脐带间充质干细胞外泌体联合红景天多肽在美容养颜中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及脐带间充质干细胞外泌体联合红景天多肽在美容养颜中的应用。

背景技术

随着年龄的增长、社会环境的不断变化以及生活压力的增加，人们的皮肤往往会出现各种各样的问题，同时，随着社会进步，人民生活水平的提高，人们对皮肤出现的问题也越来越重视，皮肤起到保护个体不受外部影响的所谓屏障功能的非常重要的作用。屏障功能是对来自外部的各种刺激(化学物质、大气污染物质、干燥的环境、紫外线等)的防御和阻止体内水分通过皮肤而过度散发的保护功能，这种保护功能只有在由角质形成细胞构成的角质层已正常形成的情况下才能维持其功能。

外泌体是指包含了复杂RNA和蛋白质的小膜泡(30-150nm)，现今，其特指直径在40-100nm的盘状囊泡；外泌体可通过其携带的蛋白质、核酸、脂类等来调节受体细胞的生物学活性。

目前，针对皮肤出现的各种问题，市面上出现了美白、去皱、保湿等各种各样的化妆品，此外，外泌体已经应用到现有化妆品中达到美容养颜的效果，然而，现有产品存在效果较差问题，不能更好的满足人们的需求。

发明内容

本发明的目的在于提供一种脐带间充质干细胞外泌体联合红景天多肽在美容养颜中的应用，该应用通过将间充质干细胞外泌体和红景天多肽共同使用，能够更好的激活皮肤成纤维细胞的功能，延缓皮肤衰老，具有显著的抗皱美容的效果。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

本发明第一方面提供一种脐带间充质干细胞外泌体联合红景天多肽在美容养颜中的应用。

优选地，所述脐带间充质干细胞外泌体和红景天多肽的质量比为(400～800)∶(1～5)。

优选地，所述红景天多肽通过如下方法制得：

(a)将红景天进行粉碎，再将粉碎的红景天和水混合后进行蒸煮，得到混合液；

(b)向冷却后的混合液中加入复合酶进行酶解，灭酶，离心，收集上清液；

(c)将上清液进行超滤，得到分子量为1000～2000Da的肽段，冷冻干燥，得到红景天多肽粗品；

(d)将红景天多肽粗品配置成溶液并采用0.45μm的微孔滤膜进行过滤，得到滤液；再将滤液采用Sephadex G-75凝胶柱进行洗脱，洗脱液为蒸馏水，收集第三个洗脱峰处的洗脱液，冷冻干燥，即得所述红景天多肽。

优选地，所述蒸煮温度为105～115℃，时间为10～20min；所述洗脱速度为0.8ml/min。

优选地，所述酶解温度35～38℃，时间为6～12h，pH值为4～6。

优选地，所述复合酶由果胶酶、纤维素酶和胰蛋白酶按照2∶(2～3)∶(2～4)组成；所述复合酶添加量为红景天质量的0.8％～2％。

优选地，所述脐带间充质干细胞外泌体通过如下方法制得：

将原代脐带间充质干细胞进行传代培养，收集脐带间充质干细胞的第三代培养上清液；再将上清液以(3000～4000)×g进行离心去除细胞和细胞碎片；

向上清液中添加外泌体沉淀试剂进行充分混匀、静置，再以(10000～50000)×g离心20～40min，收集沉淀；

采用PBS重悬沉淀后置于纯化柱中，并将纯化柱置于收集管中，将收集管在4℃下以(3000～4000)×g进行离心8～12min，将收集管内溶液进行冷冻干燥，得到所述脐带间充质干细胞外泌体。

本发明第二方面提供一种用于美容养颜的外泌体美容液，所述外泌体美容液包括上述脐带间充质干细胞外泌体和红景天多肽。

优选地，所述脐带间充质干细胞外泌体和红景天多肽的质量比为(400～800)∶(3～5)。

优选地，所述外泌体美容液中脐带间充质干细胞外泌体的含量为40～80mg/ml，红景天多肽含量为0.3～0.5mg/ml。

与现有技术相比，本发明的有益效果至少包括：

经研究表明，本发明中将人脐带间充质干细胞外泌体和红景天多肽联合使用，能够更好的激活皮肤组织功能，改善各组织的生理学功能，有效刺激成纤维细胞的增殖和胶原蛋白的生成，达到快速皮肤修复去除皱纹以及抗衰老的效果。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。在所有附图中，类似的元件或部分一般由类似的附图标记标识。附图中，各元件或部分并不一定按照实际的比例绘制。

图1为本发明实施例2中红景天多肽粗品的色谱图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。

需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。

实施例1

本实施例为一种人脐带间充质干细胞外泌体制备方法，该制备方法包括如下步骤：

1、仪器及耗材、D-MEM/F12培养基、胎牛血清、倒置显微镜、超净工作台、CO2培养箱、离心机、细胞因子、ITS和Pbs等；

2、试剂配置

1.D-MEM/F12培养基配置：含10％胎牛血清，细胞因子一只，ITS5ml的D-MEM/F12培养基；

2、细胞因子:含20ng/ml EGF，5ng/ml bFGF；

3、实验前的准备

5把剪刀，5把止血钳，3把组织镊，3把普通镊子，2个肾形盘，3个50ml烧杯，2个药勺(20cm左右)，500ml pbs 121℃高压灭菌30分钟；

4、实验操作

(1)、超净工作台紫外照射30分钟，擦拭台面；

(2)、将灭菌的实验器械放入工作台，点燃酒精灯，拿出一个肾形盘，倒入75％酒精一半，将脐带放进肾形盘中，消毒30秒；

(3)、取一个50ml烧杯，倒入一半灭菌的pbs，将脐带放入烧杯中，反复洗3次；

(4)、拿出另一个肾形盘，将脐带放入其中，倒入适量pbs，右手拿剪刀，左手拿普通镊子，将脐带剪成2cm左右的小段；

(5)、左手拿止血钳，右手拿组织镊，慢慢的将脐带外皮和血管去掉；

(6)、将剩余组织放入一个干净的烧杯中，用剪刀剪成大概3mm左右；

(7)、用药勺将组织块铺在T75的瓶子里，每瓶100左右组织块，将所有组织块铺完；

(8)、在T75瓶子一侧慢慢加入培养基15ml；放入CO

(9)、48h换液一次，待一星期后观察干细胞爬出情况，若爬出情况较好，将组织块拍掉弃之，加入培养基；

(10)、48h后消化细胞，加入1ml胰蛋白酶消化，收集离心(1200转，5分钟)，弃上清，加入培养基重悬细胞，根据细胞数量(1×10

(11)、48h后消化离心，计数，传代，即为P2代；

(12)、两天后消化离心，取上清(检测无菌，支原体，内毒素，)计数细胞，以4.5×10

(13)、根据生产需要复苏P2代细胞，传至P3代取上清液；

(14)、将上清液以4000×g进行离心去除细胞和细胞碎片；

(15)、向上清液中添加外泌体沉淀试剂进行充分混匀、静置，再以10000×g离心30min，收集沉淀；

(16)、采用PBS重悬沉淀后置于纯化柱中，并将纯化柱置于收集管中，将收集管在4℃下以4000×g进行离心10min，将收集管内溶液进行冷冻干燥，得到人脐带间充质干细胞外泌体。

实施例2

本实施例为一种红景天多肽的制备方法，该制备方法包括如下步骤：

(a)将红景天进行粉碎，过100目筛，将筛下物和水混合后在110℃进行蒸煮15min，得到混合液，其中，水的质量是筛下物的3倍；

(b)向冷却后的混合液中加入复合酶并调节pH值至4～6，在35～38℃下酶解10h，高温灭酶、离心，收集上清液，其中，复合酶由果胶酶、纤维素酶和胰蛋白酶按照2∶2.5∶3组成；复合酶添加量为红景天筛下物质量的1.2％；

(c)将上清液进行超滤，得到分子量为1000～2000Da的肽段，冷冻干燥，得到红景天多肽粗品；

(d)将红景天多肽粗品配置成溶液并采用0.45μm的微孔滤膜进行过滤，得到滤液；再将滤液采用Sephadex G-75凝胶柱进行洗脱，洗脱速度为0.8ml/min，洗脱液为蒸馏水，洗脱结果如图1所示；按照出峰顺序分别收集不同洗脱峰处的洗脱液，将洗脱液冷冻干燥，得到第一个洗脱峰的红景天多肽记为A1(出峰时间大约在16min左右)，第二个洗脱峰的红景天多肽记为A2(大约在18min)，第三个洗脱峰的红景天多肽记为A3(大约在20min左右)。

实施例3

本实施例为一种用于美容养颜的外泌体美容液，所述外泌体美容液包括实施例1的脐带间充质干细胞外泌体和实施例2中第第三个洗脱峰处的红景天多肽，其中，脐带间充质干细胞外泌体和红景天多肽的质量比为597∶3；外泌体美容液中脐带间充质干细胞外泌体的含量为6％。

实施例4

本实施例为实施例1的外泌体(记为B)以及实施例2的红景天多肽(A3)不同含量对成纤维细胞的影响研究：

将成纤维细胞NIH/3T3配制成1×10

然后，分别加入A3多肽至终浓度为0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0/4mg/ml、0.5mg/ml；实施例1外泌体终浓度为10mg/ml、20ml/mg/ml、40ml/mg/ml、60ml/mg/ml、80ml/mg/ml；最后，在37℃下，5％的二氧化碳浓度进行细胞培养24h；

按照MTT试剂盒的说明书进行处理后，采用酶标仪检测各孔570nm处的OD值，根据OD值计算细胞存活率，添加多肽和外泌体的为实验组，细胞存活率为实验组OD值/空白组OD值×100％；计算结果如表1所示：

表1

由表1可知：

本申请多肽含量为0.3～0.5mg/ml时对细胞的增殖效果最好，且随着多肽含量的增加为先增加后减少的趋势；然而，细胞外泌体B随着含量增加，细胞存活率逐渐增加，但增加趋势减缓，因此，考虑外泌体含量不低于40mg/ml。

实施例5

本实施例为实施例1的外泌体以及实施例2的红景天多肽对成纤维细胞的影响研究：

将成纤维细胞NIH/3T3配制成1×10

然后，分别加入A1、A2、A3、实施例1外泌体(记为B)、A1+实施例1外泌体(记为A1B)、A2+实施例1外泌体(记为A2B)、A3+实施例1外泌体(记为A3B)并设置一空白对照组，设置3个重复，其中，A1、A2、A3的添加终浓度为0.3mg/ml，外泌体添加终浓度为59.7mg/ml；最后，在37℃下，5％的二氧化碳浓度进行细胞培养24h；

按照MTT试剂盒的说明书进行处理后，采用酶标仪检测各孔570nm处的OD值，根据OD值计算细胞存活率，添加多肽和外泌体的为实验组，细胞存活率为实验组OD值/空白组OD值×100％；计算结果如表2所示：

表2

由表2可知：

通过A1～A3多肽的比较，A3多肽具有更好的促进成纤维细胞的增殖和存活，经外泌体和多肽组合数据可知，将A3多肽和外泌体共同用于成纤维细胞的增殖中能够显著提高细胞的存活率。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。