一种靶向WDR5的多肽抑制剂及其用途

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种靶向WDR5的多肽抑制剂及其用途。

背景技术

WDR5是一种高度保守的WD40家族蛋白，在多种蛋白质复合物中作为核心支架成分发挥作用，作为表观遗传机制的一部分控制转录调控和组蛋白密码修饰过程。WDR5具有334个氨基酸，N端是一个大约30个残基的无序结构，其C端包含七个WD40重复序列，形成一个特征性的类似“甜甜圈”的七叶片β螺旋桨结构。WDR5采用这种结构提供两个主要的结合位点作为复合物形成的界面，一个表面上有一个浅裂隙，称为“WDR5结合基序”(WBM)位点，另一个表面上有一个精氨酸结合腔，称为“WDR5相互作用”(WIN)位点(Guarnaccia and Tansey,2018)。

目前研究的最充分的是WDR5与MLL1(混合谱系白血病1)之间的相互作用，通过识别WIN序列，WDR5与MLL1、RBBP5(视网膜母细胞瘤结合蛋白5)、ASH2L(absent,small,orhomeotic 2-like)以及DPY-30(Dumpy-30)共同形成H3K4甲基转移酶复合物。MLL1通常在急性髓细胞性白血病和淋巴细胞性白血病中失调，其常见缺陷是11号染色体的基因易位，并导致产生白血病的MLL1融合蛋白的形成。MLL1融合蛋白缺乏SET(SET结构域以首次发现的表达此类结构域的三个基因的首字母命名，即Suppressor of variegation 3-9、Enhancerof zeste和Trithorax，SET结构域是大多数转移酶含有的结构域，负责甲基转移酶的酶促活性)结构域，因此缺乏H3K4甲基转移酶活性，与野生型MLL1复合物协同激活MLL1靶基因并导致白血病发生(Karatas et al.,2013)。单独的MLL1甲基转移酶活性较弱，破坏WDR5-MLL1之间的相互作用会显著抑制H3K4甲基转移酶活性从而抑制下游基因的异常表达。因此，靶向MLL1的H3K4甲基转移酶活性可能是治疗携带MLL1融合蛋白的白血病的有希望的策略(Thiel et al.,2010)。

WDR5还通过WBM位点与MYC相关联，WDR5是将MYC募集到其基因组目标子集所需的关键辅助因子。WDR5与MYC共定位于关键靶基因的染色质上，MYC需要WDR5才能有效识别染色质上的靶基因(Thomas et al.,2015)。WDR5-MYC轴被证明与胰腺癌的发生发展密切相关(Carugo et al.,2016)。破坏MYC与WDR5相互作用可以减弱MYC与其约80％的染色体位置的结合，并使其无法促进诱导多能干细胞形成和驱动肿瘤发生(Thomas et al.,2015)。

除了上述提到的癌症外，WDR5的过度表达与许多人类癌症的不良临床结果相关，包括神经母细胞瘤(Sun et al.,2015)、乳腺癌(Dai et al.,2015)、膀胱癌(Chen et al.,2015)、肺癌(Xie et al.,2017)以及结直肠癌(Tan et al.,2017)等。考虑到WDR5在人类恶性肿瘤中的多方面作用，WDR5已成为研发多肽或小分子抑制剂的有吸引力的药物靶标。

此外，这几年越来越多的研究证据表明相分离与多种疾病的病理过程相关，北卡罗莱纳大学教堂山分校Gang Greg Wang团队等研究证明了相分离是癌症形成的驱动因素(Ahn et al.,2021)，而相分离在细胞中普遍存在，类似于油水分离的现象，一旦分子达到一定的浓度，它们就可以发生相分离，将相似的成分聚集在一起形成信号体以加速反应，实现多种生物学功能。有关相分离机制的研究，将为有效靶分子提供理论依据，靶向相分离也成了具有很大潜力的药物研发方向。因此可以考虑通过设计靶向相分离的多肽或小分子抑制剂来调节蛋白功能，从而研发全新的药物。

发明内容

本发明的目的在于提供一种靶向WDR5的多肽抑制剂，破坏WDR5的相分离及WDR5与其他蛋白质的相互作用，从而起到抑癌作用。

本发明的另一目的是针对WDR5的结构特点，设计一种分子量小的多肽抑制剂。

本发明的技术方案是提供一种靶向WDR5的多肽抑制剂(SEQ ID NO.5)，及其在抑制MLL1蛋白复合物甲基转移酶活性和抑制肿瘤生长方面的应用。

具体来说，本发明提供了如下技术方案：

一方面，本发明提供一种靶向WDR5的多肽抑制剂，其特征在于，其氨基酸序列为Ala-Arg-Ala-Gln。

在一些实施方案中，其特征在于，所述多肽抑制剂竞争性抑制WDR5的N端与其本身的WD40结构域结合。

在一些实施方案中，其特征在于，所述多肽抑制剂根据与WD40结构域结合的N端四个氨基酸合成。

另一方面，本发明提供一种分离的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列编码上述多肽抑制剂。

另一方面，本发明提供一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含上述核苷酸序列。

另一方面，本发明提供一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含上述表达载体。

另一方面，本发明提供一种药物组合物，其特征在于，其包括上述的多肽抑制剂和药学上可接受的载体。

在一些实施方案中，所述药学上可接受的载体包括但不限于赋形剂、辅料、填充剂、甜味剂、崩解剂、湿润剂和润滑剂。

在一些实施方案中，所述药学上可接受的载体选自赋形剂、辅料、填充剂、甜味剂、崩解剂、湿润剂和润滑剂。

另一方面，本发明提供上述多肽抑制剂在制备治疗肿瘤的药物中的应用。

在一些实施方案中，所述肿瘤选自白血病、胰腺癌、神经母细胞瘤、乳腺癌、膀胱癌、肺癌以及结直肠癌。

在一些实施方案中，所述白血病为急性髓细胞性白血病或淋巴细胞性白血病。

在一些实施方案中，所述胰腺癌为腺癌。

在一些实施方案中，所述胰腺癌为转移胰腺癌和/或原位胰腺癌。

在一些实施方案中，所述胰腺癌为转移胰腺腺癌和/或原位胰腺腺癌。

定义

多肽：多肽是由多个氨基酸通过肽键连接形成的化合物。

多肽抑制剂：通常是由几个到二十几个氨基酸组成的比较短的多肽，能够靶向作用于蛋白，降低蛋白活性或者阻碍生化反应。多肽抑制剂结构明确，易于合成。相比于小分子抑制剂，多肽抑制剂主要通过水解和肾过滤来清除，水解的产物为氨基酸，因此多肽抑制剂的代谢产物毒性很低；其次多肽抑制剂往往以内源性多肽为模板进行特异性设计，通常具有较高的靶标亲和力。

WDR5(WD40 repeat protein 5)：WDR5是一种高度保守的WD40家族蛋白，是人类MLL和SET1组蛋白H3K4甲基化酶的蛋白复合物的重要一员。包含七个以β-螺旋桨形状排列的WD40重复序列，通常充当支架作用。WDR5在多种癌症的发生发展过程中也发挥着关键的作用。

相分离：相分离是调控生物大分子(如蛋白质、核酸)在细胞中区室化分布的重要机制之一。根据参与相分离过程的不同机制可以将相分离蛋白划分为两类：一类能够自发组装形成相分离凝聚体；另一类则依赖与其他生物大分子的相互作用发生相分离。

WD40：典型的WD40结构域是由7个重复叶片组成的螺旋桨状结构，每个叶片含有40-60个残基并折叠成四个反平行的β-链。采用保守的色氨酸-天冬氨酸(WD)基序和长度为40来常规地命名重复序列和结构域。通常在结构中的重复叶片和序列中的重复单元之间存在一条β链的移位，从而产生可以关闭β-螺旋桨的“Velcro”。

MLL1：又称组蛋白赖氨酸甲基转移酶2(KMT2A)，因其可诱发混合谱系白血病而得名。MLL1在人体组织中广泛存在，编码MLL1的基因位于11q23染色体上。在MLL1基因被翻译后，全长MLL1蛋白在第2666/2667残基和第2718/2719处被taspase1切断，产生两个多肽(N端多肽和C端多肽，MLL-C和MLL-N)，随后N端多肽和C端多肽分别通过FYRN和FYRC连接形成一个完整的活性MLL1蛋白。

相分离与癌症的关系：癌症的发展与含有内在无序区域(IDR)的蛋白质的遗传异常密切相关。北卡罗莱纳大学教堂山分校Gang Greg Wang团队等研究证明了相分离是癌症形成的驱动因素(Ahn et al.,2021)，癌症通过相分离获得突变以建立致癌转录因子凝聚物，这同时增强了它们的基因组靶向性，并在肿瘤转化过程中诱导异常三维染色质结构的形成。当正常的液-液相分离被遗传或表观遗传突变破坏时，异常的生物分子凝聚物可能参与肿瘤发生，因为它们在染色体组织、信号转导和转录失调中发挥作用，从而促进癌症的发展。比如，应激颗粒成分的表达和/或活性异常会导致多种癌症的耐药性和肿瘤发生，包括结直肠癌(Bouchard et al.,2018)、胰腺癌(Grabocka and Bar-Sagi,2016)和白血病(Podszywalow-Bartnicka et al.,2014)。癌症相关的SPOP(斑点样POZ蛋白)突变会干扰蛋白的底物共定位，影响蛋白的相分离能力和抑癌能力(Bouchard et al.,2018)。由于相分离/相变是一个高度复杂的过程，许多类型的药物，如小分子、靶向无序区域的抗体和设计的肽，可以控制相分离的过程并最终有效治疗癌症。

WDR5的相分离与癌症的关系：WDR5是一种典型的支架蛋白，而支架蛋白在调节相分离的生物学功能中发挥着重要作用(Alberti and Dormann,2019)。通常相分离蛋白WDR5在多种癌症中异常高表达，影响其正常有序地进行相分离的能力，进而影响导致肿瘤发生的相应生物学过程。

有益结果：

本发明的研究表明，多肽抑制剂(SEQ ID NO.5)能靶向WD40形成的“甜甜圈”结构，竞争性抑制WDR5本身N端与C端的结合，破坏WDR5的相分离及WDR5与其他蛋白质的相互作用，抑制MLL1蛋白复合物甲基转移酶活性，抑制胰腺癌细胞和白血病细胞的增殖，起到抑癌作用。

许多药物靶点，特别是激酶，已经提供了显著的临床结果。然而，有许多靶点，如RAS、MYC和融合蛋白，由于缺乏可被小分子靶向的蛋白质袋，因此被认为在癌症中不可成药(Dang et al.,2017)。有趣的是，一些抗肿瘤药物可以选择性地在凝集体中分配，并且细胞可以通过改变凝集体的机制从而发展出对药物的耐药性(Klein et al.,2020)，这提供了强有力的证据表明化合物可以干扰相分离的错误调节。因此，干扰相分离复合物可能成为靶向不可成药蛋白质的潜在途径，并使这些不可成药的靶点成为药物靶点，从而治疗疾病。

本发明首次提出通过破坏相分离来抑制WDR5与其他蛋白质的相互作用，从而抑制相关肿瘤细胞的生长。

附图说明

图1A是在不同的蛋白缓冲液中，突变WDR5蛋白N端氨基酸，在显微镜下观察对相分离液滴形成的影响。

图1B是在WDR5蛋白中加入WDR5蛋白N端多肽(SEQ ID NO.1)以及突变后的多肽(SEQ ID NO.2)，于蛋白缓冲液中共同孵育，随后在显微镜下观察其对WDR5相分离液滴形成的影响。

图2A和2B是在WDR5蛋白中分别加入DMSO或相同浓度的不同大小的多肽片段后，在显微镜下观察并对形成的相分离液滴的面积进行统计。

图3是通过Western-blot检测多肽(SEQ ID NO.5)处理MV4-11细胞96小时后对H3K4三甲基化(H3K4me3)水平的影响。

图4是用不同浓度的多肽(SEQ ID NO.5)分别处理胰腺癌细胞AsPC-1、BxPC-3以及白血病细胞MV4-11，通过CCK8检测细胞活力。

以上实验的标尺均为5μm。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。

WDR5的N端是一个大约30个残基的无序结构，后面包含七个WD40重复序列，作为支架蛋白，能与多种蛋白质相互作用，比如通过WIN位点与MLL1相互作用。除了与其他蛋白质相互作用，有趣的是，WDR5的N末端残基(aa11-17)也能与其本身的WD40区域的β-螺旋桨结构的顶面结合(Guarnaccia and Tansey,2018；Schuetz et al.,2006)。

之前的报道提示我们WDR5是一种相分离蛋白(Zhou et al.,2019)，我们的体外实验也验证了WDR5是一种相分离蛋白。而相分离过程通常需要弱相互作用驱动，我们猜想WDR5的相分离是通过N端的无序结构和WD40形成的“甜甜圈”结构之间的分子间相互作用力驱动的，而我们的研究进一步支持了这一机制。本发明人于金斯瑞公司合成了与WD40区域结合的N端序列多肽(SEQ ID NO.1)，并对其进行了截短和筛选，最终确定了最合适的基序作为本发明的多肽抑制剂并在肿瘤细胞中验证了其有效性。

本发明通过以下几方面研究：1.多肽抑制剂的截短与筛选；2.蛋白免疫印迹检测多肽片段对H3K4甲基转移酶活性的影响；3.细胞内检测多肽片段对癌细胞增殖的影响。

得到的结果：

我们设计合成了WDR5 N端序列多肽(SEQ ID NO.1)，通过截短筛选后确定了最优的多肽序列(SEQ ID NO.5)，破坏了WDR5的相分离以及WDR5与其他蛋白质的相互作用，从而抑制肿瘤细胞的生长，起到抑癌作用。

下面结合附图对本发明进一步详细说明：

实施例1多肽抑制剂的截短与筛选

本实施例中WDR5(WDR5具有高度保守性，人源WDR5和鼠源WDR5的11-17位氨基酸序列均为EAARAQP)蛋白线性多肽抑制剂的氨基酸序列如表1所示，表中序列均交由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

人源WDR5的序列(SEQ ID NO.6)如下：

MATEEKKPETEAARAQPTPSSSATQSKPTPVKPNYALKFTLAGHTKAVSSVKFSPNGEWLASSSADKLIKIWGAYDGKFEKTISGHKLGISDVAWSSDSNLLVSASDDKTLKIWDVSSGKCLKTLKGHSNYVFCCNFNPQSNLIVSGSFDESVRIWDVKTGKCLKTLPAHSDPVSAVHFNRDGSLIVSSSYDGLCRIWDTASGQCLKTLIDDDNPPVSFVKFSPNGKYILAATLDNTLKLWDYSKGKCLKTYTGHKNEKYCIFANFSVTGGKWIVSGSEDNLVYIWNLQTKEIVQKLQGHTDVVISTACHPTENIIASAALENDKTIKLWKSDC

表1 WDR5蛋白线性多肽抑制剂的氨基酸序列

本发明根据WDR5蛋白的N端结构域来设计更有效的靶向WDR5的多肽抑制剂。WDR5的晶体结构揭示了其N末端残基(aa11-17)能与C端WD40结构域形成的“甜甜圈”结构的顶面结合(Guarnaccia and Tansey,2018；Schuetz et al.,2006)，同时相关的报道(Zhou etal.,2019)和我们的实验都证实了WDR5是一种相分离蛋白。鉴于目前越来越多的证据表明相分离与疾病的发生与发展密切相关以及WDR5在肿瘤发展中的重要作用，因而我们推测破坏WDR5这种自身的弱相互作用，能通过抑制其相分离来抑制WDR5与其他蛋白质之间的相互作用，从而抑制相关的肿瘤生长。

本发明基于WDR5的N末端残基第11位到第17位蛋白序列合成了多肽，其序列如表1中所示。如图1A所示，我们在体外纯化了WDR5-GFP蛋白，与不同的蛋白缓冲液孵育。观察时，先在载玻片上涂上一圈长城7501高真空硅脂，再在其中央滴加样品，盖上盖玻片，倒置放于100倍油镜镜头上，并利用实验室的共聚焦显微成像系统对样品进行观察。

发明人先构建了带有His标签的WDR5-GFP质粒，接下来纯化了WDR5-GFP蛋白，蛋白具体纯化方法如下：

1)配制LB培养基：称量25g LB粉末(生工，货号：A507002-0250)，加入培养瓶，加入1L水，封盖，置入高压蒸汽锅灭菌。

2)转化：从冰箱取出Rosetta(DE3)感受态和WDR5-GFP质粒，取1μL质粒加入Rosetta(DE3)感受态中，放置在42℃水浴锅中，热激90秒后立马插到冰上，冰浴5分钟，涂平板，37℃培养16小时。

3)初培养：在15mL离心管中加入5mL的LB培养基，并加入相应抗生素，用枪头挑取单个较大菌落于离心管，放入恒温摇床，250rpm，37℃过夜培养。

4)扩大培养：将初培养后的菌液转移到1L的LB培养基中，放置恒温摇床上继续振荡培养，培养4～5小时后，至OD值达到0.5～0.8时停止培养。

5)菌液冷却：停止振荡培养，将扩大培养后的菌液放入4℃冰箱冷却2个小时。

6)诱导：取出冷却后的菌液，加入IPTG(异丙基β-D-硫代半乳糖苷，Sigma，货号：I6758)，使其工作浓度为0.1mM。将菌液置于恒温摇床上，16℃，180rpm诱导培养16个小时以上。

7)收集菌体：将诱导后的菌液倒入离心管中，5000rpm，离心10分钟，弃上清，收集菌体。

8)重悬菌体：用Binding Buffer重悬细菌沉淀，4℃，5000rpm，10分钟离心后，加入30mL预冷的Binding Buffer充分悬浮菌体，需要完全重悬，直至无菌块，在冰上静置10分钟。

Binding Buffer配方(500mL)如下：

9)冰水浴超声破碎：25％功率，超声2秒停4秒，持续30分钟，再调整探头位置继续破碎10分钟。

10)收集上清：菌体破碎后，4℃，12000rpm，30分钟离心，收取蛋白上清至新的50mL离心管中。

11)树脂平衡：取出适量Ni-NTA(Qiagen，货号：30210)加入到蛋白纯化柱中，待溶液自然流干后，用预冷的Binding Buffer平衡柱子。

12)挂柱：树脂平衡完成后，在纯化柱中加入破碎离心后的蛋白上清，使蛋白流穿液在重力作用下缓慢流下。

13)洗涤：用预冷的Wash Buffer(在Binding Buffer的基础上添加70mM咪唑后，调节pH至8.0)填充蛋白纯化柱。

14)洗脱：将预冷的洗脱液Elution Buffer(基于Binding Buffer添加500mM咪唑)加入蛋白纯化柱以洗脱目的蛋白。

15)浓缩：将洗脱液加入到预处理过的浓缩管中，放入4℃预冷的离心机中，3000rpm离心，直到蛋白液体积小于1mL，完成浓缩。

16)SDS-PAGE验证：SDS-PAGE验证目的蛋白的表达及纯化结果。

17)蛋白分装：蛋白纯化成功后，测定蛋白浓度，将其分装成小份后放置于-80℃冰箱保存。

获取WDR5-GFP蛋白后，将其稀释到蛋白缓冲液，终浓度为10μM。配制相应的蛋白缓冲液，控制不同的NaCl浓度以及拥挤剂PEG 3350(seebio，货号：167228)或PEG 8000(BioFroxx，货号：1363GR500)。WDR5-GFP与不同的蛋白缓冲液孵育，孵育10分钟后在显微镜下进行观察。观察时，先在载玻片上涂上一圈高真空硅脂(长城7501)，再在其中央滴加蛋白样品，盖上盖玻片，倒置放于100倍油镜镜头上，并利用实验室的共聚焦显微成像系统对样品进行观察。观察结果如图1所示，发明人发现不管是低盐无拥挤剂的情况下，还是高盐有拥挤剂的情况下，WDR5蛋白均能形成规则的圆形液滴。

一般来说，体外重构的相分离蛋白在合适的蛋白浓度、盐浓度下，能够在体外形成规则的圆形液滴，这种相分离液滴还具有流动性。发明人也通过FRAP实验和融合实验证明了WDR5蛋白形成的液滴具有流动性，但在此本申请中并未展示。

然而，对WDR5的N端氨基酸进行突变后，也就是将对结合最重要的第15位的精氨酸突变为丙氨酸后，发现突变后形成的相分离液滴数量和大小都会相应减少，尤其是在添加拥挤剂PEG 8000组中，突变后形成的大多相分离液滴的半径都减少为原来的1/5，数目至少减少了1/2。同样地，在正常的WDR5蛋白中加入未突变的多肽(SEQ ID NO.1)或者突变后的多肽(SEQ ID NO.2)，共同孵育后，如图1B所示，未突变的多肽会竞争性结合WDR5，从而破坏WDR5的相分离；而突变后的多肽则不能与之竞争性结合，因此对WDR5的相分离几乎无影响。说明未突变的多肽片段可以竞争性结合WDR5的WD40结构域，从而破坏促进相分离的弱相互作用，进而破坏WDR5的相分离。

SEQ ID NO.1的多肽很容易溶解于DMSO中，但DMSO会产生毒性作用。多肽的溶解度与整个肽链的氨基酸序列息息相关，通常情况下，少于5个氨基酸的肽一般溶于水溶液，水作为溶剂对细胞来说更加安全，靶向性也更高。因此，考虑到多肽的水溶性和安全性，本发明将上述多肽进行了序列截短，合成了逐渐缩短的多肽，序列分别为SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5。通过比较不同长度的多肽对WDR5相分离能力的影响来选择最合适的多肽。如图2A和2B所示，将10μM不同长度的多肽与相同浓度的WDR5蛋白共同孵育后，在显微镜下观察并拍摄不同多肽处理后的结果。鉴于相分离的大小和数量都有所变化，我们统计了形成的相分离液滴的面积来显示不同效果。结果显示与对照组相比，不同多肽处理后形成的相分离液滴均有所减少。其中对照组中液滴面积平均值为2096μm

实施例2多肽抑制剂对甲基转移酶活性的影响

根据上述的实验结果，发明人选择效果最好的SEQ ID NO.5作为WDR5多肽抑制剂。

WDR5与MLL1的相互作用对MLL1复合体的H3K4甲基转移酶的活性是至关重要的，可以通过Western-blot检测H3K4三甲基化水平来测试其对MLL1蛋白复合物甲基转移酶活性的影响。

本发明选择与MLL1蛋白活性密切相关的人髓性单核细胞白血病细胞MV4-11(中科院上海细胞库，SCSP-5031)。实验中，将MV4-11细胞离心重悬后铺于六孔板中，待第二天细胞密度达到70％-80％时，用0μM、20μM、50μM、100μM的多肽处理细胞，在细胞培养箱继续培养96小时后收取细胞，用Western-blot检测白血病细胞中H3K4三甲基化的表达情况。

Western-blot具体实验步骤如下：

1)细胞样品的准备和处理：收取细胞后，用RIPA裂解液(碧云天，货号：P0013B)裂解10分钟。裂解完成后选用BCA蛋白浓度测定试剂盒(Biosharp，货号：BL521A)对蛋白进行定量，检测并计算出蛋白浓度，根据上样量加适量的蛋白Loading Buffer(Yeasen：货号：20315ES05)，100℃煮样10分钟。

2)蛋白电泳：清洗干净玻璃板，再放入60℃烘箱烘干。配制好分离胶后，灌胶，水封，压平分离胶，等待30分钟后倒去液封的水，将配制好的浓缩胶加入至胶板中，插上10孔或15孔的梳子。等待30分钟后拔掉梳子，加入电泳缓冲液。在上样孔中加入蛋白样品和蛋白marker(天能，货号：180-6003)。80V电压电泳50分钟左右，待蛋白样品进入分离胶时，改用120V电压。当Loading Buffer跑到分离胶底部合适的位置时，停止电泳，准备转膜。

3)转膜：配制好转膜缓冲液，并放入冰箱预冷，同时裁剪好名片大小的PVDF膜。轻轻撬开电泳凝胶板，去除浓缩胶，裁取分离胶，像制作“三明治”一样叠加海绵、滤纸、PVDF膜(Millipore，货号：ISEQ00010)，组装湿转系统，灌满4℃预冷的转膜缓冲液，没过“三明治”，350mA湿转90分钟。

4)免疫反应：配制5％的脱脂奶粉封闭液和1L的TBST(内含500μL的Tween)(TBS：Biosharp，货号：BL602A；Tween20：BioFroxx，货号：1247ML500)，取出PVDF膜，先用TBST润洗一下，加入适量脱脂奶粉，放置在摇床上室温封闭1～2小时。用TBST润洗2～3次，洗去残留在PVDF膜上的脱脂奶粉。用TBST配制5％的BSA(上海生工生物公司，货号：A500023)，根据抗体说明书按比例稀释一抗(WDR5抗体：Abcam，货号：ab22512；H3K4me3抗体：CST，货号：9751；H3抗体：圣克鲁斯，货号：sc-517576；GAPDH抗体：Proteintech，货号：60004-1-Ig)，放置于4℃摇床上过夜孵育。回收一抗，放入-20℃冰箱保存，以供下一次继续使用。TBST洗3次，每次5分钟。用脱脂奶粉(伊利)稀释与一抗相同种属的二抗，加入稀释后的二抗，室温孵育1小时。

5)显影：TBST润洗后，按比例配制好显影液，并用枪头轻轻滴加至PVDF膜上，用UVP凝胶成像系统显影。

如图3所示，实验结果表明，与对照组相比，不同浓度的多肽处理MV4-11细胞后，H3K4三甲基化水平明显下降，相较于0μM处理的组别，20μM、50μM、100μM的多肽处理细胞后，通过灰度分析显示H3K4三甲基化水平分别下降了29％、34％以及51％。H3K4三甲基化水平下降，说明本发明的多肽抑制剂能有效抑制MLL1组蛋白甲基转移酶活性。而单独的MLL融合蛋白是不能导致白血病的，野生型MLL1的甲基转移酶催化活性对MLL1融合蛋白诱发白血病生成是必需的。因此，本抑制剂可以通过抑制MLL1甲基转移酶活性来治疗白血病。

实施例3肿瘤细胞活性实验

胰腺癌是消化道常见的恶性肿瘤之一，术后极易复发且致死率高。早期研究发现铂类化学疗法(如顺铂和奥沙利铂)，但长期使用细胞毒性药物治疗会使得患者的毒性累积，导致患者器官功能障碍(Chevalier et al.,2020；Von Hoff et al.,2013)。此外，胰腺癌患者90％存在KRAS突变，但KRAS无明显结合位点，难以合成靶向药，胰腺癌的治疗仍缺乏很好的靶向药。多篇文章报道了WDR5在胰腺癌中的作用，有人提出WDR5在染色质上对c-Myc的募集对胰腺癌的致瘤机制至关重要(Carugo et al.,2016)。也有文章指出，通过抑制WDR5-H3K4me3表观遗传轴可有效抑制胰腺肿瘤免疫逃逸(Lu et al.,2021)。因此，WDR5可能会成为治疗胰腺癌的潜在位点。

多篇文章中显示WDR5对胰腺癌和白血病的发生发展起着关键作用(Carugo etal.,2016，Lu et al.,2021，Thiel et al.,2010)，因此本发明选取了人转移胰腺腺癌细胞AsPC-1(中科院上海细胞库，TCHu 8)和人原位胰腺腺癌细胞BxPC-3(中科院上海细胞库，TCHu 12)以及人髓性单核细胞白血病细胞MV4-11作为实验对象。将细胞消化重悬或离心重悬后进行计数，取4000个细胞接种于96孔板的100μL培养基(AsPC-1和BxPC-3细胞用RPMI1640培养基培养，MV4-11用Iscove's Modified Dulbecco'sMedium培养基培养)中。待细胞贴壁后用0μM、20μM、50μM、100μM的多肽SEQ ID NO.5进行处理，并设置好空白组，于37℃、5％CO2浓度下培养96小时，每孔加入10μL的CCK8(Biosharp，货号：BS350B)溶液，继续放入细胞培养箱培养1小时，用酶标仪检测在450nm处的吸光值，根据OD值计算细胞活力。CellCounting Kit-8(简称CCK-8)是一种基于WST-8的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂。WST-8，是一种类似于MTT的化合物，它在电子载体(1-Methoxy PMS)存在的情况下，被线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的橙黄色甲瓒产物(formazan)。细胞增殖越多越快，颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅，对于同样的细胞，颜色的深浅与活细胞的数量成正比，因此可利用这一特性直接进行细胞活力分析。

如图4的结果显示，本发明的多肽抑制剂对这三种肿瘤细胞的生长均有抑制效果，在20μM的多肽浓度处理下，AsPC-1、BxPC-3、MV4-11的细胞活力分别下降了21％、17％、40％；在50μM的多肽浓度处理下，AsPC-1、BxPC-3、MV4-11的细胞活力分别下降了44％、69％、48％；在100μM的多肽浓度处理下，AsPC-1、BxPC-3、MV4-11的细胞活力分别下降了73％、82％、65％，说明本发明的多肽抑制剂是有效的。此外，在20μM的浓度下即可抑制肿瘤细胞的活性，说明抑制剂多肽具有潜在的药物研发潜力。

现有技术中WDR5抑制剂的发挥活性的最小浓度及其对肿瘤细胞的抑制效果如下：

WDR5-IN-1，IC50＝2.2nM，在CHP-134(神经母细胞瘤)和Ramos(Burkitt淋巴瘤)细胞系中显示出有效的抗增殖作用；

WDR5-0103，IC50＝450nM，能在体外实验中降低急性髓性白血病细胞的活性；

OICR-9429，IC50＝5μΜ，能在体外实验中降低急性髓性白血病细胞的活性；

DDO-2093，IC50＝8.6nM，选择性抑制MLL复合物的催化活性。

根据WDR5抑制剂的研究现状，大多数抑制剂都是针对MLL1-WDR5之间的相互作用来抑制白血病细胞的活性，分为拟肽类抑制剂和非拟肽类抑制剂。但本发明的多肽抑制剂通过破坏相分离不但能对白血病细胞有所抑制，而且对胰腺癌细胞也有所抑制，因此有很大的医药开发潜力。此外，我们的发现也有助于阐明胰腺癌复杂的病理机制，为胰腺癌治疗提供了一条新的有潜力的方向。

以上实验证明了SEQ ID NO.5能有效抑制与WDR5密切相关的肿瘤细胞的生长，此外，本发明的多肽分子量小易于合成，还具有很好的水溶性，安全性大大提高，因此本发明的多肽抑制剂具有潜在的生物医药开发价值。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

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以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。