一种犁齿鲷鱼鳞抗冻肽及其筛选方法和应用

技术领域

本发明涉及多肽技术领域，尤其涉及一种犁齿鲷鱼鳞抗冻肽及其筛选方法和应用。

背景技术

低温保存是食品和生物医药领域中最广泛应用的贮藏手段。但是，食品不可避免地会在冷冻保存过程中生长和低温运输过程中重结晶。

抗冻蛋白是一类在结冰或亚结冰状态下能保护生物体免受伤害蛋白质，它能非依数性降低溶液冰点、有效抑制冰晶生长和重结晶的发生，抑制冻结所造成的低温损伤。抗冻肽是抗冻蛋白中具有活性的结构域部位，类似于抗冻蛋白具有对生物体的独特冷冻保护能力。抗冻肽是一类小分子蛋白或蛋白质水解物，由于天然源抗冻蛋白含量甚微，通过生物酶解技术，获取特异性多肽链结构域片段，生产成本低且性能稳定。相较于数量有限与价格昂贵的抗冻蛋白，抗冻肽更具有应用前景。

鲷鱼是我国重要的经济鱼类，广泛分布于我国海域。在罐头和鱼制品的生产过程中，会产生大量的碎屑和无用的鳞片。鱼鳞下脚料通常作为废弃物处理，不仅浪费资源，而且污染环境。鲷鱼鳞富含胶原蛋白，可作为活性肽生产来源。利用鲷鱼鳞开发制备抗冻肽，不仅充分利用资源，提高鱼类加工的附加值，而且还符合绿色协调可持续发展的理念，促进鱼类加工业的发展。与传统的哺乳动物源胶原蛋白抗冻肽相比，鱼源胶原蛋白抗冻肽更具安全性。目前，利用犁齿鲷鱼鳞制备抗冻肽的工艺迄今为止尚未见报道。

发明内容

(一)要解决的技术问题

鉴于现有技术的上述缺点、不足，本发明提供一种犁齿鲷鱼鳞抗冻肽，其具有优异的抗冻特性，为新的鱼鳞抗冻肽；

相应地，本发明还提供一种犁齿鲷鱼鳞抗冻肽的筛选方法，其通过与冰晶的分子对接筛选得到特定氨基酸序列的犁齿鲷鱼鳞高活性抗冻肽，方法简单高效便捷，成本低。

相应地，本发明还提供一种犁齿鲷鱼鳞抗冻肽作为抗冻产品的应用。

(二)技术方案

为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：

第一方面，本发明提供一种犁齿鲷鱼鳞抗冻肽，其氨基酸序列为：NAITDVVPAPK。

可选地，犁齿鲷鱼鳞抗冻肽与冰晶形成氢键的位点包括THR4、ASP5、ALA9和LYS11。

可选地，其具有α螺旋结构。

第二方面，本发明还提供上述任一方案中犁齿鲷鱼鳞抗冻肽的筛选方法，其包括以下步骤：

S1犁齿鲷鱼鳞抗冻肽初提物经质谱分析得到的肽序列；

S2肽序列与冰晶棱面通过分子对接软件筛选得到的最优构象肽序列；

S3三维分析下，以形成的氢键数量为指标，从最优构象肽序列筛选得到的抗冻肽序列。

本发明在筛选得到的最优构象肽序列之后，直接通过肽序列与冰晶形成的氢键数量为指标，可筛选得到抗冻肽序列；抗冻肽与冰晶作用的最重要的化学键为氢键，通过氢键数量可直接筛选得到具有抗冻活性的肽序列。本发明还通过肽序列与冰晶的对接总能量(指的是肽跟冰晶对接的作用能；在多肽序列相同的前提下，对接总能量的绝对值越高代表体系相对稳定)辅助筛选。

其中，分子对接软件可以是分子对接软件Hex8.0.0。

其中，三维分析使用三维分析软件，包括PyMOL软件。

可选地，筛选方法还包括以下步骤：在步骤S2前，肽序列通过蛋白质数据库筛选得到的具有胶原蛋白源的肽序列。本发明过滤非胶原蛋白源的肽序列，源于本发明犁齿鲷鱼鳞多肽为胶原蛋白源的多肽，可过滤仪器等残留物为非犁齿鲷鱼鳞多肽对筛选结果的影响。蛋白质数据库优选为Cryoprotect数据库。

可选地，筛选方法还包括以下步骤：在步骤S2前，肽序列通过RPBS结构生物学数据库中PEP-FOLD 3.5多肽结构预测建模程序进行建模，选择模拟次数100，模型排序依据sOPEP；以评分最高的建模结果作为最终结构，筛选得到具有二级结构的肽序列。

可选地，抗冻肽初提物的制备包括以下步骤：犁齿鲷鱼鳞粉加水制成的鱼鳞浆料液，调节pH值至弱碱性，加入胰蛋白酶36～38℃下酶解4～6h，制得的降解物。

可选地，抗冻肽初提物的制备包括以下步骤：犁齿鲷鱼鳞降解物冰亲和吸附制得抗冻肽初提物。通过冰亲和吸附方法可提高所得抗冻肽初提物抗冻肽的纯度。

可选地，筛选方法还包括以下步骤：在步骤S2前，肽序列通过抗冻多肽数据库进行初步筛选得到的肽序列。其中，抗冻多肽数据库优选为Cryoprotect数据库，过滤去除不具有冷冻保护活性的多肽序列；Cryoprotect数据库筛选的准确率虽然仅有88.28％。但是本发明通过步骤S2和S3的组合可以克服Cryoprotect数据库筛选的准确率仅有88.28％的技术问题。

可选地，筛选方法还包括以下步骤：在步骤S2前，肽序列通过多肽毒性数据库筛选得到无毒性、亲水性＞0的肽序列。为了简化后续步骤的筛选，本发明可优先通过ToxinPred数据库筛选亲水性和无毒性的序列。由于抗冻肽在溶液体系下起作用，因此亲水性和无毒性的筛选，可准确的去除难溶或者不溶于水的抗冻活性多肽。

第三方面，本发明还提供上述任一方案中，所述犁齿鲷鱼鳞抗冻肽作为抗冻产品的应用。

本发明利用肽组学和分子对接的方法，简化了分离纯化等繁琐的步骤，节省了昂贵的仪器耗材使用，从犁齿鲷鱼鳞酶解物中高效便捷地筛选出具有特定氨基酸序列的高活性抗冻肽。以食源性下脚料进行抗冻肽的可控酶解制备，降低成本的同时有利于实现抗冻肽的规模化生产和应用，为应用于食品、保健品和低温组织工程提供理论支撑。

(三)有益效果

本发明的有益效果是：

1.本发明提供的犁齿鲷鱼鳞抗冻肽，弥补了犁齿鲷鱼鳞抗冻肽的空白，并且其具有高抗冻活性，可作为抗冻剂等产品的应用。

2.本发明提供的新的抗冻肽的筛选方法，其通过冰晶和多肽的分子对接筛选最优构象，在此基础之上，通过肽序列与冰晶形成的氢键数量为指标，可筛选得到抗冻肽序列，其具有简化了分离纯化等繁琐的步骤，方法简单。

本发明进一步通过相应地数据库筛选无毒性、亲水性＞0的肽序列、具有冷冻保护活性的肽序列、具有二级以上结构的序列、胶原蛋白源的肽序列；提高高活性肽序列的筛选效率和得率。

附图说明

图1为实施例3所得质谱分析总离子流图；

图2为实施例1的抗冻肽的二级质谱图；

图3为实施例1的抗冻肽的二级结构模型图；

图4为实施例3中所述抗冻肽与冰晶的分子对接结构示意图；

图5为实施例4中不同样品对菌体低温保护活性测定的结果；

图6为实施例4中不同样品测定的热滞活性值；

图7为实施例4中不同样品测定的生成的冰晶含量。

具体实施方式

为了更好的解释本发明，以便于理解，下面通过具体实施方式，对本发明作详细描述。

本发明实施例提出的犁齿鲷鱼鳞抗冻肽，其来自于犁齿鲷鱼鳞的降解物，是一种新的具有高抗冻活性的多肽，可以直接用于抗冻剂的添加剂应用于各种产品中。此抗冻肽可与冰晶形成4个位点的氢键，使其抗冻活性极强。

为了更好的理解上述技术方案，下面将更详细地描述本发明的示例性实施例。虽然以下显示了本发明的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更清楚、透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。

实施例1

本实施例提供的犁齿鲷鱼鳞抗冻肽，其氨基酸序列为：NAITDVVPAPK。

本实施例犁齿鲷鱼鳞抗冻肽与冰晶形成氢键的位点包括THR4、ASP5、ALA9、LYS11氨基酸位点，四个位点可同时形成氢键。

本实施例犁齿鲷鱼鳞抗冻肽的亲水性为0，分子量为1123.62Da；具有二级α螺旋结构，与冰晶对接所需总能量为-237.50Kcal/moL。

本实施例犁齿鲷鱼鳞抗冻肽的二级质谱图如图2所示。

本实施例提供的抗冻肽，可以通过固相合成方法合成，也可以从犁齿鲷鱼鳞的降解产物中提取并NAITDVVPAPK的分子量大小等特殊性质设计特殊的纯化步骤纯化。

实施例2

本实施例提供的犁齿鲷鱼鳞抗冻肽初提物的制备方法，其步骤为：

S1酶解液的获取

S11利用粉碎机将犁齿鲷鱼鳞粉碎成絮状，称取15.7g犁齿鲷鱼鳞絮状物，加入1L去离子水，调节pH至8.00，加入0.9247g胰蛋白酶，置于37℃中酶解5.00h，而后置于沸水浴中煮沸10min，10000rpm离心10min，取上清液；

S12重复步骤S11两次，混合两次的上清液获得犁齿鲷鱼鳞酶解液；

S2犁齿鲷鱼鳞酶解物置于冰提装置容器中，容器中间夹层循环着低温恒温槽驱动的无水乙醇，温度设置为-6℃；待酶解液部分结冰后，调整温度为-4℃，使高活性抗冻组分与容器外壁上的冰吸附结合，持续提取5h后，弃去未结冰溶液，用适量去离子水环绕冰四周慢慢清洗，关闭出水开关，关闭制冷系统，待冰融化后收集液体并冷冻干燥，制得抗冻肽初提物。

实施例3

本实施例提供的犁齿鲷鱼鳞抗冻肽的筛选方法，其步骤为：

S1将实施例2所得抗冻肽初提物利用纳升液相色谱-四极杆轨道阱质谱仪鉴定所含多肽的氨基酸序列，并且分别获得如图1所示的质谱分析总离子流图和如图2所示的实施例1的抗冻肽肽序列二级质谱图；

S2无毒、亲水性>0的多肽序列的筛选：将所得的所有多肽的氨基酸序列输入ToxinPred数据库，剔除非水溶性和有毒性的多肽序列；

S3具有冷冻保护活性多肽序列的筛选：将所得无毒、亲水性>0的多肽序列输入Cryoprotect数据库，筛选得到具有冷冻保护活性的多肽序列；

S4具有二级以上结构多肽序列的筛选：使用RPBS结构生物学数据库中PEP-FOLD3.5多肽结构预测建模程序对筛选得到具有冷冻保护活性的肽序列进行建模，选择模拟次数100，模型排序依据sOPEP。以评分最高的建模结果作为最终结构，选择具有二级结构的多肽序列；

S5胶原蛋白源多肽序列的筛选：将二级以上结构多肽序列输入Uniprot数据库对多肽来源进行分析，筛选得到胶原蛋白源的多肽序列；

S6使用分子对接软件Hex8.0.0对冰晶棱面与胶原蛋白源多肽序列抗进行分子对接，得到最优构象和Etotal的多肽序列；

S7以冰晶棱面和多肽序列形成的氢键数量为指标，通过PyMOL软件从最优构象肽序列筛选得到的抗冻肽序列。

本实施例的筛选方法，依次通过相应地数据库筛选无毒性、亲水性＞0的肽序列、具有冷冻保护活性的肽序列、具有二级以上结构的序列、胶原蛋白源的肽序列，提高高活性肽序列的筛选效率和得率。通过此筛选方法，筛选得到10条以上，热滞活性值在0.2以上的抗冻多肽序列，由此，本实施例的筛选方法准确率高，效率高的优点。

本实施例将筛选得到的抗冻肽序列合成相应的多肽；通过测定其热滞活性，从中筛选热滞活性高、冰晶生成量低、菌体保护存活率高、相同长度肽序列中与冰晶接总能量最高进行综合筛选得多的抗冻肽序列。

实施例1的犁齿鲷鱼鳞抗冻肽的亲水性为0，分子量为1123.62Da；具有二级α螺旋结构，与冰晶对接所需总能量为-237.50Kcal/moL，其由11个氨基酸残基形成，并且可以形成四个氢键，热滞活性在0.2～1.3之间，其对菌体的低温保护活性为86.17％，可知其具有很强的抗冻活性，稳定性强。

图1的质谱分析总离子流图为：被分离组分经离子源电离后的所有离子产生的离子流信号，经放大后与组分的流出时间所作的色谱图。

图2的质谱分析二级质谱图：选择母离子肽段，将其进一步解离，分析所形成的子离子的质荷比和强度，是对本条肽在本次质谱实验中被分离出来的一个证明。

图3为实施例1犁齿鲷鱼鳞抗冻肽的建模可视化二级结构图。

图4为步骤S7中实施例1犁齿鲷鱼鳞抗冻肽与冰晶的分子对接示意图实施例1多肽具有α-螺旋的二级结构(红色)，NK11与冰晶形成4条氢键(黄色)，相应的对接位点氨基酸分别是THR4、ASP5、ALA9、LYS11。

实施例4

本实施例提供实施例1所得犁齿鲷鱼鳞抗冻肽对菌体低温保护活性的测定方法，并且以实施例2的酶解液(记为：EjAFPs)和抗冻肽初提物作为对照(记为：I-EjAFPs)，试验时，分别配成蛋白浓度相同的溶液作为样品。

具体方法为：

取50μL二次活化的嗜热链球菌接种到4mL的M17液体培养基中，培养4h(37℃，180rpm)，5000rpm离心10min，收集菌泥，用生理盐水洗涤两次后重悬于等体积的生理盐水中，获得嗜热链球菌菌液。

取540μL样品与60μL菌液混匀，生理盐水替换样品做空白组。吸取50μL混合液到4mL的M17培养液中，培养7h，检测600nm处的吸光值A

式中：A

本实施例得到如图5所示的数据：

图中表示不同抗冻剂对嗜热链球菌冷胁迫保护能力，空白组为生理盐水组，图中可以看出，酶解液EjAFPs相比空白组，对嗜热链球菌冷冻保护率已有显著提高，抗冻肽初提物I-EjAFPs,与筛选后的纯肽的冷冻保护率分别相比前一步骤有提高。说明实施例1所制得抗冻肽具有显著更强的抗冻活性。

通过一步步的筛选，得到了高抗冻活性的纯肽序列，可以用于将来的菌冷冻保护。

实施例5

本实施例提供实施例1所得犁齿鲷鱼鳞抗冻肽(以NK11来表示)对冰晶含量抑制效果，并且以实施例2的酶解液(记为：EjAFPs)和抗冻肽初提物作为对照(记为：I-EjAFPs)，试验时，分别配成蛋白浓度相同的溶液作为样品。

具体的抑制效果、热滞活性的测定方法如下：

取5μL 15mg/mL样品到铝样品盘，参比组为空白铝样品盘，将二者同时置入差示扫描量热仪中，以-2℃/min速率降温至-30℃，平衡5min，再以2℃/min速率升温至保留温度(-1.0℃、-0.5℃、-0.3℃、0℃)，使样品处于部分熔融状态，平衡5min。根据DSC热流曲线分析样品的抗冻活性。冰晶含量(Φ)和THA分别按照公式(2)和(3)计算。

THA＝ T

式中：Φ为样品中的冰晶含量，△H

本实施例的热滞活性测定结果如图6所示；当抗冻多肽吸附于冰水界面时，造成冰晶生长轨迹发生改变，导致冰水界面蒸汽压升高使得溶液冰点与熔点之间形成差值，而热滞活性的高低可以通过这个温度差值体现。

图6中，空白组为牛血清蛋白组(无抗冻活性的蛋白)，图中可以看出，实施例1的纯肽NK11的热滞活性相比对照组有大幅度提高。

本实施例测定的不同样品对应的冰晶含量如图7所示：

空白组为牛血清蛋白组(无抗冻活性的蛋白)，图中可以看出，筛纯肽NK11的体系冰晶含量的控制相比对照组有大幅度提高，可以显著降低体系中的冰晶含量，从而发挥抗冻效果。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。