QRSL1基因作为急性B淋巴细胞白血病标志物的应用

技术领域

本发明属于生物医学领域，具体涉及QRSL1基因作为急性B淋巴细胞白血病标志物的应用。

背景技术

儿童急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)是由前B细胞异常增殖引起的血液恶性肿瘤。尽管根据确定的危险因素进行多药化疗，儿童B-ALL的5年生存率有极大提升，但由于人口基数大，发病率高，该病严重危险儿童的身心健康和生命安全。B细胞发育相关基因的损伤可导致B-ALL的发生和预后不良，在40％的B-ALL中，编码B淋巴细胞发育和分化主要调节因子的基因发生了改变。因此，识别与B细胞发育相关的新分子标记物有助于研究B-ALL的发病机制，并对临床预后具有潜在的重要意义。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种急性B淋巴细胞白血病诊断、预后生物标志物QRSL1。

本发明还提出一种上述生物标志物或引物组的应用。

本发明还提出一种定量检测上述生物标志物的产品的应用。

本发明还提出一种含有上述定量包含上述定量检测标志物的产品。

本发明还提出一种筛选治疗急性B淋巴细胞白血病药物的方法。

本发明还提出一种抑制QRSL1表达的物质在制备治疗或辅助治疗急性B淋巴细胞白血病中的应用。

本发明还提出上述生物标志物在制备控制神经系统发育和细胞发育的药物中的应用。

根据本发明的一个方面，提出了一种急性B淋巴细胞白血病诊断、预后的生物标志物，所述生物标志物为QRSL1，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

在本发明的一些实施方式中，编码上述氨基酸序列的核苷酸序列的NCBI序列号如NC_000006.12所示。

在本发明的一些实施方式中，所述急性B淋巴细胞白血病为儿童急性B淋巴细胞白血病。

根据本发明的第二方面，提出了上述生物标志物在(1)或(2)中的应用：

(1)制备检测或辅助检测急性B淋巴细胞白血病预后的产品；

(2)制备检测或辅助检测急性B淋巴细胞白血病的产品。

在本发明的一些实施方式中，所述应用还可以为制备预测或辅助预测急性B淋巴细胞白血病患者接受治疗后的生存时间的产品中的应用。

根据本发明的第三方面，提供定量检测上述标志物的产品在(I)～(III)中的任意一种中的应用：

(I)制备检测或辅助检测急性B淋巴细胞白血病预后产品；

(II)制备预测或辅助预测急性B淋巴细胞白血病患者接受治疗后的生存时间产品；

(III)制备检测或辅助检测急性B淋巴细胞白血病产品。

在本发明的一些实施方式中，所述产品在基因水平或蛋白水平上定量检测QRSL1。

在本发明的一些实施方式中，所述产品为在基因水平或蛋白水平上定量检测QRSL1的试剂和/或仪器。

在本发明的一些实施方式中，所述定量检测QRSL1基因表达水平的产品包括通过测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术或免疫测定的方法检测标志物基因表达水平的试剂和/或仪器。

在本发明的一些实施方式中，所述定量检测QRSL1基因表达水平的试剂包括引物、探针、基因芯片。

在本发明的一些实施方式中，所述引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的正向引物序列和核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的反向引物序列。

在本发明的一些实施方式中，所述预后为接受化疗治疗的预后。

根据本发明的第四方面，提供一种试剂盒，包含本发明第三方面所述的定量检测上述生物标志物的产品。

在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒在基因水平或蛋白水平上定量检测QRSL1。

在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒为在基因水平或蛋白水平上定量检测QRSL1的试剂和/或仪器。

根据本发明的第五方面，提供一种筛选治疗急性B淋巴细胞白血病药物的方法，通过检测给药前后急性B淋巴细胞白血病患者QRSL1的表达量。

根据本发明的第六方面，提供抑制QRSL1表达的物质在制备治疗或辅助治疗急性B淋巴细胞白血病中的应用。

根据本发明的第七方面，提出了上述生物标志物在制备控制神经系统发育和细胞发育的药物中的应用。

本发明的有益效果是：本发明鉴定出一种新的急性B淋巴细胞白血病生物标志物QRSL1，QRSL1的表达水平可作为预测急性B淋巴细胞白血病预后效果的独立因子。而且还发现相对于正常人群，急性B淋巴细胞白血病患者中QRSL1的表达量显著升高，说明QRSL1可用于急性B淋巴细胞白血病的诊断或辅助诊断。本发明为急性B淋巴细胞白血病的诊断和治疗提供了新的思路，本发明鉴定出的QRSL1基因可作为未来用于预测急性B淋巴细胞白血病病人诊断、预后效果的有效指标。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：

图1为本发明实施例1中的QRSL1在不同细胞中的表达结果图；

图2为本发明实施例1中的QRSL1在不同造血细胞中的表达结果图。

图3为本发明实施例1中的B细胞系发育过程中QRSL1的表达分析结果图；

图4为本发明实施例1中的，在B细胞持续分化过程中QRSL1的表达分析结果图；

图5为本发明实施例1中的胎儿骨髓的RNA测序结果图；

图6为本发明实施例1中的QRSL1在不同癌细胞系中的表达结果图；

图7为本发明实施例1中的在HEMAP数据库中，QRSL1表达的表达结果图；

图8为本发明实施例1中的在HEMAP数据库中，QRSL1表达的表达结果图；

图9为本发明实施例1中的在两个微阵列数据(GSE13164和GSE13159)和两个单细胞序列(GSE130116和GSE132509)中B-ALL患者和正常人的QRSL1的表达结果图，其中，A为微阵列数据GSE13164中B-ALL患者和正常人的QRSL1的表达结果图，B为微阵列数据GSE13159中B-ALL患者和正常人的QRSL1的表达结果图，C单细胞序列GSE130116中B-ALL患者和正常人的QRSL1的表达结果图，D单细胞序列GSE132509中B-ALL患者和正常人的QRSL1的表达结果图，“****”为P＜0.001，“*”为P＜0.05；

图10为本发明实施例1中的28例B-ALL患儿和健康对照组外周血单个核细胞(PBMC)中QRSL1的表达结果图；

图11为本发明实施例1中的ELISA检测QRSL1表达的结果图，其中，“****”为P＜0.001；

图12为本发明实施例1中的WesternBlot检测B-ALL患者和健康对照外周血(Normal)PBMC中的QRSL1表达结果图；

图13为本发明实施例1中的WesternBlot检测B-ALL患者和健康对照外周血(Normal)PBMC中的QRSL1表达结果图，其中，“*”为P＜0.05；

图14为本发明实施例2中的地理数据集(GSE28497和GSE79533)中，不同儿童B-ALL亚型的QRSL1表达结果图，其中，A为GSE28497地理数据集中不同儿童B-ALL亚型(TCF3-PBX1、Hypo、Mll、ETV6_RUNX1、Ph、Hyperdiploid)的QRSL1表达结果图；B为GSE79533地理数据集中不同儿童B-ALL亚型(TCF3-PBX1、BCR-ANL1、Mll-AF4、ETV6_RUNX1、Hyperdiploid、ZNF384)的QRSL1表达结果图；C为QRSL1的表达增加与TCF3-PBX1阳性分子亚型相关的验证结果图；D为ROC曲线结果图；

图15为本发明实施例3中的QRSL1与B-ALL患者预后相关的结果图；

图16为本发明实施例3中的QRSL1与B-ALL患者预后相关的结果图；

图17为本发明实施例3中的OS单变量森林图；

图18为本发明实施例3中的EFS单变量森林图；

图19为本发明实施例3中的OS多变量森林图；

图20为本发明实施例3中的EFS多变量森林图；

图21为本发明实施例3中的QRSL1低组和QRSL1高组的转录组的表达式火山图；

图22为本发明实施例3中的QRSL1在B-ALL患者神经系统发育和细胞发育的负调控的作用结果图；

图23为本发明实施例3中的与QRSL1相互作用的串联基因图；

图24为本发明实施例3中的GPR183的表达与QRSL1的表达分析图；

图25为本发明实施例3中的QRSL1的高水平表达与存活率的相关结果图。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。

实施例1 QRSL1的鉴定与数据分析

1、QRSL1在不同细胞中的表达差异的分析

本实施例基于HPA数据库(The Human Protein Atlas)分析了QRSL1(QRSL1基因的核苷酸序列如NCBI序列号：NC_000006.12所示)在B细胞、子宫内膜纤毛细胞、少突胶质细胞、精母细胞、心肌细胞、绒毛外滋养层、少突胶质细胞前体细胞、细胞滋养细胞、膜细胞、星形胶质细胞等细胞中的表达的差异，QRSL1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

MLGRSLREVSAALKQGQITPTELCQKCLSLIKKTKFLNAYITVSEEVALKQAEESEKRYKNGQSLGDLDGIPIAVKDNFSTSGIETTCASNMLKGYIPPYNATVVQKLLDQGALLMGKTNLDEFAMGSGSTDGVFGPVKNPWSYSKQYREKRKQNPHSENEDSDWLITGGSSGGSAAAVSAFTCYAALGSDTGGSTRNPAAHCGLVGFKPSYGLVSRHGLIPLVNSMDVPGILTRCVDDAAIVLGALAGPDPRDSTTVHEPINKPFMLPSLADVSKLCIGIPKEYLVPELSSEVQSLWSKAADLFESEGAKVIEVSLPHTSYSIVCYHVLCTSEVASNMARFDGLQYGHRCDIDVSTEAMYAATRREGFNDVVRGRILSGNFFLLKENYENYFVKAQKVRRLIANDFVNAFNSGVDVLLTPTTLSEAVPYLEFIKEDNRTRSAQDDIFTQAVNMAGLPAVSIPVALSNQGLPIGLQFIGRAFCDQQLLTVAKWFEKQVQFPVIQLQELMDDCSAVLENEKLASVSLKQ(SEQ ID NO:1)。

结果如图1所示，从图中可以看出，与其他细胞相比，QRSL1在B细胞中的表达最高。

2、QRSL1在造血过程的表达分析

为了进一步阐明QRSL1表达在造血过程中的意义，本实施例使用HemaExplorer数据库和DMAP数据库分析造血细胞中QRSL1 mRNA水平的变化。

结果如图2所示，从图中可以看出，在所有造血细胞中，QRSL1在B细胞中的表达最高。

3、B细胞系发育过程中QRSL1的表达分析

本实施例使用GEO数据库分析B细胞系发育过程中QRSL1的表达的变化，根据文献数据(Decoding human fetal liver haematopoiesis)对受孕后7-17周的人胎肝细胞进行的单细胞转录组学研究推断出B细胞的发育轨迹，以及对胎儿骨髓的RNA测序分析造血干细胞(HSC)发展为B细胞的过程中，QRSL1的表达的变化。

结果如图3-5所示，从图3中可以看出，DAMP数据库中，B细胞系发育过程中QRSL1的表达通常高于其他细胞系，如自然杀伤细胞(NK)、T细胞和树突状细胞(DC)；从图4中可以看出，对受孕后7-17周的人胎肝细胞进行的单细胞转录组学研究推断出B细胞的发育轨迹，在B细胞持续分化过程中，“pro-B”簇上QRSL1的表达开始显著增加；从图5中可以看出，胎儿骨髓的RNA测序表明，QRSL1的表达在从造血干细胞(HSC)发展为B细胞的过程中持续增加，但从HSC发展为多能祖细胞(MPP)的过程除外，结果表明，QRSL1在B细胞中的表达最高，这表明它可能参与了B细胞的发育。

4、QRSL1在不同癌细胞系的表达差异分析

本实施例基于CELL细胞数据库分析了QRSL1在B淋巴细胞白血病、白血病、Burkitt淋巴瘤、弥漫大B细胞淋巴瘤、其他B细胞淋巴瘤、慢性髓细胞白血病、急性髓细胞白血病、脑膜瘤、胃癌等癌细胞系中的表达；利用造血肿瘤数据的在线资源HEMAP数据库分析了QRSL1在前B急性淋巴细胞白血病(前B-ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性髓细胞白血病、急性髓细胞白血病等癌细胞系的表达差异。

结果如图6-8所示，从图6中可以看出，在细胞数据库中，与包括B细胞相关肿瘤在内的其他癌细胞系相比，QRSL1在B-ALL(B淋巴细胞白血病)中的表达最高；从图7和图8中可以看出，在造血肿瘤数据的在线资源HEMAP数据库中，QRSL1主要表达于前B急性淋巴细胞白血病(前B-ALL)和慢性淋巴细胞白血病(CLL)。

5、QRSL1在癌细胞系和正常细胞系中的表达差异分析

本实施从GEO数据库中检索了两个微阵列数据(GSE13164和GSE13159)和两个单细胞序列(GSE130116和GSE132509)，评估了B-ALL患者和正常人中QRSL1的表达差异。

结果如图9所示，从图9中可以看出，四个地理数据集显示，B-All中QRSL1的表达高于正常人。

6、QRSL1在B-ALL患者中的表达分析

通过检测28例B-ALL患儿和健康对照组外周血单个核细胞(PBMC)中QRSL1的表达，具体步骤如下：用TRIzol试剂从儿童B-ALL患者(来自西安市儿童医院血液肿瘤科)或健康对照(来自西安市儿童医院)的外周血单个核细胞(PBMC)中提取总RNA。使用Revert AidFirst Strand cDNA合成试剂盒(购自英潍捷基)合成cDNA。使用SYBR试剂对cDNA样本进行定量PCR分析。用于QRSL1表达的引物如下：正向引物(5’-3’)：GATGTGCAGGATCTTAACCA(SEQID NO:2)；反向引物(5’-3’)：GCCAAACTGGGAAGCATGAATG(SEQ ID NO:3)。QRSL1的表达标准化为内部对照(GAPDH)。

检测结果如图10所示，从图中可以看出，B-ALL患儿和健康对照组外周血单个核细胞(PBMC)中QRSL1的表达结果与GEO数据库分析相似，QRSL1在B-ALL患者的PBMC中高度表达，与健康对照组的表达水平之间的差异具有统计学意义。

7、QRSL1在B-ALL患者和正常患者中的表达分析

(1)通过ELISA检测西安市儿童医院22名B-ALL患者和14名健康对照外周血血浆的QRSL1表达，检测结果如图11所示，从图中可以看出，B-ALL患者表达高于正常对照。

(2)通过Western Blot检测西安市儿童医院4名B-ALL患者和4名健康对照外周血PBMC中的QRSL1表达，以β-actin作为内参基因，检测结果如图12-13所示，从图中可以看出，发现B-ALL患者表达高于正常对照。

实施例2 QRSL1高表达组和QRSL1低表达组的差异比较

本实施例研究了134例RNA-seq患者(B-ALL患者)(来自TARGET)队列的临床数据，以分析QRSL1低表达组和高表达组之间某些临床特征的差异。

此外，也从GEO数据库中检索了两个微阵列数据(GSE13164和GSE13159)和两个单细胞序列(GSE28497和GSE79533)，评估了B-ALL患者和正常人中QRSL1的表达差异。

计算上述134例B-ALL患者的QRSL1的表达量(连续数值)与TCF3-PBX1状态(阳性或阴性)的相关性，采用Graphad的简单逻辑回归计算，得到ROC曲线，并求得ROC曲线下面积。

表1

其中，“*”为p＜0.05，“**”为p＜0.01。

根据134例B-ALL患者的QRSL1的表达量的平均值，将其分成QRSL1低表达组和高表达组，QRSL1低表达组和高表达组之间某些临床特征的差异的比较结果如表1所示，从表1中可以看出，QRSL1低组和QRSL1高组在年龄、性别和白细胞方面无显著差异(p>0.05)。对于复发部位，QRSL1过度表达与骨髓复发部位尤其相关(p＝0.0335)。在分子亚型中，QRSL1的高表达仅与TCF3-PBX1状态相关。

两个GEO数据集(GSE28497和GSE79533)的比较结果如图14所示，从图中可以看出，在儿童B-ALL亚型中，QRSL1在TCF3-PBX1中高度表达；通过绘制ROC曲线，说明QRSL1的表达量与TCF3-PBX1阳性的相关性，利用ROC曲线验证所构建的ROC模型的准确性和特异性，求得ROC曲线下面积为0.8325，证明该模型在预测QRSL1的表达量与TCF3-PBX1阳性的相关性之间存在较好的准确性和特异性，表明，QRSL1的表达增加与TCF3-PBX1阳性分子亚型相关。

实施例3 QRSL1表达与B-ALL患者的预后的相关分析

本实施例研究了QRSL1表达是否与B-ALL患者的预后相关。

1、QRSL1表达与B-ALL患者的预后的相关数据分析

通过TARGET数据库评估QRSL1表达对总生存率(OS)和无事件生存率(EFS)的影响，具体方法为将B-ALL患者分为QRSL1高表达和低表达组，然后通过Log-rank,and Gehan–Breslow–Wilcoxon test计算其对预后的差异。

结果如图15-16所示，B-ALL患者的QRSL1低表达与更好的预后相关(OS p<0.0001；EFS p＝0.0002)。

2、QRSL1表达的预后价值分析

为了评估QRSL1表达在存在其他临床和分子因素的情况下的预后价值，从TARGET数据库中收集B-ALL患者的临床预后指标，包括患者性别(男性vs.女性)、患者年龄(＞3vs≤3岁)、白细胞计数(＞50vs≤50×10

单变量和多变量Cox回归分析中的OS和EFS森林图如图17-20所示，从图中可以看出，QRSL1有效量的置信区间位于无效线的右侧，表明QRSL1高表达是一个不利因素。单因素Cox回归分析表明，骨髓复发对OS和EFS有不良影响(均p<0.001)，TCF3-PBX1阳性导致OS和EFS较差(均p<0.01)；多因素Cox回归分析显示，即使存在其他协变量，骨髓复发和TCF3-PBX1阳性也是OS和EFS的独立危险因素(均p<0.01)。

3、QRSL1在B-ALL中的应用

基于TARGET数据库比较B-ALL患儿的外周血单个核细胞全基因转录组中QRSL1表达低组和QRSL1表达高组；再通过Metascape中的工具研究QRSL1在B-ALL患者中可能的生物学功能。

结果如图21-25所示，从图21中可以看出，有265个上调基因和784个下调基因与QRSL1表达相关(调整p≤0.01，|log2FC|≥1.5)；从图22中可以看出，通过Metascape中的工具研究QRSL1在B-ALL患者中可能的生物学功能的结果表明，神经系统发育和细胞发育的负调控与QRSL1有关；从图23中可以看出，本实施例还分析了与QRSL1相互作用的串联基因，并通过Cytoscape生成了图，最重要的模块包含11个基因，在hub基因中，GPR183参与B细胞增殖、激活和成熟B细胞分化，参与免疫反应；从图24-25中可以看出，在TARGET数据库中，对于B-ALL患者而言，GPR183的表达与QRSL1呈负相关，QRSL1的高水平表达与良好的OS相关。

综上所述，本发明方案的QRSL1可以有效作为急性B淋巴细胞白血病诊断、预后生物标志物，为急性B淋巴细胞白血病的诊断和治疗提供了新的思路，本发明鉴定出的QRSL1基因可作为未来用于预测急性B淋巴细胞白血病病人诊断、预后效果的有效指标。

QRSL1是线粒体中谷氨酰胺氨基转移酶的亚单位，与GATB、GATC共同组成异三聚体酶复合物。当QRSL1突变时，会通过影响该关键酶复合物的功能，干扰线粒体氧化磷酸化过程。QRSL1缺陷通常会导致小儿线粒体心肌缺陷病，主要是因为心脏是人体耗氧量最多的器官之一。QRSL1的表达还被证实与人类多种肿瘤的预后相关，同时，它也被认为是一种免疫细胞相关基因或免疫细胞的基因标记物。

上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。