表达昆虫dsRNA的抗虫转基因玉米

技术领域

本发明属于生物技术和农业应用领域，具体地，本发明涉及表达昆虫dsRNA的抗虫转基因玉米。

背景技术

亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)属于鳞翅目螟蛾科秆野螟属，是危害玉米的头号大害虫。该虫主要分析在亚洲，我国除青藏高原外均有报道。除了危害玉米外，还能为害棉花、谷子、高粱、大麻、小麦等多种植物。其为害特点是：在玉米心叶期，亚洲玉米螟的幼虫可以取食叶肉或蛀食未展开的心叶，形成串状的“空洞”。在玉米抽穗后，幼虫就钻蛀到玉米的茎秆中危害，可导致雌穗发育受阻而减产，蛀孔处非常容易倒折。在玉米的穗期，幼虫可蛀食雌穗、嫩粒，造成籽粒缺损霉烂，品质下降，一般年份导致玉米减产10％～30％，大发生年份可减产50％以上。

由于亚洲玉米螟属于钻蛀危害性的害虫，给防治带来了很多困难。而且长期期施用化学农药，不仅破坏生态环境，而且还导致亚洲玉米螟抗药性增加，天敌数量减少，防治越来越困难。急需开发出新的、更加方便有效的防治技术。

发明内容

本发明的目的在于提供新的、更加方便有效的防治技术。

在本发明的第一方面，提供了一种dsRNA构建物，所述dsRNA的构建物为双链，并且其正链或负链含有式I所示的结构：

Seq

式中，

Seq

Seq

X为位于Seq

在另一优选例中，丝氨酸蛋白酶抑制剂基因OfSer来自秆野螟属。

在另一优选例中，所述dsRNA的长度为至少100nt，优选100-250nt。

在另一优选例中，与所述dsRNA的同源性至少为70％，较佳地，为85％-100％。

在另一优选例中，Seq

在另一优选例中，所述dsRNA构建物可形成式II所示的dsRNA，

式中，

Seq’

Seq’

X’为无；或为位于Seq’

||表示在Seq

在另一优选例中，所述dsRNA为不带loop的dsRNA。

在另一优选例中，所述dsRNA由SEQ ID NO.:1所示的序列扩增而得。

本发明第二方面提供了一种式II所示的dsRNA，

式中，

Seq’

Seq’

X’为无；或为位于Seq’

||表示在Seq

在另一优选例中，Seq

在另一优选例中，所述的间隔序列X’的长度为0-300bp。

在另一优选例中，丝氨酸蛋白酶抑制剂基因OfSer来自秆野螟属(Ostrinia)。

在另一优选例中，所述丝氨酸蛋白酶抑制剂基因OfSer的序列如SEQ ID NO.:1所示。

在另一优选例中，所述dsRNA的序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明第三方面提供了一种表达载体，所述表达载体含有本发明第一方面中所述的dsRNA构建物。

在另一优选例中，所述的载体为植物表达载体，优选植物双元表达载体。

本发明第四方面提供了一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码本发明第一方面所述的dsRNA构建物或本发明第二方面所述的dsRNA。

本发明第五方面提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞中含有本发明第三方面中所述的表达载体或本发明第四方面所述的多核苷酸或者染色体中整合有对应于本发明第一方面中所述的dsRNA构建物的DNA序列。

在另一优选例中，所述的宿主细胞为植物细胞。

在另一优选例中，所述植物包括禾本科植物。

在另一优选例中，所述植物包括玉米、高粱、谷子、甘蔗、水稻。

在另一优选例中，所述的宿主细胞是用选自下组的方法将本发明第一方面所述的构建物或本发明第三方面所述的表达载体或本发明第四方面所述的多核苷酸导入细胞的：农杆菌转化法、基因枪法、显微注射法、电击法、超声波法和聚乙二醇(PEG)介导法。

本发明第六方面提供了一种组合物，所述组合物包括本发明第一方面中所述的dsRNA构建物和/或本发明第二方面中所述的dsRNA，以及昆虫喂食上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的昆虫喂食上可接受的载体包括水。

在另一优选例中，所述的组合物是用于诱导或导致玉米螟属幼虫期死亡的组合物。

在另一优选例中，所述的dsRNA具有以下序列：

dsRNA：具有对应于SEQ ID NO.:1所示的序列。

在另一优选例中，丝氨酸蛋白酶抑制剂基因OfSer来自昆虫，较佳地来自鳞翅目昆虫，最佳地来自秆野螟属。

在另一优选例中，所述的药物组合物中，dsRNA含量为1-500ng/μl，较佳地为5-300ng/μl，更佳地，100-250ng/μl。

本发明第七方面提供了本发明第一方面所述的dsRNA构建物，或本发明第二方面所述的dsRNA，或本发明第三方面所述的表达载体，或本发明第四方面所述的多核苷酸或本发明第五方面所述的宿主细胞、或本发明第六方面所述组合物的用途，所述用途选自下组：

(1)提高秆野螟属(比如，亚洲玉米螟)的防治效果；和/或

(2)提高植物对秆野螟属(比如，亚洲玉米螟)的抗性；

(3)降低丝氨酸蛋白酶抑制剂基因OfSer的表达量；和/或

(4)减少植物受害率；和/或

(4)降低作物受害程度，提高农作物产品质量；和/或

(5)减少化学农药的用量，降低化学农药对食品和环境造成的污染。

本发明第八方面提供了一种杀灭昆虫的方法，包括步骤：

用干扰丝氨酸蛋白酶抑制剂基因OfSer或其片段表达的干扰分子，或含所述干扰分子的载体、细胞、植物组织或昆虫防治试剂饲喂或喷洒昆虫。

在另一优选例中，所述杀灭昆虫包括：

(1)提高秆野螟属(比如，亚洲玉米螟)的防治效果；和/或

(2)提高植物对秆野螟属(比如，亚洲玉米螟)的抗性；

(3)降低丝氨酸蛋白酶抑制剂基因OfSer的表达量；和/或

(4)减少植物受害率；和/或

(4)降低作物受害程度，提高农作物产品质量；和/或

(5)减少化学农药的用量，降低化学农药对食品和环境造成的污染。

在另一优选例中，所述的干扰分子选自：以丝氨酸蛋白酶抑制剂基因OfSer或其片段或其转录本为抑制或沉默靶标的dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA。

在另一优选例中，所述的丝氨酸蛋白酶抑制剂基因OfSer来源于秆野螟属。

在另一优选例中，所述昆虫为植食性昆虫，较佳地为鳞翅目昆虫，最佳地来自秆野螟属。

在另一优选例中，所述方法包括步骤：用本发明第一方面所述的dsRNA构建物，或本发明第二方面所述的dsRNA、或本发明第四方面所述的多核苷酸或本发明第五方面所述的宿主细胞、或本发明第六方面所述组合物饲喂或喷洒昆虫。

在另一优选例中，所述方法包括步骤：用含有本发明第一方面所述的dsRNA构建物，或本发明第二方面所述的dsRNA、或本发明第三方面所述的表达载体或本发明第四方面所述的多核苷酸的植物饲喂昆虫。

本发明第九方面提供了一种制备本发明第二方面所述dsRNA的方法，包括步骤：

(i)制备表达dsRNA的构建物，所述构建物为双链，并且其正链或负链含有式I所示的结构：

Seq

式中，

Seq

Seq

X为位于Seq

(ii)将步骤(i)所述的构建物转入宿主细胞，从而在宿主细胞中表达形成式II所示的dsRNA，

式中，

Seq’

Seq’

X’为无；或为位于Seq’

||表示在Seq

本发明第十方面提供了一种制备昆虫防治试剂的方法，包括步骤：将本发明第一方面所述的dsRNA构建物，或本发明第二方面所述的dsRNA或本发明第五方面所述的宿主细胞或本发明第六方面所述的组合物喷洒于植物表面，从而制得昆虫防治试剂。

在另一优选例中，所述植物选自下组：玉米、高粱、谷子、甘蔗、水稻、或其组合。

本发明第十一方面提供了一种提高植物对昆虫抗性的方法，包括：

在植物中表达重组DNA构建体，其中所述重组DNA构建体包含编码RNA的DNA，所述RNA具有与所述靶基因的至少21个或更多个连续核苷酸基本上相同或基本互补的序列，其中所述靶基因为丝氨酸蛋白酶抑制剂基因OfSer。

在另一优选例中，所述靶基因选自下组：

(i)序列如SEQ ID NO.:1所示的多核苷酸；

(ii)核苷酸序列与SEQ ID NO.:1所示序列的同源性≥80％，较佳地，85％-90％，更佳地，为95％、96％、97％、98％、99％或100％)的多核苷酸；

(iii)在SEQ ID NO.:1所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短或添加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸的多核苷酸；

(iv)与(i)-(iii)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

在另一优选例中，所述靶基因如SEQ ID NO.:1所示。

在另一优选例中，与所述RNA的同源性至少为70％，较佳地，为85％-100％，更佳地，95-100％。

在另一优选例中，所述RNA具有与所述靶基因的21-303，较佳地，100-250个连续核苷酸基本上相同或基本互补的序列。

在另一优选例中，所述RNA是包含至少一条RNA链的dsRNA。

在另一优选例中，所述RNA链包括与选自SEQ ID NO.:2中所示的序列具有至少90％，较佳地，95-100％同源性的序列。

在另一优选例中，所述重组DNA构建体包含启动子，较佳地，异源启动子。

在另一优选例中，所述启动子选自下组：组成型启动子、空间特异性启动子、时间特异性启动子、发育特异性启动子、诱导型启动子、或其组合。

在另一优选例中，所述启动子是在植物中有功能的启动子。

在另一优选例中，所述启动子包括35S启动子。

在另一优选例中，所述重组DNA构建体还包括选自下组的一种或多种其他元件：增强子、小RNA识别位点、适体或核酶、终止子、用于表达编码序列的额外和另外的表达盒(例如，表达转基因，例如杀虫蛋白或可选择的标记物)、非编码序列(例如，表达另外的抑制元件)、或其组合。

在另一优选例中，所述植物中还表达选自下组的一种或多种杀虫剂蛋白：patatin、植物凝集素、植物甾体、苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白、Xenorhabdus杀虫蛋白、Photorhabdus杀虫蛋白、芽孢杆菌晚疫杀虫蛋白、球形芽孢杆菌杀虫蛋白。

在另一优选例中，所述植物包括被子植物和裸子植物。

在另一优选例中，所述裸子植物选自下组：苏铁科(Cycadaceae)、罗汉松科(Podocarpaceae)、南洋杉科(Araucariaceae)、松科(Pinaceae)、杉科、柏科、三尖杉科、红豆杉科、麻黄科、买麻藤科、单型科、百岁兰科、或其组合。

在另一优选例中，所述植物包括单子叶植物和双子叶植物。

在另一优选例中，所述植物包括草本植物和木本植物。

在另一优选例中，所述草本植物选自下组：十字花科、茄科、禾本科植物、豆科，锦葵科植物、或其组合。

在另一优选例中，所述木本植物选自下组：猕猴桃科、蔷薇科、桑科、或其组合。

在另一优选例中，所述植物选自下组：十字花科植物、锦葵科植物、禾本科植物、豆科植物、茄科、猕猴桃科、锦葵科、芍药科、蔷薇科、百合科、或其组合。

在另一优选例中，所述的植物选自下组：甘蓝、上海青、拟南芥、白菜、大豆、番茄、玉米、烟草、小麦、高粱、萝卜、或其组合。

本发明第十二方面提供了一种制备转基因植物细胞的方法，包括步骤：

(i)将重组DNA构建体导入或转染植物细胞，使得所述植物细胞含有所述构建物从而制得所述转基因植物细胞，其中所述重组DNA构建体包含编码RNA的DNA，所述RNA具有与所述靶基因的至少21个或更多个连续核苷酸基本上相同或基本互补的序列，其中所述靶基因为丝氨酸蛋白酶抑制剂基因OfSer。

在另一优选例中，所述靶基因选自下组：

(i)序列如SEQ ID NO.:1所示的多核苷酸；

(ii)核苷酸序列与SEQ ID NO.:1所示序列的同源性≥80％，较佳地，85％-90％，更佳地，为95％、96％、97％、98％、99％或100％)的多核苷酸；

(iii)在SEQ ID NO.:1所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短或添加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸的多核苷酸；

(iv)与(i)-(iii)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

在另一优选例中，与所述RNA的同源性至少为80％，较佳地，为85％-100％，更佳地，95-100％。

在另一优选例中，所述的转染采用农杆菌转化法或基因枪轰击法。

本发明第十三方面提供了一种制备转基因植物的方法，包括步骤：

将本发明第十二方面所述方法制备的所述转基因植物细胞再生为植物体，从而获得所述转基因植物。

本发明第十四方面提供了一种转基因植物细胞，所述的植物细胞是用本发明第十二方面所述的方法制备的。

本发明第十五方面提供了一种转基因植物，所述的植物是用本发明第十三方面所述的方法制备的。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了pART27-dsOfSer表达载体框架结构示意图。RB:右边界；CaMV 35S:CaMV35S启动子:Anti-sense-C2:反向片段C2；PDK:PDK内含子；Sense-C1:正向片段C1；OCS ter:OCS终止子；NOS pro:NOS启动子；NPT II:新霉素磷酸转移酶基因；NOS ter:NOS终止子；LB:左边界。

图2显示了表达昆虫基因dsRNA的转基因玉米株系及其抗虫鉴定结果。

图3显示了对照和转基因玉米表型。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现，针对如SEQ ID NO.:1所示的丝氨酸蛋白酶抑制剂基因OfSer，合成干扰RNA(dsRNA)，所述dsRNA藉由植食性昆虫(如秆野螟属)取食或直接喷洒到植食性昆虫表面，从而干扰靶基因，抑制靶基因的表达，最终杀灭秆野螟属(比如亚洲玉米螟)。本发明还可构建能够提高对昆虫抗性的植物，并且本发明的方法还可有效杀灭秆野螟属(比如亚洲玉米螟)。在此基础上，本发明人完成了本发明。

术语

如本文所用，所述“农作物”指农业上栽培的各种植物。包括粮食作物﹑经济作物(油料作物、蔬菜作物、花、草、树木)、工业原料作物、饲料作物，药材作物等，并且能大批长成或大面积收获，供盈利或口粮用的植物(例如谷物、蔬菜、棉花、亚麻等)。

其中，粮食作物以水稻、玉米、豆类、薯类、青稞、蚕豆、小麦为主要作物；油料作物以油籽、蔓青、大芥、花生、胡麻、大麻、向日葵等为主；蔬菜作物主要有萝卜、白菜、芹菜、韭菜、蒜、葱、胡萝卜、菜瓜、莲花菜、菊芋、刀豆、芫荽、莴笋、黄花、辣椒、黄瓜、西红柿、香菜等；果类有梨、青梅、苹果、桃、杏、核桃、李子、樱桃、草莓、沙果、红枣等品种；野生果类有酸梨、野杏、毛桃、山枣、山樱桃、沙棘等；饲料作物如玉米、绿肥、紫云英等；药用作物有人参、当归、金银花、薄荷、艾蒿等。

RNA干扰(RNAi)

如本文所用，术语“RNA干扰(RNA interference，RNAi)”是指：一些小的双链RNA可以高效、特异地阻断体内特定基因的表达，促使mRNA降解，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型，其也称为RNA干预或者RNA干涉。RNA干扰是高度特异的在mRNA水平上的基因沉默机制。

如本文所用，术语“小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)”是指一种短片段双链RNA分子，能够以同源互补序列的mRNA为靶目标降解特定的mRNA，这个过程就是RNA干扰途径(RNA interference pathway)。

在本发明中，所述RNA干扰的基本原理是：以植物作为媒介，使昆虫取食可干扰其基因(如丝氨酸蛋白酶抑制剂基因OfSer基因)表达的小干扰RNA(siRNA)，从而抑制昆虫的生长。

具体地，所述的原理为：藉由秆野螟属(比如亚洲玉米螟)植食性取食转入dsRNA的植物或将干扰物质喷洒秆野螟属(比如亚洲玉米螟)，使得RNAi进入虫体，对靶基因的RNA进行干扰，抑制靶基因的表达，从而干扰昆虫正常的生长发育，导致秆野螟属(比如亚洲玉米螟)死亡。

作为一种优选的方式，利用一个内含子序列，两端连接上互补的基因序列，导入细胞后，能产生“颈-环”结构，并且“颈”状部分能够在昆虫体内被加工成约19-25nt左右的小RNA，这种小RNA能特别有效的抑制目的基因的表达。

作为另一种优选的方式，利用表1中的引物进行扩增，通过转录互补作用形成的双链RNA，这种双链RNA可直接用于抑制目的基因的表达。

昆虫基因

如本文所用，术语“昆虫基因”一词是指与昆虫生长发育调控相关基因，在本发明的一个优选例中，所述的昆虫基因为丝氨酸蛋白酶抑制剂基因OfSer，所述基因的低表达或不表达将导致昆虫的生长、发育、代谢、繁殖等过程产生异常，甚至导致昆虫的死亡。

作为本发明的优选方式，本发明优选的昆虫基因的片段的长度至少为19bp，比如可以是19bp、20bp、21bp、25bp、30bp、50bp、60bp、80bp、100bp、200bp、303bp或基因的全长。所述基因在用于本发明时，可以是全长基因或基因片段，这些片段与这些基因的相似度分别为85％-100％，均为可产生相同的杀虫效果。

本发明提供针对昆虫生长发育调控相关基因的干扰RNA，昆虫可以通过口服喷洒RNAi的植物或表达dsRNA构建物或dsRNA，来摄入所述的干扰RNAi，或将干扰RNAi直接喷洒到昆虫表面。

本发明所示的dsRNA构建物如式I所示，dsRNA如式II所示，所采用的间隔序列X的长度没有特别的限制，只要在其与正向序列和反向序列形成构建物且被导入到体内后，能够形成式II所示的dsRNA即可。作为本发明的优选方式，本发明所述的间隔序列的长度为80-300bp；更佳地为100-250bp。

在本发明的一个优选例中，将所述的表达昆虫基因dsRNA的构建物导入到宿主细胞中，所述宿主细胞可以为植物细胞、组织或器官，所述构建物在植物体内可以表达昆虫基因dsRNA，dsRNA被加工成siRNA。一般地，siRNA的长度约在19-25nt左右。

通常，所述的构建物位于表达载体上。所述的表达载体通常还含有启动子、复制起点和/或标记基因等。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如卡拉霉素、庆大霉素、潮霉素、氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当基因序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主。在本发明的方法中，所述的宿主可以是任何适合于携带所述表达载体并能够将所述表达载体传递给植物细胞的宿主。优选的，所述的宿主为农杆菌。

尽管在本发明的实例中所举例的昆虫为亚洲玉米螟。然而应理解，本发明对于适用于本发明的昆虫没有特别的限制，所述昆虫可以是任何一种能以植物为食的植食性昆虫，比如其可以是鳞翅目昆虫。

本发明对于适用于本发明的植物没有特别的限制，较佳地亚洲玉米螟食用的植物，例如禾本科植物，较佳地，玉米、高粱、谷子、甘蔗、水稻等作物。

丝氨酸蛋白酶抑制剂基因OfSer

如本文所用，术语“丝氨酸蛋白酶抑制剂基因OfSer”、“OfSer”可互换使用，均是昆虫生长发育相关基因。

OfSer是蛋白酶抑制剂超家族的成员，广泛存在于动物，植物，细菌，古细菌和一些病毒中。它具有多种生理功能，包括调节免疫系统，调节细胞凋亡，激素转运和充当储存蛋白等。根据其抑制的蛋白酶种类不同，可将其分为四类:丝氨酸蛋白酶抑制剂、巯基蛋白酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂和酸性蛋白酶抑制剂，其中大多数属于丝氨酸蛋白酶抑制剂，目前已经有近1500种丝氨酸蛋白酶抑制剂基因被鉴定出来，根据其是否具有抑制蛋白酶活性的功能，可以分为抑制型和非抑制型两种，抑制型丝氨酸蛋白酶抑制剂能够以一种不可逆的方式与靶蛋白酶形成复合物，通过一系列构象变化抑制靶蛋白酶的活性，参与血液凝固，纤维蛋白溶解及细胞程序性死亡等一系列生物途径中。丝氨酸蛋白酶抑制剂还可以分为规范的抑制剂，非规范的抑制剂和Serpin三类。根据其序列同源性，活性中心的位置和分子中二硫键的拓扑学结构，规范的丝氨酸蛋白酶抑制剂又可以分为TIL,Kazal,Kunitz和Bowman-Birk等多个蛋白家族，这类丝氨酸蛋白酶抑制剂分子量较小，一般由14-200个氨基酸残基组成。非规范的抑制剂目前仅在吸血类昆虫以及蛭类中被发现，Serpin类大多由350-400个氨基酸组成，分子量大小在40-50kDa之间。

研究表明，昆虫的蛋白酶级联反应承担着昆虫免疫信号的放大和传递的作用，而丝氨酸蛋白酶抑制剂通过调控蛋白酶的活性将免疫信号的强度控制在合理范围内，维持昆虫正常的免疫反应和生长发育过程。例如，Serpin在埃及伊蚊(Aedes aegypti)，烟草天蛾(Manduca sexta)，家蚕(Bombyx mori)，柞蚕(Antheraea pernyi)等多种昆虫中被证实参与黑化反应过程中酚氧化物酶原(pPO)的激活以及Toll通路中抗菌肽物质的产生。而小分子量的含有保守的TIL domain的丝氨酸蛋白酶抑制剂的功能在昆虫中研究地比较少。

丝氨酸蛋白酶是害虫主要的蛋白消化酶(鳞翅目和部分鞘翅目害虫)，其中最主要的是胰蛋白酶和类胰蛋白酶。然而，胰蛋白酶抑制剂可以与这些酶相互作用，两者发生反应时，蛋白酶抑制剂能够抑制剂暴露在外的蛋白酶活性中心，并与蛋白酶的活动中心通过氢键相连接，形成稳定的共价型复合物，从而导致酶活动中心的闭锁，并导致蛋白酶的活性丧失，从而影响酶对蛋白的消化，最终导致昆虫无法正常吸收蛋白类营养成份，严重时可导致昆虫营养不良，发育延迟或死亡。

在本发明的一个实施方式中，基于RNAi技术，以OfSer基因作为靶标，筛选了针对OfSer基因的干扰RNA片段，优选地，所述OfSer基因的序列如SEQ ID NO：1所示：

ATGAGGCCTCAGCTGATACTCGTCGGCACTCTGGCTGTTCTCGCCATCCTCGCAGCTCTCGGCGAAGGCTCGTCGTCCTGGCCCTGCTGCAACAACTGCGGTGCTTGCAACAAGAAGCAGCCGCCGGAGTGCCAGTGCAATGACGTGTCGGTCAACGGGTGCCATCCGGAGTGCATGAACTGCGTCAAGGTCGGTGCAGGAATTCGTCCCGGCATGGGCCATGGCCCCGTCGTCACCTACCGCTGTGACGACGTTCTCACAAACTTCTGCCAGAGCAGCTGCCCGGAGGCGCCGGCGCCATAG(SEQ ID NO.:1，303bp，为OfSer全长序列)

SEQ ID NO.:2为合成的dsRNA的序列：

GGCACTCTGGCTGTTCTCGCCATCCTCGCAGCTCTCGGCGAAGGCTCGTCGTCCTGGCCCTGCTGCAACAACTGCGGTGCTTGCAACAAGAAGCAGCCGCCGGAGTGCCAGTGCAATGACGTGTCGGTCAACGGGTGCCATCCGGAGTGCATGAACTGCGTCAAGGTCGGTGCAGGAATTCGTCCCGGCATGGGCCATGGCCCCGTCGTCACCTACCGCTGTGACGACGTTCTCACAAACTTCTGCCAGAGCAGCTGCCCGGAGGC(SEQ ID NO.2)

dsRNA构建物及其应用

本发明提供了一种dsRNA构建物，所述dsRNA的构建物为双链，并且其正链或负链含有式I所示的结构：

Seq

式中，

Seq

Seq

X为位于Seq

在本发明的一个优选例中，Seq

在本发明的一个优选例中，所述dsRNA构建物被昆虫(如亚洲玉米螟)摄食后，形成式II所示的dsRNA，

式中，

Seq’

Seq’

X’为无；或为位于Seq’

||表示在Seq

本发明还提供了所述dsRNA构建物的用途，它被用于：(1)提高玉米螟属(比如，亚洲玉米螟)的防治效果；和/或

(2)提高植物对秆野螟属(比如，亚洲玉米螟)的抗性；

(3)降低丝氨酸蛋白酶抑制剂基因OfSer的表达量；和/或

(4)减少植物受害率；和/或

(4)降低作物受害程度，提高农作物产品质量；和/或

(5)减少化学农药的用量，降低化学农药对食品和环境造成的污染。

dsRNA及其应用

本发明还提供了一种如式II所示的dsRNA，

式中，

Seq’

Seq’

X’为无；或为位于Seq’

||表示在Seq

在另一优选例中，所述的间隔序列X的长度为0-300bp，较佳地为100bp。

所述的丝氨酸蛋白酶抑制剂基因OfSer来源于亚洲玉米螟；所述OfSer基因的序列如SEQ ID NO.:1所示。

在另一优选例中，所述昆虫为植食性昆虫，较佳地来自鳞翅目昆虫，最佳地来秆野螟属。

本发明还提供了所述dsRNA的用途，它被用于：(1)提高秆野螟属(比如，亚洲玉米螟)的防治效果；和/或

(2)提高植物对秆野螟属(比如，亚洲玉米螟)的抗性；

(3)降低丝氨酸蛋白酶抑制剂基因OfSer的表达量；和/或

(4)减少植物受害率；和/或

(4)降低作物受害程度，提高农作物产品质量；和/或

(5)减少化学农药的用量，降低化学农药对食品和环境造成的污染。

组合物及其应用

本发明还提供了一种组合物，本发明人针对高效杀灭亚洲玉米螟的难题，基于RNAi技术开发了针对靶标基因的RNAi片段，并通过藉由昆虫饲喂或直接喷洒昆虫，提高蚜虫的防治效果，使RNAi起到抑制基因表达的效果，最终达到高效杀灭亚洲玉米螟的目的。本发明方法高效、方便、快捷、准确且无公害。

所述组合物包括dsRNA构建物和/或dsRNA，以及昆虫喂食上可接受的有效量的载体。在另一优选例中，所述的组合物是用于诱导或导致亚洲玉米螟死亡的组合物。

在另一优选例中，所述的dsRNA具有以下序列：

dsRNA：具有对应于SEQ ID NO.:1所示的序列；

本发明还提供了所述组合物的用途，所述用途选自下组：

(1)提高秆野螟属(比如，亚洲玉米螟)的防治效果；和/或

(2)提高植物对玉米螟属(比如，亚洲玉米螟)的抗性；

(3)降低丝氨酸蛋白酶抑制剂基因OfSer的表达量；和/或

(4)减少植物受害率；和/或

(4)降低作物受害程度，提高农作物产品质量；和/或

(5)减少化学农药的用量，降低化学农药对食品和环境造成的污染。

在本发明的一个优选例中，组合物为水溶液，pH通常约为5-8，较佳地，pH约为6-8。

如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对所述昆虫喂食产生功能或活性的且可被所述昆虫所接受的量。优选地，dsRNA的含量为约1-500ng/μl，较佳地，5-300ng/μl，更佳地，100-250ng/μl。优选有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过饲喂试验或喷洒实验)。

如本文所用，“昆虫喂食上可接受的”的成分是适用于所述昆虫而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。

如本文所用，术语“载体”包括各种赋形剂和稀释剂。这类载体包括(但并不限于)：水、盐水、缓冲液、葡萄糖、甘油、乙醇、及其组合。

本发明的组合物可以直接喷洒、喂食，或被制成针剂形式，例如用水、生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的组合物宜在无菌或无RNA酶的条件下制造。

本发明的主要优点包括：

1)本发明针对特定的靶基因设计的dsRNA可高效杀灭亚洲玉米螟，提高亚洲玉米螟的防治效果；

2)本发明提供了一个基于RNA干扰技术对亚洲玉米螟具有较高致死效果的杀虫靶标基因；

3)本发明的田间测试结果表明，表达该基因dsRNA的转基因玉米，其百株玉米茎杆和百株玉米穗部亚洲玉米螟的虫口数量显著降低。说明表达该基因dsRNA的转基因玉米可用于亚洲玉米螟的防治。

4)本发明对获得了玉米转基因植株进行了田间抗虫效果评价。通过对百株玉米茎杆和百株玉米穗部亚洲玉米螟的虫口数量进行统计，结果表明：表达OfSer基因dsRNA的转基因玉米可显著提高其对亚洲玉米螟的抗性。

5)本发明首次意外地发现，针对如SEQ ID NO.:1所示的丝氨酸蛋白酶抑制剂基因OfSer，合成干扰RNA(dsRNA)，所述dsRNA藉由植食性昆虫(如玉米螟属)取食或直接喷洒到植食性昆虫表面，从而干扰靶基因，抑制靶基因的表达，最终杀灭秆野螟属(比如亚洲玉米螟)。本发明还可构建能够提高对昆虫抗性的植物，并且本发明的方法还可有效杀灭秆野螟属(比如亚洲玉米螟)。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非有特别说明，否则实施例中所用的材料和试剂均为市售产品。

本发明的dsRNA以如SEQ ID NO.2所示的序列为例。

实施例1获得靶标基因序列

(1)亚洲玉米螟总RNA的提取

以亚洲玉米螟的3龄幼虫为材料，采用常规Trizol法提取，常规方法纯化，DNA酶处理，获得浓度≥300ng/ul、总量≥6ug、OD260/280为1.8～2.2的Total RNA样品。

(2)mRNA的分离及cDNA的合成

用带有oligo-dT的磁珠分离出带有polyA的mRNA，然后用随机6聚物和Invitrogen的Superscript II reverse transcriptase试剂盒合成cDNA第一链。

(3)基因的扩增及测序

利用靶标基因特异的引物进行扩增，将获得的基因片段纯化，连接到(Takara公司生产)PMD-18载体中，转化Top10菌株，蓝白斑筛选，阳性菌株测序。扩增该靶标基因的引物见表1。

表1.本发明涉及的引物序列

实施例2构建玉米重组表达载体DTS5001

(1)所用材料：连接载体pMD-18T购自于宝生物工程(大连)有限公司，用于构建的植物双元表达载体pART27、中间载体pKANNIBAL、大肠杆菌DH5α、大肠杆菌HT115以及L4440载体由本实验室保存。DNA Marker、T4 DNA Ligase购自于宝生物工程(大连)有限公司，限制性内切酶(HindⅢ、XbaⅠ、KpnⅠ、XhoⅠ、PstⅠ、KpnⅠ和NotⅠ)购自于NEB(北京)有限公司。TIANprep Mini Plasmid Kit质粒小抽试剂盒为天根生化科技(北京)有限公司产品。试验所用的其他生化试剂及常规试剂均为分析纯级，由本实验室保存。

(2)dsRNA表达载体的构建

分别利用HindⅢ和XbaⅠ双酶切pKANNIBAL和dsOfSer-pMD18-T载体，从凝胶中切胶回收和纯化中间载体pKANNIBAL质粒的大片段及来自重组质粒dsOfSer-pMD18-T(SEQ IDNo.1)的目标基因片段，用T4 DNA Ligase将二者在16℃的条件下连接过夜，构建成为含有正向片段插入的质粒pKANNIBAL-dsOfSer。然后，分别利用KpnⅠ和XhoⅠ双酶切pKANNIBAL-dsOfSer质粒和dsOfSer-pMD18-T质粒，回收相应的酶切片段产物，用T4 DNA Ligase将二者在16℃的条件下连接过夜反应，从而构建成含有正向及反向dsOfSer片段的中间载体pKANNIBAL-dsOfSer。将其转入感受态细胞DH5α中，涂布于加有卡那霉素的LB固体培养基平板上，培养14h左右，挑取白色单菌落于液体LB培养基中培养。收集菌液，小量抽提质粒，进行酶切检测。用NotⅠ对pKANNIBAL-dsOfSer质粒和pART-27质粒进行酶切，回收大片段，纯化之后用T4 DNA Ligase将二者在16℃的条件下连接过夜反应，得到具有目的片段双向重复序列的植物RNAi双元表达载体pART-dsOfSer(结构示意图见图1)。用液氮冻融法将pART-dsOfSer质粒转入根癌农杆菌EHA105中，提取质粒进行酶切分析,将构建完成的载体命名为DTS5001。

实施例3重组农杆菌介导转化法获得转基因玉米植株

(1)玉米幼胚准备

去除玉米苞叶，切除果穗顶端约1cm左右，用镊子从顶端插入果穗，以镊子当作把手，然后把果穗放入含有消毒液的烧杯里，根据实际需要，可在同一个烧杯里放4～6个果穗。然后，向烧杯里加约700mL的消毒液(50％的漂白剂或5.25％的次氯酸钠，并加入一滴Tween20)浸泡果穗，消毒20min；在消毒期间，定时旋转果穗同时轻轻拍打烧杯以驱除籽粒表面的气泡，从而达到最佳的消毒效果；消毒结束后，取出果穗并放入盛满灭菌水的烧杯里，清洗3次，然后准备剥胚；5)把消毒过的果穗的一端放在一个大的培养皿上，用大的手术刀削掉籽粒的顶部(1.5～1.8mm)，在此过程当中，要勤消毒所用的工具，如：手术刀片、培养皿、剥胚刀等；用剥胚刀的刀尖插在胚和胚乳之间，然后轻轻向上撬出幼胚，用小的手术刀尖轻轻托起幼胚，确保幼胚不会受到任何损伤，把幼胚的胚轴面紧贴放有滤纸的N6E培养基上，胚的密度大约为2×2cm(每个培养皿放30个)；最后，用封口膜封住培养皿，28℃暗培养2～3天。

(2)重组农杆菌侵染

取已经构建好的重组农杆菌在在YEP(含Kan 50mg/L和Str100 mg/L抗生素)培养基上活化培养；然后将其划线接种在YEP培养基上(含Kan 50mg/L和Str 50mg/L抗生素)，并放置在19℃培养3天；3天后挑取重组农杆菌放入50mL离心管中(含有5mL浸染培养基)，同时加100uM AS(inf+AS)，在室温(25℃)、转速75rpm的摇床上，摇菌2～4h；随后，把剥离的幼胚放入含有inf+AS液体培养基(2mL)的离心管中，每管约20～100个幼胚，用同样的培养基洗涤2次，然后加入1～1.5mL OD

(3)共培养和静息

侵染后，把幼胚转移到共培养的培养基上，使幼胚的胚轴接触培养基表面，同时用无菌滤纸吸干水分，以驱除培养表面多余的农杆菌，然后用封口膜封好培养皿，放置在20℃条件下暗培养3天。随后，把幼胚转移至静自培养基上，用封口膜封好培养皿，放置在28℃条件下暗培养7天。

(4)选择

7天后把所有的幼胚转移到达选择培养基上(内含1.5mg/L的双丙磷)，培养两周后再进行亚培养，将双丙磷的浓度增加至3.0mg/L，再培养5周左右，含有转化子的细胞会长成肉眼可见的II型愈伤组织。

(5)转基因植株的再生

在光照培养室内，取伍仟组织在再生培养基I上生长3周，然后在再生培养基II上发芽，待转基因再生苗生长出3～4片叶时，将其转移到温室，并进行检查，保留阳性植株，待其生长至吐丝散粉期进行人工授粉。最终表达dsSer的DTS5001载体的转基因玉米获得了4个单拷贝，2个中拷贝和1个高拷贝，共7个转化事件。本专利选择3个株系(line1.2,line1.6和line1.9)田间抗虫效果评价。

由于载体中包含DsRed表达盒，我们可以根据种子颜色辨别转基因(红色)和非常转基因(黄色)，见图3。

实施例4转基因玉米的田间抗虫性评价

为了测试转基因玉米在田间的抗虫效果，我们将表达亚洲玉米螟OfSer基因dsRNA的三个株系(line1.2,line1.6 line1.9)的转基因玉米和非转基因玉米材料(control)于2020年6月8日分别播种于田间。除了不施用化学杀虫或杀菌剂外，其他均按照常规的田间管理进行。并于当年9月29日进行抗虫效果统计。主要统计百株茎杆和百穗玉米上亚洲玉米螟的虫口数。结果如图2所示，结果表明，与对照材料相比，表达亚洲玉米螟靶标基因dsRNA的line1.2和line1.6的虫口数量均显著减少，达到了显著水平(P<0.05)。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 上海植生优谷生物技术有限公司

<120> 表达昆虫dsRNA的抗虫转基因玉米

<130> P2021-0841

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 303

<212> DNA

<213> 秆野螟属(Ostrinia)

<400> 1

atgaggcctc agctgatact cgtcggcact ctggctgttc tcgccatcct cgcagctctc 60

ggcgaaggct cgtcgtcctg gccctgctgc aacaactgcg gtgcttgcaa caagaagcag 120

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tag 303

<210> 2

<211> 266

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 2

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<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 3

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<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 4

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<210> 5

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 5

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<210> 6

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 6

taatacgact cactataggg gcctccgggc agctgc 36

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 7

atgaagtctg taacggtgtg 20

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 8

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