可以通过发现最低自由能结构来预测结构。在一些实施例中，公开于Reuter,J.S.,&Mathews,D.H.(2010)《RNA结构：用于预测和分析RNA二级结构的软件(RNAstructure:software for RNA secondary structure prediction andanalysis.)》《BMC生物信息学(BMC Bioinformatics)》,11,129中并且在RNA结构软件中实施(万维网网址：“rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb/index.html”处获得)的算法可以用于预测ITR结构。所述算法还可以包括37℃下的自由能变化参数和来源于实验文献的焓变化参数以允许预测任意温度下的构象稳定性。使用RNA结构软件，可以将经修饰的ITR结构中的一些预测为具有估计在图7A-22B中所示的生理条件下去折叠的吉布斯自由能(ΔG)的经修饰的T形茎-环结构。使用RNA结构软件，预测三种类型的经修饰的ITR具有比AAV2的野生型ITR高的去折叠的吉布斯自由能(-92.9kcal/mol)并且如下：(a)预测本文所提供的具有单个臂/单个不成对的环结构的经修饰的ITR具有在-85kcal/mol与-70kcal/mol之间的范围内的去折叠的吉布斯自由能。(b)预测具有本文所提供的单发夹结构的经修饰的ITR具有在-70kcal/mol与-40kcal/mol之间的范围内的去折叠的吉布斯自由能。(c)预测具有本文所提供的两个臂结构的经修饰的ITR具有在-90kcal/mol与-70kcal/mol之间的范围内的去折叠的吉布斯自由能。不希望受理论所束缚，具有较高吉布斯自由能的结构更容易去折叠，以供Rep 68或Rep 78复制蛋白复制。因此，具有较高去折叠的吉布斯自由能的经修饰的ITR(例如，单个臂/单个不成对的环结构、单发夹结构、截断结构)往往比野生型ITR更有效率地复制。

在一个实施例中，ceDNA载体的左ITR相对于野生型AAV ITR结构经修饰或突变，并且右ITR是具有相同突变的对称(反向互补)。在一个实施例中，ceDNA载体的右ITR相对于野生型AAV ITR结构经修饰，并且左ITR是具有相同突变的对称(反向互补)ITR。在此类实施例中，ITR(例如，左或右ITR)的修饰可以通过来自来源于AAV基因组的野生型ITR的一个或多个核苷酸的缺失、插入或取代来产生。

本文所使用的ITR可以是可分辨的和不可分辨的，并且选择用于ceDNA载体中的ITR优选地是AAV序列，其中血清型1、2、3、4、5、6、7、8和9是优选的。可分辨的AAV ITR不需要野生型ITR序列(例如，内源性或野生型AAV ITR序列可以通过插入、缺失、截断和/或错义突变来更改)，只要末端重复介导所需功能，例如复制、病毒包装、整合和/或前病毒拯救等即可。通常(但不一定)，ITR来自相同的AAV血清型，例如ceDNA载体的两种ITR序列都来自AAV2。如上文所讨论，在一些实施例中，经修饰的ITR对大体上对称，因为其具有对称的三维空间组构，但不具有相同的反向互补核苷酸序列。在此类实施例中，经修饰的ITR对中的每个ITR可以来自不同血清型(例如AAV1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12)，如AAV2与AAV6的组合，其中一个ITR中的修饰在来自不同血清型的同源ITR的对应位置得到反映。在一些实施例中，经修饰的ITR可以是充当AAV反向末端重复序列的合成序列，如Samulski等人的美国专利第5,478,745号中所描述的“双D序列”。

在一个实施例中，ceDNA可以包括相对于本文所公开的野生型ITR中的一个突变的ITR结构，但其中突变型或经修饰的ITR仍保留可操作的Rep结合位点(RBE或RBE')和末端解链位点(trs)。在一个实施例中，突变型ceDNA ITR包括功能性复制蛋白位点(RPS-1)并且结合RPS-1位点的复制胜任型蛋白质用于生产。

在一个实施例中，ITR中的至少一个是相对于Rep结合和/或Rep切口的有缺陷的ITR。在一个实施例中，相对于野生型ITR，缺陷为至少30％，在其它实施例中，其为至少35％...、50％...、65％...、75％...、85％...、90％...、95％...、98％...或完全缺乏功能或其间的任一点。宿主细胞不表达病毒衣壳蛋白并且多核苷酸载体模板不含任何病毒衣壳编码序列。在一个实施例中，不含AAV衣壳基因的多核苷酸载体模板和宿主细胞以及所得蛋白质也不编码或表达其它病毒的衣壳基因。另外，在特定实施例中，核酸分子还不含AAVRep蛋白编码序列。

在一些实施例中，ITR的结构元件可以是参与ITR与较大Rep蛋白(例如Rep 78或Rep 68)的功能性相互作用的任何结构元件。在某些实施例中，结构元件为ITR与较大Rep蛋白的相互作用提供选择性，即，至少部分确定哪种Rep蛋白与ITR功能性相互作用。在其它实施例中，当Rep蛋白与ITR结合时，结构元件与较大Rep蛋白物理上相互作用。每个结构元件可以是例如ITR的二级结构、ITR的核苷酸序列、两个或更多个元件之间的间隔，或上述任一个的组合。在一个实施例中，结构元件选自以下组成的组：A和A'臂、B和B'臂、C和C'臂、D臂、Rep结合位点(RBE)和RBE'(即互补RBE序列)以及末端解链位点(trs)。

更确切地说，ITR可以在结构上进行修饰。举例来说，可以与ITR的野生型序列相比较来修饰结构元件的核苷酸序列。在一个实施例中，可以去除ITR的结构元件(例如A臂、A'臂、B臂、B'臂、C臂、C'臂、D臂、RBE、RBE'和trs)并用来自不同细小病毒的野生型结构元件替代。举例来说，替代结构可以来自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、蛇细小病毒(例如巨蟒细小病毒)、牛细小病毒、山羊细小病毒、禽类细小病毒、犬细小病毒、马细小病毒、虾细小病毒、猪细小病毒或昆虫AAV。举例来说，ITR可以是AAV2 ITR，并且A或A'臂或RBE可以用来自AAV5的结构元件替代。在另一个实例中，ITR可以是AAV5 ITR，并且C或C'臂、RBE和trs可以用来自AAV2的结构元件替代。在另一个实例中，AAV ITR可以是B和B'臂被AAV2 ITR B和B'臂替代的AAV5 ITR。

仅举例来说，表3指示在经修饰的ITR的区域中的至少一个核苷酸的示例性修饰(例如缺失、插入和/或取代)，其中X指示在所述部分中相对于对应野生型ITR的至少一个核酸的修饰(例如缺失、插入和/或取代)。在一些实施例中，在C和/或C'和/或B和/或B'的任何区域中的至少一个核苷酸的任何修饰(例如缺失、插入和/或取代)在至少一个末端环中保留三个连续的T核苷酸(即，TTT)。举例来说，如果修饰引起以下中任一种：单臂ITR(例如，单个C-C'臂或单个B-B'臂)或经修饰的C-B'臂或C'-B臂、或具有至少一个截断臂(例如截断的C-C'臂和/或截断的B-B'臂)的两臂ITR，那么至少所述单臂、或两臂ITR(其中一个臂可以是截断的)的至少一个臂在至少一个末端环中保留三个连续的T核苷酸(即TTT)。在一些实施例中，截断的C-C'臂和/或截断的B-B'臂在末端环中具有三个连续的T核苷酸(即TTT)。

表3描绘ITR的不同B-B'和C-C'区或臂的至少一个核苷酸的修饰(例如缺失、插入和/或取代)的示例性组合(X指示核苷酸修饰，例如所述区域中的至少一个核苷酸的添加、缺失或取代)。

表3：修饰的示例性组合

在一些实施例中，本文中使用的经修饰的ITR可以包含表3中展示的修饰的组合中的任一个，以及还包含选自以下的区域中的任一个或多个中的至少一个核苷酸的修饰：A'与C之间、C与C'之间、C'与B之间、B与B'之间以及B'与A之间。在一些实施例中，C或C'或B或B'区中的至少一个核苷酸的任何修饰(例如，缺失、插入和/或取代)仍保留茎-环的末端环。在一些实施例中，在C与C'和/或B与B'之间的至少一个核苷酸的任何修饰(例如，缺失、插入和/或取代)在至少一个末端环中保留三个连续的T核苷酸(即，TTT)。在替代实施例中，C与C'和/或B与B'之间的至少一个核苷酸的任何修饰(例如，缺失、插入和/或取代)在至少一个末端环中保留三个连续的A核苷酸(即，AAA)在一些实施例中，本文中使用的经修饰的ITR可以包含表3中所示的修饰的组合中的任一个，并且还包含选自以下的任一个或多个区域中的至少一个核苷酸的修饰(例如，缺失、插入和/或取代)：A'、A和/或D。举例来说，在一些实施例中，本文中使用的经修饰的ITR可以包含表3中所示的修饰的组合中的任一个，并且还包含A区中的至少一个核苷酸的修饰(例如，缺失、插入和/或取代)。在一些实施例中，本文中使用的经修饰的ITR可以包含表3中所示的修饰的组合中的任一个，并且还包含A'区中的至少一个核苷酸的修饰(例如，缺失、插入和/或取代)。在一些实施例中，本文中使用的修饰ITR可以包含表3中所示的修饰的组合中的任一个，并且还包含A和/或A'区中的至少一个核苷酸的修饰(例如，缺失、插入和/或取代)。在一些实施例中，本文中使用的经修饰的ITR可以包含表3中所示的修饰的组合中的任一个，并且还包含D区中的至少一个核苷酸的修饰(例如，缺失、插入和/或取代)。

在一个实施例中，可以修饰结构元件的核苷酸序列(例如，修饰1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个或更多个核苷酸或其中的任何范围)，以产生经修饰的结构元件。在一个实施例中，本文中示例对对称ITR的特定修饰(例如，表4中所鉴定的对称修饰的ITR对。

在一些实施例中，可以修饰ITR(例如，通过修饰1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个或更多个核苷酸或其中的任何范围)。在其它实施例中，ITR可以具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更多序列一致性，具有表4中经修饰的ITR中的一个(例如，或选自以下组成的组的对称经修饰对的A-A'臂的含RBE部分以及C-C'和B-B'臂：例如SEQ ID NO:101与SEQ ID NO:102；SEQ ID NO:103与SEQ ID NO:96；SEQ ID NO:105与SEQ ID NO:106；SEQ ID NO:545与SEQ ID NO:116；SEQ ID NO:111与SEQ ID NO:112；SEQ ID NO:117与SEQ ID NO:118；SEQID NO:119与SEQ ID NO:120；SEQ ID NO:121与SEQ ID NO:122；SEQ ID NO:107与SEQ IDNO:108；SEQ ID NO:123与SEQ ID NO:124；SEQ ID NO:125与SEQ ID NO:126；SEQ ID NO:127与SEQ ID NO:128；SEQ ID NO:129与SEQ ID NO:130；SEQ ID NO:131与SEQ ID NO:132；SEQ ID NO:133与SEQ ID NO:134；SEQ ID NO:547与SEQ ID NO:546。

在一些实施例中，经修饰的ITR可以例如包含去除或缺失特定臂的全部，例如A-A'臂的全部或一部分、或B-B'臂的全部或一部分、或C-C'臂的全部或一部分，或可替代地，去除1、2、3、4、5、6、7、8、9个或更多个形成环的茎的碱基对，只要将茎(例如单个臂)封端的最终环仍然存在(例如，参见ITR-6)即可。在一些实施例中，经修饰的ITR可以包含从B-B'臂去除1、2、3、4、5、6、7、8、9个或更多个碱基对。在一些实施例中，经修饰的ITR可以包含从C-C'臂去除1、2、3、4、5、6、7、8、9个或更多个碱基对。在一些实施例中，经修饰的ITR可以包含从C-C'臂去除1、2、3、4、5、6、7、8、9个或更多个碱基对以及从B-B'臂去除1、2、3、4、5、6、7、8、9个或更多个碱基对。设想去除碱基对的任何组合，例如可以在C-C'臂中去除6个碱基对以及在B-B'臂中去除2个碱基对。作为说明性实例，示例性经修饰的ITR具有从C部分和C'部分中的每一个缺失至少7个碱基对，C与C'区之间的环中的核苷酸的取代，以及从B区和B'区中的每一个缺失至少一个碱基对，使得经修饰的ITR包含至少一个臂(例如C-C')被截断的两个臂。应注意，在这个实例中，因为经修饰的ITR包含来自B区和B'区中的每一个的至少一个碱基对缺失，所以臂B-B'也相对于WT ITR被截断。

在一些实施例中，将1、2、3、4、5、6、7、8、9个或更多个互补碱基对从C-C'臂的C部分和C'部分中的每一个去除，使得所述C-C'臂被截断。也就是说，如果在C-C'臂的C部分中去除碱基，那么去除在C'部分中的互补碱基对，由此截断C-C'臂。在此类实施例中，将2、4、6、8个或更多个碱基对从C-C'臂去除，使得C-C'臂被截断。在替代性实施例中，将1、2、3、4、5、6、7、8、9个或更多个碱基对从C-C'臂的C部分去除，使得仅臂的C'部分保留。在替代性实施例中，将1、2、3、4、5、6、7、8、9个或更多个碱基对从C-C'臂的C'部分去除，使得仅臂的C部分保留。

在一些实施例中，将1、2、3、4、5、6、7、8、9个或更多个互补碱基对从B-B'臂的B部分和B'部分中的每一个去除，使得所述B-B'臂被截断。也就是说，如果在B-B'臂的B部分中去除碱基，那么去除在B'部分中的互补碱基对，由此截断B-B'臂。在此类实施例中，将2、4、6、8个或更多个碱基对从B-B'臂去除，使得B-B'臂被截断。在替代性实施例中，将1、2、3、4、5、6、7、8、9个或更多个碱基对从B-B'臂的B部分去除，使得仅臂的B'部分保留。在替代性实施例中，将1、2、3、4、5、6、7、8、9个或更多个碱基对从B-B'臂的B'部分去除，使得仅臂的B部分保留。

在一些实施例中，经修饰的ITR相对于全长野生型ITR序列可以具有1与50个之间(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50)的核苷酸缺失。在一些实施例中，相对于全长WT ITR序列，经修饰的ITR可以具有1与30个之间的核苷酸缺失。在一些实施例中，相对于全长野生型ITR序列，经修饰的ITR可以具有2与20个之间的核苷酸缺失。

在一些实施例中，经修饰的ITR形成两个相对的纵向对称的茎-环，例如C-C'环与B-B'环长度不同。在一些实施例中，经修饰的ITR的相对的纵向对称茎-环中的一个具有8到10个碱基对长度范围内的C-C'和/或B-B'茎部分和具有2到5个未配对脱氧核糖核苷酸的环部分(例如，C-C'之间或B-B'之间)。在一些实施例中，经修饰的ITR的一个纵向对称的茎-环具有小于8个，或小于7个、6个、5个、4个、3个、2个、1个碱基对长度的C-C'和/或B-B'茎部分，以及具有0-5个核苷酸之间的环部分(例如，C-C'之间或B-B'之间)。在一些实施例中，具有纵向不对称茎-环的经修饰的ITR具有长度小于3个碱基对的C-C'和/或B-B'茎部分。

在一些实施例中，经修饰的ITR在A或A'区的含RBE部分中不含任何核苷酸缺失，以便干扰DNA复制(例如，通过Rep蛋白结合到RBE，或在末端解链位点切割)。在一些实施例中，预期用于本文中的经修饰的ITR在如本文所描述的B、B'、C和/或C区中具有一个或多个缺失。经修饰的ITR的若干非限制性实例展示于图6B-21B中。

在一些实施例中，经修饰的ITR可以包含B-B'臂的缺失，使得C-C'臂保留，例如参见图7A-7B中所示的示例性ITR-33(左)和ITR-18(右)，或ITR-35(左)和ITR-19(右))(图9A-9B)在一些实施例中，经修饰的ITR可以包含C-C'臂的缺失，使得B-B'臂保留，例如参见图8A-8B中所示的示例性ITR-34(左)和ITR-51(右)。在一些实施例中，经修饰的ITR可以包含B-B'臂和C-C'臂的缺失，以使得单个茎-环保留，例如参见图11A-11B中所示的示例性ITR-37(左)和ITR-21(右)。在一些实施例中，经修饰的ITR可以包含C'区的缺失，使得截断的C环和B-B'臂保留，例如参见图10A-10B中所示的示例性ITR-36(左)和ITR-20(右)；ITR-42(左)和ITR-26(右)(图16A-16B)；ITR-43(左)和ITR-27(右)(图17A-17B)；ITR-44(左)和ITR-28(右)(图18A-18B)；ITR-45(左)和ITR-29(右)(图19A-19B)；ITR-46(左)和ITR-23(右)(图20A-20B)；ITR-47(左)和ITR-31(右)(图21A-21B)；ITR-48(左)和ITR-32(右)(图22A-22B)。类似地，在一些实施例中，经修饰的ITR可以包含B区的缺失，使得B环和C-C'臂保留，例如参见图12A-12B中所示的示例性ITR-38(左)和ITR-22(右)；ITR-39(左)和ITR-23(右)(图13A-13B)；ITR-40(左)和ITR-24(右)(图14A-14B)以及ITR-41(左)和ITR-25(右)(图15A-15B)。

在一些实施例中，经修饰的ITR可以包含以下中的任一个或多个中的碱基对的缺失：C部分、C'部分、B部分或B'部分，使得在C-B'部分与C'-B部分之间发生互补碱基配对以产生单个臂，例如参见ITR-10(右)和ITR-10(左)。

在一些实施例中，除在C、C'、B和/或B'区中的一个或多个核苷酸中的修饰以外，本文中使用的经修饰的ITR可以包含在选自以下区域的任一个或多个中的至少1、2、3、4、5、6个核苷酸的修饰(例如，缺失、取代或添加)：在A'与C之间、在C与C'之间、在C'与B之间、在B与B'之间以及在B'与A之间。举例来说，在经修饰的右ITR中的B'与C之间的核苷酸可以从A取代为G、C或A，或缺失或一或多个核苷酸添加；在经修饰的左ITR中的C'与B之间的核苷酸可以从T变为G、C或A，或缺失或一或多个核苷酸添加。

在本发明的某些实施例中，ceDNA载体不具有由选自以下任一种的核苷酸序列组成的经修饰ITR：SEQ ID NO:550-557。在本发明的某些实施例中，ceDNA载体不具有包含选自以下任一种的核苷酸序列的经修饰的ITR：SEQ ID NO:550-557。

在一些实施例中，ceDNA载体包含如本文所公开的调控开关和所选择的经修饰的ITR，所述所选择的经修饰的ITR具有选自以下组成的组中的任一个的核苷酸序列：SEQ IDNO:550-557。

在另一个实施例中，结构元件的结构可以为经修饰的。举例来说，结构元件改变了茎高和/或环中核苷酸的数目。举例来说，茎高可以是约2、3、4、5、6、7、8或9个核苷酸或更多个核苷酸或其中的任何范围。在一个实施例中，茎高可以是约5个核苷酸到约9个核苷酸并与Rep功能性相互作用。在另一个实施例中，茎高可以是约7个核苷酸并与Rep功能性相互作用。在另一个实例中，环可以具有3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸或更多个核苷酸或其中的任何范围。

在另一个实施例中，RBE或扩展RBE内的GAGY结合位点或GAGY相关结合位点的数目可以增加或减少。在一个实例中，RBE或扩展RBE可以包含1、2、3、4、5或6个或更多个GAGY结合位点或其中的任何范围。每个GAGY结合位点可以独立地是精确的GAGY序列或类似于GAGY的序列，只要所述序列足以结合Rep蛋白即可。

在另一个实施例中，可以更改(例如增加或减少)两个元件(例如(但不限于)RBE与发夹)之间的间距，以更改与较大Rep蛋白的功能性相互作用。举例来说，间距可以是约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21个核苷酸或更多个核苷酸或其中的任何范围。

表4展示了示例性经修饰的对称ITR对(即，经修饰的左ITR和经修饰的对称右ITR)。序列的黑体(红色)部分鉴定了部分ITR序列(即A-A'、C-C'和B-B'环的序列)，也在图7A-22B中示出。这些示例性经修饰的ITR可以包含GCGCGCTCGCTCGCTC-3'(SEQ ID NO:531)的RBE、ACTGAGGC(SEQ ID NO:532)的间隔子、间隔子互补序列GCCTCAGT(SEQ ID NO:535)和GAGCGAGCGAGCGCGC(SEQ ID NO:536)的RBE'(即，RBE的互补序列)。

表4：示例性经修饰的对称ITR对

在本发明的实施例中，本文所公开的ceDNA载体不具有经修饰的ITR，所述经修饰的ITR具有选自以下的组中的任一个的核苷酸序列：SEQ ID NO:550、551、552、553、553、554、555、556和557。

IV.调控元件

ceDNA载体可以由进一步包含顺式调控元件的特定组合的表达构建体产生。顺式调控元件包括(但不限于)：启动子、核糖开关、隔离子、mir可调控元件、转录后调控元件、组织和细胞类型特异性启动子以及增强子。在一些实施例中，ITR可以充当转基因的启动子。在一些实施例中，ceDNA载体包含调控转基因表达的其它组分，例如如本文所描述的调控转基因表达的调控开关，或可以杀灭包含ceDNA载体的细胞的杀灭开关。

所述ceDNA载体可以由还包含如WHP转录后调控元件(WPRE)(例如SEQ ID NO:8)和BGH聚A(SEQ ID NO:9)的顺式调控元件的特定组合的表达构建体产生。适用于表达构建体中的表达盒不受病毒衣壳强加的包装约束的限制。

启动子：本发明的表达盒包括可以影响总体表达水平以及细胞特异性的启动子。为了转基因表达，其可以包括高度活性的病毒来源的即刻早期启动子。表达盒可以含有组织特异性的真核启动子，以将转基因表达限制在特定细胞类型，并减少由不受调控的异常表达引起的毒性效应和免疫应答。

适合的启动子，包括上文所描述的那些启动子，可以来源于病毒并因此可以称为病毒启动子，或其可以来源于任何生物体，包括原核或真核生物体。适合的启动子可以用于通过任何RNA聚合酶(例如pol I、pol II、pol III)来驱动表达。示例性启动子包括(但不限于)：SV40早期启动子；小鼠乳腺肿瘤病毒长末端重复(LTR)启动子；腺病毒主要晚期启动子(Ad MLP)；单纯疱疹病毒(HSV)启动子；巨细胞病毒(CMV)启动子，如CMV即刻早期启动子区(CMVIE)；劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子；人类U6小核启动子(U6，例如SEQ ID NO:18(Miyagishi等人.,《自然生物技术(Nature Biotechnology)》20,497-500(2002))；增强的U6启动子(例如Xia等人.,《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》2003年9月1日；31(17))、人类H1启动子(H1)(例如SEQ ID NO:19)、CAG启动子、人类α1-抗胰蛋白酶(HAAT)启动子(例如SEQ ID NO:21)等等。在实施例中，这些启动子在其下游含内含子的末端处被更改以包括一个或多个核酸酶裂解位点。在实施例中，含有一个或多个核酸酶裂解位点的DNA与启动子DNA是无关的。

根据一些实施例，启动子可以包含一个或多个特异性转录调控序列以进一步增强表达和/或更改其空间表达和/或暂时表达。启动子还可以包含末端增强子或阻遏子元件，其可以位于来自转录起始位点的多达几千个碱基对。启动子可以来源于包括病毒、细菌、真菌、植物、昆虫和动物的来源。启动子可以相对于发生表达的细胞、组织或器官或相对于发生表达的发育阶段，或响应于外部刺激(如生理学压力、病原体、金属离子或诱发剂)组成性或有差异地调控基因组分的表达。启动子的代表性实例包括噬菌体T7启动子、噬菌体T3启动子、SP6启动子、lac操纵子-启动子、tac启动子、SV40晚期启动子、SV40早期启动子、RSV-LTR启动子、CMV IE启动子、SV40早期启动子或SV40晚期启动子和CMV IE启动子，以及下文所列的启动子。此类启动子和/或增强子可以用于表达任何所关注基因，例如基因编辑分子、供体序列、治疗蛋白等)。举例来说，载体可以包含可操作地连接到编码治疗蛋白的核酸序列的启动子。可操作地连接到编码序列的治疗蛋白的启动子可以是来自猴病毒40(SV40)的启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、人类免疫缺陷病毒(HIV)启动子(如牛免疫缺陷病毒(BIV)长末端重复(LTR)启动子)、莫洛尼病毒(Moloney virus)启动子、禽白血病病毒(ALV)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子(如CMV即刻早期启动子)、埃-巴二氏病毒(Epstein Barr virus；EBV)启动子或劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子。启动子还可以是来自人类基因的启动子，例如人类泛素C(hUbC)、人类肌动蛋白、人类肌凝蛋白、人类血红素、人类肌肉肌酸或人类金属硫蛋白。启动子还可以是组织特异性启动子，如肝脏特异性启动子，如天然或合成的人类α1-抗胰蛋白酶(hAAT)。在一个实施例中，使用内源性ApoE、经由存在于肝细胞表面上的低密度脂蛋白(LDL)受体将包含ceDNA载体的组合物特异性靶向肝细胞可以实现向肝脏的递送。

在一个实施例中，所用的启动子是编码治疗蛋白的基因的天然启动子。编码治疗蛋白的相应基因的启动子和其它调控序列是已知的并且已被表征。所用的启动子区还可以包括一个或多个另外的调控序列(例如，天然的)，例如增强子(例如SEQ ID NO:22和SEQ IDNO:23)。

根据本发明使用的适合的启动子的非限制性实例包括：例如(SEQ ID NO:3)的CAG启动子、hAAT启动子(SEQ ID NO:21)、人类EF1-α启动子(SEQ ID NO:6)或EF1a启动子的片段(SEQ ID NO:15)、IE2启动子(例如SEQ ID NO:20)和大鼠EF1-α启动子(SEQ ID NO:24)。

根据一些实施例，表达盒可以含有合成调控元件，如CAG启动子(SEQ ID NO:3)。CAG启动子包含(i)巨细胞病毒(CMV)早期增强子元件，(ii)鸡β-肌动蛋白基因的启动子、第一外显子和第一内含子，以及(iii)兔β-珠蛋白基因的剪接受体。可替代地，表达盒可以含有hAAT启动子(SEQ ID NO:21)、α-1-抗胰蛋白酶(AAT)启动子(SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:74)、肝特异性(LP1)启动子(SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:16)、人类延伸因子-1α(EF1α)启动子或其片段(例如，SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:15)、大鼠EF1α启动子(SEQ ID NO:24)或IE2启动子(SEQ ID NO:20)。在一些实施例中，表达盒包括一个或多个组成型启动子，例如逆转录病毒劳氏肉瘤病毒(RSV)LTR启动子(任选地具有RSV增强子)，或巨细胞病毒(CMV)即刻早期启动子(任选地具有CMV增强子，例如SEQ ID NO:22)。可替代地，可以使用诱导型启动子、转基因的天然启动子、组织特异性启动子或所属领域已知的各种启动子。

聚腺苷酸化序列：ceDNA载体中可以包括编码聚腺苷酸化序列的序列，以稳定由ceDNA载体表达的mRNA，并有助于核输出和翻译。在一个实施例中，ceDNA载体不包括聚腺苷酸化序列。在其它实施例中，载体包括至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少40个、至少45个、至少50个或更多个腺嘌呤二核苷酸。在一些实施例中，聚腺苷酸化序列包含约43个核苷酸、约40-50个核苷酸、约40-55个核苷酸、约45-50个核苷酸、约35-50个核苷酸或其间的任何范围。

表达盒可以包括所属领域中已知的聚腺苷酸化序列或其变体，如从牛BGHpA(例如SEQ ID NO:74)或病毒SV40pA(例如SEQ ID NO:10)中分离的天然存在的序列，或合成序列(例如SEQ ID NO:27)。一些表达盒还可以包括SV40晚期聚A信号上游增强子(USE)序列。在一些实施例中，USE可以与SV40pA或异源聚A信号组合使用。

表达盒还可以包括转录后元件以增加转基因的表达。在一些实施例中，使用土拨鼠肝炎病毒(WHP)转录后调控元件(WPRE)(例如SEQ ID NO:8)以增强转基因的表达。可以使用其它转录后处理元件，如来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶基因或乙型肝炎病毒(HBV)的转录后元件。分泌序列可以连接到转基因，例如VH-02和VK-A26序列，例如SEQ ID NO:25和SEQID NO:26。

在一个实施例中，宿主细胞并不表达病毒衣壳蛋白并且多核苷酸载体模板不含任何病毒衣壳编码序列。在一个实施例中，多核苷酸载体模板不含AAV衣壳基因，而且不含其它病毒的衣壳基因)。在一个实施例中，核酸分子还不含AAV Rep蛋白编码序列。因此，在一些实施例中，本发明的核酸分子不含功能性AAV盖和AAV rep基因二者。

V.调控开关

分子调控开关是一种响应信号而产生可测量的状态变化的开关。此类调控开关可以与本文所描述的ceDNA载体有效地组合以控制ceDNA载体的输出。在一些实施例中，ceDNA载体包含用以微调转基因表达的调控开关。举例来说，其可以发挥ceDNA载体的生物封存功能。在一些实施例中，开关是“ON/OFF”型开关，其设计成以可控和可调控方式来启动或终止(即，关闭)所关注基因在ceDNA中的表达。在一些实施例中，开关可以包括“杀灭开关”，一旦所述开关被激活，其就可以指令包含ceDNA载体的细胞经历细胞程序性死亡。

A.二进制调控开关

在一些实施例中，ceDNA载体包含可以用来可控制地调节转基因的表达的调控开关。在此类实施例中，位于ceDNA载体的ITR之间的表达盒可以另外包含可操作地连接到所关注基因的调控区，例如启动子、顺式元件、阻遏子、增强子等，其中调控区由一种或多种辅因子或外源剂调控。因此，在一个实施例中，仅当细胞中存在一种或多种辅因子或外源剂时，才会从ceDNA载体转录和表达所关注基因。在另一个实施例中，一种或多种辅因子或外源剂可以用于对所关注基因的转录和表达进行解抑制。

所属领域的普通技术人员已知的任何核酸调控区可以在经设计以包括调控开关的ceDNA载体中采用。仅举例来说，调控区可以通过小分子开关或诱导型或阻遏型启动子进行调节。诱导型启动子的非限制性实例是激素诱导型或金属诱导型启动子。其它示例性诱导型启动子/增强子元件包括(但不限于)：RU486诱导型启动子、蜕皮激素诱导型启动子、雷帕霉素诱导型启动子和金属硫蛋白启动子。涵盖基于典型四环素或基于其它抗生素的开关供使用，包括公开于(Fussenegger等人,《自然生物技术》.18:1203-1208(2000))中的那些。

B.小分子调控开关

所属领域中已知的多种基于小分子的调控开关在所属领域中是已知的，并且可以与本文公开的ceDNA载体组合以形成调控开关控制的ceDNA载体。在一些实施例中，调控开关可以选自以下中的任一种或组合：正交配体/核受体对，例如类视黄醇受体变体/LG335和GRQCIMFI，以及控制操作性连接的转基因的表达的人工启动子，如Taylor等人,《BMC生物技术(BMC Biotechnology)》10(2010):15中公开的人工启动子；经工程改造的类固醇受体，例如C末端截断的经修饰的孕酮受体，其不能结合孕酮但结合RU486(米非司酮)(美国专利第5,364,791号)；来自果蝇(Drosophila)的蜕皮激素受体和其蜕皮类固醇配体(Saez等人，《美国国家科学院院刊(PNAS)》，97(26)(2000),14512-14517；或由抗生素甲氧苄啶(trimethoprim，TMP)控制的开关，如Sando R；《自然方法(Nat Methods.)》第3版2013,10(11):1085-8中所公开。

所属领域的普通技术人员已知的其它基于小分子的调控开关也设想用于控制ceDNA的转基因表达并且包括(但不限于)：公开于Buskirk等人,《细胞(Cell)》；《化学和生物学杂志(Chem and Biol.)》2005；12(2)；151-161中的那些；脱落酸敏感性ON-开关；如公开于Liang,F.-S.,等人,(2011)《科学信号传导(Science Signaling)》,4(164)中的开关；外源性L-精氨酸敏感性ON开关，如公开于Hartenbach,等人《核酸研究》,35(20),2007中的那些，合成胆汁酸敏性ON开关，如公开于

在一些实施例中，控制转基因或由ceDNA载体表达的调控开关是前药活化开关，如美国专利8,771,679和6,339,070中公开的活化开关。

用于ceDNA载体的示例性调控开关包括(但不限于)表5中的那些调控开关。

C.“密码”调控开关

在一些实施例中，调控开关可以是“密码开关”或“密码回路”。在发生特定条件时，也就是说，需要存在条件的组合才能发生转基因表达和/或阻遏时，密码开关允许微调对转基因从ceDNA载体的表达的控制。举例来说，为了发生转基因的表达，至少必须发生条件A和B。密码调控开关可以是任何数目个条件，例如，要存在至少2个、或至少3个、或至少4个、或至少5个、或至少6个或至少7个或更多个条件才能发生转基因表达。在一些实施例中，需要发生至少2个条件(例如A、B条件)，并且在一些实施例中，需要发生至少3个条件(例如A、B和C，或A、B和D)。仅举例来说，为了从具有密码“ABC”调控开关的ceDNA发生基因表达，必须存在条件A、B和C。条件A、B和C可以如下：条件A是存在病状或疾病，条件B是激素应答，并且条件C是对转基因表达的响应。仅作为示例性实例，如果转基因是胰岛素，那么如果个体患有糖尿病则条件A发生，如果是条件B，那么血液中的糖水平高，并且条件C是并不以所需量表达内源性胰岛素的水平。一旦糖水平降低或达到期望的胰岛素水平，转基因(例如，胰岛素)就会关闭，直到再次发生3个条件，其重新打开。在另一个示例性实例中，如果转基因是EPO，那么条件A是存在慢性肾病(CKD)，如果个体的肾脏中有低氧状况，那么发生条件B，条件C是肾脏中产生促红细胞生成素产生的细胞(EPC)的募集受损；或可替代地，HIF-2活化受损。一旦氧水平升高或达到期望的EPO水平，转基因(例如，EPO)就会关闭，直到再次发生3个条件，其重新打开。

密码调控开关适用于微调来自ceDNA载体的转基因的表达。举例来说，密码调控开关可以是模块化的，因为其包含多个开关，例如仅在一定水平的代谢物存在下打开的组织特异性诱导型启动子。在此类实施例中，对于发生从ceDNA载体进行的转基因表达，在所需细胞类型(条件B)诱导剂必须存在(条件A)，并且代谢物处于或高于或低于某一阈值(条件C)。在替代性实施例中，密码调控开关可以经设计以使得转基因表达在条件A和条件B存在时打开，但在条件C存在时关闭。当条件C作为表达的转基因的直接结果发生时，此类实施例是有用的，即条件C充当正反馈以循环以在转基因具有足够量的所需治疗效果时关闭来自ceDNA载体的转基因表达。

在一些实施例中，涵盖在ceDNA载体中使用的密码调控开关公开于WO2017/059245中，所述文献描述被称为“密码开关”或“密码回路”或“密码杀灭开关”的开关，所述开关是使用杂合转录因子(TF)以构建细胞存活需要的复杂环境的合成生物回路。WO2017/059245中所描述的密码调控开关尤其适用于ceDNA载体，因为其是模块化并可定制的，这两个在控制回路活化的环境条件方面和控制细胞归宿的输出模块中都是如此。另外，密码回路具有在ceDNA载体中使用的特定效用，因为在无适当“密码”分子的情况下，其仅在所需的预定条件存在下允许转基因表达。如果某物的细胞出现问题或因为任何原因而无所期望的进一步转基因表达，那么可以触发相关杀灭开关(即，失能开关)。

在一些实施例中，涵盖用于ceDNA载体中的密码调控开关或“密码回路”包含杂合转录因子(TF)以扩大用于定义生物封存条件的环境信号的范围和复杂度。与在预定条件存在下触发细胞死亡的失能开关相反，“密码回路”允许在特定“密码”存在下细胞存活或转基因表达，并且只有当存在预定环境条件或密码时，才可以容易地重新编程以允许转基因表达和/或细胞存活。

在一个方面，将细胞生长限制为至少两种所选药剂的预定组存在的“密码”系统包括编码表达模块的一个或多个核酸构建体，所述表达模块包含：i)编码毒素的毒素表达模块，所述毒素对宿主细胞有毒性，其中编码毒素的序列可操作地连接到通过第一杂合阻遏子蛋白hRP1的结合抑制的启动子P1；ii)编码第一杂合阻遏子蛋白hRP1的第一杂合阻遏子蛋白表达模块，其中hRP1的表达受由两个杂合转录因子hTF1和hTF2形成的AND门控制，其结合或活性分别对药剂A1和A2起反应，使得两种药剂A1和A2都为hRP1表达所需的，其中在不存在A1或A2的情况下，hRP1表达不足以抑制毒素启动子模块P1和毒素产生，使得宿主细胞被杀灭。在这一系统中，杂交因子hTF1、hTF2和hRP1各自包含来自一个转录因子的环境传感模块和来自不同转录因子的DNA识别模块，所述不同转录因子使得相应密码调控开关的结合对环境剂A1或A2的存在敏感，所述环境剂A1或A2不同于相应子单元本质上通常将结合的环境剂A1或A2。

因此，ceDNA载体可以包含需要特定分子的存在和/或不存在来激活输出模块的“密码调控回路”。在一些实施例中，在编码细胞毒素的基因置于输出模块中的情况下，这一密码调控回路不仅可以用于调控转基因表达，而且还可以用于创建杀灭开关机构，其中回路在细胞以不合需要的方式表现(例如，其离开由传感器域定义的特定环境，或分化成不同的细胞类型)的情况下杀灭细胞。在一个非限制性实例中，杂合转录因子、回路架构和输出模块的模块化允许回路被重新配置以感应其它环境信号，以其它方式对环境信号作出反应，并且除诱导细胞死亡以外还控制细胞中的其它功能，如所属领域中所理解的。

本文公开的调控开关，例如小分子开关、基于核酸的开关、小分子-核酸杂合开关、转录后转基因调控开关、翻译后调控、辐射控制开关、低氧介导的开关和如本文公开的所属领域的普通技术人员已知的其它调控开关中的任何和所有组合均可以用于如本文公开的密码调控开关中。涵盖使用的调控开关也在综述文章Kis等人,《皇家学会界面杂志(JR SocInterface)》.12:20141000(2015)中讨论，并总结在Kis的表1中。在一些实施例中，密码系统中使用的调控开关可以选自表5中的开关中的任一个或组合。

D.控制转基因表达的基于核酸的调控开关

在一些实施例中，控制由ceDNA载体表达的转基因的调控开关是建立在基于核酸的控制机构的基础上。示例性核酸控制机构是所属领域中已知的并且是设想使用的。举例来说，此类机构包括核糖开关，如以下文献中所公开的那些核糖开关：例如US2009/0305253、US2008/0269258、US2017/0204477、WO2018026762A1、美国专利9,222,093和EP申请EP288071；以及Villa JK等人,《微生物学光谱(Microbiol Spectr.)》2018年5月；6(3)的评论中所公开的核糖开关。还包括代谢物响应性转录生物传感器，如WO2018/075486和WO2017/147585中公开的那些。设想使用的其它所属领域中已知的机构包括用siRNA或RNAi分子(例如miR、shRNA)使转基因沉默。举例来说，ceDNA载体可以包含编码与由ceDNA载体表达的转基因互补的RNAi分子的调控开关。当此类RNAi表达时，即使ceDNA载体表达转基因，所述转基因也将因互补的RNAi分子而沉默，并且当ceDNA载体表达转基因时而所述RNAi未表达时，所述转基因不会因RNAi沉默。控制基因表达或作为调控开关的RNAi分子的此类实例公开于US2017/0183664中。在一些实施例中，调控开关包含阻断转基因从ceDNA载体表达的阻遏子。在一些实施例中，开/关开关是基于较小转录活化RNA(STAR)的开关，例如，如Chappell J.等人,《自然化学生物学(Nat Chem Biol.)》2015年3月；11(3):214-20；以及Chappell等人,《微生物学光谱》2018年5月；6(3中公开的开关。在一些实施例中，调控开关是脚趾头开关，如US2009/0191546、US2016/0076083、WO2017/087530、US2017/0204477、WO2017/075486中以及Green等人,《细胞》,2014；159(4)；925-939中公开的。

在一些实施例中，调控开关是组织特异性自失活调控开关，例如如US2002/0022018中所公开，其中调控开关在其中转基因表达原本可能不利的位点有意地将转基因表达关闭。在一些实施例中，调控开关是重组酶可逆基因表达系统，例如如US2014/0127162和美国专利8,324,436中所公开。

在一些实施例中，控制由ceDNA载体表达的所关注转基因或基因的调控开关是基于核酸的控制机构和小分子调控因子系统的杂合。此类系统对于所属领域的普通技术人员是熟知的并且设想用于本文中。此类调控开关的实例包括(但不限于)LTRi系统或“Lac-Tet-RNAi”系统，例如如US2010/0175141中和Deans T.等人,《细胞》,2007,130(2)；363-372；WO2008/051854以及美国专利9,388,425中所公开。

在一些实施例中，控制由ceDNA载体表达的所关注转基因或基因的调控开关涉及环状排列，如美国专利8,338,138中所公开。在此类实施例中，分子开关为多稳定的，即能够在至少两种状态之间切换，或可替代地，双稳态的，即，状态为例如能够发光或不能发光、能够结合或不能结合、能够催化或不能催化、能够转移电子或不能转移电子等的“ON”或“OFF”。在另一方面，分子开关使用融合分子，因此开关能够在超过两种状态之间切换。举例来说，响应于插入序列或受体序列所展现的特定阈值状态，融合体的相应其它序列可以呈现一系列状态(例如，结合活性范围、酶催化范围等)。因此，融合分子可以展现对刺激的分级应答，而非从“ON”或“OFF”切换。

一些实施例中，基于核酸的调控开关可以选自表5中的开关中的任一个或组合。

E.转录后和翻译后调控开关.

一些实施例中，控制由ceDNA载体表达的所关注转基因或基因的调控开关是转录后修饰系统。举例来说，此类调控开关可以是对四环素或茶碱敏感的适体酶(aptazyme)核糖开关，如以下中所公开：US2018/0119156、GB201107768、WO2001/064956A3、欧洲专利2707487和Beilstein等人,《ACS合成生物学(ACS Synth.Biol.)》,2015,4(5),第526-534页；Zhong等人,Elife.2016年11月2日；5.pii:e18858。在一些实施例中，设想所属领域的普通技术人员可以编码转基因和含有配体敏感性(OFF-开关)适体的抑制性siRNA二者，净结果是配体敏感性ON-开关。

在一些实施例中，控制由ceDNA载体表达的所关注转基因或基因的调控开关是翻译后修饰系统。在替代实施例中，所关注基因或蛋白质表示为原蛋白或前-原蛋白，或具有附接到所表达蛋白质的信号响应元件(SRE)或去稳定化域(DD)，由此阻止正确的蛋白质折叠和/或活性直到发生翻译后修饰。在去稳定域(DD)或SRE的情况下，去稳定域在外源剂或小分子存在下进行翻译后裂解。所属领域的普通技术人员可以利用如美国专利8,173,792和PCT申请WO2017180587中所公开的此类控制方法。设想用于控制功能性转基因活性的ceDNA载体中的其它转录后控制开关公开于Rakhit等人,《化学生物学(Chem Biol.)》2014；21(9):1238-52和Navarro等人,《ACS化学生物学》2016；19；11(8):2101-2104A中。

在一些实施例中，控制由ceDNA载体表达的所关注转基因或基因的调控开关是将配体敏感性内含肽并入转基因编码序列中的翻译后修饰系统，使得转基因或表达的蛋白质在剪接之前被抑制。举例来说，这已使用4-羟基他莫昔芬和甲状腺激二者证实(参见例如美国专利7,541,450；9,200,045；7,192,739；Buskirk等人,《美国国家科学院院刊》2004年7月20日；101(29):10505-10510；《ACS合成生物学(ACS Synth Biol.)》2016年12月16日；5(12):1475-1484；以及2005年2月；14(2):523-532。在一些实施例中，基于转录后的调控开关可以选自表5中的开关中的任一个或组合。

F.其它示例性调控开关

任何已知的调控开关可以用于ceDNA载体中以控制ceDNA载体所表达的转基因的基因表达，包括环境变化所触发的那些。其它实例包括(但不限于)；Suzuki等人,《科学报告8(Scientific Reports 8)》；10051(2018)的BOC方法；遗传密码扩展和非生理氨基酸；辐射控制或超声控制的on/off开关(参见例如Scott S等人,《基因疗法》.2000年7月；7(13):1121-5；美国专利5,612,318；5,571,797；5,770,581；5,817,636；以及WO1999/025385A1。在一些实施例中，调控开关是通过可植入系统控制，例如如美国专利7,840,263；US20070190028A1中所公开，其中基因表达是通过一种或多种形式的能量控制，包括电磁能，所述能量将可操作地连接到ceDNA载体中的转基因的启动子活化。

在一些实施例中，设想用于ceDNA载体中的调控开关是低氧介导或应激活化的开关，例如以下文献中所公开的那些：WO1999060142A2；美国专利5,834,306；6,218,179；6,709,858；US2015/0322410；Greco等人(2004)《靶向癌症疗法(Targeted CancerTherapies)》9；S368以及FROG、TOAD和NRSE元件，以及条件诱导型沉默元件，包括低氧应答元件(HRE)、发炎应答元件(IRE)和剪切应激活化元件(SSAE)，例如如美国专利9,394,526中所公开。此类实施例适用于在缺血后或在缺血组织和/或肿瘤中打开转基因从ceDNA载体的表达。

在一些实施例中，设想用于ceDNA载体中的调控开关是光遗传学(例如，光控的)调控开关，例如，在Polesskaya等人,《BMC神经科学(BMC.)》2018；19(增刊1):12中综述的开关中的一个，并且也设想用于本文中。在此类实施例中，ceDNA载体可以包含基因元件，所述基因元件是光敏感性的并且可以调控响应于可见波长(例如蓝、近IR)的转基因表达。包含光遗传学调控开关的ceDNA载体在可以接受此类光源的身体位置(例如皮肤、眼睛、肌肉等)中表达转基因时是有用的，并且还可以在ceDNA载体在内部器官和组织中表达转基因时使用，其中光信号可以由适合的方式(例如，如本文所公开的可植入装置)提供。此类光遗传学调控开关包括使用光响应性元件或光诱导型转录效应子(LITE)(例如，2014/0287938中所公开)；Light-On系统(例如，在Wang等人,《自然方法(Nat Methods.)》2012年10月12日；9(3):266-9中所公开；其据报告能够体内控制胰岛素转基因的表达；Cry2/CIB1系统(例如，在Kennedy等人,《自然方法》；7,973-975(2010)中所公开；以及FKF1/GIGANTEA系统(例如，在Yazawa等人,《自然生物技术》2009年10月27(10):941-5中所公开)。

G.杀灭开关

本发明的其它实施例涉及包含杀灭开关的ceDNA载体。如本文公开的杀灭开关能够使包含ceDNA载体的细胞被杀灭或经历程序性细胞死亡，作为从个体的系统中永久去除引入的ceDNA载体的手段。所属领域的普通技术人员将了解，杀灭开关在本发明的ceDNA载体中的使用通常联接ceDNA载体靶向个体可以接受地所能失去的有限数目个细胞或靶向希望细胞凋亡的细胞类型(例如癌细胞)。在所有方面，如本文公开的“杀灭开关”被设计成在缺乏输入的存活信号或其它指定条件下提供对包含ceDNA载体的细胞的快速而稳固的细胞杀灭。换句话说，由本文中ceDNA载体编码的杀灭开关可以将包含ceDNA载体的细胞的细胞存活限制在由特定输入信号限定的环境中。如果希望从个体中去除ceDNA载体或确保其不表达所编码的转基因，那么此类杀灭开关发挥生物学的生物封存功能。因此，杀灭开关是在包含ceDNA载体的细胞的条件存活下联接环境信号的ceDNA载体中的合成生物回路。在一些实施例中，不同的ceDNA载体可以被设计成具有不同的杀灭开关。如果使用ceDNA载体的混合物，那么这允许能够控制哪种转基因表达细胞被杀灭。

在一些实施例中，ceDNA载体可以包含为模块化生物学抑制回路的杀灭开关。在一些实施例中，涵盖在ceDNA载体中使用的杀灭开关公开于WO2017/059245中，所述文献描述了被称作“失能杀灭开关”的开关，其包含至少两个可抑制序列的相互抑制排列，使得环境信号抑制构建体中的第二分子的活性(例如，小分子结合转录因子用于产生归因于毒素产生抑制的“存活”状态)。在包含含失能杀灭开关的ceDNA载体的细胞中，在损失环境信号后，回路永久性地切换到‘死亡'状态，其中毒素现在是解抑制，导致杀灭细胞的毒素产生。在另一个实施例中，提供合成生物回路，所述合成生物回路被称作“密码回路”或“密码杀灭开关”，其使用杂合转录因子(TF)来构建细胞存活需要的复杂环境。WO2017/059245中所描述的失能和密码杀灭开关尤其适用于ceDNA载体，因为其是模块化并可定制的，这两个在控制回路活化的环境条件方面和控制细胞归宿的输出模块中都是如此。恰当选择的毒素，包括(但不限于)核酸内切酶，例如EcoRI，存在于ceDNA载体中的密码回路不仅可以用于杀灭包含ceDNA载体的宿主细胞，而且可以用于使其基因组和伴随的质粒降解。

所属领域的普通技术人员已知的其它杀灭开关涵盖用于如本文所公开的ceDNA载体中，所述杀灭开关例如如以下文献中所公开：US2010/0175141；US2013/0009799；US2011/0172826；US2013/0109568；以及以下文献中所公开的杀灭开关：Jusiak等人，《细胞生物学和分子医药评论(Reviews in Cell Biology and molecular Medicine)》；2014；1-56；Kobayashi等人，《美国国家科学院院刊》,2004；101；8419-9；Marchisio等人，《国际生物化学和细胞生物学杂志(Int.Journal of Biochem and Cell Biol.)》,2011；43；310-319；以及Reinshagen等人，《科学转化医学(Science Translational Medicine)》2018,11。

因此，在一些实施例中，ceDNA载体可以包含杀灭开关核酸构建体，其包含编码效应子毒素或报道蛋白的核酸，其中效应子毒素(例如死亡蛋白)或报道蛋白的表达受预定条件控制。举例来说，预定条件可以是存在环境剂，例如外源剂，在没有所述环境剂的情况下，细胞将默认表达效应子毒素(例如死亡蛋白)并且被杀灭。在替代实施例中，预定条件是存在两种或更多种环境剂，例如细胞将仅在提供两种或更多种必需的外源剂时存活，而在其中的任一种不存在的情况下，包含ceDNA载体的细胞被杀灭。

在一些实施例中，ceDNA载体经修饰以并入杀灭开关，从而破坏包含ceDNA载体的细胞，以有效地终止ceDNA载体(例如治疗基因、蛋白质或肽等)正在表达的转基因的体内表达。具体地说，进一步对ceDNA载体进行基因工程改造以表达在哺乳动物细胞中、在正常生理学条件下不具功能性的开关蛋白。仅在药物施用后或在特异性靶向这种开关蛋白的环境条件下，表达开关蛋白的细胞被破坏，从而终止治疗蛋白或肽的表达。举例来说，据报告，表达HSV-胸苷激酶的细胞在药物(例如苷昔洛韦(ganciclovir)和胞嘧啶脱氨酶)施用后可以被杀灭。参见例如Dey和Evans，《单纯疱疹病毒-1胸苷激酶(HSV-TK)的自杀基因疗法(Suicide Gene Therapy by Herpes Simplex Virus-1 Thymidine Kinase(HSV-TK))》，于You编辑的《基因疗法中的靶标(Targets in Gene Therapy)》(2011)中；以及Beltinger等人，《美国国家科学院院刊》96(15):8699-8704(1999)。在一些实施例中，ceDNA载体可以包含siRNA杀灭开关，称为DISE(存活基因排除所诱发的死亡)(Murmann等人，《肿瘤标靶(Oncotarget)》2017；8:84643-84658.DISE在体内卵巢癌细胞中的诱导(Induction ofDISE in ovarian cancer cells in vivo))。

在一些方面，失能杀灭开关为使细胞应答对预定条件(如细胞生长环境中缺乏药剂，例如外源剂)敏感的生物回路或系统。此类回路或系统可以包含含表达模块的核酸构建体，所述表达模块形成对预定条件敏感的失能调控回路，包含形成调控回路的表达模块的构建体，所述构建体包括：

i)第一阻遏子蛋白表达模块，其中所述第一阻遏子蛋白结合第一阻遏子蛋白核酸结合元件并且抑制来自包含所述第一阻遏子蛋白结合元件的编码序列的转录，并且其中所述第一阻遏子蛋白的抑制活性对第一外源剂的抑制敏感，所述第一外源剂的存在或不存在确立的预定条件；

ii)第二阻遏子蛋白表达模块，其中所述第二阻遏子蛋白结合第二阻遏子蛋白核酸结合元件并且抑制来自包含所述第二阻遏子蛋白结合元件的编码序列的转录，其中所述第二阻遏子蛋白不同于所述第一阻遏子蛋白；以及

iii)包含编码效应子蛋白的核酸序列的效应子表达模块，其可操作地连接到包含第二阻遏子蛋白的结合元件的基因元件，使得第二阻遏子蛋白的表达导致抑制来自效应子表达模块的效应子表达，其中第二表达模块包含结合元件的第一阻遏子蛋白核酸，当所述要素由第一阻遏子蛋白结合时，所述元件允许抑制第二阻遏子蛋白的转录，相应模块形成调控回路，使得在不存在第一外源剂的情况下，第一阻遏子蛋白由第一阻遏子蛋白表达模块产生并抑制来自第二阻遏子蛋白表达模块的转录，从而降低了第二阻遏子蛋白对效应子表达的抑制，导致了效应子蛋白的表达，但在第一外源剂存在下，第一阻遏子蛋白的活性被抑制，允许第二阻遏子蛋白的表达，其将效应子蛋白表达的表达维持在“关闭”状态，因此回路需要第一外源剂来将效应子蛋白表达维持在“关闭”状态，并且去除或不存在第一外源剂默认为效应子蛋白表达。

在一些实施例中，效应子为诱导细胞死亡程序的毒素或蛋白质。可以使用对宿主细胞具有毒性的任何蛋白质。在一些实施例中，毒素仅杀灭其所表达的那些细胞。在其它实施例中，毒素杀灭同一宿主生物体的其它细胞。会引起细胞死亡的大量产品中的任一个可以在失能杀灭开关中采用。抑制DNA复制、蛋白质翻译或其它过程或例如使宿主细胞的核酸降解的药剂特别有用。为了识别在回路活化后杀灭宿主细胞的有效机构，测试直接损伤宿主细胞的DNA或RNA的若干毒素基因。测试核酸内切酶ecoRI

如本文所用，术语“预定输入”是指以已知方式影响转录因子多肽的活性的药剂或条件。一般来说，此类药剂可以结合到转录因子多肽和/或改变转录因子多肽的构象，从而改变转录因子多肽的活性。预定输入的实例包括(但不限于)给定宿主生物体存活不需要的环境输入剂(即，在不存在如本文所描述的合成生物回路的情况下)。可以提供预定输入的条件包括例如温度，例如其中一个或多个因素的活性为温度敏感的，在光存在或不存在，包括波长的给定光谱的光，以及气体、盐、金属或矿物质的浓度。环境输入剂包括例如小分子、生物药剂(如信息素)、激素、生长因子、代谢物、养分等和其类似物；化学物质、环境副产物、金属离子和其它此类分子或药剂的浓度；光水平；温度；机械应力或压力；或电信号，如电流和电压。

在一些实施例中，报道子用于定量由本发明的模块或可编程合成生物回路接收到的信号的强度或活性。在一些实施例中，报道子可以与其它蛋白质编码序列融合以识别蛋白质位于细胞或生物体中的位置。对于本文所描述的各种实施例，荧光素酶可以用作效应子蛋白，例如测量低水平的基因表达，因为细胞在不存在荧光素酶的情况下往往几乎没有背景发光。在其它实施例中，可以使用分光光度计或包括平板读数器的可以获取吸光度测量值的其它仪器定量产生彩色底物的酶。类似于荧光素酶，如β-半乳糖苷酶的酶可以用于测量低水平的基因表达，因为其往往会放大低信号。在一些实施例中，效应子蛋白可以是可以降解或以其它方式破坏给定毒素的酶。在一些实施例中，效应子蛋白可以是将底物转化成气味产物的气味酶。在一些实施例中，效应子蛋白可以是使小分子或其它蛋白质磷酸化或去磷酸化的酶，或使其它蛋白质或DNA甲基化或去甲基化的酶。

在一些实施例中，效应子蛋白可以是受体、配体或溶解蛋白。受体往往具有三个域：结合配体(如蛋白质、肽或小分子)的胞外域、跨膜域和通常可以参与某种信号转导事件(如磷酸化)的细胞内或胞质域。在一些实施例中，转运蛋白、通道或泵基因序列被用作效应子蛋白。如本文所描述，与杀灭开关一起使用的效应子蛋白的非限制性实例和序列可以在parts.igem.org的万维网上的标准生物部分注册处找到。

如本文所用，“调节蛋白”是调节来自目标核酸序列的表达的蛋白质。调节蛋白包括例如转录因子，尤其包括转录活化因子和阻遏子，以及结合或改变转录因子并且影响其活性的蛋白质。在一些实施例中，调节蛋白包括例如降解参与调节目标核酸序列的表达的蛋白质因子的蛋白酶。优选的调节蛋白包括模块化蛋白质，其中例如DNA结合和输入剂结合或反应性元件或域是可分离的和可转移的，使得例如第一调节蛋白的DNA结合域融合到输入剂-第二响应域产生一种新的蛋白质，所述蛋白质结合由第一蛋白质识别的DNA序列，但对第二蛋白质通常响应的输入剂敏感。因此，如本文所用，除指定多肽以外，术语“调节多肽”和更特定的“阻遏子多肽”包括例如“LacI(阻遏子)多肽”变体或对不同的或变异输入剂起反应的此类多肽的衍生物。因此，对于LacI多肽，包括结合到除乳糖或IPTG以外的药剂的LacI突变体或变体。广泛范围的此类药剂为所属领域中已知的。

表5.示例性调控开关。

表5：实例调控开关

VI.ceDNA载体的产生

A.通用产生

ceDNA载体的产生描述于2018年9月7日提交的PCT/US18/49996的章节IV中，其以全文引用的方式并入本文中。如本文所描述，ceDNA载体可以由包含以下步骤的方法获得：a)在Rep蛋白存在下，在有效并且持续足以诱导宿主细胞内ceDNA载体产生的时间的条件下培育携带多核苷酸表达构建体模板(例如ceDNA-质粒、ceDNA-杆粒和/或ceDNA-杆状病毒)的宿主细胞(例如昆虫细胞)群体，所述模板不含病毒衣壳编码序列，并且其中所述宿主细胞并不包含病毒衣壳编码序列；以及b)从宿主细胞中收获并分离ceDNA载体。Rep蛋白的存在诱导具有经修饰的ITR的载体多核苷酸复制，从而在宿主细胞中产生ceDNA载体。然而，没有表达病毒粒子(例如AAV病毒粒子)。因此，没有大小限制，如在AAV或其它基于病毒的载体中天然强加的大小限制。

可以通过用在ceDNA载体上具有单个识别位点的限制酶消化从宿主细胞分离的DNA，并在非变性凝胶上分析消化的DNA物质，以与线性和非连续DNA相比较确认线性和连续DNA的特征带的存在，从而确认从宿主细胞分离的ceDNA载体的存在。

根据一些实施例，本发明提供了将DNA载体多核苷酸表达模板(ceDNA模板)稳定地整合到其自身基因组中的宿主细胞系的用途，所述细胞系用于产生非病毒DNA载体，例如如Lee,L.等人(2013)《公共科学图书馆·综合(Plos One)》8(8):e69879中所描述。优选地，Rep以约3的MOI添入宿主细胞中。当宿主细胞系是哺乳动物细胞系，例如HEK293细胞时，所述细胞系可以具有稳定整合的多核苷酸载体模板，并且可以使用第二载体，如疱疹病毒将Rep蛋白引入细胞中，使得在Rep和辅助病毒存在下切除和扩增ceDNA。

在一个实施例中，用于制备本文所描述的ceDNA载体的宿主细胞是昆虫细胞，并使用杆状病毒递送编码Rep蛋白的多核苷酸和用于ceDNA的非病毒DNA载体多核苷酸表达构建体模板，例如如图4A-4C和实例1中所描述。在一些实施例中，宿主细胞经工程改造以表达Rep蛋白。

然后从宿主细胞中收获和分离ceDNA载体。从细胞收获和收集本文所描述的ceDNA载体的时间可以进行选择和优化，以实现高产率地产生ceDNA载体。举例来说，可以根据细胞活力、细胞形态、细胞生长等选择收获时间。在一个实施例中，细胞在足以产生ceDNA载体的条件下生长，并在杆状病毒感染后足以产生ceDNA载体但在大多数细胞开始因杆状病毒毒性而死亡之前的时间收获。可以使用质粒纯化试剂盒，例如Qiagen Endo-Free Plasmid试剂盒分离DNA载体。为分离质粒而开发的其它方法也适用于DNA载体。通常，可以采用任何核酸纯化方法。

DNA载体可以通过所属领域的技术人员已知用于纯化DNA的任何手段来纯化。在一个实施例中，ceDNA载体被纯化为DNA分子。在另一个实施例中，将ceDNA载体作为外泌体或微粒进行纯化。

ceDNA载体的存在可以如下证实：使用对DNA载体具有单个识别位点的限制酶消化从细胞中分离出的载体DNA，并且使用凝胶电泳术分析已消化和未消化的DNA物质，从而相较于线性和非连续DNA来证实线性和连续DNA的特征带的存在。图4C和4D说明了用于鉴定通过本文的方法产生的封闭式ceDNA载体的存在的一个实施例。

B.ceDNA质粒

ceDNA-质粒是用于后来产生的ceDNA载体的质粒。在一些实施例中，ceDNA-质粒可以使用已知的技术构建，以在转录方向上提供至少以下可操作连接的组分：(1)如本文所描述的5'ITR序列(例如，野生型或经修饰的5'ITR序列)；(2)含有例如启动子、诱导型启动子、调控开关、增强子等顺式调控元件的表达盒；以及(3)如本文所描述的3'ITR序列(例如，野生型的经修饰的3'ITR序列)，其中3'ITR序列相对于5'ITR序列对称。在一些实施例中，侧接ITR的表达盒包含用于引入外源序列的克隆位点。表达盒替换了AAV基因组的rep和cap编码区。

一个方面，ceDNA载体是从质粒获得，所述质粒在本文中称为“ceDNA-质粒”，其按此次序编码：第一腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)、包含至少转基因和调控开关的表达盒以及经突变或修饰的AAV ITR，其中所述ceDNA-质粒不含AAV衣壳蛋白编码序列。在替代实施例中，ceDNA-质粒按此次序编码：第一(或5')经修饰或突变的AAV ITR、包含至少转基因和调控开关的表达盒以及第二(或3')经修饰的AAV ITR，其中所述ceDNA-质粒不含AAV衣壳蛋白编码序列，并且其中5'和3'ITR相对于彼此对称。在替代实施例中，ceDNA-质粒按此次序编码：第一(或5')经修饰或突变的AAV ITR、包含至少转基因和调控开关的表达盒以及第二(或3')经突变或修饰的AAV ITR，其中所述ceDNA-质粒不含AAV衣壳蛋白编码序列，并且其中5'和3'经修饰ITR具有相同的修饰(即相对于彼此反向互补或对称)。在替代实施例中，ceDNA-质粒按此次序编码：第一(或5')WT AAV ITR、包含至少转基因和调控开关的表达盒以及第二(或3')WT AAV ITR，其中所述ceDNA-质粒不含AAV衣壳蛋白编码序列，并且其中5'和3'ITR相对于彼此对称。在替代实施例中，ceDNA-质粒按此次序编码：第一(或5')WT AAV ITR、包含至少转基因和调控开关的表达盒以及第二(或3')WT AAV ITR，其中所述ceDNA-质粒不含AAV衣壳蛋白编码序列，并且其中5'和3'ITR相对于彼此大体上对称。

在另一个实施例中，cDNA-质粒系统不含病毒衣壳蛋白编码序列(即，其不含AAV衣壳基因，也没有其它病毒的衣壳基因)。另外，在特定实施例中，ceDNA-质粒还不含AAV Rep蛋白编码序列。因此，在优选实施例中，ceDNA-质粒不含AAV2的功能性AAV cap和AAV rep基因GG-3')加上允许发夹形成的可变回文序列。

本发明的ceDNA-质粒可以使用所属领域熟知的任何AAV血清型的基因组的天然核苷酸序列来产生。在一个实施例中，ceDNA-质粒骨架来源于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV 5、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV 11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAV-DJ和AAV-DJ8基因组。例如NCBI:NC 002077；NC 001401；NC001729；NC001829；NC006152；NC 006260；NC 006261；Kotin和Smith,《施普林格病毒索引》(The Springer Index of Viruses)》,在Springer维护的URL上可得(www网址：oesys.springer.de/viruses/database/mkchapter.asp？virID＝42.04.)(注意-对URL或数据库的引用是指截至本申请生效提交日为止的URL或数据库的内容)。在特定实施例中，ceDNA-质粒骨架来源于AAV2基因组。在另一个特定实施例中，ceDNA-质粒骨架是合成的骨架，其经过基因工程以在其5'和3'ITR处包括来源于这些AAV基因组之一。

ceDNA-质粒可以任选地包括选择性或选择标记，用于建立产生ceDNA载体的细胞系。在一个实施例中，选择标记可以插入3'ITR序列的下游(即3')。在另一个实施例中，选择标记可以插入5'ITR序列的上游(即5')。适当的选择标记包括例如赋予耐药性的那些标记。选择标记可以是例如杀稻瘟菌素S抗性基因、卡那霉素(kanamycin)、遗传霉素(geneticin)等。在优选实施例中，药物选择标记是杀稻瘟菌素S抗性基因。

示例性ceDNA(例如rAAV0)是从rAAV质粒产生。一种用于产生rAAV载体的方法可以包含：(a)为宿主细胞提供如上文所描述的rAAV质粒，其中宿主细胞和质粒均不含衣壳蛋白编码基因，(b)在允许产生ceDNA基因组的条件下培养宿主细胞；以及(c)收获细胞并分离从所述细胞产生的AAV基因组。

C.从ceDNA质粒制备ceDNA载体的示例性方法

本文还提供了制备无衣壳的ceDNA载体的方法，特别是具有足够高的产率以提供足够的载体用于体内实验的方法。

在一些实施例中，产生ceDNA载体的方法包含以下步骤：(1)将包含表达盒和两个对称ITR序列的核酸构建体引入宿主细胞(例如Sf9细胞)中；(2)任选地，例如通过使用质粒上存在的选择标记建立克隆细胞系；(3)将Rep编码基因引入(通过用携带所述基因的杆状病毒转染或感染)所述昆虫细胞中；以及(4)收获细胞并纯化ceDNA载体。上文所描述的用于产生无衣壳AAV载体的包含表达盒和两个ITR序列的核酸构建体可以呈cfAAV-质粒的形式，或如下文所描述用cfAAV-质粒生成的杆粒或杆状病毒的形式。可以通过转染、病毒转导、稳定整合或所属领域中已知的其它方法将核酸构建体引入宿主细胞中。

D.细胞系

用于产生ceDNA载体的宿主细胞系可以包括来源于草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)的昆虫细胞系，如Sf9 Sf21，或粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)细胞，或其它无脊椎动物、脊椎动物或其它真核细胞系，包括哺乳动物细胞。也可以使用普通技术人员已知的其它细胞系，如HEK293、Huh-7、HeLa、HepG2、HeplA、911、CHO、COS、MeWo、NIH3T3、A549、HT1180、单核细胞、以及成熟和不成熟的树突状细胞。可以转染宿主细胞系以稳定表达ceDBA-质粒，从而高产率地产生ceDNA载体。

根据一些实施例，可以使用所属领域中已知的试剂(例如脂质体、磷酸钙)或物理手段(例如电穿孔)，通过瞬时转染将ceDNA-质粒引入Sf9细胞中。可替代地，可以建立将ceDNA-质粒稳定整合到基因组中的稳定Sf9细胞系。此类稳定细胞系可以通过如上文所描述将选择标记并入ceDNA-质粒中来建立。如果用于转染细胞系的ceDNA-质粒包括选择标记，如抗生素，那么可以通过向细胞生长培养基中加入抗生素来选择已用ceDNA-质粒转染并将ceDNA-质粒DNA整合到基因组中的细胞。然后可以通过单细胞稀释或集落转移技术来分离细胞的抗性克隆并增殖。

E.分离和纯化ceDNA载体

图4A-4E和下面的特定实例中描述了用于获得和分离ceDNA载体的方法的实例。本文公开的ceDNA载体可以从表达一种或多种AAV Rep蛋白的生产细胞获得，进一步用ceDNA-质粒、ceDNA-杆粒或ceDNA-杆状病毒转化。适用于产生ceDNA载体的质粒包括图9A(适用于产生Rep BIIC)、图9B(用于获得ceDNA载体的质粒)中所示的质粒。

根据一些实施例，多核苷酸编码在质粒(Rep-质粒)、杆粒(Rep-杆粒)或杆状病毒(Rep-杆状病毒)中递送到生产细胞的AAV Rep蛋白(Rep 78或68)。Rep-质粒、Rep-杆粒和Rep-杆状病毒可以通过上文所描述的方法产生。

本文描述了ceDNA-载体作为示例性ceDNA载体产生的方法。用于产生本发明的ceDNA载体的表达构建体可以是质粒(例如ceDNA-质粒)、杆粒(例如ceDNA-杆粒)和/或杆状病毒(例如ceDNA-杆状病毒)。仅举例来说，ceDNA-载体可以由用ceDNA-杆状病毒和Rep-杆状病毒共同感染的细胞产生。由Rep-杆状病毒产生的Rep蛋白可以复制ceDNA-杆状病毒以产生ceDNA-载体。可替代地，ceDNA载体可以由经构建体稳定转染的细胞产生，所述构建体包含编码AAV Rep蛋白(Rep78/52)的序列，所述AAV Rep蛋白在Rep-质粒、Rep-杆粒或Rep-杆状病毒中递送。ceDNA-杆状病毒可以瞬时转染到细胞中，通过Rep蛋白复制并产生ceDNA载体。

杆粒(例如ceDNA-杆粒)可以转染到容许昆虫细胞中，例如Sf9、Sf21、Tni(粉纹夜蛾)细胞、High Five细胞，并且产生ceDNA-杆状病毒，所述杆状病毒是重组杆状病毒，其包括包含对称ITR的序列和表达盒的序列。ceDNA-杆状病毒可以再次感染到昆虫细胞中以获得下一代重组杆状病毒。任选地，所述步骤可以重复一次或多次以产生更大量的重组杆状病毒。

从细胞收获和收集本文所描述的ceDNA载体的时间可以进行选择和优化，以实现高产率地产生ceDNA载体。举例来说，可以根据细胞活力、细胞形态、细胞生长等选择收获时间。通常，细胞可以在杆状病毒感染后足以产生ceDNA载体(例如ceDNA载体)的时间后但在大多数细胞开始因病毒毒性而死亡之前收获。使用质粒纯化试剂盒，例如Qiagen ENDO-FREE

可替代地，可以通过对细胞集结粒进行碱溶解法、离心所得溶解液并进行色谱分离来实施纯化。作为一个非限制性实例，所述方法可以如下进行：将上清液装载于保留核酸的离子交换柱(例如SARTOBIND

在一些实施例中，ceDNA载体也可以外泌体或微粒形式纯化。所属领域中已知，许多细胞类型不仅释放出可溶性蛋白质，而且通过膜微囊泡脱落释放出复杂的蛋白质/核酸货物(Cocucci等人,2009；EP 10306226.1)此类囊泡包括微囊泡(也称为微粒)和外泌体(也称为纳米囊泡)，二者均包含蛋白质和RNA作为货物。微囊泡由质膜的直接出芽产生，而外泌体在多囊泡内体与质膜融合后释放到细胞外的环境中。因此，可以从已经用ceDNA-质粒转导的细胞或用ceDNA-质粒产生的杆粒或杆状病毒中分离出含有ceDNA载体的微囊泡和/或外泌体。

微囊泡可以通过对培养基进行过滤或以20,000×g超速离心来分离，而对外泌体以100,000×g超速离心。超速离心的最佳持续时间可以通过实验确定，并将取决于从中分离出囊泡的特定细胞类型。优选地，首先利用低速离心(例如在2000×g下进行5-20分钟)清除培养基并且使用例如

本文发明的另一方面涉及从已将ceDNA构建体稳定整合到自身基因组中的宿主细胞系中纯化ceDNA载体的方法。在一个实施例中，ceDNA载体被纯化为DNA分子。在另一个实施例中，将ceDNA载体作为外泌体或微粒进行纯化。

PCT/US18/49996的图5展示了使用实例中所描述的方法证实由多种ceDNA-质粒构建体产生ceDNA的凝胶。ceDNA通过凝胶中的特征带图案证实，如本文所讨论。

VII.药物组合物

在另一方面，提供了药物组合物。药物组合物包含如本文公开的ceDNA载体和药学上可接受的载剂或稀释剂。

本文公开的DNA-载体可以并入适用于施用个体的药物组合物中，以体内递送到个体的细胞、组织或器官。通常，药物组合物包含如本文公开的ceDNA-载体和药学上可接受的载剂。举例来说，可以将本文所描述的ceDNA载体并入适用于期望的治疗施用途径(例如肠胃外施用)的药物组合物中。还涵盖通过高压静脉内或动脉内输注以及如核内显微注射或胞质内注射的细胞内注射进行的被动组织转导。用于治疗目的的药物组合物可以配制成溶液、微乳液、分散液、脂质体或其它适合于高ceDNA载体浓度的有序结构。无菌注射溶液可以通过将所需量的ceDNA载体化合物根据需要与上文列举的成分中的一种或组合一起并入适当的缓冲液中，接着进行过滤灭菌来制备。

含ceDNA载体的药物活性组合物可以被配制成将核酸中的转基因递送到接受者的细胞，从而引起转基因在其中发生治疗表达。组合物还可以包括药学上可接受的载剂。

如本文公开的ceDNA载体可以并入适合于局部、全身、羊膜内、鞘内、颅内、动脉内、静脉内、淋巴内、腹膜内、皮下、气管、组织内(例如肌肉内、心内、肝内、肾内、脑内)、鞘内、膀胱内、结膜(例如眼眶外、眼眶内、眼眶后、视网膜内、视网膜下、脉络膜、脉络膜下、基质内、前房内和玻璃体内)、耳蜗内和粘膜(例如口腔、直肠、鼻)施用的药物组合物。还涵盖通过高压静脉内或动脉内输注以及如核内显微注射或胞质内注射的细胞内注射进行的被动组织转导。

用于治疗目的的药物组合物通常必须在制造和存储条件下是无菌的和稳定的。组合物可以配制成溶液、微乳液、分散液、脂质体或其它适合于高ceDNA载体浓度的有序结构。无菌注射溶液可以通过将所需量的ceDNA载体化合物根据需要与上文列举的成分中的一种或组合一起并入适当的缓冲液中，接着进行过滤灭菌来制备。

将核酸递送到细胞的各种技术和方法是所属领域中已知的。举例来说，可以将核酸(如ceDNA)配制成脂质纳米粒子(LNP)、类脂(lipidoid)、脂质体、脂质纳米粒子、脂质体复合物(lipoplex)或核壳纳米粒子。通常，LNP由核酸(例如ceDNA)分子、一种或多种可电离或阳离子脂质(或其盐)、一种或多种非离子或中性脂质(例如磷脂)、防止聚集的分子(例如PEG或PEG-脂质偶联物)以及任选的固醇(例如胆固醇)构成。

将核酸(例如ceDNA)递送到细胞的另一种方法是将核酸与被所述细胞内化的配体偶联。举例来说，配体可以结合细胞表面上的受体并通过胞吞而被内化。配体可以与核酸中的核苷酸共价连接。用于将核酸递送到细胞中的示例性偶联物描述于例如WO2015/006740、WO2014/025805、WO2012/037254、WO2009/082606、WO2009/073809、WO2009/018332、WO2006/112872、WO2004/090108、WO2004/091515和WO2017/177326中。

核酸，如ceDNA，也可以通过转染递送到细胞。有用的转染方法包括(但不限于)：脂质介导的转染、阳离子聚合物介导的转染或磷酸钙沉淀。转染试剂在所属领域中是熟知的并且包括(但不限于)：TurboFect转染试剂(赛默飞世尔科技(Thermo FisherScientific))、Pro-Ject试剂(赛默飞世尔科技)、TRANSPASS

体内或离体非病毒递送核酸的方法包括电穿孔、脂质体转染(参见美国专利第5,049,386号；第4,946,787号，以及市售试剂，如Transfectam

如本文所描述的ceDNA载体也可以直接施用生物体以在体内转导细胞。施用是通过正常用于引入分子与血液或组织细胞最终接触的任何途径，包括(但不限于)：注射、输注、局部施用和电穿孔。适合的施用此类核酸的方法是可利用的并且是所属领域的技术人员熟知的，并且虽然可以使用超过一种途径来施用特定的组合物，但特定的途径经常可以提供比另一途径更直接和更有效的反应。

引入如本文公开的核酸载体ceDNA载体的方法可以例如通过如例如美国专利第5,928,638号中所描述的方法来递送到造血干细胞中。

所属领域中已知的各种递送方法或其修改可以用于体外或体内递送ceDNA载体。举例来说，在一些实施例中，通过机械、电力、超声波、流体动力或基于激光的能量让细胞膜瞬时渗透以便于DNA进入靶向细胞中来递送ceDNA载体。举例来说，可以通过经过大小限制的通道挤压细胞或通过所属领域中已知的其它手段来瞬时破坏细胞膜来递送ceDNA载体。在一些情况下，单独的ceDNA载体作为裸DNA直接注射到皮肤、胸腺、心肌、骨骼肌或肝细胞中。

在一些情况下，通过基因枪递送ceDNA载体。涂覆有无衣壳的AAV载体的金或钨球形粒子(直径1-3μm)可以通过加压气体加速到高速而渗透到目标组织细胞中。

在一些实施例中，使用电穿孔来递送ceDNA载体。电穿孔通过将一对电极插入组织中而引起目标细胞组织细胞膜的暂时失稳，使得失稳膜的周围介质中的DNA分子能够渗入细胞的胞质和核质中。电穿孔已经在体内用于许多类型的组织，如皮肤、肺和肌肉。

在一些情况下，通过流体动力注射来递送ceDNA载体，这是一种将任何水溶性化合物和粒子直接经细胞内递送到内脏器官和整个肢体的骨骼肌中的简单高效的方法。

在一些情况下，通过超声波在膜上制造纳米孔，以促进DNA粒子在细胞内递送到内部器官或肿瘤的细胞中来递送ceDNA载体，因此质粒DNA的大小和浓度在所述系统的效率中起着重要作用。在一些情况下，通过使用磁场的磁转染来递送ceDNA载体，以将含有核酸的粒子集中到目标细胞中。

在一些情况下，可以使用化学递送系统，例如通过使用纳米复合物，其包括用属于阳离子脂质体/胶束或阳离子聚合物的聚阳离子纳米粒子来压紧带负电核酸。用于递送方法的阳离子脂质包括(但不限于)：单价阳离子脂质、多价阳离子脂质、含胍化合物、胆固醇衍生化合物、阳离子聚合物，(例如聚(乙烯亚胺)、聚-L-赖氨酸、鱼精蛋白、其它阳离子聚合物)和脂质-聚合物杂合物。

A.外泌体

在一些实施例中，如本文公开的ceDNA载体通过包装在外泌体中来递送。外泌体是胞吞来源的小膜囊泡，其在多囊泡体与质膜融合后被释放到细胞外环境中。其表面由来自供体细胞的细胞膜的脂质双层组成，其含有来自产生外泌体的细胞的胞溶质并且在表面上展现来自亲本细胞的膜蛋白。外泌体由包括上皮细胞、B和T淋巴细胞、肥大细胞(MC)以及树突状细胞(DC)在内的各种细胞类型产生。一些实施例设想使用直径在10nm与1μm之间、20nm与500nm之间、30nm与250nm之间、50nm与100nm之间的外泌体。使用外泌体的供体细胞或通过将特定核酸引入外泌体中，可以分离外泌体以递送到目标细胞中。所属领域中已知的各种方法可以用于产生含有本发明的无衣壳AAV载体的外泌体。

B.微米粒子/纳米粒子

在一些实施例中，如本文公开的ceDNA载体通过脂质纳米粒子来递送。通常，脂质纳米粒子包含可电离的氨基脂质(例如4-(二甲基氨基)丁酸三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基酯、DLin-MC3-DMA、磷脂酰胆碱(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱，DSPC)、胆固醇和外被脂质(聚乙二醇-二肉豆蔻酰基甘油，PEG-DMG)，例如如Tam等人(2013).《用于递送siRNA的脂质纳米粒子的进展(Advances in Lipid Nanoparticles for siRNAdelivery.)》《药物(Pharmaceuticals)》5(3):498-507所公开。

在一些实施例中，脂质纳米粒子的平均直径在约10nm与约1000nm之间。在一些实施例中，脂质纳米粒子的直径小于300nm。在一些实施例中，脂质纳米粒子的直径在约10nm与约300nm之间。在一些实施例中，脂质纳米粒子的直径小于200nm。在一些实施例中，脂质纳米粒子的直径在约25nm与约200nm之间。在一些实施例中，脂质纳米粒子制剂(例如包含多个脂质纳米粒子的组合物)具有其中平均大小(例如直径)为约70nm到约200nm，并且更通常地平均大小为约100nm或更小的大小分布。

所属领域中已知的各种脂质纳米粒子可以用于递送本文公开的ceDNA载体。举例来说，在美国专利第9,404,127号、第9,006,417号和第9,518,272号中描述了使用脂质纳米粒子的各种递送方法。

一些实施例中，通过金纳米粒子递送本文公开的ceDNA载体。通常，核酸可以与金纳米粒子共价结合或与金纳米粒子非共价结合(例如通过电荷-电荷相互作用结合)，例如如Ding等人(2014).《用于核酸递送的金纳米粒子(Gold Nanoparticles for NucleicAcid Delivery.)》《分子疗法》22(6)；1075-1083所描述。在一些实施例中，使用例如美国专利第6,812,334号中描述的方法产生金纳米粒子-核酸偶联物。

C.偶联物

在一些实施例中，将如本文公开的ceDNA载体偶联(例如与增加细胞吸收的药剂共价结合。“增加细胞吸收的药剂”是促进核酸跨脂质膜运输的分子。举例来说，核酸可以与亲脂性化合物(例如胆固醇、生育酚等)、细胞穿透肽(CPP)(例如穿膜肽、TAT、Syn1B等)和多元胺(例如精胺)偶联。增强细胞吸收的药剂的其它实例公开于例如Winkler(2013).《用于治疗应用的寡核苷酸偶联物(Oligonucleotide conjugates for therapeuticapplications.)》《治疗剂递送(Ther.Deliv.)》4(7)；791-809中所公开。

在一些实施例中，如本文公开的ceDNA载体与聚合物(例如聚合分子)或叶酸类分子(例如叶酸分子)偶联。通常，与聚合物偶联的核酸的递送是所属领域中已知的，例如如WO2000/34343和WO2008/022309中所描述。在一些实施例中，例如如美国专利第8,987,377号中所描述，将如本文公开的ceDNA载体与聚(酰胺)聚合物偶联。在一些实施例中，如美国专利第8,507,455号中所描述，将本公开所描述的核酸与叶酸分子偶联。

在一些实施例中，例如如美国专利第8,450,467号中所描述，将如本文公开的ceDNA载体与碳水化合物偶联。

D.纳米胶囊

可替代地，可以使用如本文公开的ceDNA载体的纳米胶囊配制物。纳米胶囊通常可以呈稳定并且可再现的方式截留物质。为了避免由于细胞内聚合物过载所致的副作用，应使用能够在体内降解的聚合物来设计此类超细粒子(尺寸约0.1μm)。满足这些要求的可生物降解的聚烷基-氰基丙烯酸酯纳米粒子是预期使用的。

E.脂质体

根据本发明的ceDNA载体可以添加到脂质体中以递送到个体的细胞或目标器官中。脂质体是具有至少一个脂质双层的囊泡。在医药研发的背景下，脂质体通常用作药物/治疗剂递送的载剂。其通过与细胞膜融合并重新定位其脂质结构以递送药物或活性药物成分(API)来起作用。用于此类递送的脂质体组合物由磷脂，尤其具有磷脂酰胆碱基团的化合物构成，然而这些组合物还可以包括其它脂质。

脂质体的形成和使用是所属领域的技术人员通常已知的。已经研发了血清稳定性和循环半衰期有所改善的脂质体(美国专利第5,741,516号)。此外，已经描述了脂质体和脂质体样制剂作为潜在药物载剂的各种方法(美国专利第5,567,434号；第5,552,157号；第5,565,213号；第5,738,868号和第5,795,587号)。

脂质体已经成功地用于正常对通过其它程序的转染具有抗性的许多细胞类型。另外，脂质体没有基于病毒的递送系统典型的DNA长度限制。脂质体已经有效用于将基因、药物、放射治疗剂、病毒、转录因子和变构效应子引入各种培养的细胞系和动物中。另外，已经完成了几项成功的考查脂质体介导的药物递送的有效性的临床试验。

脂质体由分散在水性介质中并自发形成多层的同心双层囊泡(也称为多层囊泡(MLV))的磷脂形成。MLV的直径通常为25nm到4μm。超声波处理MLV导致形成直径在200ANG到500ANG范围内的小单层囊泡(SUV)，其核心中含有水溶液。

在一些实施例中，脂质体包含阳离子脂质。术语“阳离子脂质”包括兼具极性和非极性域，并能够在生理pH或生理pH附近带正电荷，并且结合如核酸的聚阴离子，并促进核酸递送到细胞中的脂质和合成脂质。在一些实施例中，阳离子脂质包括胺、酰胺或其衍生物的饱和和不饱和烷基以及脂环族醚和酯。在一些实施例中，阳离子脂质包含直链、支链烷基、烯基或前述的任何组合。在一些实施例中，阳离子脂质含有1个到约25个碳原子(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个碳原子。在一些实施例中，阳离子脂质含有超过25个碳原子。在一些实施例中，直链或支链烷基或烯基具有六个或更多个碳原子。在一些实施例中，阳离子脂质还可以包含一个或多个脂环族基。脂环族基的非限制性实例包括胆固醇和其它类固醇基团。在一些实施例中，阳离子脂质与一种或多种抗衡离子一起制备。抗衡离子(阴离子)的实例包括(但不限于)：Cl

在一些方面，本公开提供了一种脂质体配制物，其包括一种或多种具有聚乙二醇(PEG)官能团的化合物(所谓的“PEG化的化合物”)，所述聚乙二醇官能团可以降低一种或多种所述化合物的免疫原性/抗原性、为其提供亲水性和疏水性并降低剂量频率。或者，脂质体配制物仅包括聚乙二醇(PEG)聚合物作为额外组分。在此类方面，PEG或PEG官能团的分子量可以从62Da到约5,000Da。

在一些方面，本公开提供了一种脂质体配制物，其将在数小时到数周的时段内以延长释放或受控释放曲线来递送API。在一些相关的方面，脂质体配制物可以包含以脂质双层结合的水性腔。在其它相关方面，脂质体配制物将API与组分一起包封起来，所述组分在升高的温度下经历物理转变，在数小时到数周的时段内释放API。

在一些方面，脂质体配制物包含鞘磷脂和一种或多种本文公开的脂质。在一些方面，脂质体配制物包含光敏体。

在一些方面，本公开提供了一种脂质体配制物，其包括一种或多种选自以下的脂质：N-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺钠盐、(二硬脂酰基-sn-甘油-磷酸乙醇胺)、MPEG(甲氧基聚乙二醇)偶联的脂质、HSPC(氢化大豆磷脂酰胆碱)；PEG(聚乙二醇)；DSPE(二硬脂酰基-sn-甘油-磷酸乙醇胺)；DSPC(二硬脂酰基磷脂酰胆碱)；DOPC(二油酰基磷脂酰胆碱)；DPPG(二棕榈酰基磷脂酰甘油)；EPC(卵磷脂酰胆碱)；DOPS(二油酰基磷脂酰丝氨酸)；POPC(棕榈酰基油酰基磷脂酰胆碱)；SM(鞘磷脂)；MPEG(甲氧基聚乙二醇)；DMPC(二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱)；DMPG(二肉豆蔻酰基磷脂酰甘油)；DSPG(二硬脂酰基磷脂酰甘油)；DEPC(二芥酰基磷脂酰胆碱)；DOPE(二油酰基-sn-甘油-磷酸乙醇胺)、硫酸胆固醇酯(CS)、二棕榈酰基磷脂酰甘油(DPPG)、DOPC(二油酰基-sn-甘油-磷脂酰胆碱)或其任何组合。

在一些方面，本公开提供了一种脂质体配制物，其包含磷脂、胆固醇和PEG化脂质，摩尔比为56:38:5。在一些方面，脂质体配制物的总脂质含量为2-16mg/mL。在一些方面，本公开提供了一种脂质体配制物，其包含含有磷脂酰胆碱官能团的脂质、含有乙醇胺官能团的脂质和PEG化脂质。在一些方面，本公开提供了一种脂质体配制物，其包含含有磷脂酰胆碱官能团的脂质、含有乙醇胺官能团的脂质和PEG化脂质，摩尔比分别为3:0.015:2。在一些方面，本公开提供了一种脂质体配制物，其包含含有磷脂酰胆碱官能团的脂质、胆固醇和PEG化脂质。在一些方面，本公开提供了一种脂质体配制物，其包含含有磷脂酰胆碱官能团的脂质和胆固醇。在一些方面，PEG化脂质是PEG-2000-DSPE。在一些方面，本公开提供了一种脂质体配制物，其包含DPPG、大豆PC、MPEG-DSPE脂质偶联物和胆固醇。

在一些方面，本公开提供了一种脂质体配制物，其包含一种或多种含有磷脂酰胆碱官能团的脂质和一种或多种含有乙醇胺官能团的脂质。在一些方面，本公开提供了一种脂质体配制物，其包含以下中的一种或多种：含有磷脂酰胆碱官能团的脂质、含有乙醇胺官能团的脂质和固醇，例如胆固醇。在一些方面，脂质体配制物包含DOPC/DEPC；和DOPE。

在一些方面，本公开提供了一种脂质体配制物，其还包含一种或多种药物赋形剂，例如蔗糖和/或甘氨酸。

在一些方面，本公开提供了一种结构上为单层或多层的脂质体配制物。在一些方面，本公开提供了一种包含多囊泡粒子和/或基于泡沫粒子的脂质体配制物。在一些方面，本公开提供了一种相对普通纳米粒子的相对大小更大并且大小为约150nm到250nm的脂质体配制物。在一些方面，脂质体配制物是冻干粉末。

在一些方面，本公开提供了一种脂质体配制物，其通过向在脂质体外部具有分离的ceDNA的混合物中添加弱碱，用本文中公开或描述的ceDNA载体制备并负载所述ceDNA载体。这种添加将脂质体外部的pH提高到大致7.3，并驱动API进入脂质体中。在一些方面，本公开提供了一种脂质体内部pH为酸性的脂质体配制物。在此类情况下，脂质体的内部可以处于pH 4-6.9下，并且更优选pH 6.5。在其它方面，本公开提供了一种通过使用脂质体内药物稳定化技术制备的脂质体配制物。在此类情况下，利用聚合或非聚合的带高电荷阴离子和脂质体内捕获剂，例如多磷酸盐或蔗糖八硫酸盐。

在其它方面，本公开提供了一种包含磷脂、卵磷脂、磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺的脂质体配制物。

阳离子脂质的非限制性实例包括聚乙烯亚胺、聚酰胺基胺(PAMAM)星爆式树枝状聚合物、Lipofectin(DOTMA与DOPE的组合)、Lipofectase、LIPOFECTAMINE

在一些实施例中，如本文公开的ceDNA载体使用美国专利第8,158,601号中所描述的阳离子脂质或如美国专利第8,034,376号中所描述的多元胺化合物或脂质来递送。

F.示例性脂质体和脂质纳米粒子(LNP)组合物

可以将根据本发明的ceDNA载体添加到脂质体中，以递送到需要基因编辑的细胞，例如需要供体序列的细胞。脂质体是具有至少一个脂质双层的囊泡。在医药研发的背景下，脂质体通常用作药物/治疗剂递送的载剂。其通过与细胞膜融合并重新定位其脂质结构以递送药物或活性药物成分(API)来起作用。用于此类递送的脂质体组合物由磷脂，尤其具有磷脂酰胆碱基团的化合物构成，然而这些组合物还可以包括其它脂质。

在一些方面，本公开提供了一种脂质体配制物，其包括一种或多种具有聚乙二醇(PEG)官能团的化合物(所谓的“PEG化的化合物”)，所述聚乙二醇官能团可以降低一种或多种所述化合物的免疫原性/抗原性、为其提供亲水性和疏水性并降低剂量频率。或者，脂质体配制物仅包括聚乙二醇(PEG)聚合物作为额外组分。在此类方面，PEG或PEG官能团的分子量可以从62Da到约5,000Da。

在一些方面，本公开提供了一种脂质体配制物，其将在数小时到数周的时段内以延长释放或受控释放曲线来递送API。在一些相关的方面，脂质体配制物可以包含以脂质双层结合的水性腔。在其它相关方面，脂质体配制物将API与组分一起包封起来，所述组分在升高的温度下经历物理转变，在数小时到数周的时段内释放API。

在一些方面，脂质体配制物包含鞘磷脂和一种或多种本文公开的脂质。在一些方面，脂质体配制物包含光敏体。

在一些方面，本公开提供了一种脂质体配制物，其包括一种或多种选自以下的脂质：N-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺钠盐、(二硬脂酰基-sn-甘油-磷酸乙醇胺)、MPEG(甲氧基聚乙二醇)偶联的脂质、HSPC(氢化大豆磷脂酰胆碱)；PEG(聚乙二醇)；DSPE(二硬脂酰基-sn-甘油-磷酸乙醇胺)；DSPC(二硬脂酰基磷脂酰胆碱)；DOPC(二油酰基磷脂酰胆碱)；DPPG(dipalmitoylphosphatidylglycerol)；EPC(卵磷脂酰胆碱)；DOPS(二油酰基磷脂酰丝氨酸)；POPC(palmitoyloleoylphosphatidylcholine)；SM(鞘磷脂)；MPEG(甲氧基聚乙二醇)；DMPC(二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱)；DMPG(二肉豆蔻酰基磷脂酰甘油)；DSPG(distearoylphosphatidylglycerol)；DEPC(二芥酰基磷脂酰胆碱)；DOPE(二油酰基-sn-甘油-磷酸乙醇胺)、硫酸胆固醇酯(CS)、dipalmitoylphosphatidylglycerol(DPPG)、DOPC(二油酰基-sn-甘油-磷脂酰胆碱)或其任何组合。

在一些方面，本公开提供了一种脂质体配制物，其包含磷脂、胆固醇和PEG化脂质，摩尔比为56:38:5。在一些方面，脂质体配制物的总脂质含量为2-16mg/mL。在一些方面，本公开提供了一种脂质体配制物，其包含含有磷脂酰胆碱官能团的脂质、含有乙醇胺官能团的脂质和PEG化脂质。在一些方面，本公开提供了一种脂质体配制物，其包含含有磷脂酰胆碱官能团的脂质、含有乙醇胺官能团的脂质和PEG化脂质，摩尔比分别为3:0.015:2。在一些方面，本公开提供了一种脂质体配制物，其包含含有磷脂酰胆碱官能团的脂质、胆固醇和PEG化脂质。在一些方面，本公开提供了一种脂质体配制物，其包含含有磷脂酰胆碱官能团的脂质和胆固醇。在一些方面，PEG化脂质是PEG-2000-DSPE。在一些方面，本公开提供了一种脂质体配制物，其包含DPPG、大豆PC、MPEG-DSPE脂质偶联物和胆固醇。

在一些方面，本公开提供了一种脂质体配制物，其包含一种或多种含有磷脂酰胆碱官能团的脂质和一种或多种含有乙醇胺官能团的脂质。在一些方面，本公开提供了一种脂质体配制物，其包含以下中的一种或多种：含有磷脂酰胆碱官能团的脂质、含有乙醇胺官能团的脂质和固醇，例如胆固醇。在一些方面，脂质体配制物包含DOPC/DEPC；和DOPE。

在一些方面，本公开提供了一种脂质体配制物，其还包含一种或多种药物赋形剂，例如蔗糖和/或甘氨酸。

在一些方面，本公开提供了一种结构上为单层或多层的脂质体配制物。在一些方面，本公开提供了一种包含多囊泡粒子和/或基于泡沫粒子的脂质体配制物。在一些方面，本公开提供了一种相对普通纳米粒子的相对大小更大并且大小为约150nm到250nm的脂质体配制物。在一些方面，脂质体配制物是冻干粉末。

在一些方面，本公开提供了一种脂质体配制物，其通过向在脂质体外部具有分离的ceDNA的混合物中添加弱碱，用本文中公开或描述的ceDNA载体制备并负载所述ceDNA载体。这种添加将脂质体外部的pH提高到大致7.3，并驱动API进入脂质体中。在一些方面，本公开提供了一种脂质体内部pH为酸性的脂质体配制物。在此类情况下，脂质体的内部可以处于pH 4-6.9下，并且更优选pH 6.5。在其它方面，本公开提供了一种通过使用脂质体内药物稳定化技术制备的脂质体配制物。在此类情况下，利用聚合或非聚合的带高电荷阴离子和脂质体内捕获剂，例如多磷酸盐或蔗糖八硫酸盐。

在其它方面，本公开提供了一种包含磷脂、卵磷脂、磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺的脂质体配制物。在一些实施例中，脂质体配制物为下表6中所描述的配制物。

表6：示例性脂质体配制物

在一些方面，本公开提供了包含ceDNA和可电离脂质的脂质纳米粒子。举例来说，通过如2018年9月7日提交的国际申请PCT/US2018/050042中公开的方法获得的ceDNA制备并负载ceDNA的脂质纳米粒子配制物，所述申请并入本文中。这可以通过在低pH下将乙醇脂质与ceDNA水溶液高能混合，使可电离脂质质子化并为ceDNA/脂质缔合和粒子成核提供有利的能量来实现。通过水稀释和去除有机溶剂可以进一步稳定粒子。可以将粒子浓缩到所需水平。

通常，以约10:1到30:1的总脂质与ceDNA(质量或重量)比率制备脂质粒子。在一些实施例中，脂质与ceDNA比率(质量/质量比率；w/w比率)可以在约1:1到约25:1、约10:1到约14:1、约3:1到约15:1、约4:1到约10:1、约5:1到约9:1或约6:1到约9:1范围内。可以调节脂质和ceDNA的量以提供所需的N/P比，例如N/P比为3、4、5、6、7、8、9、10或更高。通常，脂质粒子配制物的总脂质含量可以在约5mg/ml到约30mg/mL的范围内。

可电离脂质通常用于在低pH下浓缩核酸货物(例如ceDNA)并驱动膜缔合和融合。通常，可电离脂质是包含至少一个氨基的在酸性条件下(例如在pH 6.5或更低的条件下)带正电或质子化的脂质。可电离脂质在本文中也称为阳离子脂质。

示例性可电离脂质描述于PCT专利公开案WO2015/095340、WO2015/199952、WO2018/011633、WO2017/049245、WO2015/061467、WO2012/040184、WO2012/000104、WO2015/074085、WO2016/081029、WO2017/004143、WO2017/075531、WO2017/117528、WO2011/022460、WO2013/148541、WO2013/116126、WO2011/153120、WO2012/044638、WO2012/054365、WO2011/090965、WO2013/016058、WO2012/162210、WO2008/042973、WO2010/129709、WO2010/144740、WO2012/099755、WO2013/049328、WO2013/086322、WO2013/086373、WO2011/071860、WO2009/132131、WO2010/048536、WO2010/088537、WO2010/054401、WO2010/054406、WO2010/054405、WO2010/054384、WO2012/016184、WO2009/086558、WO2010/042877、WO2011/000106、WO2011/000107、WO2005/120152、WO2011/141705、WO2013/126803、WO2006/007712、WO2011/038160、WO2005/121348、WO2011/066651、WO2009/127060、WO2011/141704、WO2006/069782、WO2012/031043、WO2013/006825、WO2013/033563、WO2013/089151、WO2017/099823、WO2015/095346和WO2013/086354以及美国专利公开案US2016/0311759、US2015/0376115、US2016/0151284、US2017/0210697、US2015/0140070、US2013/0178541、US2013/0303587、US2015/0141678、US2015/0239926、US2016/0376224、US2017/0119904、US2012/0149894、US2015/0057373、US2013/0090372、US2013/0274523、US2013/0274504、US2013/0274504、US2009/0023673、US2012/0128760、US2010/0324120、US2014/0200257、US2015/0203446、US2018/0005363、US2014/0308304、US2013/0338210、US2012/0101148、US2012/0027796、US2012/0058144、US2013/0323269、US2011/0117125、US2011/0256175、US2012/0202871、US2011/0076335、US2006/0083780、US2013/0123338、US2015/0064242、US2006/0051405、US2013/0065939、US2006/0008910、US2003/0022649、US2010/0130588、US2013/0116307、US2010/0062967、US2013/0202684、US2014/0141070、US2014/0255472、US2014/0039032、US2018/0028664、US2016/0317458和US2013/0195920中，所有这些专利公开案的内容以全文引用的方式并入本文中。

在一些实施例中，可电离脂质为具有以下结构的MC3(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基-4-(二甲基氨基)丁酸酯(DLin-MC3-DMA或MC3)：

脂质DLin-MC3-DMA描述于Jayaraman等人，《英国应用化学国际版(Angew.Chem.Int.Ed Engl.)》(2012),51(34):8529-8533，其内容以全文引用的方式并入本文中。

在一些实施例中，可电离脂质为具有以下结构的脂质ATX-002：

脂质ATX-002描述于WO2015/074085中，其内容以全文引用的方式并入本文中。

在一些实施例中，可电离脂质为具有以下结构的(13Z,16Z)-N,N-二甲基-3-壬基二十二碳-13,16-二烯-1-胺(化合物32)：

化合物32描述于WO2012/040184中，其内容以全文引用的方式并入本文中。

在一些实施例中，可电离脂质为具有以下结构的化合物6或化合物22：

化合物6和22描述于WO2015/199952中，其内容以全文引用的方式并入本文中。

不受限制地，可电离脂质可以占脂质纳米粒子中存在的总脂质的20％-90％(mol)。举例来说，可电离脂质摩尔含量可以为脂质纳米粒子中存在的总脂质的20％-70％(mol)、30％-60％(mol)或40％-50％(mol)。在一些实施例中，可电离脂质占脂质纳米粒子中存在的总脂质的约50mol％到约90mol％。

在一些方面，脂质纳米粒子可以还包含非阳离子脂质。非离子脂质包括两亲脂质、中性脂质和阴离子脂质。因此，非阳离子脂质可以是中性不带电的、两性离子型或阴离子脂质。非阳离子脂质通常用于增强融合性。

示例性非阳离子脂质包括(但不限于)：二硬脂酰基-sn-甘油-磷酸乙醇胺、二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰基磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰基磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰基-磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺(POPE)、二油酰基-磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-甲酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆酰基磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰基-磷脂酰基-乙醇胺(DSPE)、单甲基-磷脂酰乙醇胺(如16-O-单甲基PE)、二甲基-磷脂酰乙醇胺(如16-O-二甲基PE)、18-1-反式PE、1-硬脂酰基-2-油酰基-磷脂酰乙醇胺(SOPE)、氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、卵磷脂酰胆碱(EPC)、二油酰基磷脂酰丝氨酸(DOPS)、鞘磷脂(SM)、二肉豆酰基磷脂酰胆碱(DMPC)、二肉豆酰基磷脂酰甘油(DMPG)、二硬脂酰基磷脂酰甘油(DSPG)、二芥酰基磷脂酰胆碱(DEPC)、棕榈酰基油酰磷脂酰甘油(POPG)、二反式油酰基-磷脂酰乙醇胺(DEPE)、卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、溶血卵磷脂、溶血磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、鞘磷脂、卵鞘磷脂(ESM)、脑磷脂、心磷脂、磷脂酸、脑苷脂、磷酸二鲸蜡酯、溶血磷脂酰胆碱、二亚油酰基磷脂酰胆碱或其混合物。应理解也可以使用其它二酰基磷脂酰胆碱和二酰基磷脂酰乙醇胺磷脂。这些脂质中的酰基优选为衍生自具有C

适用于脂质纳米粒子的非阳离子脂质的其它实例包括非磷脂质，如硬脂胺、十二烷基胺、十六烷基胺、乙酰基棕榈酸酯、甘油蓖麻油酸酯、硬脂酸十六酯、肉豆蔻酸异丙酯、两性丙烯酸聚合物、三乙醇胺-十二烷基硫酸酯、烷基-芳基硫酸酯聚乙氧基化脂肪酸酰胺、二(十八烷基)二甲基溴化铵、神经酰胺、鞘磷脂等。

在一些实施例中，非阳离子脂质是磷脂。在一些实施例中，非阳离子脂质是选自DSPC、DPPC、DMPC、DOPC、POPC、DOPE和SM。在一些优选实施例中，非阳离子脂质是DPSC。

示例性非阳离子脂质在PCT公开案WO2017/099823和美国专利公开案US2018/0028664中描述，所述公开案的内容以全文引用的方式并入本文中。在一些实例中，非阳离子脂质是油酸或如在US2018/0028664中定义的式(I)

非阳离子脂质可以占脂质纳米粒子中存在的总脂质的0％-30％(mol)。举例来说，非阳离子脂质含量为脂质纳米粒子中存在的总脂质的5％-20％(mol)或10％-15％(mol)。在各种实施例中，可电离脂质与中性脂质的摩尔比为约2:1到约8:1。

在一些实施例中，脂质纳米粒子不包含任何磷脂。

在一些方面，脂质纳米粒子可以还包含如固醇的组分，以提供膜完整性。

可以用于脂质纳米粒子中的一种示例性固醇是胆固醇和其衍生物。非限制性胆固醇衍生物的实例包括：极性类似物，如5α-胆甾烷醇、5β-粪醇、胆固醇基-(2′-羟基)-乙基醚、胆固醇基-(4′-羟基)-丁基醚和6-酮胆甾烷醇；非极性类似物，如5α-胆甾烷、胆甾烯酮、5α-胆甾酮、5β-胆甾酮和胆固醇癸酸酯；以及其混合物。在一些实施例中，胆固醇衍生物是极性类似物，如胆固醇基-(4′-羟基)-丁基醚。

示例性胆固醇衍生物描述于PCT公开案WO2009/127060和美国专利公开案US2010/0130588中，所述公开案的内容以全文引用的方式并入本文中。

如固醇的提供膜完整性的组分可以占脂质纳米粒子中存在的总脂质的0％-50％(mol)。在一些实施例中，此类组分占脂质纳米粒子的总脂质含量的20％-50％(mol)、30％-40％(mol)。

在一些方面，脂质纳米粒子可以还包含聚乙二醇(PEG)或偶联的脂质分子。通常，这些用于抑制脂质纳米粒子的聚集和/或提供空间稳定。示例性偶联脂质包括(但不限于)：PEG-脂质偶联物、聚噁唑啉(POZ)-脂质偶联物、聚酰胺-脂质偶联物(如ATTA-脂质偶联物)、阳离子聚合物脂质(CPL)偶联物以及其混合物。在一些实施例中，偶联的脂质分子是PEG-脂质偶联物，例如(甲氧基聚乙二醇)偶联的脂质。

示例性PEG-脂质偶联物包括(但不限于)：PEG-二酰基甘油(DAG)(如1-(单甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻酰甘油(PEG-DMG))、PEG-二烷氧基丙基(DAA)、PEG-磷脂、PEG-神经酰胺(Cer)、聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)、PEG丁二酸酯二酰基甘油(PEGS-DAG)(如4-O-(2',3'-二(十四烷酰氧基)丙基-1-O-(w-甲氧基(聚乙氧基)乙基)丁二酸酯(PEG-S-DMG))、PEG二烷氧基丙基氨基甲酸酯、N-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺钠盐，或其混合物。另外的示例性PEG-脂质偶联物描述于例如US5,885,613、US6,287,591、US2003/0077829、US2003/0077829、US2005/0175682、US2008/0020058、US2011/0117125、US2010/0130588、US2016/0376224和US2017/0119904中，所有这些文献的内容以全文引用的方式并入本文中。

在一些实施例中，PEG-脂质是如在US2018/0028664中定义的式(III)

在一些实施例中，PEG-脂质是如US20150376115或US2016/0376224中定义的式(II)

PEG-DAA偶联物可以是例如PEG-二月桂酰氧基丙基、PEG-二肉豆蔻酰氧基丙基、PEG-二棕榈酰氧基丙基或PEG-二硬脂酰氧基丙基。PEG-脂质可以是以下中的一种或多种：PEG-DMG、PEG-二月桂基甘油、PEG-二棕榈酰基甘油、PEG-二硬脂基甘油、PEG-二月桂基甘油酰胺、PEG-二肉豆蔻基甘油酰胺、PEG-二棕榈酰基甘油酰胺、PEG-二硬脂基甘油酰胺、PEG-胆固醇(1-[8'-(胆甾-5-烯-3[β]-氧基)甲酰胺基-3',6'-二氧杂辛基]氨甲酰基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)、PEG-DMB(3,4-二(十四烷氧基)苯甲基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)醚)，以及1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]。在一些实例中，PEG-脂质可以选自以下组成的组：PEG-DMG、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]、

也可以使用与除PEG以外的分子偶联的脂质代替PEG-脂质。举例来说，代替PEG-脂质或除PEG-脂质以外，还可以使用聚噁唑啉(POZ)-脂质偶联物、聚酰胺-脂质偶联物(如ATTA-脂质偶联物)和阳离子聚合物脂质(CPL)偶联物。

在以下中描述了示例性偶联的脂质，即PEG-脂质、(POZ)-脂质偶联物、ATTA-脂质偶联物和阳离子聚合物-脂质：PCT专利申请公开案WO1996/010392、WO1998/051278、WO2002/087541、WO2005/026372、WO2008/147438、WO2009/086558、WO2012/000104、WO2017/117528、WO2017/099823、WO2015/199952、WO2017/004143、WO2015/095346、WO2012/000104、WO2012/000104和WO2010/006282；美国专利申请公开案US2003/0077829、US2005/0175682、US2008/0020058、US2011/0117125、US2013/0303587、US2018/0028664、US2015/0376115、US2016/0376224、US2016/0317458、US2013/0303587、US2013/0303587和US20110123453；以及美国专利US5,885,613、US6,287,591、US6,320,017和US6,586,559，所有文献的内容以全文引用的方式并入本文中。

PEG或偶联的脂质可以占脂质纳米粒子中存在的总脂质的0％-20％(mol)。在一些实施例中，PEG或偶联的脂质含量为脂质纳米粒子中存在的总脂质的0.5％-10％或2％-5％(mol)。

可电离脂质、非阳离子脂质、固醇和PEG/偶联的脂质的摩尔比可以根据需要改变。举例来说，脂质粒子可以包含按摩尔或按组合物的总重量计30％-70％的可电离脂质、按摩尔或按组合物的总重量计0％-60％的胆固醇、按摩尔或按组合物的总重量计0％-30％的非阳离子脂质以及按摩尔或按组合物的总重量计为1％-10％的偶联的脂质。优选地，组合物包含按摩尔或按组合物的总重量计30％-40％的可电离脂质、按摩尔或按组合物的总重量计40％-50％的胆固醇以及按摩尔或按组合物的总重量计10％-20％的非阳离子脂质。在一些其它实施例中，组合物为按摩尔或按组合物的总重量计50％-75％的可电离脂质、按摩尔或按组合物的总重量计20％-40％的胆固醇和按摩尔或按组合物的总重量计5％至10％的非阳离子脂质，以及按摩尔或按组合物的总重量计1％-10％的偶联的脂质。组合物可以含有按摩尔或按组合物的总重量计60％-70％的可电离脂质、按摩尔或按组合物的总重量计25％-35％的胆固醇以及按摩尔或按组合物的总重量计5％-10％的非阳离子脂质。组合物还可以含有按摩尔或按组合物的总重量计高达90％的可电离脂质以及按摩尔或按组合物的总重量计2％到15％的非阳离子脂质。配制物还可以是脂质纳米粒子配制物，例如包含按摩尔或按组合物的总重量计8％-30％的可电离脂质、按摩尔或按组合物的总重量计5％-30％的非阳离子脂质以及按摩尔或按组合物的总重量计0％-20％的胆固醇；按摩尔或按组合物的总重量计4％-25％的可电离脂质、按摩尔或按组合物的总重量计4％-25％的非阳离子脂质、按摩尔或按组合物的总重量计2％到25％的胆固醇、按摩尔或按组合物的总重量计10％到35％的偶联的脂质以及按摩尔或按组合物的总重量计5％的胆固醇；或按摩尔或按组合物的总重量计2％-30％的可电离脂质、按摩尔或按组合物的总重量计2％-30％的非阳离子脂质、按摩尔或按组合物的总重量计1％到15％的胆固醇、按摩尔或按组合物的总重量计2％到35％的偶联的脂质以及按摩尔或按组合物的总重量计1％-20％的胆固醇；或按摩尔或按组合物的总重量计甚至高达90％的可电离脂质以及按摩尔或按组合物的总重量计2％-10％的非阳离子脂质，或按摩尔或按组合物的总重量计甚至100％的阳离子脂质。在一些实施例中，脂质粒子配制物包含摩尔比为50:10:38.5:1.5的可电离脂质、磷脂、胆固醇和PEG化脂质。在一些其它实施例中，脂质粒子配制物包含摩尔比为60:38.5:1.5的可电离脂质、胆固醇和PEG化脂质。

在一些实施例中，脂质粒子包含可电离脂质，非阳离子脂质(例如磷脂)、固醇(例如胆固醇)和PEG化脂质，其中可电离脂质的脂质摩尔比在20摩尔％到70摩尔％范围内，目标为40摩尔％-60摩尔％，非阳离子脂质的摩尔百分比在0到30范围内，目标为0到15，固醇的摩尔百分比在20到70范围内，目标为30到50，并且PEG化脂质的摩尔百分比在1到6范围内，目标为2到5。

包含ceDNA的脂质纳米粒子(LNP)在2018年9月7日提交的国际申请PCT/US2018/050042中公开，其以全文引用的方式并入本文中并设想用于本文所公开的方法和组合物中。

可以使用Malvern Zetasizer Nano ZS(英国莫尔文(Malvern,UK))通过准弹性光散射来测定脂质纳米粒子的粒度，并且其直径为大致50nm-150nm、直径为大致55nm-95nm或直径为大致70nm-90nm。

配制的阳离子脂质的pKa可以与LNP递送核酸的效力相关(参见Jayaraman等人,《应用化学国际版(Angewandte Chemie,International Edition)》(2012),51(34),8529-8533；Semple等人,《自然生物技术》28,172-176(20l 0)，两个文献都以全文引用的方式并入本文中)。pKa的优选范围是约5到约7。使用基于2-(对甲苯胺基)-6-萘磺酸(TNS)荧光的分析测定脂质纳米粒子中每种阳离子脂质的pKa。可以使用如本文和别处所描述的在线方法来制备在PBS中0.4mM总脂质的浓度的由阳离子脂质/DSPC/胆固醇/PEG-脂质(50/10/38.5/1.5mol％)构成的脂质纳米粒子。TNS可以在蒸馏水中制成100μM的储备溶液。可以在2mL缓冲溶液中将囊泡稀释到24μM脂质，所述缓冲溶液含有10mM HEPES、10mM MES、10mM乙酸铵、130mM NaCl，其中pH在2.5到11范围内。可以添加等分试样的TNS溶液，使最终浓度为1μM，并在涡旋混合后，在室温下，使用321nm和445nm的激发和发射波长，在SLM Aminco系列2发光分光光度计中测量荧光强度。可以将S型最佳拟合分析应用于荧光数据，并测量pKa，其为达到半最大荧光强度的pH值。

相对活性可以通过在经由尾静脉注射施用后4小时测量肝脏中的荧光素酶表达来确定。在0.3和1.0mg ceDNA/kg的剂量下比较活性，并以施用后4小时测得的ng荧光素酶/g肝脏表示。

不受限制地，本发明的脂质纳米粒子包括可以用于递送无衣壳非病毒的DNA载体到所关注的目标位点(例如细胞、组织、器官等)的脂质配制物。通常，脂质纳米粒子包含无衣壳非病毒的DNA载体和可电离脂质或其盐。

在一些实施例中，脂质粒子包含大致50:10:38.5:1.5的摩尔比的可电离脂质/非阳离子脂质/固醇/偶联的脂质。

在一些实施例中，脂质粒子包含大致50.0:7.0:40.0:3.0的摩尔比的可电离脂质/非阳离子脂质/固醇/偶联的脂质。

在其它方面，本公开提供了一种包含磷脂、卵磷脂、磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺的脂质纳米粒子配制物。

在一些实施例中，还可以包括一种或多种另外的化合物。可以分开施用那些化合物，或另外的化合物可以包括在本发明的脂质纳米粒子中。换句话说，脂质纳米粒子除了ceDNA或至少第二ceDNA以外，还可以含有不同于第一ceDNA的其它化合物。不受限制地，其它另外的化合物可以选自以下组成的组：有机或无机的小分子或大分子、单糖、二糖、三糖、寡糖、多糖、肽、蛋白质、肽类似物和其衍生物、拟肽、核酸、核酸类似物和衍生物、由生物材料制成的提取物或其任何组合。

在一些实施例中，一种或多种另外的化合物可以是治疗剂。治疗剂可以选自适合于治疗目的的任何类别。换句话说，治疗剂可以选自适合于治疗目的的任何类别。换句话说，可以根据治疗目的和所需的生物学作用选择治疗剂。举例来说，如果LNP内的ceDNA适用于治疗癌症，那么另外的化合物可以是抗癌剂(例如化学治疗剂、靶向癌症疗法(包括但不限于小分子、抗体或抗体-药物偶联物)。在另一个实例中，如果含有ceDNA的LNP适用于治疗感染，那么另外的化合物可以是抗菌剂(例如抗生素或抗病毒化合物)。在又另一个实例中，如果含有ceDNA的LNP适用于治疗免疫疾病或病症，那么另外的化合物可以是调节免疫应答的化合物(例如免疫抑制剂、免疫刺激化合物或调节一种或多种特异性免疫路径的化合物)。在一些实施例中，含有如编码不同蛋白质的ceDNA的不同化合物或如治疗剂的不同化合物的不同脂质纳米粒子的不同混合物可以用于本发明的组合物和方法中。

在一些实施例中，另外的化合物是免疫调节剂。举例来说，另外的化合物是免疫抑制剂。在一些实施例中，另外的化合物是免疫刺激剂。

本文还提供了包含脂质纳米粒子和药学上可接受的载剂或赋形剂的药物组合物。

在一些方面，本公开提供了一种脂质纳米粒子配制物，其还包含一种或多种药物赋形剂。在一些实施例中，脂质纳米粒子配制物还包含蔗糖、tris、海藻糖和/或甘氨酸。

通常，本发明的脂质纳米粒子具有经选择以提供预期的治疗效果的平均直径。因此，在一些方面，脂质纳米粒子的平均直径为约30nm到约150nm、更通常为约50nm到约150nm、更通常为约60nm到约130nm、更通常为约70nm到约110nm、最通常为约85nm到约105nm，并且优选为约100nm。在一些方面，本公开提供了一种相对普通纳米粒子的相对大小更大并且大小为约150nm到250nm的脂质粒子。脂质纳米粒子的粒度可以使用例如MalvernZetasizer Nano ZS(英国莫尔文)系统通过准弹性光散射来确定。

取决于脂质粒子的预期用途，可以改变组分的比例并且可以使用例如内体释放参数(ERP)分析来测量特定配制物的递送效率。

ceDNA可以与粒子的脂质部分复合或包封在脂质纳米粒子的脂质位置中。在一些实施例中，可以将ceDNA完全包封在脂质纳米粒子的脂质位置中，从而保护其免于被核酸酶降解，例如在水溶液中。在一些实施例中，脂质纳米粒子中的ceDNA在37℃下脂质纳米粒子暴露于核酸酶至少约20分钟、30分钟、45分钟或60分钟后基本上不降解。在一些实施例中，脂质纳米粒子中的ceDNA在37℃下在粒子在血清中培育至少约30分钟、45分钟或60分钟或至少约2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时、24小时、26小时、28小时、30小时、32小时、34小时或36小时后基本上不降解。

在某些实施例中，脂质纳米粒子对个体，例如对哺乳动物，如人类基本上是无毒的。

在一些方面，脂质纳米粒子配制物是冻干粉末。

在一些实施例中，脂质纳米粒子是具有至少一个脂质双层的固体芯粒子。在其它实施例中，脂质纳米粒子具有非双层结构，即非层状(即非双层)形态。不受限制地，非双层形态可以包括例如三维管、棒、立方对称等。脂质粒子的非层状形态(即非双层结构)可以使所属领域的技术人员已知的分析技术来确定。此类技术包括(但不限于)：低温透射电子显微镜(“Cryo-TEM”)、差示扫描量热法(“DSC”)、X射线衍射等。举例来说，脂质纳米粒子的形态(层状相对于非层状)可以很容易地进行评估，并使用例如Cryo-TEM分析如内容US2010/0130588中所描述来表征，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。

在一些其它实施例中，具有非层状形态的脂质纳米粒子是电子致密的。

在一些方面，本公开提供了一种结构上为单层或多层的脂质纳米粒子。在一些方面，本公开提供了一种包含多囊泡粒子和/或基于泡沫的粒子的脂质纳米粒子配制物。

通过控制脂质组分的组成和浓度，可以控制脂质偶联物从脂质粒子中交换出来的速率，进而可以控制脂质纳米粒子融合的速率。另外，包括例如pH、温度或离子强度的其它变量可以用于改变和/或控制脂质纳米粒子融合的速率。基于本公开，所属领域的普通技术人员将清楚可以用于控制脂质纳米粒子融合的速率的其它方法。同样显而易见，通过控制脂质偶联物的组成和浓度，可以控制脂质粒子的大小。

配制的阳离子脂质的pKa可以与LNP递送核酸的效力相关(参见Jayaraman等人,《应用化学国际版》(2012),51(34),8529-8533；Semple等人,《自然生物技术》28,172-176(20l 0)，两个文献都以全文引用的方式并入本文中)。pKa的优选范围是约5到约7。使用基于2-(对甲苯胺基)-6-萘磺酸(TNS)荧光的分析测定脂质纳米粒子中阳离子脂质的pKa。

脂质粒子中ceDNA的包封可以通过进行不可渗透膜的荧光染料排斥分析，例如

VIII.递送ceDNA载体的方法

在一些实施例中，可以通过各种适合的方法将ceDNA载体体外或体内递送到目标细胞。ceDNA载体可以单独施加或注射。CeDNA载体可以在不借助于转染试剂或其它物理方式的情况下递送到细胞。可替代地，ceDNA载体可以使用所属领域已知的任何转染试剂或所属领域已知的促进DNA进入细胞的其它物理方式递送，例如脂质体、醇类、富含聚赖氨酸的化合物、富含精氨酸的化合物、磷酸钙、微囊泡、显微注射、电穿孔等等。

比之下，用本文公开的无衣壳AAV载体进行的转导可以有效地靶向难以使用各种递送试剂用常规AAV病毒粒子转导的细胞和组织类型。

在另一个实施例中，将ceDNA载体施用CNS(例如脑或眼睛)。可以将ceDNA载体引入脊髓、脑干(延髓、脑桥)、中脑(下丘脑、丘脑、上丘脑、垂体腺、黑质、松果体)、小脑、端脑(纹状体；包括枕骨、颞叶、顶叶和额叶的大脑；皮质；基底神经节；海马和杏仁核(portaamygdala))、边缘系统、新皮质、纹状体、大脑和下丘。也可以将ceDNA载体施用眼睛的不同区域，如视网膜、角膜和/或视神经。ceDNA载体可以被递送到脑脊髓液中(例如通过腰椎穿刺)。可以在血脑屏障已被扰动的情况下(例如脑瘤或大脑梗塞)，进一步将ceDNA载体通过血管内施用CNS。

一些实施例中，ceDNA载体可以通过所属领域中已知的任何途径施用一个或多个CNS的所需区域，所述途径包括(但不限于)：鞘内、眼内、大脑内、脑室内、静脉内(例如在如甘露糖醇的糖的存在下)、鼻内、耳内、眼内(例如玻璃体内、视网膜下、前房)和眼周(例如眼球筋膜囊下区(sub-Tenon's region))递送，以及逆行递送到运动神经元的肌肉内递送。

在一些实施例中，ceDNA载体在液体配制物中通过直接注射(例如立体定向注射)施用CNS中的所需区域或区室中。在其它实施例中，可以通过局部施加到期望区域或通过鼻内施用气雾剂配制物来提供ceDNA载体。可以通过局部施加液滴来施用眼睛。作为另一个替代方案，ceDNA载体可以作为固体、缓释型配制物施用(参见例如美国专利第7,201,898号)。在另外的实施例中，ceDNA载体可以用于逆行转运，以治疗、改善和/或预防涉及运动神经元的疾病和病症(例如肌萎缩性侧索硬化(ALS)；脊髓性肌萎缩(SMA)等)。举例来说，可以将ceDNA载体递送到肌肉组织，其可以从肌肉组织迁移到神经元中。

IX.ceDNA载体的其它用途

本文提供的组合物和ceDNA载体可以出于各种目的递送转基因。在一些实施例中，转基因编码旨在用于研究目的的蛋白质或功能性RNA，例如建立携带转基因的体细胞转基因动物模型，例如以研究转基因产物的功能。在另一个实例中，转基因编码旨在用于建立动物疾病模型的蛋白质或功能性RNA。在一些实施例中，转基因编码一种或多种适用于治疗、预防或改善哺乳动物个体的疾病状态或病症的肽、多肽或蛋白质。可以将转基因以足量转移到个体(例如在其中表达)，以治疗与基因表达降低、缺乏表达或功能障碍有关的疾病。在一些实施例中，转基因可以在个体中足量表达，以治疗与基因产物的表达、活性增加或基因的不当上调有关的疾病，基因产物的表达、活性增加或基因的不当上调使得转基因抑制或以其它方式引起其表达减少。在一些实施例中，转基因用于敲除内源性基因。

X.使用方法

本发明的ceDNA载体还可以用于将所关注的核苷酸序列递送到目标细胞的方法中。所述方法尤其可以是用于将所关注的治疗基因递送到有需要的个体的细胞中的方法。本发明允许由个体的细胞中的治疗性外源性DNA序列编码的多肽、蛋白质或寡核苷酸的体内表达，使得表达所述多肽、蛋白质或寡核苷酸的治疗水平。在ceDNA载体的体内和体外递送模式中均可以看到这些结果。

一种用于在个体的细胞中递送所关注的核酸的方法可以包含向所述个体施用本发明的包含所关注的所述核酸的ceDNA载体。另外，本发明提供了一种向有需要的个体的细胞递送所关注的核酸的方法，所述方法包含多次施用本发明的包含所述所关注的核酸的ceDNA载体。因为本发明的ceDNA载体不诱导免疫应答，所以此类多次施用策略将不会被针对本发明的ceDNA载体的宿主免疫系统应答减弱，与衣壳化载体所观察到的情况相反。

一种或多种ceDNA载体核酸以足以转染所需组织细胞和提供足够的基因转移和表达水平而无不当副作用的量施用。常规和药学上可接受的施用途径包括(但不限于)：静脉内(例如在脂质体配制物中)、直接递送到所选器官(例如门静脉内递送到肝脏)、肌肉内和其它肠胃外施用途径。如果需要，可以组合施用途径。

ceDNA载体递送不限于ceDNA载体的一个物种。因而，在另一方面，可以将包含不同外源性DNA序列的多种ceDNA载体同时或依次递送到目标细胞、组织、器官或个体。因此，这一策略可以允许多个基因的表达。考虑到由于缺乏病毒衣壳而缺乏抗衣壳宿主免疫应答，递送也可以进行多次，并且对于临床环境中的基因疗法来说，重要的是随后增加或减少剂量。

本发明还提供了一种治疗个体的疾病的方法，所述方法包含将治疗有效量的ceDNA载体任选地与药学上可接受的载剂一起引入个体的有需要的目标细胞(尤其是肌肉细胞或组织)中。虽然ceDNA载体可以在载剂存在下引入，但此类载剂不是必需的。所建构的ceDNA载体包含适用于治疗疾病的所关注的核苷酸序列。具体地说，ceDNA载体可以包含与控制元件可操作地连接的期望的外源性DNA序列，当引入个体中时，所述控制元件能够指导由外源性DNA序列编码的期望的多肽、蛋白质或寡核苷酸的转录。ceDNA载体可以通过如上文和本文其它地方提供的任何适合的途径施用。

XI.治疗方法

本文所描述的技术还展示了通过多种方式制备所公开的ceDNA载体的方法和其使用方法，包括例如异位、体外和体内施用、方法、诊断程序和/或基因治疗方案。

本文提供了一种治疗个体的疾病或病症的方法，所述方法包含将治疗有效量的ceDNA载体任选地与药学上可接受的载剂一起引个体的有需要的目标细胞(例如肌肉细胞或组织，或其它受影响的细胞类型)。虽然ceDNA载体可以在载剂存在下引入，但此类载剂不是必需的。所建构的ceDNA载体包含适用于治疗疾病的所关注的核苷酸序列。具体地说，ceDNA载体可以包含与控制元件可操作地连接的期望的外源性DNA序列，当引入个体中时，所述控制元件能够指导由外源性DNA序列编码的期望的多肽、蛋白质或寡核苷酸的转录。ceDNA载体可以通过如上文和本文其它地方提供的任何适合的途径施用。

任何转基因可以通过如本文所公开的ceDNA载体递送。所关注的转基因包括编码多肽的核酸，或优选地治疗性(例如用于医学、诊断或兽医学用途)或免疫原性(例如用于疫苗)多肽的非编码核酸(例如RNAi、miR等)。

在某些实施例中，待由本文所描述的ceDNA载体表达的转基因将表达或编码一种或多种多肽、肽、核酶、肽核酸、siRNA、RNA、反义寡核苷酸、反义多核苷酸、抗体、抗原结合片段或其任何组合。

具体地说，转基因可以编码一种或多种治疗剂，包括(但不限于)例如用于治疗、防治和/或改善疾病、功能障碍、损伤和/或病症的一种或多种症状的一种或多种蛋白质、一种或多种多肽、一种或多种肽、一种或多种酶、抗体、抗原结合片段以及其变体和/或活性片段、激动剂、拮抗剂、模拟物。在一个方面，所述疾病、功能障碍、创伤、损伤和/或病症是人类疾病、功能障碍、创伤、损伤和/或病症。

如本文所指出，转基因可以编码包括(但不限于)以下的治疗蛋白或肽，或治疗性核酸序列或治疗剂：一种或多种激动剂、拮抗剂、抗细胞凋亡因子、抑制剂、受体、细胞因子、细胞毒素、促红细胞生成剂、糖蛋白、生长因子、生长因子受体、激素、激素受体、干扰素、白介素、白介素受体、神经生长因子、神经活性肽、神经活性肽受体、蛋白酶、蛋白酶抑制剂、蛋白质脱羧酶、蛋白激酶、蛋白激酶抑制剂、酶、受体结合蛋白、转运蛋白或其一种或多种抑制剂、血清素受体或其一种或多种吸收抑制剂、丝氨酸蛋白酶抑制蛋白(serpin)、丝氨酸蛋白酶抑制蛋白受体、肿瘤抑制剂、诊断分子、化学治疗剂、细胞毒素或其任何组合。

在一些实施例中，本文所描述的表达盒、表达构建体或ceDNA载体中的转基因可以针对宿主细胞进行密码子优化。如本文所用，术语“进行密码子优化”或“密码子优化”是指通过用例如小鼠或人类(例如人类化)的所关注脊椎动物的基因中使用频率较高或最高的密码子替换天然序列(例如原核序列)的至少一个、超过一个或大量密码子来修饰核酸序列以增强其在所述脊椎动物的细胞中的表达的过程。各种物种对特定氨基酸的某些密码子表现出特定的偏好。通常，密码子优化不会改变原始翻译蛋白质的氨基酸序列。使用例如Aptagen的Gene

在一些实施例中，ceDNA载体表达个体宿主细胞中的转基因。在一些实施例中，个体宿主细胞为人类宿主细胞，包括例如血细胞、干细胞、造血细胞、CD34

本文公开了ceDNA载体组合物和配制物，其包括本发明的一种或多种ceDNA载体以及一种或多种药学上可接受的缓冲剂、稀释剂或赋形剂。此类组合物可以包括在一种或多种诊断或治疗试剂盒中，以用于诊断、预防、治疗或改善疾病、损伤、病症、创伤或功能障碍的一种或多种症状。在一个方面，所述疾病、损伤、病症、创伤或功能障碍是人类疾病、损伤、病症、创伤或功能障碍。

本文所描述技术的另一方面提供了一种向有需要的个体提供诊断或治疗有效量的ceDNA载体的方法，所述方法包含向有需要的个体的细胞、组织或器官提供如本文公开的ceDNA载体，提供的量和时间有效地使转基因从ceDNA载体表达，从而为个体提供诊断或治疗有效量的由ceDNA载体表达的蛋白质、肽、核酸。在另一方面，个体为人类。

本文描述的技术的另一方面提供了一种用于诊断、预防、治疗或改善个体的疾病、病症、功能障碍、损伤、异常病状或创伤的至少一种或多种症状的方法。从总体和一般意义上讲，所述方法至少包括以下步骤：向有需要的个体施用一种或多种所公开的ceDNA载体，施用的量和时间足以诊断、预防、治疗或改善个体的疾病、病症、功能障碍、损伤、异常病状或创伤的一种或多种症状。在另一方面，个体为人类。

另一方面是ceDNA载体作为治疗或减轻疾病或疾病状态的一种或多种症状的工具的用途。有许多遗传性疾病中的缺陷基因是已知的，并且通常分为两类：缺陷状态，通常是酶，一般以隐性方式遗传；和不平衡状态，其可以涉及调节蛋白或结构蛋白，并且通常但不总是以显性方式遗传。对于缺陷状态疾病来说，ceDNA载体可以用于递送转基因以将正常基因引入受影响的组织中进行替代疗法，在一些实施例中，还使用反义突变建立动物模型。对于不平衡的疾病状态来说，ceDNA载体可以用于在模型系统中确立疾病状态，然后可以尝试用于抵消所述疾病状态。因此，本文公开的ceDNA载体和方法允许治疗遗传性疾病。如本文所用，通过部分或完全拯救导致疾病或使其更严重的缺陷或不平衡，可以治疗疾病状态。

一般来说，如本文所公开的ceDNA载体可以用于递送任何转基因以治疗、预防或改善与涉及基因表达的任何病症相关的症状。说明性疾病状态包括(但不限于)：囊性纤维化(和肺的其它疾病)、A型血友病、B型血友病、地中海贫血、贫血和其它血液病症、AIDS、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿氏病、肌萎缩性侧索硬化、癫痫症和其它神经病症、癌症、糖尿病、肌营养不良症(例如杜兴氏、贝克尔)、赫尔勒氏病(Hurler'sdisease)、腺苷脱氨酶缺陷、代谢障碍、视网膜变性疾病(和眼部的其它疾病)、线粒体病(例如莱博氏遗传性视神经病变(Leber's hereditary optic neuropathy；LHON)、雷氏综合征(Leigh syndrome)和亚急性硬化性脑病变)、肌病(例如颜面肩胛肱骨型肌病(FSHD)和心肌病)、实体器官(例如脑、肝脏、肾脏、心脏)的疾病等等。在一些实施例中，如本文公开的ceDNA载体可以有利地用于治疗患有代谢病症(例如鸟氨酸氨甲酰基转移酶缺乏症)的个体。

在一些实施例中，本文所描述的ceDNA载体可以用于治疗、改善和/或预防由基因或基因产物突变引起的疾病或病症。可以用ceDNA载体治疗的示例性疾病或病症包括(但不限于)：代谢性疾病或病症(例如法布里病(Fabry disease)、戈谢病(Gaucher disease)、苯丙酮尿症(PKU)、糖原贮积病)；尿素循环疾病或病症(例如鸟氨酸氨甲酰基转移酶(OTC)缺乏症)；溶酶体贮积病或病症(例如异染性脑白质营养不良(MLD)、II型粘多糖贮积病(MPSII；亨特综合征(Hunter syndrome)))；肝脏疾病或病症(例如进行性家族性肝内胆汁淤积症(PFIC)；血液疾病或病症(例如血友病(A型和B型)、地中海贫血和贫血)；癌症和肿瘤以及遗传性疾病或病症(例如囊性纤维化)。

作为又另一方面，在希望调控转基因(例如如本文所描述的编码激素或生长因子的转基因)的表达水平的情况下，可以采用如本文公开的ceDNA载体递送异源核苷酸序列。作为一个实例，转基因可以抑制控制目标基因的表达或活性的路径。作为另一个实例，转基因可以增强控制目标基因的表达或活性的路径的活性。

因此，在一些实施例中，本文所描述的ceDNA载体可以用于矫正导致疾病或病症的异常基因产物的水平和/或功能(例如蛋白质缺乏或缺陷)。ceDNA载体可以产生功能蛋白和/或调节蛋白质的水平，以减轻或减少由所述蛋白质的缺乏或缺陷引起的特定疾病或病症所产生的症状或为所述疾病或病症带来益处。例如，可以通过产生功能OTC酶来实现OTC缺乏症的治疗；可以通过调节因子VIII、因子IX和因子X的水平来实现A型和B型血友病的治疗；可以通过调节苯丙氨酸羟化酶的水平来实现PKU的治疗；可以分别通过产生功能性α半乳糖苷酶或β葡糖脑苷脂酶来实现法布里病或戈谢病的治疗；可以分别通过产生功能性芳基硫酸酯酶A或艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶来实现MLD或MPSII的治疗；可以通过产生功能性囊性纤维化跨膜传导调控因子来实现囊性纤维化的治疗；可以通过恢复功能性G6Pase酶功能来实现糖原贮积病的治疗；并且可以通过产生功能性ATP8B1、ABCB11、ABCB4或TJP2基因来实现PFIC的治疗。

在替代实施例中，如本文公开的ceDNA载体可以用于在体外或体内向细胞提供反义核酸。举例来说，在转基因是RNAi分子的情况下，目标细胞中反义核酸或RNAi的表达会削弱细胞对特定蛋白质的表达。因此，为了减少特定蛋白质在有需要的个体中的表达，可以施用作为RNAi分子或反义核酸的转基因。还可以将反义核酸体外施用细胞以调控细胞生理，例如优化细胞或组织培养系统。

在一些实施例中，由ceDNA载体编码的示例性转基因包括(但不限于)：溶酶体酶(例如与泰-萨氏病(Tay-Sachs disease)相关的己糖胺酶A或与亨特综合征/MPS II相关的艾杜糖醛酸硫酸酯酶)、促红细胞生成素、血管抑制素、内皮抑制素、超氧化物歧化酶、珠蛋白、瘦素、过氧化氢酶、酪氨酸羟化酶以及细胞因子(例如干扰素、β-干扰素、干扰素-γ、白介素-2、白介素-4、白介素12、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、淋巴毒素等)、肽生长因子和激素(例如生长激素、胰岛素、胰岛素样生长因子1和2、血小板衍生生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、神经生长因子(NGF)、神经营养因子-3和4、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经胶质衍生的生长因子(GDNF)、转化生长因子-α和-β等)、受体(例如肿瘤坏死因子受体)。在一些示例性实施例中，转基因编码对一个或多个期望的目标具有特异性的单克隆抗体。在一些示例性实施例中，ceDNA载体编码超过一种转基因。在一些示例性实施例中，转基因编码包含两种不同的所关注多肽的融合蛋白。在一些实施例中，转基因编码如本文定义的抗体，包括全长抗体或抗体片段。在一些实施例中，抗体是如本文所定义的抗原结合域或免疫球蛋白可变域序列。其它说明性的转基因序列编码自杀基因产物(胸腺嘧啶激酶、胞嘧啶脱氨酶、白喉毒素、细胞色素P450、脱氧胞苷激酶和肿瘤坏死因子)、赋予对癌症疗法中所用药物的抗性的蛋白质以及肿瘤遏制基因产物。

代表性实施例中，由ceDNA载体表达的转基因可以用于治疗有需要的个体的肌营养不良症，所述方法包含：施用治疗、改善或预防有效量的本文所描述的ceDNA载体，其中ceDNA载体包含编码以下的异源核酸：肌养蛋白、迷你肌养蛋白、微肌养蛋白、肌抑素前肽、卵泡抑素、II型激活素可溶性受体、IGF-1、抗炎多肽(如Ikappa B显性突变体、肌长蛋白(sarcospan)、肌营养相关蛋白(utrophin)、微肌养蛋白、层连结蛋白-α2、α-肌聚糖、β-肌聚糖、γ-肌聚糖、δ-肌聚糖、IGF-1、针对肌抑素或肌抑素前肽的抗体或抗体片段和/或针对肌抑素的RNAi。在特定实施例中，如本文其它地方所描述，可以将ceDNA载体施用骨骼肌、隔膜肌和/或心肌。

在一些实施例中，ceDNA载体可以用于将转基因递送到骨骼肌、心肌或隔膜肌，以产生在血液中正常循环的多肽(例如酶)或功能性RNA(例如RNAi、微RNA、反义RNA)，或用于全身递送到其它组织以治疗、改善和/或预防病症(例如代谢病症，如糖尿病(例如胰岛素)、血友病(例如VIII)、粘多糖病症(例如斯莱综合征；赫尔勒综合征；沙伊综合征；赫尔勒-沙伊综合征；亨特氏综合征；圣菲利波综合征A、B、C、D；莫基奥综合征；马-拉二氏综合征等)或溶酶体贮积症(如戈谢病[葡糖脑苷脂酶]、庞贝病[溶酶体酸α-葡糖苷酶]或法布里病[α-半乳糖苷酶A])或糖原贮积症(如庞贝病[溶酶体酸α-葡糖苷酶])。适用于治疗、改善和/或预防代谢病症的其它蛋白质在上文描述。

在其它实施例中，如本文所公开的ceDNA载体可以在治疗、改善和/或预防有需要的个体的代谢病症的方法中用于递送转基因。本文描述了说明性代谢病症和编码多肽的转基因。任选地，多肽是分泌的(例如多肽为呈天然状态分泌的多肽，或例如如所属领域中已知的，通过与分泌信号序列可操作地结合，已被工程改造成分泌的多肽)。

本发明的另一方面涉及一种治疗、改善和/或预防有需要的个体的先天性心力衰竭或PAD的方法，所述方法包含向哺乳动物个体施用如本文所描述的ceDNA载体，其中所述ceDNA载体包含编码以下的转基因：例如肌质内质网Ca

如本文所公开的ceDNA载体可以通过任何适合的手段施用个体的肺，任选地通过施用包含ceDNA载体的可吸入粒子的气雾剂悬浮液，使个体吸入其。可吸入粒子可以是液体或固体。包含ceDNA载体的液体粒子的气雾剂可以通过任何适合的方式产生，如用压力驱动的气雾剂喷雾器或超声波喷雾器，如所属领域的技术人员已知的。参见例如美国专利第4,501,729号。包含ceDNA载体的固体粒子的气雾剂也可以通过制药领域已知的技术，用任何固体粒子药物气雾剂发生器产生。

在一些实施例中，可以将ceDNA载体施用CNS的组织(例如脑、眼睛)。在特定实施例中，可以施用如本文所公开的ceDNA载体以治疗、改善或预防CNS的疾病，包括遗传性病症、神经退化性病症、精神病症和肿瘤。CNS的说明性疾病包括(但不限于)：阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿氏病、卡纳万病、雷氏病、雷夫叙姆病、妥瑞综合征、原发性侧索硬化、肌萎缩性侧索硬化、进行性肌萎缩、皮克氏病、肌营养不良症、多发性硬化症、重症肌无力、宾斯旺格氏病、由于脊髓或头部损伤引起的创伤、泰-萨二氏病、莱施-尼汉病、癫痫症、脑梗塞；精神病症，包括情绪障碍(例如抑郁、双极性情感障碍、持续性情感障碍、继发性情绪障碍)、精神分裂症、药物依赖(例如酗酒和其它物质依赖性)、神经症(例如焦虑症、强迫症、类躯体化症精神障碍、分离性障碍、哀伤、分娩后抑郁)、精神病(例如幻觉和错觉)、痴呆症、妄想症、注意缺陷障碍、性心理障碍、睡眠障碍、疼痛障碍、进食障碍或体重失调(例如肥胖症、恶病质、神经性厌食症和贪食症)，以及CNS的癌症和肿瘤(例如垂体肿瘤)。

可以用本发明的ceDNA载体治疗、改善或预防的眼病包括涉及视网膜、后束和视神经的眼科病症(例如视网膜色素变性，糖尿病性视网膜病变和其它视网膜变性疾病、葡萄膜炎、年龄相关性黄斑变性、青光眼)。许多眼科疾病和病症与以下三种类型适应症中的一种或多种有关：(1)血管产生、(2)炎症和(3)变性。在一些实施例中，如本文所公开的ceDNA载体可以用于递送抗血管生成因子；抗炎因子；延缓细胞变性、促进细胞免毒或促进细胞生长的因子以及前述的组合。举例来说，糖尿病性视网膜病变的特征在于血管生成。糖尿病性视网膜病变可以通过在眼内(例如在玻璃体中)或眼周(例如眼球筋膜囊下区)递送一种或多种抗血管生成因子来治疗。一种或多种神经营养因子也可以在眼内(例如玻璃体内)或眼周共同递送。可以用本发明的ceDNA载体治疗、改善或预防的其它眼病包括：地图样萎缩、血管性或“湿性”黄斑变性、斯塔加特氏病、雷伯氏先天性黑蒙(LCA)、尤塞氏综合征、弹力纤维性假黄瘤(PXE)、x-连锁视网膜色素变性(XLRP)、x-连锁视网膜劈裂症(XLRS)、无脉络膜症、雷伯氏遗传性视神经病变(LHON)、全色盲、视锥-视杆细胞营养不良、富克斯角膜内皮营养不良、糖尿病性黄斑水肿以及眼癌和肿瘤。

在一些实施例中，炎性眼部疾病或病症(例如葡萄膜炎)可以通过本发明的ceDNA载体治疗、改善或预防。一种或多种抗炎因子可以通过眼内(例如玻璃体或前房)施用如本文所公开的ceDNA载体来表达。在其它实施例中，以视网膜变性为特征的眼部疾病或病症(例如视网膜色素变性)可以通过本发明的ceDNA载体来治疗、改善或预防。如本文所公开的编码一种或多种神经营养因子的ceDNA载体的眼内施用(例如玻璃体施用)可以用于治疗此类基于视网膜变性的疾病。在一些实施例中，涉及血管生成和视网膜变性(例如年龄相关性黄斑变性)二者的疾病或病症可以用本发明的ceDNA载体治疗。年龄相关性黄斑变性可以通过在眼内(例如玻璃体)施用编码一种或多种神经营养因子的如本文所公开的ceDNA载体和/或在眼内或眼周(例如在眼球筋膜囊下区中)施用编码一种或多种抗血管生成因子的如本文所公开的ceDNA载体来治疗。青光眼的特征在于眼压升高和视网膜神经节细胞丧失。青光眼的治疗包括使用如本文所公开的ceDNA载体来施用一种或多种保护细胞免受兴奋性毒性损害的神经保护剂。因此，此类药剂包括N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)拮抗剂、细胞因子和神经营养因子，可以使用如本文所公开的ceDNA载体在眼内递送，任选地在玻璃体内递送。

在其它实施例中，如本文所公开的ceDNA载体可以用于治疗癫痫，例如以减少癫痫的发作、发生率或严重程度。治疗性治疗癫痫的功效可以通过行为(例如晃动、眼睛或嘴巴转动(tick))和/或电图方式(大多数癫痫具有标志性的电图异常)来评估。因此，如本文所公开的ceDNA载体也可以用于治疗以随时间推移多次癫痫发作为标志的癫痫症。在一个代表性实施例中，使用如本文所公开的ceDNA载体将生长抑素(或其活性片段)施用脑以治疗垂体肿瘤。根据这个实施例，如本文所公开的编码生长抑素(或其活性片段)的ceDNA载体通过微输注施用垂体。同样，此类疗法可以用于治疗肢端肥大症(垂体的生长激素分泌异常)。生长抑素的核酸序列(例如基因库登录号J00306)和氨基酸序列(例如基因库登录号P01166；含有加工的活性肽生长抑素-28和生长抑素-14)是所属领域中已知的。在特定实施例中，如美国专利第7,071,172号中所描述，ceDNA载体可以编码包含分泌信号的转基因。

本发明的另一方面涉及如本文所描述的ceDNA载体在产生反义RNA、RNAi或其它功能性RNA(例如核酶)以体内全身递送到个体的用途。因此，在一些实施例中，ceDNA载体可以包含编码以下的转基因：反义核酸、核酶(例如如美国专利第5,877,022号中所描述)、影响剪接体介导的反式剪接的RNA(参见Puttaraju等人，(1999)《自然生物技术》17:246；美国专利第6,013,487号；美国专利第6,083,702号)、介导基因沉默的干扰RNA(RNAi)(参见Sharp等人，(2000)《科学》287:2431)或其它非翻译RNA，如“向导”RNA(Gorman等人，(1998)《美国国家科学院院刊》95:4929；Yuan等人的美国专利第5,869,248号)等。

在一些实施例中，ceDNA载体还可以包含编码报道多肽(例如酶，如绿色荧光蛋白或碱性磷酸酶)的转基因。在一些实施例中，编码适用于实验或诊断目的的报道蛋白的转基因选自下列中的任一种：β-内酰胺酶、β-半乳糖苷酶(LacZ)、碱性磷酸酶、胸苷激酶、绿色荧光蛋白(GFP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、荧光素酶和所属领域中熟知的其它转基因。在一些方面，包含编码报道多肽的转基因的ceDNA载体可以用于诊断目的或用作ceDNA载体在其所施用的个体中的活性的标记。

在一些实施例中，ceDNA载体可以包含与宿主染色体上的基因座共有同源性并与其重组的转基因或异源核苷酸序列。这个方法可以用于矫正宿主细胞中的基因缺陷。

在一些实施例中，ceDNA载体可以包含可以用于在个体中表达免疫原性多肽的转基因，例如用于疫苗接种。转基因可以编码所属领域中已知的任何所关注的免疫原，包括(但不限于)来自人类免疫缺陷病毒、流感病毒、gag蛋白、肿瘤抗原、癌症抗原、细菌抗原、病毒抗原等的免疫原。

XII.施用

特定实施例中，可以在不同时间间隔的时段内，例如每日、每周、每月、每年等，利用超过一次施用(例如两次、三次、四次或更多次施用)来达成所期望的基因表达水平。

本文所公开的ceDNA载体的示例性施用模式包括口服、经直肠、经粘膜、鼻内、吸入(例如通过气雾剂)、经颊(例如舌下)、经阴道、鞘内、眼内、经皮、内皮内、子宫内(或卵内)、肠胃外(例如静脉内、皮下、皮内、颅内、肌肉内[包括施用骨骼肌、隔膜肌和/或心肌]、胸膜内、大脑内和关节内)、局部(例如皮肤和粘膜表面二者，包括气道表面和经皮施用)、淋巴管内等，以及直接组织或器官注射(例如对肝脏、眼睛、骨骼肌、心肌、隔膜肌或脑)。

可以向个体的任何部位施用ceDNA载体，包括(但不限于)选自以下组成的组的部位：脑、骨骼肌、平滑肌、心脏、膈膜、气道上皮、肝脏、肾脏、脾脏、胰腺、皮肤和眼睛。也可以对肿瘤(例如肿瘤或淋巴结内或附近)施用ceDNA载体。在任何给定情况下最适合的途径将取决于所治疗、改善和/或预防的病状的性质和严重程度，以及所使用的特定ceDNA载体的性质。另外，ceDNA容许通过单个载体或多个ceDNA载体(例如ceDNA混合物)施用超过一种转基因。

根据本发明对骨骼肌施用本文所公开的ceDNA载体包括(但不限于)：对肢体(例如上臂、下臂、大腿和/或小腿)、背部、颈部、头部(例如舌头)、胸部、腹部、骨盆/会阴和/或手指中的骨骼肌施用。如本文所公开的ceDNA载体可以通过静脉内施用、动脉内施用、腹膜内施用、肢体灌注(任选地，腿和/或手臂的隔离肢体灌注；参见例如Arruda等人，(2005)《血液(Blood)》105:3458-3464)和/或直接肌肉内注射而递送到骨骼肌。在特定实施例中，如本文所公开的ceDNA载体通过肢体灌注、任选地隔离肢体灌注(例如静脉内或关节内施用)来施用个体(例如患有如DMD的肌营养不良症的个体)的肢体(臂和/或腿)。在实施例中，如本文所公开的ceDNA载体可以在不使用“流体动力学”技术的情况下施用。

对心肌施用如本文所公开的ceDNA载体包括对左心房、右心房、左心室、右心室和/或中隔施用。如本文所描述的ceDNA载体可以通过静脉内施用、动脉内施用(如主动脉内施用)、直接心脏注射(例如注入左心房、右心房、左心室、右心室)和/或冠状动脉灌注而递送到心肌。施用隔膜肌可以采用任何适合的方法，包括静脉内施用、动脉内施用和/或腹膜内施用。对平滑肌的施用可以通过任何适合的方法，包括静脉内施用、动脉内施用和/或腹膜内施用。在一个实施例中，可以施用存在于平滑肌内、附近和/或平滑肌上的内皮细胞。

在一些实施例中，将根据本发明的ceDNA载体施用骨骼肌、隔膜肌和/或心肌(例如以治疗、改善和/或预防肌营养不良症或心脏病(例如PAD或充血性心力衰竭)。

A.离体处理

一些实施例中，从个体取出细胞，将ceDNA载体引入其中，然后将细胞替换回个体中。从个体取出细胞进行离体处理、然后再引回到个体中的方法是所属领域中已知的(参见例如美国专利第5,399,346号；其公开内容以全文引用的方式并入本文中)。可替代地，将ceDNA载体引入另一个个体的细胞，引入培养细胞中，或引入任何其它适合来源的细胞中，并将细胞施用有需要的个体。

用ceDNA载体转导的细胞优选与药学载剂组合以“治疗有效量”施用个体。所属领域的技术人员将了解，治疗效果不必是完全的或治愈的，只要给个体提供了一些益处即可。

在一些实施例中，ceDNA载体可以编码作为希望在体外、离体或体内在细胞中产生的任何多肽的转基因(有时称为异源核苷酸序列)。举例来说，与如本文所讨论的治疗方法中使用ceDNA载体相反，在一些实施例中，可以将ceDNA载体引入培养细胞中并从中分离所表达的基因产物，例如用于产生抗原或疫苗。

兽医和医学应用中均可以使用ceDNA载体。如上文所描述的离体基因递送方法的适合的个体包括禽类(例如鸡、鸭、鹅、鹌鹑、火鸡和野鸡)和哺乳动物(例如人类、牛、绵羊、山羊、马、猫、犬和兔)，其中哺乳动物是优选的。人类个体是最优选的。人类个体包括新生儿、婴儿、青少年和成人。

本文所描述的技术的一个方面涉及一种将转基因递送到细胞的方法。通常，对于体外方法，可以使用如本文所公开的方法以及所属领域中已知的其它方法将ceDNA载体引入细胞中。本文所公开的ceDNA载体优选以生物有效量施用细胞。如果将ceDNA载体在体内施用细胞(例如施用个体)，那么ceDNA载体的生物学有效量是足以使转基因在目标细胞中转导和表达的量。

B.剂量范围

可以任选地采用体内和/或体外分析来帮助鉴定使用的最佳剂量范围。配制物中将采用的精确剂量还将取决于施用途径和病状严重度，并应根据所属领域的普通技术人员的判断和每个个体的情况来决定。有效剂量可以从源自于体外或动物模型试验系统的剂量-反应曲线推断。

ceDNA载体核酸以足以转染所需组织细胞和提供足够的基因转移和表达水平而无不当副作用的量施用。常规和药学上可接受的施用途径包括(但不限于)上文在“施用”章节中所描述的那些途径，例如直接递送到所选器官(例如门静脉内递送到肝脏)、口服、吸入(包括鼻内和气管内递送)、眼内、静脉内、肌肉内、皮下、皮内、肿瘤内和其它肠胃外施用途径。如果需要，施用途径可以组合。

实现特定“治疗效果”所需的ceDNA载体量的剂量将基于若干因素而变化，这些因素包括(但不限于)：核酸施用途径、实现治疗效果所需的基因或RNA表达水平、所治疗的特定疾病或病症以及一种或多种基因、一种或多种RNA产物或一种或多种所得表达的蛋白质的稳定性。所属领域的技术人员可以基于前述的因素以及所属领域中熟知的其它因素容易地确定治疗患有特定疾病或病症的患者的ceDNA载体剂量范围。

剂量方案可以调整，以提供最佳的治疗反应。举例来说，可以重复施用寡核苷酸，例如可以每天施用若干剂，或可以根据治疗情况的紧急程度的指示，按比例减少剂量。所属领域的普通技术人员将能够容易地确定个体寡核苷酸的适当剂量和施用计划，无论所述寡核苷酸是施用细胞还是个体。

“治疗有效剂量”将落在相对较宽的范围内，所述范围可以通过临床试验确定并将取决于特定应用(神经细胞将需要很少的量，而全身性注射将需要大量)。举例来说，对于体内直接注射到人类个体的骨骼肌或心肌中，治疗有效剂量将为约1μg到100g左右的ceDNA载体。如果使用外泌体或微粒来递送ceDNA载体，那么可以通过实验确定治疗有效剂量，但预计递送1μg到约100g的载体。

药学上可接受的赋形剂和载剂溶液的配制物是所属领域的技术人员熟知的，开发在多种治疗方案中使用本文所描述的特定组合物的适合的剂量和治疗方案也是所属领域技术人员熟知的。

对于体外转染，待递送到细胞(1×10

治疗可以涉及施用单次剂量或多次剂量。在一些实施例中，可以向个体施用超过一剂；实际上，可以根据需要施用多剂，因为ceDNA载体由于没有病毒衣壳而不会引起抗衣壳的宿主免疫应答。因此，所属领域的技术人员可以容易地确定适当剂数。施用的剂数可以例如约1-100剂，优选2-20剂。

不希望受任何特定理论束缚，缺乏通过施用如本公开所描述的ceDNA载体(即，缺乏衣壳组分)所诱发的典型抗病毒免疫应答允许ceDNA载体在多种场合下施用宿主。在一些实施例中，将异源核酸递送到个体的次数在2到10次的范围内(例如2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次或10次)。在一些实施例中，向个体递送ceDNA载体超过10次。

在一些实施例中，每日历日(例如24小时期间)向个体施用一剂ceDNA载体不超过一次。在一些实施例中，每2个、3个、4个、5个、6个或7个日历日向个体施用一剂ceDNA载体不超过一次。在一些实施例中，每日历周(例如7个日历日)向个体施用一剂ceDNA载体不超过一次。在一些实施例中，每两周向个体施用一剂ceDNA载体不超过一次(例如，两个日历周时段为一次)。在一些实施例中，每日历月向个体施用一剂ceDNA载体不超过一次(例如，30个日历日为一次)。在一些实施例中，每六个日历月向个体施用一剂ceDNA载体不超过一次。在一些实施例中，每日历年(例如365天或闰年366天)向个体施用一剂ceDNA载体不超过一次。

C.单位剂型

在一些实施例中，药物组合物可以单位剂型呈现。单位剂型通常将适合于药物组合物的一种或多种特定施用途径。在一些实施例中，单位剂型适合于通过吸入施用。在一些实施例中，单位剂型适合于通过汽化器施用。在一些实施例中，单位剂型适合于通过喷雾器施用。在一些实施例中，单位剂型适合于通过气雾器施用。在一些实施例中，单位剂型适合于口服施用、经颊施用或舌下施用。在一些实施例中，单位剂型适合于静脉内、肌肉内或皮下施用。在一些实施例中，单位剂型适合于鞘内或脑室内施用。在一些实施例中，配制药物组合物以供局部施用。可以与载剂材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将通常是化合物产生治疗效果的量。

XIII.各种应用

如本文所描述的ceDNA载体和组合物可以用于在宿主细胞中引入核酸序列(例如，治疗性核酸序列)。根据一些实施例，如本文所描述的ceDNA载体和组合物可以用于在宿主细胞中引入核酸序列(例如，治疗性核酸序列)，其中治疗性核酸序列的表达处于可调控开关的控制下。在一个实施例中，使用如本文所描述的ceDNA载体在宿主细胞中引入核酸序列可以用来自经治疗患者的适当生物标记监测以评估基因表达。

根据一些实施例，ceDNA载体可以多种方式使用，包括例如非原位、体外和体内应用、方法、诊断程序和/或基因疗法方案。

根据一些实施例，本文提供的组合物和ceDNA载体可以用于递送转基因以用于如上文所描述的各种目的。在一些实施例中，转基因编码旨在用于研究目的的蛋白质或功能性RNA，例如建立携带转基因的体细胞转基因动物模型，例如以研究转基因产物的功能。在另一个实例中，转基因编码旨在用于建立动物疾病模型的蛋白质或功能性RNA。

在一些实施例中，转基因编码一种或多种适用于治疗、改善或预防哺乳动物个体的疾病病况的肽、多肽或蛋白质。可以将转基因以足量转移到患者(例如在其中表达)，以治疗与基因表达降低、缺乏表达或功能障碍有关的疾病。

在一些实施例中，设想ceDNA载体用于诊断和筛选方法中，其中使转基因瞬时或稳定表达于细胞培养系统中，或可替代地，表达于转基因动物模型中。

本文描述的技术的另一方面提供一种转导哺乳动物细胞群的方法。从总体和一般意义上讲，所述方法至少包括以下步骤：将包含有效量的一种或多种如本文所公开的ceDNA的组合物引入所述群体的一个或多个细胞中。

另外，本发明提供了组合物以及治疗和/或诊断试剂盒，所述试剂盒包括一种或多种所公开的ceDNA载体或ceDNA组合物，所述ceDNA载体或ceDNA组合物与一种或多种另外的成分一起配制，或备有一个或多个关于其使用的说明书。

根据一些实施例，待施用如本文所公开的ceDNA载体的细胞可以是任何类型的，包括(但不限于)：神经细胞(包括外周和中枢神经系统的细胞，特别是脑细胞)、肺细胞、视网膜细胞、上皮细胞(例如肠道和呼吸道上皮细胞)、肌肉细胞、树突状细胞、胰腺细胞(包括胰岛细胞)、肝细胞、心肌细胞、骨细胞(例如骨髓干细胞)、造血干细胞、脾细胞、角质形成细胞、成纤维细胞、内皮细胞、前列腺细胞、生殖细胞等等。可替代地，细胞可以是任何祖细胞。作为另一个替代方案，细胞可以是干细胞(例如神经干细胞、肝干细胞)。作为又另一个替代方案，细胞可以是癌细胞或肿瘤细胞。此外，如上文指出，细胞可以来自任何物种来源。

实例

通过说明而非限制的方式提供以下实施例。

实例1：构建ceDNA载体

在PCT/US18/49996的实例1中描述了使用多核苷酸构建体模板产生ceDNA载体。举例来说，用于产生本发明的ceDNA载体的多核苷酸构建体模板可以是ceDNA-质粒、ceDNA-杆粒和/或ceDNA-杆状病毒。不受理论的限制，在容许宿主细胞中，在例如Rep的存在下，具有两个对称ITR和表达构建体的多核苷酸构建体模板进行复制以产生ceDNA载体，其中ITR中的至少一个相对于野生型ITR序列被修饰。ceDNA载体产生经历两个步骤：首先，通过Rep蛋白从模板骨架(例如，ceDNA-质粒、ceDNA-杆粒、ceDNA-杆状病毒基因组等)中切下(“拯救”)模板；并且其次，切下的ceDNA载体在Rep介导下进行复制。

产生ceDNA载体的一种示例性方法是从如本文所描述的ceDNA-质粒产生。参考图1A和1B，ceDNA-质粒中的每一种的多核苷酸构建体模板均包括左修饰ITR和右修饰ITR，在ITR序列之间具有以下：(i)增强子/启动子；(ii)转基因的克隆位点；(iii)转录后反应元件(例如，土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE))；以及(iv)聚腺苷酸化信号(例如，来自牛生长激素基因(BGHpA))。在每个组分之间还引入了独特的限制性核酸内切酶识别位点(R1-R6)(图1A和1B中所示)，以便于将新的基因组分引入构建体中的特定位点。将R3(PmeI)GTTTAAAC(SEQ ID NO:7)和R4(PacI)TTAATTAA(SEQ ID NO:542)酶位点工程改造到克隆位点中，以引入转基因的开放阅读框。将这些序列克隆到从赛默飞世尔科学获得的pFastBacHT B质粒中。

简单来说，使用图5A-5C中所示的方法和表4中所示的ITR序列，从表7中所示的ceDNA-质粒构建体获得一系列ceDNA载体。表7指示每个组分的对应多核苷酸序列的数目，包括在可操作地连接到转基因的启动子的任一端上作为复制蛋白位点(RPS)(例如Rep结合位点)具有活性的序列。表7中的数字是指本文档中的SEQ ID NO，对应于每个组分的序列。表7中的质粒在转基因与右侧ITR之间的3'非翻译区中用包含SEQ ID NO:8的WPRE和随后包含SEQ ID NO:9的BGHpA构建。

表7：示例性ceDNA构建体

在其它实施例中，使用图5A-5C中所示的方法，从包含AAV2 5'和3'WT-ITR的ceDNA-质粒构建体获得一系列ceDNA载体。在一些实施例中，制备ceDNA载体的构建体包含作为如本文所描述的调控开关的启动子，例如诱导型启动子。

参考图5A，按照根据制造商的说明书的方案，用测试或对照质粒转化DH10Bac感受态细胞(MAX

从大肠杆菌中分离重组ceDNA-杆粒，并使用FugeneHD将其转染到Sf9或Sf21昆虫细胞中以产生感染性杆状病毒。将附着性Sf9或Sf21昆虫细胞在25℃下在T25烧瓶内的50ml培养基中进行培养。四天后，从细胞去除培养基(含有P0病毒)，将培养基通过0.45μm过滤器过滤，从细胞或细胞碎片中分离出感染性杆状病毒粒子。

任选地，第一代杆状病毒(P0)通过在50ml到500ml培养基中感染未处理的Sf9或Sf21昆虫细胞来扩增。将细胞维持在25℃下的130rpm的回旋式振荡培育箱中的悬浮培养物中，监测细胞直径和活力，直到细胞达到18-19nm的直径(从14-15nm的初始直径起)和约4.0E+6个细胞/mL的密度为止。在感染后3天与8天之间，在离心去除细胞和碎片后，然后通过0.45μm过滤器过滤后收集培养基中的P1杆状病毒粒子。

收集包含测试构建体的ceDNA-杆状病毒，并测定杆状病毒的感染活性或滴度。具体来说，用P1杆状病毒按下列稀释度处理四个20ml的2.5E+6个细胞/ml的Sf9细胞培养物：1/1000、1/10,000、1/50,000、1/100,000，并在25℃-27℃下培育。通过细胞直径增加和细胞周期停滞的速率以及4到5天中每天细胞活力的变化来确定感染性。

参考图5A，在包含Rep78(SEQ ID NO:13)或Rep68(SEQ ID NO:12)和Rep52(SEQ IDNO:14)或Rep40(SEQ ID NO:11)二者的pFASTBACTM-双重表达载体(赛默飞世尔)中，产生根据例如图9A的“Rep-质粒”。

按照制造商提供的方案，将Rep-质粒转化到DH10Bac感受态细胞(MAX

将Sf9或Sf21昆虫细胞在50ml培养基中培养4天，并从培养物中分离感染性重组杆状病毒(“Rep-杆状病毒”)。任选地，第一代Rep-杆状病毒(P0)通过感染未处理的Sf9或Sf21昆虫细胞来扩增并且在50ml到500ml培养基中培养。在感染后3天与8天之间，通过离心或过滤或其它分级分离方法分离细胞来收集培养基中的P1杆状病毒粒子。收集Rep-杆状病毒并测定杆状病毒的感染活性。具体来说，用P1杆状病毒按下列稀释度处理四个20ml的2.5×10

参考图5B，然后将含有(1)含有ceDNA-杆粒或ceDNA-杆状病毒的样品和(2)上文所描述的Rep-杆状病毒二者中的一种的Sf9昆虫细胞培养基分别以1:1000和1:10,000的比率添加到新制Sf9细胞培养物(2.5E+6个细胞/ml，20ml)中。然后将细胞在25℃下以130rpm培养。共同感染4-5天后，检测细胞直径和活力。当细胞直径达到18-20nm并且活力为约70％-80％时，将细胞培养物离心，去除培养基，并收集细胞集结粒。首先将细胞集结粒悬浮于适量的水性介质，即水或缓冲液中。使用凯杰(Qiagen)MIDI PLUS

初始基于260nm下的UV吸光度，测定从Sf9昆虫细胞产生和纯化的ceDNA载体的产率。

可以通过如图5D所示在天然或变性条件下的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定来评估ceDNA载体，其中(a)在限制性核酸内切酶裂解和凝胶电泳分析后，对比天然凝胶，变性凝胶上存在以两倍大小迁移的特征带；以及(b)在未裂解物质的变性凝胶上存在单体和二聚体(2x)带是ceDNA载体存在的特征。

通过用限制性核酸内切酶消化从共同感染的Sf9细胞(如本文所描述)获得的DNA，进一步分析分离的ceDNA载体的结构，其中限制性核酸内切酶是针对以下条件选择的：a)在ceDNA载体内仅存在单个切割位点；和b)所得片段足够大，以便在0.8％变性琼脂糖凝胶上进行分级分离时被清楚看到(>800bp)。如图5D和5E所示，具有非连续结构的线性DNA载体以及具有线性和连续结构的ceDNA载体可以通过其反应产物的大小来区分-例如，预期具有非连续结构的DNA载体将产生1kb和2kb片段，而具有连续结构的非衣壳化载体预期产生2kb和4kb片段。

因此，为了以定性方式证明分离的ceDNA载体是根据定义所要求那样共价封闭式的，将样品用在特定DNA载体序列的背景下被鉴定为具有单个限制位点的限制性核酸内切酶消化，优选产生两个大小不等的裂解产物(例如1000bp和2000bp)。在变性凝胶(其将两条互补的DNA链分开)上进行消化和电泳后，线性、非共价封闭的DNA将以1000bp和2000bp大小分解，而共价封闭的DNA(即ceDNA载体)将以2倍大小分解(2000bp和4000bp)，这是因为两条DNA链是连接的并且现在未折叠，并且长度翻倍(尽管是单链)。此外，由于多聚体DNA载体的端对端连接，对单体、二聚体和n聚体形式的DNA载体的消化都将分解为相同大小的片段(参见图5D)。

如本文所用，短语“通过在天然凝胶和变性条件下的琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA载体的分析”是指通过进行限制性核酸内切酶消化，然后对消化产物进行电泳评估来评估ceDNA闭合端的分析。后面是一种此类示例性分析，尽管所属领域的普通技术人员将了解，对这个实例可以进行许多所属领域已知的变化。选择限制性核酸内切酶作为所关注的ceDNA载体的单切酶，其将产生DNA载体长度的大致1/3×和2/3×的产物。由此使天然凝胶和变性凝胶上的带解析。变性之前，重要的是从样品中去除缓冲液。凯杰PCR清洁试剂盒或脱盐“离心柱”，例如GE HEALTHCARE ILUSTRA

产生的ceDNA载体的纯度可以使用任何所属领域已知的方法来评估。作为一种示例性和非限制性方法，可以通过将ceDNA载体的荧光强度与标准品进行比较来估算ceDNA-质粒对样品总体UV吸光度的贡献。举例来说，如果基于UV吸光度，将4μg ceDNA载体装载到凝胶上，并且ceDNA载体荧光强度等同于已知为1μg的2kb带，那么就有1μg的ceDNA载体，并且ceDNA载体为总UV吸收材料的25％。然后将凝胶上的带强度相对于带表示的计算输入作图-例如，如果总ceDNA载体是8kb，而切下的比较带为2kb，那么带强度将按总输入的25％绘制，在这种情况下，对于1.0μg输入，将为0.25μg。使用ceDNA载体质粒滴定来绘制标准曲线，然后使用回归线方程计算ceDNA载体带的量，然后可以用于测定ceDNA载体所表示的总输入的百分比或纯度百分比。

按照根据制造商的说明书的方案，用测试或对照质粒转化DH10Bac感受态细胞(MAX EFFICIENCY㈢DH10Bac

从大肠杆菌中分离重组ceDNA-杆粒，并使用FugeneHD将其转染到Sf9或Sf21昆虫细胞中以产生感染性杆状病毒。将附着性Sf9或Sf21昆虫细胞在25℃下在T25烧瓶内的50mL培养基中进行培养。四天后，从细胞去除培养基(含有P0病毒)，将培养基通过0.45μm过滤器过滤，从细胞或细胞碎片中分离出感染性杆状病毒粒子。

任选地，第一代杆状病毒(P0)通过在50mL到500mL培养基中感染未处理的Sf9或Sf21昆虫细胞来扩增。将细胞维持在25℃下的130rpm的回旋式振荡培育箱中的悬浮培养物中，监测细胞直径和活力，直到细胞达到18-19nm的直径(从14-15nm的初始直径起)和约4.0E+6个细胞/mL的密度为止。在感染后3天与8天之间，在离心去除细胞和碎片后，然后通过0.45μm过滤器过滤后收集培养基中的P1杆状病毒粒子。

收集包含测试构建体的ceDNA-杆状病毒，并测定杆状病毒的感染活性或滴度。具体来说，用P1杆状病毒按下列稀释度处理四个20ml的2.5E+6个细胞/ml的Sf9细胞培养物：1/1000、1/10,000、1/50,000、1/100,000，并在25℃-27℃下培育。通过细胞直径增加和细胞周期停滞的速率以及4到5天中每天细胞活力的变化来确定感染性。

在包含Rep78或Rep68和Rep52或Rep40二者的pFASTBACTM-双重表达载体(赛默飞世尔)中产生“Rep-质粒”。按照制造商提供的方案，将Rep-质粒转化到DH10Bac感受态细胞(MAX

将Sf9或Sf21昆虫细胞在50mL培养基中培养4天，并从培养物中分离感染性重组杆状病毒(“Rep-杆状病毒”)。任选地，第一代Rep-杆状病毒(P0)通过感染未处理的Sf9或Sf21昆虫细胞来扩增并且在50mL到500mL培养基中培养。在感染后3天与8天之间，通过离心或过滤或其它分级分离方法分离细胞来收集培养基中的P1杆状病毒粒子。收集Rep-杆状病毒并测定杆状病毒的感染活性。具体来说，用P1杆状病毒按下列稀释度处理四个20ml的2.5×10

实例2：通过切除从双链DNA分子产生合成的ceDNA

ceDNA载体的合成产生描述于2019年1月18日提交的国际申请PCT/US19/14122的实例2-6中，所述国际申请以全文引用的方式并入本文中。使用合成方法产生ceDNA载体的一种示例性方法涉及切除双链DNA分子。简单来说，使用双链DNA构建体可以产生ceDNA载体，参见例如PCT/US19/14122的图7A-8E。在一些实施例中，双链DNA构建体是ceDNA质粒，例如参见例如2018年12月6日提交的国际专利申请PCT/US2018/064242的图6)。

在一些实施例中，制备ceDNA载体的构建体包含如本文所描述的调控开关。

出于说明的目的，实例1描述了ceDNA载体的产生，所述ceDNA载体是使用这一方法产生的示例性封闭式DNA载体。然而，尽管在本实例中示例了ceDNA载体，以说明通过切除包含ITR和表达盒(例如异源核酸序列)的双链多核苷酸，然后如本文所描述接合自由3'和5'末端来生成封闭式DNA载体的体外合成产生方法，但所属领域的普通技术人员知道，可以如上文所说明来修饰双链DNA多核苷酸分子，从而生成任何所需的封闭式DNA载体，包括(但不限于)辅助DNA、doggybone

所述方法涉及(ⅰ)从双链DNA构建体切除编码表达盒的序列；以及(ii)在ITR中的一个或多个处形成发夹结构；以及(iii)通过例如用T4 DNA接合酶接合来连接自由5'和3'末端。

双链DNA构建体按照5'到3'次序包含：第一限制性核酸内切酶位点；上游ITR；表达盒；下游ITR；以及第二限制性核酸内切酶位点。然后使双链DNA构建体与一种或多种限制核酸内切酶接触，以在两个限制性核酸内切酶位点处均产生双链断裂。一种核酸内切酶可以靶向两个位点，或每个位点可以被不同的限制性内切酶靶向，只要限制性位点不存在于ceDNA载体模板内即可。由此将限制性核酸内切酶位点之间的序列从双链DNA构建体的其余部分中切除(参见PCT/US19/14122的图9)。接合后，形成封闭式DNA载体。

所述方法中使用的一个或两个ITR可以是野生型ITR。也可以使用经修饰的ITR，其中所述修饰可以包括形成B和B'臂和/或C和C'臂的序列中的野生型ITR中的一个或多个核苷酸的缺失、插入或取代(参见例如PCT/US19/14122的图6-8和10、图11B)，并且可以具有两个或更多个发夹环(参见例如PCT/US19/14122的图6-8、图11B)或单个发夹环(参见例如PCT/US19/14122的图10A-10B、图11B)。通过对现有寡核苷酸进行基因修饰或通过重新生物学和/或化学合成可以产生发夹环经修饰的ITR。

实例3：通过寡核苷酸构建来产生ceDNA

使用涉及组装不同寡核苷酸的合成方法产生ceDNA载体的另一种示例性方法提供于PCT/US19/14122的实例3中，其中ceDNA载体是通过合成5'寡核苷酸和3'ITR寡核苷酸并且将ITR寡核苷酸与包含表达盒的双链多核苷酸接合来产生。PCT/US19/14122的图11B展示了将5'ITR寡核苷酸和3'ITR寡核苷酸与包含表达盒的双链多核苷酸接合的示例性方法。

在一些实施例中，制备ceDNA载体的构建体包含如本文所描述的调控开关。

ITR寡核苷酸可以包含如本文所描述的WT-ITR，或可以包含如本文所描述的经修饰的ITR。经修饰的ITR可以包括形成B和B'臂和/或C和C'臂的序列中的野生型ITR中的一个或多个核苷酸的缺失、插入或取代。可以通过基因修饰或生物和/或化学合成来生成用于无细胞合成的包含如本文所描述的WT-ITR或mod-ITR的ITR寡核苷酸。如本文所讨论，实例2和3中的ITR寡核苷酸可以包含WT-ITR，或呈对称或不对称构型的经修饰的ITR(mod-ITR)，如本文所讨论。

实例4：通过单链DNA分子产生ceDNA

使用合成方法产生ceDNA载体的另一种示例性方法提供于PCT/US19/14122的实例4中，并且其使用包含两个有义ITR的单链线性DNA，所述两个有义ITR侧接有义表达盒序列并且共价附接到与反义表达盒侧接的两个反义ITR，然后将所述单链线性DNA的末端接合以形成封闭式单链分子。一个非限制性实例包含合成和/或产生单链DNA分子、使所述分子的各部分粘接以形成具有二级结构的一个或多个碱基对区域的单一线性DNA分子，然后使自由的5'与3'端彼此接合以形成封闭的单链分子。

在一些实施例中，制备ceDNA载体的构建体包含如本文所描述的调控开关。

ITR寡核苷酸可以包含如本文所描述的WT-ITR，或可以包含如本文所描述的经修饰的ITR。

用于产生ceDNA载体的示例性单链DNA分子从5'到3'包含：有义第一ITR；有义表达盒序列；有义第二ITR；反义第二ITR；反义表达盒序列；以及反义第一ITR。

用于实例4的示例性方法的单链DNA分子可以通过本文所描述的任何DNA合成方法形成，例如体外DNA合成，或通过用核酸酶使DNA构建体(例如质粒)裂解并将所得的dsDNA片段解链以提供ssDNA片段来提供。

通过将温度降低到低于有义和反义序列对的所计算的解链温度可以实现粘接。解链温度取决于特定核苷酸碱基含量和所用溶液的特征，例如盐浓度。任何给定序列的解链温度和溶液组合容易由所属领域的普通技术人员计算出。

所粘接分子的自由5'和3'端可以彼此接合，或与发夹分子接合而形成ceDNA载体。适合的示例性接合方法和发夹分子描述于实例2和3中。

实例5：ceDNA载体体外表达荧光素酶转基因

通过将编码荧光素酶报道基因的开放阅读框引入以下ceDNA-质粒构建体的克隆位点中来生成构建体：构建体-15-30(参见以上表7)，或包含包括荧光素酶编码序列的AAV2WT-ITR的构建体。培养HEK293细胞，并使用

实例6：来自ceDNA载体的荧光素酶转基因的体内蛋白质表达

在小鼠中评估来自由上文所描述的构建体产生的ceDNA载体的转基因的体内蛋白质表达。测试从ceDNA-质粒构建体获得的ceDNA载体，并证实在小鼠模型中在流体动力学注射ceDNA构建体后并且没有脂质体情况下的持续并且持久的荧光素酶转基因表达，再给药(第28天时)，以及外源性萤火虫荧光素酶ceDNA的持久性(直到第42天)。在不同的实验中，在体内评估所选ceDNA载体的荧光素酶表达，其中所述ceDNA载体包含荧光素酶转基因以及：i)选自表4中所示的任何对称对的经修饰的5'ITR和对称经修饰的3'ITR，或图7A-22B中所示的经修饰的ITR对，或ii)AAV2 5'WT-ITR和AAV2 3'WT-ITR。

在小鼠中评估来自由具有如上文所描述的AAV2 WT-ITR的构建体产生的ceDNA载体的转基因的体内蛋白质表达。测试从ceDNA-质粒构建体获得的ceDNA载体，并证实在小鼠模型中在流体动力学注射ceDNA构建体后并且没有脂质体情况下的持续并且持久的荧光素酶转基因表达，再给药(第28天时)，以及外源性萤火虫荧光素酶ceDNA的持久性(直到第42天)。在不同的实验中，在体内评估所选ceDNA载体的荧光素酶表达，其中所述ceDNA载体包含荧光素酶转基因和AAV2 5'WT-ITR以及AAV2 3'WT-ITR。

体内荧光素酶表达：通过在第0天对尾静脉进行静脉内流体动力学施用，以1.2mL体积向5-7周的雄性CD-1IGS小鼠(查尔斯河实验室(Charles River Laboratories))施用0.35mg/kg的表达荧光素酶的ceDNA载体。在第3天、第4天、第7天、第14天、第21天、第28天、第31天、第35天和第42天通过IVIS成像评估荧光素酶表达。简单来说，小鼠腹膜内注射150mg/kg的荧光素底物，并且然后通过

IVIS成像在第3天、第4天、第7天、第14天、第21天、第28天、第31天、第35天和第42天进行，并在第42天处死后将收集的器官离体成像。

在研究过程期间，每天对动物进行称重并监测整体健康。处死时，通过末端心脏穿刺(terminal cardiac stick)从每只动物收集血液，并分成两部分并且处理为1)血浆和2)血清，其中将血浆速冻，并且血清用于肝酶谱，并且随后速冻。另外，收集肝脏、脾脏、肾脏和腹股沟淋巴结(LN)并通过IVIS离体成像。

通过

实施例7：WT/WT ceDNA的形成和分析

使用野生型AAV II型ITR检查ceDNA形成和表达ceDNA编码的转基因的能力。下面进一步详细描述了载体构建、ceDNA形成的分析以及对ceDNA转基因在人类细胞培养物中的表达的评估。

WT/WT ITR构建

将具有野生型AAV II型ITR盒的质粒计算机模拟设计并且随后在Sf9昆虫细胞中评价。所述盒含有由用于在昆虫细胞中表达的p10启动子序列驱动的绿色荧光蛋白(GFP)报道基因。

将Sf9悬浮液培养物维持于排出的200mL组织培养烧瓶中的Sf900 III培养基(吉毕科公司(Gibco))中。每48小时传代培养物并且在每一通道之前使用ViCell计数器(贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter))测量细胞计数和生长度量。将培养物维持在27℃下在震荡条件(1"轨道，130rpm)下。

如上述实例1中所描述的产生和构建ceDNA载体。简单来说，参考图4B，使用质粒构建体转导的Sf9细胞在27℃下在静止条件下粘附生长24小时。24小时后，经转染的Sf9细胞通过杆状病毒感染的昆虫细胞(BIIC)用Rep载体感染。BIIC先前已经分析以表征感染性并且以1:2000的最终稀释度使用。将Sf900昆虫细胞培养基中1:100稀释的BIIC添加到每个先前经转染的细胞孔中。将非Rep载体BIIC添加到孔的子组中作为阴性对照。通过在培养盘摇荡器上平缓摇荡来混合培养盘2分钟。细胞然后在静止条件下在27℃下再生长48小时。一式三份地分析所有实验构建体和对照物。

48小时后，将96孔盘从培育箱中取出，短暂地平衡到室温，并且使用荧光显微镜检查GFP表达。在40×放大率下捕捉荧光和亮场图像。如所预期的，阴性对照(在不存在含Rep的杆状病毒细胞的情况下处理的样品)展示无显著的GFP表达。在WT/WT ITR GFP载体样品中观察到稳定的GFP表达，指示ceDNA编码的转基因被成功转染。结果展示于图24A-24B中。如所预期的，阴性对照(在不存在含Rep的杆状病毒细胞的情况下处理的样品)展示无显著的GFP表达。在野生型样品中观察到稳定的GFP表达，指示ceDNA编码的转基因被成功转染和表达。

ceDNA形成的分析

为了确保在前述研究中产生的ceDNA具有预期的封闭式结构，进行实验以产生足够量的ceDNA，其随后可以对适当结构进行测试。简单来说，Sf9悬浮培养物用WT/WT ITRDNA转染。将培养物以1.25×10

使用凯杰质粒加Midi纯化试剂盒(凯杰)，根据制造商的“高产率”方案，从所有烧瓶(实验和对照)提取假定的粗ceDNA。使用从NanoDrop OneC(赛默飞世尔)获得的光密度测量来定量洗脱份。将所得ceDNA提取物存储在4℃下。

将前述ceDNA提取物在用1:10,000稀释的SYBR安全凝胶染色(赛默飞世尔科学)制备的原生琼脂糖(1％琼脂糖，1×TAE缓冲液)凝胶上，与TrackIt 1kb加DNA梯一起运行。随后在UV/蓝光下使用Gbox微型成像器显像凝胶。如先前所描述，预期在天然凝胶上运行的ceDNA样品中的两个主要带：表示单体物种的约4,000bp带和对应于二聚物种的约8,000bp带。测试野生型样品并且将预期的单体和二聚体带显示在原生琼脂糖凝胶上。构建体的代表性样品的结果展示于图25中。使用偶合的限制消化和变性琼脂糖凝胶进一步分析来自小规模生产的假定的粗ceDNA和对照提取物以确认ceDNA的双链DNA结构诊断。预期野生型ceDNA具有单一ClaI限制位点，并且因此，如果恰当地形成，那么在ClaI消化后产生两个特征片段。高保真度限制性核酸内切酶ClaI(新英格兰生物实验室)用于根据制造商的说明书消化假定的ceDNA提取物。未分析来自模拟和生长对照的提取物，因为使用NanoDrop(赛默飞世尔)的分光光度法定量以及原生琼脂糖凝胶分析揭露在洗脱物中不存在可检测的ceDNA/质粒样产物。使用凯杰PCR清洁试剂盒(凯杰)根据制造商的说明书纯化经消化物质，不同之处在于纯化的经消化的物质是在无核酸酶水中而非凯杰洗脱缓冲液中洗脱。在4℃下使碱性琼脂糖凝胶(8％碱性琼脂糖)在平衡缓冲液(1mM EDTA，200mM NaOH)中平衡过夜。将10×变性溶液(50mM NaOH，1mM EDTA)添加到纯化的ceDNA消化物和对应的未消化的ceDNA(总共1μg)的样品中，并且在65℃下加热样品10分钟。将10×负载染料(溴酚蓝，50％甘油)添加到每个变性样品中并且混合。TrackIt 1kb加DNA梯(赛默飞世尔科学)也装载在凝胶上作为参考。凝胶在4℃和恒定电压(25V)下运行约18小时，随后用去离子水H

与以预期约9,000bp大小迁移的未消化样品形成鲜明的对比，两种显著带在ClaI处理的样品中的每个样品色带中可见，在变性凝胶上以预期大小迁移。图26展示代表性样品的结果，其中相较于未消化样品中可见的单一带，对于消化的样品可见高于背景的两个带。因此，样品似乎正确地形成了ceDNA。

人类细胞培养物中的功能表达

为了评估通过小规模生产方法产生的WT/WT ITR ceDNA的功能性，用WT/WT ceDNA样品转染HEK293细胞。将主动分裂的HEK293细胞以3×10

实例8：ITR步行对称的突变体筛选

进行ITR结构与ceDNA形成的关系的进一步分析。构建一系列突变体以查询特定结构变化对ceDNA形成的影响和表达ceDNA编码的转基因的能力。以类似于上文所详细描述的方法的方式进行人类细胞培养物中的突变体构建、ceDNA形成的分析和ceDNA转基因表达的评估。

突变型ITR构建

将具有独特对称AAV II型ITR突变盒的16个质粒的库计算机模拟设计并且随后在Sf9昆虫细胞和人类胚胎肾细胞(HEK293)中进行评价。每个ITR盒含有由用于在昆虫细胞中表达的p10启动子序列和用于在哺乳动物细胞中表达的CAG启动子序列驱动的荧光素酶(LUC)或绿色荧光蛋白(GFP)报道基因。在左和右ITR区上对称地产生对ITR序列的突变。库含有16个右侧双突变，如本文表4中所公开，其中所预测的结构在图7A-22B中展示。

将Sf9悬浮液培养物维持于排出的200mL组织培养烧瓶中的Sf900 III培养基(吉毕科公司)中。每48小时传代培养物并且在每一通道之前使用ViCell计数器(贝克曼库尔特公司)测量细胞计数和生长度量。将培养物维持在27℃下在震荡条件(1"轨道，130rpm)下。将HEK293细胞的粘附性培养物维持在37℃下在5％CO

如上述实例1中所描述的产生和构建ceDNA载体。简单来说，参考图5B，使用质粒构建体转导的Sf9细胞在27℃下在静止条件下粘附生长24小时。24小时后，经转染的Sf9细胞通过杆状病毒感染的昆虫细胞(BIIC)用Rep载体感染。BIIC先前已经分析以表征感染性并且以1:2000的最终稀释度使用。将Sf900昆虫细胞培养基中1:100稀释的BIIC添加到每个先前经转染的细胞孔中。将非Rep载体BIIC添加到孔的子组中作为阴性对照。通过在培养盘摇荡器上平缓摇荡来混合培养盘2分钟。细胞然后在静止条件下在27℃下再生长48小时。一式三份地分析所有实验构建体和对照物。

48小时后，从培育箱中取出96孔盘，短暂地平衡到室温，并且分析荧光素酶表达(OneGlo荧光素酶分析(普洛麦格公司))。使用SpectraMax M系列微板读数仪测量总发光。将重复实验求平均值。表7的对称ITR突变构建体的荧光素酶活性展示于图23中。如所预期的，三个阴性对照(仅培养基、缺乏供体DNA的模拟转染和在不存在含Rep的杆状病毒细胞下处理的样品)均不展示显著的荧光素酶表达。在突变型样品中的每一个中均观察到了稳定的荧光素酶表达，这表明对于每个样品，不管是何种突变，均成功转染了和表达了ceDNA编码的转基因。

实例9：来自具有对称的突变型ITR的ceDNA构建体荧光素酶表达的体内评价

用由Sf9产生的各种类型的ceDNA以及上文所描述的合成方法处理CD-1小鼠(N＝30，雄性，约4周龄)。特别地，将具有呈对称构型的左侧和右侧两侧上的突变型ITR的ceDNA构建体(构建体-388)(参见图27；左图)与具有左侧和右侧两侧上的野生型AAV ITR的ceDNA构建体(构建体-393)(参见图27；右图)对其活体表达进行比较。这些构建体由如上文所描述的Sf9细胞产生并且配制于LNA中。另外，还将Sf9产生的具有ITR的不对称构型的ceDNA、左侧的野生型AAV2 ITR和构建体右侧的截断突变型ITR配制于LNA中并用作对照。此外，还测试具有对称或不对称ITR构型的合成产生的DNA的表达水平。

每天进行笼侧观察；并且在给药后1、6和24小时进行临床观察。在指定时间点记录所有动物的体重(参见图28)。

在第0天，ceDNA通过侧尾静脉的静脉内施用以5mL/kg进行给药。通过腹膜内(IP)注射，以2.5mL/kg向动物给药150mg/kg荧光素(60mg/mL)。在施用荧光素后15分钟内，所有动物具有IVIS成像和测量。如图28中所示，给药构建体-388的动物的体重变化百分比类似于在第6天用构建体-393处理的动物的体重变化百分比(图28)。对应于荧光素酶表达水平的IVIS测量结果展示于图29A和图29B中。出人意料地，在构建体(即，构建体-388)的左侧和右侧具有突变型ITR的ceDNA的体内表达以与在构建体(即，构建体-393)的左侧和右侧两侧具有野生型AAV ITR的ceDNA构建体中所见的水平类似的水平观察到(参见图29A和29B)。这一数据表明对于功能性ceDNA定位和表达可能不需要完整的ITR。此外，通过本文所描述的无细胞方法产生的合成ceDNA还展现如所预期的稳定的表达水平(参见图29A)。

参考文献

本说明书和实例中列出和公开的所有参考文献，包括专利、专利申请、国际专利申请和公开案都以全文引用的方式并入本文中。