卵巢癌原代细胞的培养基、培养方法及其应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及培养基及其应用，更具 体涉及一种卵巢癌原代细胞的培养基及培养方法和用途。

背景技术

卵巢癌是指发生在卵巢的恶性肿瘤性疾病，是女性生殖器官常见 的恶性肿瘤之一，发病率仅次于子宫颈癌和子宫体癌。卵巢癌以上皮 癌最多见，其次是恶性生殖细胞肿瘤，其中卵巢上皮癌死亡率占各类 妇科肿瘤的首位，对女性生命可造成严重威胁。卵巢癌早期多无症状， 晚期可出现下腹不适、腹胀、食欲下降等消化道症状，主要的治疗方 式包括手术切除、药物治疗和放射治疗，总体预后较差。

化学治疗是治疗卵巢肿瘤的主要方法之一。虽然目前临床可以使 用的化疗药物已经有许多，但卵巢肿瘤的临床治疗有效率仅为25％ 左右。其主要原因在于，目前患者所使用的化疗药物的方案大多是根 据临床医生的经验，在没有考虑到患者个体差异的前提下，通过尝试 -评估-换药尝试-再评估的方法，不但未能提高药物的治疗效果，同时 会错过最佳的治疗时期，从而使肿瘤进入晚期。此外，在整个治疗过 程中，患者会承受药物副作用以及极高的医疗费用的负担。

因此，在体外建立原代肿瘤模型，并利用它进行高效的药物筛选 实验是一个有良好前景的方案。目前建立原代卵巢肿瘤的体外培养模 型主要的方法有人源肿瘤异种移植模型(Patient-Derived tumor Xenograft,PDX)，该方法是将患者的肿瘤细胞移植到裸鼠体内，再考 察不用抗肿瘤药物对其的治疗效果。然而，PDX方法也有一些不足， 例如：人与鼠之间的物种差异；测试周期长(4周以上)；成本高(20 万以上)；假阳性与假阴性等。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种卵巢癌原代细胞的培养 基及体外培养方法和应用。

本发明的一个方面在于提供一种卵巢癌原代细胞的培养基，所述 培养基包含MST1/2激酶抑制剂；选自Y27632、法舒地尔、和H-1152 中的至少一种的Rho蛋白激酶抑制剂；胰岛素-转铁蛋白-硒补充剂； 胰岛素；前列腺素E2；表皮生长因子；胃泌素；胰岛素样生长因子 -1；霍乱毒素；双调蛋白；N2；和B27。

其中，所述MST1/2激酶抑制剂包括式(I)的化合物或其药学 可接受的盐、或溶剂化物，

其中，

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优选的实施方式中，MST1/2激酶抑制剂包括式(Ia)的化合物 或其药学可接受的盐、或溶剂化物，

其中，

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优选地，所述MST1/2抑制剂是选自以下化合物或其药学可接受 的盐、或溶剂化物中的至少一种。

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最优选地，本发明的MST1/2激酶抑制剂为化合物1。

在本发明的实施方式中，本发明的培养基中各成分的含量满足以 下任意一项或多项或全部满足：

(1)所述MST1/2激酶抑制剂在培养基中的含量为2.5～20μ M；

(2)所述Rho蛋白激酶抑制剂在培养基中的含量为2.5～20μM；

(3)所述胰岛素-转铁蛋白-硒补充剂相对于培养基的体积比为 1:800～1:50；

(4)所述胰岛素在培养基中的含量为1～27μg/mL；

(5)所述前列腺素E2在培养基中的含量为2.5～10μM；

(6)所述表皮生长因子在培养基中的含量为2.5～40ng/mL；

(7)所述胃泌素在培养基中的含量为1～9nM；

(8)所述胰岛素样生长因子-1在培养基中的含量为25～100 ng/mL；

(9)所述霍乱毒素在培养基中的含量为0.05～0.8μg/mL；

(10)所述双调蛋白在培养基中的含量为1～81ng/mL；

(11)所述B27添加剂相对于培养基的体积比范围优选为1：25～ 1：400；

(12)所述N2添加剂相对于培养基的体积比范围优选为1：50～ 1：400。

在本发明的实施方式中，所述培养基还含有选自DMEM/F12、 DMEM、F12或RPMI-1640的初始培养基；和选自链霉素/青霉素、 两性霉素B和Primocin中的一种或多种的抗生素。

在优选的实施方式中，当抗生素选自链霉素/青霉素时，链霉素 浓度范围为25～400μg/mL，青霉素浓度范围为25～400U/mL，当 抗生素选自两性霉素B时，浓度范围为0.25～4μg/mL，当抗生素 选自Primocin时，浓度范围为25～400μg/mL。

根据第二个方面，本发明还提供一种卵巢癌原代细胞的体外培养 方法。在本发明的卵巢癌原代细胞的体外培养方法中，使用本发明的 卵巢癌原代细胞培养基对卵巢癌原代细胞进行体外培养。

本发明的卵巢癌原代细胞的体外培养方法包括以下步骤：

1.卵巢癌原代细胞的分离

(1)分离卵巢癌组织样本，按1:3的体积比加入基础培养基和 组织消化液(注：组织消化液的加入量是1g肿瘤组织使用约5-10mL 组织消化液)，置于恒温摇床中进行消化，消化温度为4～37℃，消 化转速为200rpm～350rpm；

(2)消化充分直至未见明显组织块即可终止消化，消化时间为 3～6小时；

(3)离心后弃去上清液，离心转速为1200～1600rpm，离心时 间为2～6分钟，加入基础培养基重悬备用。

其中，基础培养基配方包括选自DMEM/F12、DMEM、F12或 RPMI-1640的初始培养基；和选自链霉素/青霉素、两性霉素B和 Primocin中的一种或多种的抗生素。组织消化液配方包括1640培养 基、胶原酶Ⅱ(1～2mg/mL)、胶原酶Ⅳ(1～2mg/mL)、DNA酶(50～100 U/mL)、透明质酸酶(0.5～1mg/mL)、氯化钙(1～5mM)、牛血清白 蛋白BSA(5～10mg/mL)。

2.使用本发明的卵巢癌原代细胞培养基进行培养

使用基础培养基按照50:1的比例与基质胶(

在又一方面，本发明还提供一种卵巢癌疾病的药物筛选方法，其 包括以下步骤：

(1)使用本发明的卵巢癌原代细胞的培养方法培养卵巢癌原代 细胞；

(2)选定需要检测的药物并按照所需浓度梯度进行稀释；

(3)对(1)中培养得到的细胞添加各浓度梯度的所述药物；

(4)进行细胞活性测试。

本发明的技术方案能够取得以下技术效果：

(1)提高卵巢癌原代细胞培养的成功率，能够培养来源于上皮 性癌、恶性生殖细胞肿瘤、间质肿瘤及转移性肿瘤等多来样本源的肿 瘤组织，成功率达到80％以上；

(2)体外培养的卵巢癌原代细胞能够保持病人的病理特性；

(3)所培养的卵巢癌原代细胞不受成纤维细胞、脂肪细胞等间 质细胞的干扰；

(4)扩增效率高，可在一周左右时间内成功培养出卵巢癌原代 细胞，扩增出的卵巢癌原代细胞还可以连续传代；

(5)培养成本可控，培养基无需加入价格昂贵的Wnt激动剂等 因子；

(6)培养基不含血清，并且可避免原代细胞与基质细胞的共培 养，也解决了传统的含血清、与基质细胞共培养等培养方案所存在的 一系列问题；

(7)所述技术培养获得的卵巢癌原代细胞数量大，均一化程度 高，适合高通量筛选新候选化合物和为病人提供高通量药物体外敏 感功能。

附图说明

图1为表示卵巢癌原代细胞培养基中不同添加因子组合对卵巢 癌原代细胞生长的影响的图。

图2A-2L为显示卵巢癌原代细胞培养基的添加因子的不同浓度 对卵巢癌原代细胞生长影响的图。

图3A-3F为利用显微镜观察使用本发明的卵巢癌原代细胞培养 基培养得到的卵巢癌原代细胞的照片。

图4A-4G为原始卵巢癌组织细胞的免疫组化结果。

图5A-5G为使用本发明的卵巢癌原代细胞培养基培养原始卵巢 癌组织细胞至第四代得到的卵巢癌原代细胞的免疫组化结果。

图6A-6C显示分别使用本发明的卵巢癌原代细胞培养基、文献 培养基及商品化培养基对卵巢癌原代细胞进行培养的细胞生长曲线。

图7A-7F显示使用本发明的卵巢癌原代细胞培养基培养至不同 代数的卵巢癌原代细胞用于药物筛选的结果。

具体实施方式

为更好地理解本发明，下面结合实施例及附图对本发明作进一步 描述，以下实施例仅是对本发明进行说明而非对其加以限定。

[MST1/2激酶抑制剂的制备实施例]

本说明书中，MST1/2激酶抑制剂是指直接或间接地对MST1/2 信号传导进行负调节的任意的抑制剂。一般来说，MST1/2激酶抑制 剂例如与MST1/2激酶结合并降低其活性。由于MST1和MST2的结 构具有相似性，MST1/2激酶抑制剂也可以是例如与MST1或MST2 结合并降低其活性的化合物。

1.MST1/2激酶抑制剂化合物1的制备

4-((7-(2,6-二氟苯基)-5,8-二甲基-6-氧代-5,6,7,8-四氢蝶啶-2-基)氨基)

苯磺酰胺1

2-氨基-2-(2,6-二氟苯基)乙酸甲酯(A2)：在圆底烧瓶中加入2- 氨基-2-(2,6-二氟苯基)乙酸(2.0克)后加入甲醇(30毫升)，随后冰 浴下滴加二氯亚砜(1.2毫升)。反应体系在85℃反应过夜。反应结 束后，体系在减压下蒸干溶剂，所得白色固体，直接用于下一步。

2-((2-氯-5-硝基嘧啶-4-基)氨基)-2-(2,6-二氟苯基)乙酸甲酯(A3)： 在圆底烧瓶中加入2-氨基-2-(2,6-二氟苯基)乙酸甲酯(2克)后加入 丙酮(30毫升)和碳酸钾(2.2克)，然后用冰盐浴使体系冷却到-10℃， 接着缓慢加入2,4-二氯-5-硝基嘧啶(3.1克)的丙酮溶液。反应体系 在室温搅拌过夜。反应结束后，过滤，滤液在减压下除去溶剂，残留 物经加压硅胶柱层析提纯后得化合物A3。LC/MS：M+H 359.0。

2-氯-7-(2,6-二氟苯基)-7,8-二氢蝶啶-6(5H)-酮(A4)：在圆底烧瓶 中加入2-((2-氯-5-硝基嘧啶-4-基)氨基)-2-(2,6-二氟苯基)乙酸甲酯(2.5 克)后加入醋酸(50毫升)和铁粉(3.9克)。反应体系在60℃搅拌 两小时。反应结束后，体系在减压下蒸干溶剂，所得物用饱和碳酸氢 钠中和至碱性。乙酸乙酯萃取，有机相分别用水、饱和食盐水洗涤后 用无水硫酸钠干燥。有机相经过滤，减压蒸干后得粗品。粗品经乙醚 洗涤后得化合物A4。LC/MS：M+H 297.0。

2-氯-7-(2,6-二氟苯基)-5,8-二甲基-7,8-二氢蝶啶-6(5H)-酮(A5)： 在圆底烧瓶中加入2-氯-7-(2,6-二氟苯基)-7,8-二氢蝶啶-6(5H)-酮(2 克)和N,N-二甲基乙酰胺(10毫升)，冷却至-35℃，加入碘甲烷(0.9 毫升)，随后加入氢化钠(615毫克)，反应体系继续搅拌两小时。反 应结束后，加水淬灭，乙酸乙酯萃取，有机相分别用水、饱和食盐水 洗涤后用无水硫酸钠干燥。有机相经过滤，减压蒸干后得粗品。粗品 经乙醚洗涤后得化合物A5。LC/MS：M+H 325.0。

4-((7-(2,6-二氟苯基)-5,8-二甲基-6-氧代-5,6,7,8-四氢蝶啶-2-基)氨 基)苯磺酰胺(1)：在圆底烧瓶中加入2-氯-7-(2,6-二氟苯基)-5,8-二甲 基-7,8-二氢蝶啶-6(5H)-酮(100毫克)、磺胺(53毫克)、对甲苯磺酸 (53毫克)和仲丁醇(5毫升)。反应体系在120℃搅拌过夜。反应 结束后，过滤，甲醇和乙醚洗涤得化合物1。LC/MS：M+H 461.1。

2.本发明的其他MST1/2抑制剂化合物的制备

本发明的其他MST1/2抑制剂化合物按照与化合物1类似的方法 合成，其结构及质谱数据如下表所示。

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实施例1卵巢癌原代细胞培养基中各添加因子对卵巢癌原代细 胞生长的影响

(1)卵巢癌原代细胞培养基的配制

首先配制含有初始培养基的基础培养基。初始培养基可选自本领 域常用的DMEM/F12、DMEM、F12或RPMI-1640。在本实施例中， 基础培养基的配方为：DMEM/F12培养基(购自Corning公司)+100 μg/mL Primocin(购自InvivoGen公司，0.2％(v/v)，市售产品浓度50mg/ml)。在基础培养基内分别加入不同种类的添加剂(参见表1)配 制成含有不同添加成分的卵巢癌原代细胞培养基。

(2)卵巢癌原代细胞的分离和处理

1样品选择

卵巢癌实体瘤组织样品(术中)由专业医疗机构的专业医务人员 从患者获取，患者均签署了知情同意书。术中样本0.25cm

2材料准备

15mL无菌离心管、移液枪、10mL移液管、无菌枪头等表面消 毒后放入超净工作台中紫外照射30分钟。提前30分钟从4℃冰箱取 出基础培养基，提前30分钟从-20℃冰箱取出组织消化液。

组织消化液：1640培养基(Corning，10-040-CVR)、胶原酶Ⅱ (2mg/mL)、胶原酶Ⅳ(2mg/mL)、DNA酶(50U/mL)、透明质酸 酶(0.75mg/mL)、氯化钙(3.3mM)、BSA(10mg/mL)。

以上提及的胶原酶Ⅱ、胶原酶Ⅳ、DNA酶、和透明质酸酶均购 自Sigma公司；氯化钙购自生工生物工程(上海)股份有限公司； BSA购自Biofroxx公司。

3.卵巢癌原代细胞的分离

3.1超净台中取组织样品于培养皿中，去除带血液的组织，用基 础培养基冲洗2次，将组织转移至另一培养皿中用无菌手术刀进行 机械分离，将组织块分割为1×1×1mm

3.2将切割后的术中组织吸至15mL离心管中，加入5mL基础 培养基，混匀，于1500rpm离心4分钟；

3.3弃上清，按1:3比例加入基础培养基和组织消化液(注：组 织消化液的加入量是1g肿瘤组织使用约10mL组织消化液)，标记 样品名称及编号，用封口膜密封，在37℃下于300rpm摇床(知楚仪 器ZQLY-180N)中进行消化，期间每30分钟观察消化是否完成，判 断依据为无肉眼可见的颗粒物，消化时间4小时；

3.4消化完成后，经100μm滤网过滤掉未消化的组织团块，滤 网上的组织团块用基础培养基冲洗入离心管中以减少细胞损失，于 25℃下1500rpm离心4分钟；

3.5弃上清，观察是否有血细胞，若有血细胞，加8mL血细胞 裂解液(购自Sigma公司)，混匀，4℃裂解20分钟，期间颠倒混匀 一次，25℃下1500rpm离心4分钟；

3.6弃上清，加入2mL基础培养基重悬细胞，备用。

4细胞计数及处理

4.1镜下观察：移取少量重悬细胞平铺于培养皿中，显微镜 (CNOPTEC，BDS400)下观察癌细胞密度和形态；

4.2活细胞计数：取重悬的细胞悬液12μL，12μL台盼蓝染液(生 工生物工程(上海)股份有限公司)充分混合后，取20μL加入细胞 计数板(Countstar，规格：50片/盒)，细胞计数仪(Countstar，IC1000) 下计算出活的大细胞(细胞粒径>10μm)百分率＝活细胞数/总细胞 数×100％。

(3)卵巢癌原代细胞的培养

将按照上述步骤(2)从2例卵巢癌组织(编号为L40、LQQ) 分离得到的卵巢癌原代细胞用基础培养基重悬并计数。使用基础培养 基按照50:1的比例与基质胶(

表1培养基中的添加成分及促细胞增殖效果

其中，“+”表示与基础培养基相比，加入该添加剂的培养基对 从卵巢癌组织分离出的卵巢癌原代细胞中的两例有促进增殖的作用； “－”表示添加该添加剂的培养基对从卵巢癌组织分离出的卵巢癌原 代细胞中的一例显示有促进增殖的作用；“○”表示添加该添加剂的 培养基对从卵巢癌组织分离出的卵巢癌原代细胞中的至少两例的增 殖没有明显的影响。

根据以上结果，拟选化合物1、前列腺素E2、B27、N2、表皮生 长因子、胰岛素、胰岛素-转铁蛋白-硒补充剂、双调蛋白、Y-27632、 胰岛素样生长因子-1、胃泌素、霍乱毒素等因子进行进一步培养实验。

实施例2卵巢癌原代细胞培养基中不同添加因子的组合对卵巢 癌原代细胞增殖的影响

根据表2中的成分配制不同添加因子组合的卵巢癌原代细胞培 养基，考察不同添加因子组合对卵巢癌原代细胞的促增殖作用。

表2不同组分培养基的配制(浓度为终浓度)

按照实施例1的步骤(2)之3的方法从卵巢癌组织(编号为L46、 L55、L56)获得卵巢癌原代细胞，将所获得的细胞悬液平均分成14 份，1500rpm离心4分钟。离心后分别使用200μL BM和No.1～13 号培养基重悬。使用基础培养基按照50:1的比例与基质胶(

48孔板中细胞长至85％以上，弃培养基，使用100μL 0.05％胰 蛋白酶(购自Gibco公司)润洗1遍，吸去后再每孔加入200μL 0.05％ 胰蛋白酶。置于37℃、5％CO

根据图1的结果可知，与基础培养基相比，在使用上述No.1～ No.13培养基时，均能够不同程度地促卵巢癌原代细胞的增殖。因此， 在使用含有化合物1、前列腺素E2、B27、N2、表皮生长因子、胰岛 素、胰岛素-转铁蛋白-硒补充剂、双调蛋白、Y-27632、胰岛素样生长 因子-1、胃泌素、霍乱毒素等添加成分的培养基培养卵巢癌原代细胞 时，增殖效果较好。

实施例3卵巢癌原代细胞培养基所含添加因子的不同浓度对卵 巢癌原代细胞的增殖作用

按照实施例1的步骤(2)之3的方法从组织样本(编号为A26083、 L56、L62)获得卵巢癌原代细胞。使用实施例2中的有效因子的组 合培养基进行培养。使用基础培养基按照50:1的比例与基质胶 (

所获得的卵巢癌原代细胞，按照活细胞密度2.4×10

配制以下12种配方的培养基进行实验。

配方1：上述卵巢癌原代细胞培养基组分中不含化合物1；

配方2：上述卵巢癌原代细胞培养基基组分中不含前列腺素E2；

配方3：上述卵巢癌原代细胞培养基组分中不含B27；

配方4：上述卵巢癌原代细胞培养基组分中不含N2；

配方5：上述卵巢癌原代细胞培养基组分中不含表皮生长因子；

配方6：上述卵巢癌原代细胞培养基组分中不含胰岛素；

配方7：上述卵巢癌原代细胞培养基组分中不含胰岛素-转铁蛋白 -硒补充剂；

配方8：上述卵巢癌原代细胞培养基组分中不含双调蛋白；

配方9：上述卵巢癌原代细胞培养基组分中不含Y-27632；

配方10：上述卵巢癌原代细胞培养基组分中不含胰岛素样生长 因子-1；

配方11：上述卵巢癌原代细胞培养基组分中不含胃泌素；

配方12：上述卵巢癌原代细胞培养基组分中不含霍乱毒素；

每孔加入20μl含4x10

在使用配方1的培养基时，在接种有原代细胞的48孔板中分别 添加配制好的化合物1每孔1mL，化合物1的终浓度分别为2.5μM、 5μM、10μM、20μM、40μM；并使用配方1的培养基设置对照孔 (BC)。

在使用配方2的培养基时，在接种有原代细胞的48孔板中分别 添加配制好的前列腺素E2每孔1mL，前列腺素E2的终浓度分别为 2.5μM、5μM、10μM、20μM、40μM；并使用配方2的培养基设 置对照孔(BC)。

在使用配方3的培养基时，在接种有原代细胞的48孔板中分别 添加配制好的B27每孔1mL，B27的终浓度分别为1:400(V/V)、 1:200(V/V)、1:100(V/V)、1:50(V/V)、1:25(V/V)；并使用配方 3的培养基设置对照孔(BC)。

在使用配方4的培养基时，在接种有原代细胞的48孔板中分别 添加配制好的N2每孔1mL，N2的终浓度分别为1:400(V/V)、1:200 (V/V)、1:100(V/V)、1:50(V/V)、1:25(V/V)；并使用配方4的 培养基设置对照孔(BC)。

在使用配方5的培养基时，在接种有原代细胞的48孔板中分别 添加配制好的表皮生长因子每孔1mL，表皮生长因子的终浓度分别 为2.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL；并使用配 方5的培养基设置对照孔(BC)。

在使用配方6的培养基时，在接种有原代细胞的48孔板中分别 添加配制好的胰岛素每孔1mL，胰岛素的终浓度分别为1μg/mL、3 μg/mL、9μg/mL、27μg/mL、81μg/mL；并使用配方6的培养基设置 对照孔(BC)。

在使用配方7的培养基时，在接种有原代细胞的48孔板中分别 添加配制好的胰岛素-转铁蛋白-硒补充剂每孔1mL，胰岛素-转铁蛋 白-硒补充剂的终浓度分别为1:800(V/V)、1:400(V/V)、1:200(V/V)、 1:100(V/V)、1:50(V/V)；并使用配方7的培养基设置对照孔(BC)。

在使用配方8的培养基时，在接种有原代细胞的48孔板中分别 添加配制好的双调蛋白每孔1mL，双调蛋白的终浓度分别为1 ng/mL、3ng/mL、9ng/mL、27ng/mL、81ng/mL；并使用配方8的 培养基设置对照孔(BC)。

在使用配方9的培养基时，在接种有原代细胞的48孔板中分别 添加配制好的Y-27632每孔1mL，Y-27632的终浓度分别为2.5μM、 5μM、10μM、20μM、40μM；并使用配方9的培养基设置对照孔 (BC)。

在使用配方10的培养基时，在接种有原代细胞的48孔板中分别 添加配制好的胰岛素样生长因子-1每孔1mL，胰岛素样生长因子-1 的终浓度分别为12.5ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200 ng/mL；并使用配方10的培养基设置对照孔(BC)。

在使用配方11的培养基时，在接种有原代细胞的48孔板中分别 添加配制好的胃泌素每孔1mL，胃泌素的终浓度分别为1nM、3nM、 9nM、27nM、81nM；并使用配方11的培养基设置对照孔(BC)。

在使用配方12的培养基时，在接种有原代细胞的48孔板中分别 添加配制好的霍乱毒素每孔1mL，霍乱毒素的终浓度分别为0.05 μg/mL、0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.4μg/mL、0.8μg/mL；并使用配方 12的培养基设置对照孔(BC)。

待细胞扩增至48孔的85％左右消化计数，分别参比对照孔(BC) 细胞数计算增殖倍数，将结果分别示于图2A～2L。图2A～2L中， 比值为使用各培养基培养一代得到的细胞数与对应的对照孔培养一 代得到的细胞数的比。比值大于1说明配制的含不同浓度的因子或小 分子化合物的培养基促增殖效果优于对照孔培养基；比值小于1，则 说明配制的含不同浓度的因子或小分子化合物的培养基促增殖效果 较对照孔培养基促增殖效果弱。

根据图2A～2L的结果，化合物1、前列腺素E2、B27、N2、表 皮生长因子、胰岛素、胰岛素-转铁蛋白-硒补充剂、双调蛋白、Y-27632、 胰岛素样生长因子-1、胃泌素、霍乱毒素对卵巢癌原代细胞有明显的 促增殖作用。根据本实施例的结果，化合物1的含量优选为2.5μM～ 20μM，更优选为2.5μM～10μM，浓度为5μM时细胞增殖效果最 明显；前列腺素E2的含量优选为2.5μM～10μM，浓度为2.5μM时 细胞增殖效果最明显；B27含量优选为1:25(V/V)～1:400(V/V)， 更优选为1:50(V/V)～1:200(V/V)，浓度为1:100(V/V)时细胞 增殖效果最明显；N2含量优选为1:50(V/V)～1:400(V/V)，浓度 为1:400(V/V)时细胞增殖效果最明显；表皮生长因子的含量优选 为2.5ng/ml～40ng/ml，更优选为5ng/ml～20ng/ml，浓度为10ng/mL 时细胞增殖效果最明显；胰岛素的含量优选为1μg/ml～27μg/ml，更 优选为3μg/ml～9μg/ml，浓度为9μg/mL时细胞增殖效果最明显； 胰岛素-转铁蛋白-硒补充剂含量优选为1:50(V/V)～1:800(V/V)， 更优选为1:400(V/V)～1:100(V/V)，浓度为1:200(V/V)时细胞 增殖效果最明显；双调蛋白的含量优选为1ng/ml～81ng/ml，更优选 为1ng/ml～27ng/ml，浓度为3ng/mL时细胞增殖效果最明显； Y-27632的含量优选为2.5μM～20μM，浓度为5μM时细胞增殖效 果最明显；胰岛素样生长因子-1的含量优选为25ng/ml～100ng/ml， 浓度为50ng/mL时细胞增殖效果最明显；胃泌素的含量优选为1 nM～9nM，浓度为3nM时细胞增殖效果最明显；霍乱毒素的含量 优选为0.05μg/ml～0.8μg/ml，更优选为0.05μg/ml～0.2μg/ml，浓度 为0.1μg/mL时细胞增殖效果最明显。

采用上述培养基中各添加因子的最优选浓度，作为下面实施例中 使用的本发明的卵巢癌原代细胞培养基，其含有：基础培养基BM、 5μM化合物1、2.5μM前列腺素E2、1:100(V/V)B27、1:400(V/V) N2、10ng/mL表皮生长因子、9μg/mL胰岛素、1:200(V/V)胰岛素 -转铁蛋白-硒补充剂、3ng/mL双调蛋白、5μMY-27632、50ng/mL 胰岛素样生长因子-1、3nM胃泌素、0.1μg/mL霍乱毒素(以下称为 “OC-2”培养基)。

实施例4卵巢癌原代细胞的培养

按照实施例1的步骤(2)之3的方法从6例术中组织样本(编 号为A26083、L65、L66、L72、L74、L84)获得卵巢癌原代细胞， 并使用OC-2培养基进行培养。使用基础培养基按照50:1的比例与基 质胶(

使用显微镜(Invitrogen公司EVOS M500)观察培养得到的卵巢 癌原代细胞，图3A～3F是在10倍物镜下拍摄得到的照片，细胞在镜 下呈紧密排列，形态略不规则。

实施例5卵巢癌原代细胞培养的组化鉴定

从一例卵巢癌患者的术中组织(样本编号L74)取出约0.25cm

图4A-4G和5A-5G分别是原始组织细胞和采用该细胞以本发明 的卵巢癌原代培养基OC-2培养而获得的卵巢癌原代细胞的免疫组化 结果对比图。图4A和图5A分别是卵巢癌组织和培养后的卵巢癌原 代细胞的标记ER抗体的图片，图4B和图5B分别是卵巢癌组织和培 养后的卵巢癌原代细胞的标记PR抗体的图片，图4C和图5C分别是 卵巢癌组织和培养后的卵巢癌原代细胞的标记P53抗体的图片，图4D和图5D分别是卵巢癌组织和培养后的卵巢癌原代细胞的标记 NapsinA抗体的图片，图4E和图5E分别是卵巢癌组织和培养后的卵 巢癌原代细胞的标记Pax-8抗体的图片，图4F和图5F分别是卵巢癌 组织和培养后的卵巢癌原代细胞的标记WT-1抗体的图片，图4G和 图5G分别是卵巢癌组织和培养后的卵巢癌原代细胞的标记Ki-67抗 体的图片。由此可以确认，采用本发明技术培养的卵巢癌原代细胞培 养至第4代时，卵巢癌原代细胞上与卵巢癌相关的生物标记物的表达 情况与卵巢癌原代细胞来源的原始组织切片的标记物表达情况基本 一致。说明采用本发明技术所培养的卵巢癌原代细胞保持了卵巢癌病 人癌组织的原始病理特性。

实施例6与现有培养基培养效果的比较和卵巢癌原代细胞培养 周期和细胞数统计及Population Doubling(PD)值计算

文献培养基(Xuefeng Liu等，Nat.Protoc.，12(2):439-451， 2017))，其配方为DMEM/F12培养基+250ng/ml两性霉素B(购 自Selleck公司)+10μg/ml庆大霉素(购自MCE公司)+0.1nM霍 乱毒素+0.125ng/ml EGF+25ng/ml氢化可的松+10μM Y27632 +10％FBS。

商品化培养基：Defined K-SFM，Keratinocyte Serum Medium(购 自gibco公司，10744-019)

按照实施例1步骤(2)之3的方法从3例样本卵巢癌组织样 本(编号为L65、L66、A22083)获得卵巢癌原代细胞。对于所获得 的卵巢癌原代细胞，分别使用文献培养基、商品化培养基及实施例3 中的OC-2培养基培养，按照活细胞密度3×10

图6A-6C显示采用Graphpad Prism软件绘制的、使用文献培养 基、商品化培养基及本发明的卵巢癌原代细胞培养基OC-2培养的3 例原代细胞的生长曲线，横坐标表示细胞培养的天数，纵坐标是累计 的细胞增殖倍数，表示细胞在培养周期内扩增的倍数，数值越大表示 细胞在一定周期内扩增的次数越多，即扩增得到的细胞数也就越多， 斜率代表的是细胞扩增的速率。从图6A-6C中可以确认，本发明的 培养基OC-2培养的卵巢癌原代细胞持续培养扩增至少30天时，细 胞扩增速率基本保持不变，仍具有继续扩增的能力；根据图6A-6C 的结果可知，使用文献培养基和商品化培养基培养的卵巢癌原代细胞 扩增速率明显低于OC-2培养基。综上所述，与文献培养基和商品化 培养相比，本发明的本发明的卵巢癌原代细胞培养基体外培养卵巢癌 细胞的增殖效率明显更优。

实施例7使用本发明的培养基扩增得到的卵巢癌原代细胞用于 药物筛选和疗效评估

1、细胞培养和铺板

按照实施例1的步骤(2)之3的方法分离得到卵巢癌原代细胞 (编号为A22083)，作为一代，并使用本发明的卵巢癌原代细胞培养 基OC-2进行培养，待细胞扩增至85％，进行传代。按照实施例1中 步骤(2)之4将细胞传代计数，将细胞按照活细胞密度1×10

2、筛选药物配制

按照下表配制6个浓度梯度的5种药物(阿糖胞苷、多柔比星、 硼替佐米、帕比司他、阿扎胞苷、高三尖杉酯碱；均购自MCE公司)， 在384孔药板(购自赛默飞公司)每孔中添加30μL，保存待用。

表3药物作用浓度设置

3、高通量加药

取出配制好的药板，置于室温，于离心机(贝克曼)中室温1000 rpm离心1分钟后取出。采用高通量自动化加样系统(Perkin Elmer 公司JANUS)进行高通量加药。对培养有卵巢癌原代细胞的384孔 板在每孔加入0.1μL对应浓度的筛选药物。加药结束后，384孔板表面消毒后移至培养箱中，72小时后测定细胞活性。

4、细胞活性测试

4℃冰箱取出CellTiter-Glo发光试剂(购自Promega公司)，取 10mL试剂置于加样槽中。培养箱中取出待检测384孔板，每孔加入 10μL CellTiter-Glo发光试剂，静置10分钟后混匀，使用多功能酶标 仪(Perkin Elmer公司Envision)检测。

5、数据处理

按照公式细胞抑制率(％)＝100％-加药孔化学发光数值/对 照孔化学发光数值×100％，计算得到不同药物作用细胞后的细胞抑制 率，使用graphpad prism软件计算药物对细胞作用的半数抑制率(IC

由图7A-7E可以确认，使用本发明的卵巢癌原代细胞培养基 OC-2培养得到的卵巢癌原代细胞进行药物筛选，相同药物对于培养 的不同代数细胞的抑制效果基本保持一致(抑制曲线基本保持一致)。 同一病人的细胞对不同药物在人体内最大血药浓度时的敏感性不同。 根据结果可以判断卵巢癌患者在临床使用该种药物时的有效性，同时 可以说明根据本发明培养方法得到不同代数的肿瘤细胞对药物的敏 感性是稳定的。

工业应用性

本发明提供一种用于体外培养卵巢癌原代细胞的原代细胞培养 基及培养方法，可将培养得到的细胞应用于药物的疗效评估和筛选。 因而，本发明适于工业应用。

尽管本文对本发明作了详细说明，但本发明不限于此，本技术领 域的技术人员可以根据本发明的原理进行修改，因此，凡按照本发明 的原理进行的各种修改都应当理解为落入本发明的保护范围。